一、mRNA选择性剪接的分子机制（论文文献综述）
高佳佳[1]（2021）在《功能基因PURA、RUVBL2和CASP8调控消化肿瘤进展的作用机制研究》文中研究指明食管癌（Esophageal cancer,ECA）是我国致死率排名第四位的恶性肿瘤,其中约90%的组织学类型为食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）。食管癌早期诊断难,患者就诊时多为中晚期,预后差,探讨促进食管癌进展的分子机制对食管癌的诊断和治疗具有重要意义。富含嘌呤元件结合蛋白α（Purine-rich element binding protein alpha,PURα）是PUR蛋白家族成员之一,具有保守的核酸结合结构域,参与DNA复制、转录和修复以及RNA转运和翻译等多种生物学功能。PURα蛋白的异常表达除了参与神经系统疾病的发生外,近年发现PURα还参与一些恶性肿瘤的增殖调控,然而,PURα在食管癌中的表达和作用机制尚不清楚。本研究,首先探讨了 DNA结合蛋白PURα调控食管癌进展的分子机制。首先,分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中PURA基因在食管癌组织中mRNA表达水平,免疫组化分析评估PURα蛋白在食管癌中的表达水平,分析食管癌组织中PURα的表达水平与患者临床病理参数和预后的相关性,以及观察PURα对食管癌体外和体内肿瘤生物学表型的影响。通过构建稳定过表达和敲降PURα的食管鳞癌细胞系,利用CCK-8和平板克隆实验、划痕愈合和Transwell实验检测PURα对体外培养细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;建立裸鼠皮下移植瘤和尾静脉注射肝肺转移瘤模型,检测PURα对体内肿瘤增殖和肝肺等脏器转移能力的影响。进一步,探讨了 PURα影响食管癌进程的分子机理。对过表达和敲降PURA基因的食管鳞癌细胞的RNA-seq分析,发现受PURA调控的信号通路和差异表达基因。利用qPCR、Western blot和免疫荧光分析验证候选通路和基因,双荧光素酶报告基因和ChIP实验探究PURα对候选基因转录调控的影响,利用回复性实验验证候选基因影响PURα介导的食管癌表型改变中的作用。通过以上实验,我们发现,PURA mRNA和蛋白水平在食管癌组织中高表达,PURα高表达与食管癌患者的淋巴结转移和AJCC分期呈正相关（P<0.05）,且PURα高表达患者生存期更短（P<0.05）,提示PURα促进了食管鳞癌进展和不良预后。体内外功能实验发现,PURα促进食管鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,促进食管癌细胞的裸鼠致瘤和肝、肺等远处器官的转移能力。解析其机制,RNA-seq分析结果提示PURα参与细胞粘附分子和细胞外基质-受体相互作用等通路的调控,影响多个上皮和间质相关基因的表达;PURα下调E-钙黏蛋白（E-Cadherin,CDH1）、上调N-钙黏蛋白（N-Cadherin,CDH2）和波形蛋白（Vimentin,VIM）的表达,诱导食管癌细胞发生上皮-间叶转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）。深入的机制分析表明,PURα可以与Snail家族锌指转录因子2（Snail family transcriptional repressor 2,SNAI2）基因启动子区-896至-431 bp的序列结合,促进SNAI2的转录活性,上调Snail2蛋白的表达。敲降SNAI2可抑制PURα诱导的EMT表型,降低食管癌细胞的运动、侵袭和转移的能力。总之,本研究发现PURα通过与SNAI2基因启动子区域结合,促进SNAI2转录活性,上调Snail2的表达,诱导食管鳞癌细胞发生EMT,进而促进食管鳞癌的增殖、侵袭和迁移,促进肿瘤进展。该研究为食管癌的诊断和治疗提供了新的分子靶标。肝癌（Liver cancer）是全世界最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在所有的恶性肿瘤中排名第四位,致死率高,预后差。RuvB-like 2（RUVBL2）蛋白属于与多种细胞活性相关的保守ATPase（AAA+）蛋白亚家族,其保守的WalkerA和B结构域可以参与ATP的结合和水解。有文献报道RUVBL2可能参与肝癌的发生,然而,RUVBL2的表达、调控和临床意义尚未系统性地在大规模肝癌临床样本中分析和验证。本实验室前期研究发现,RUVBL2蛋白在肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma.HCC）中表达上调,本研究探讨了 RUVBL2在肝癌中的生物学功能和表达调控机制。前期用免疫组化分析了 153例肝癌患者组织芯片的RUVBL2表达水平,在此工作基础上,我们对TCGA数据库中收录的371例肝癌患者的转录组测序数据、体细胞拷贝数改变数据和DNA甲基化数据进行整合分析,探究RUVBL2在肝癌中表达上调的原因和临床意义。进而在体外培养的肝癌细胞上探讨了 RUVBL2在肝癌中的生物学功能。在HepG2和Huh7肝癌细胞中瞬时敲降RUVBL2,利用CCK-8和平板克隆实验,以及Transwell实验检测RUVBL2对体外细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响:Western blot检测RUVBL2对热休克蛋白90（HSP90）、细胞分裂周期蛋白37（CDC37）、丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）和细胞外调解蛋白激酶（ERK）信号通路的影响。结果发现,RUVBL2基因启动子低甲基化、拷贝数增加,MYC基因扩增和CTNNB1基因突变可能参与调控RUVBL2在肝癌中表达水平增高。高水平的RUVBL2 mRNA与肝癌患者较短的无复发生存时间（Recurrence-free survival time.RFS）相关,但不影响总生存时间（Overall survival time,OS）。敲降RUVBL2肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力降低,并抑制HSP90-CDC37、AKT和ERK的磷酸化。以上结果提示,RUVBL2在肝细胞肝癌中的表达受到转录水平和表观遗传水平的调控。RUVBL2可能通过激活HSP90-CDC37、AKT和ERK通路促进肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移,提示RUVBL2是肝癌的一个潜在预后预测标志和治疗靶标。本实验室前期采用全基因组关联分析（Genome-wide association analysis.GWAS）鉴定到位于2q33.1区域的5个单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）位点与中国汉族人群食管鳞癌的发生显着相关。本研究还探讨了一个位于CASP8基因内含子中的主效位点调控食管癌易感性的机制。发现该位点通过影响剪接因子的结合而参与调控CASP8基因的选择性剪接,产生一个新的CASP8剪接亚型Caspase-8X。新剪接亚型编码C端催化结构域缺失的Caspase-8截短体蛋白Caspase-8X,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,与食管癌发生发展相关。该研究发现了一个参与调控食管鳞癌发生的新机制,为认识食管鳞癌癌变机理积累了科学数据。
窦琳霞[2]（2020）在《RNA加工因子CPSF6的表达纯化及PQBP1在剪接体组装过程中的作用研究》文中指出前体mRNA的3’非翻译区（3’-untranslated region,3’UTR）通过选择不同的加工位点进行切割和多聚腺苷酸（poly A）合成产生长短不一的多种mRNA亚型的过程称为选择性多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation,APA）。这一过程需要多个mRNA上的顺式作用元件和反式作用蛋白因子相互协同完成。其中切割因子I（cleavage factor I,CFIm）复合物识别poly A位点上游UGUA基序并招募其他加工因子,是APA的位点选择的关键决定因素之一。为了对CFIm复合物的功能进行深入研究,我们对其组成蛋白CPSF6（又称CFIm68）进行了重组表达。然而由于CPSF6蛋白序列含有特殊的脯氨酸富集区域,在大肠杆菌表达系统中我们无法获得全长有功能的重组蛋白。为了克服这个困难,本研究构建了Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统对CPSF6蛋白进行体外表达,免疫印迹检测显示Sf9细胞感染重组杆状病毒后可成功表达出全长His-CPSF6融合蛋白,并且经过进一步的蛋白变复性和纯化可以获得高纯度的融合蛋白。该重组蛋白在体外GST pull-down实验中可以与其相互作用蛋白CPSF5结合,表明本研究获得的重组CPSF6保有其生物学活性可以用于后续的生化分析。多聚谷氨酰胺结合蛋白1（polyglutamine binding protein 1,PQBP1）是X连锁智力发育障碍的致病基因,它编码的蛋白能与多种剪接因子结合,参与前体mRNA选择性剪接的调控,但其具体的分子机制仍不清楚。文献报导以及本实验室前期研究中提示PQBP1可能为剪接体激活复合物NTC complex的组分。为了进一步探究PQBP1与剪接体不同复合物的关系,解析它在选择性剪接中的调节作用,本研究首先通过体外pull-down assay探究了PQBP1与NTC complex核心组分PRPF19蛋白的相互作用关系,随后构建了含有MS2茎环结构的mRNA剪接底物,并利用He La细胞制备核提取物,用于体外分离剪接反应中不同阶段的复合体。实验结果显示,该剪接底物结合核提取物中的蛋白复合体并通过MBP-MS2结合蛋白被分离。本研究成功构建了剪接体体外组装和分离体系,为后续研究PQBP1具体是哪一阶段剪接体复合物的组成成分以及它是如何影响剪接体组装等一系列科学问题打下了坚实的基础。
刘娴[3]（2020）在《PQBP1参与剪接因子入核转运及mRNA选择性多聚腺苷酸化的机制研究》文中提出多聚谷氨酰胺结合蛋白1（polyglutamine binding protein 1,PQBP1）是进化上高度保守的内在无序蛋白,广泛表达于多个组织中,尤其在神经系统中高度表达。它对于神经发育至关重要,已知其基因的多种突变都会导致一类统称为Renpenning综合征的X连锁智力发育迟滞疾病（X-linked intellectual disability,XLID）。但是目前人们对于它具体的分子功能仍然缺乏了解。PQBP1主要分布于细胞核内,它的不同结构域能与不同的剪接因子和转录因子相结合,从而可能参与了mRNA的代谢调控过程。本论文从PQBP1与其他蛋白的相互作用入手对它的分子功能进行了深入探索,首先详细分析了PQBP1的不同突变如何影响它与剪接因子TXNL4A的相互作用,其次通过质谱分析鉴定了新的PQBP1相互作用蛋白CPSF6,并综合利用遗传学、分子生物学、生物化学、细胞生物学等方法进行了深入研究,发现了PQBP1参与mRNA多聚腺苷酸化的新分子功能。已有报道显示PQBP1通过其C端Yxx Pxx VL基序与剪接因子TXNL4A结合,但这种相互作用的生物学功能尚未阐明。本研究发现PQBP1-TXNL4A的相互作用能够促进剪接因子TXNL4A的入核转运,而PQBP1位于C端结构域的突变破坏了两者的相互作用,从而影响TXNL4A的入核。进一步研究表明PQBP1促进TXNL4A的入核转运依赖于PQBP1自身的核定位信号,该过程通过核转运蛋白Kapβ2介导的协调转运机制实现。为了探究PQBP1的新分子功能,本研究进行了质谱分析并经过蛋白质结合实验验证后发现PQBP1能够与前体mRNA 3’末端核心加工因子CPSF6相互作用,是mRNA 3’末端加工复合物的组成成分。接着,本研究利用高通量测序技术分析了PQBP1表达水平的改变对神经细胞mRNA poly（A）位点选择的影响,结果表明敲除或敲减PQBP1会导致远端poly（A）位点的使用频率增加。进一步的生化分析显示PQBP1并不影响CFIm组分的蛋白表达和复合物组装过程,而是与CPSF5竞争性地结合前体mRNA底物中的UGUA位点,从而揭示了PQBP1调控APA过程中poly（A）位点选择的分子机制。综上所述,本论文揭示了PQBP1参与剪接因子入核转运以及参与调控mRNA选择性多聚腺苷酸化的全新分子功能,这些发现是对PQBP1分子功能研究的新突破,为人们研究Renpenning综合征的致病机制提供新的线索。
李梦仙[4]（2020）在《剪接因子SRSF9在肺癌中表达及促进肺癌细胞增殖、侵袭能力研究》文中研究指明[目 的]肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因,但目前临床上应用的治疗手段疗效不佳,寻求有效的早期诊断及治疗的分子靶标对于肺癌防控有着重要的意义。选择性剪接作为前体mRNA成熟过程中一个重要的调控过程,极大的丰富了翻译蛋白质的种类,以保证人类复杂的生命活动在有限的编码基因数中正常进行。人类大约有超过95%的基因受到选择性剪接的调控,越来越多研究发现选择性剪接异常与人类疾病密切相关。前期发现剪接因子SRSF9在非小细胞肺癌中表达异常,本研究进一步检测剪接因子SRSF9在临床肺癌样本以及肺癌细胞系中的表达水平,并深入研究剪接因子SRSF9对肺癌细胞增殖以及侵袭等生物学功能影响的分子机制,旨在为肺癌的临床诊断及治疗提供新的思路。[方 法]1.本研究第一部分首先通过实时荧光定量PCR确定了剪接因子SRSF9在64例收集于昆明医科大学第三附属医院肺癌患者的癌组织及相对应的癌旁组织、肺癌细胞系A549、H1299及人胚肺二倍体细胞KMB17中的表达量;结合临床资料分析剪接因子SRSF9表达量与性别、年龄、病理类型等之间有无相关性。2.本研究第二部分通过慢病毒感染肺癌细胞系A549和H1299下调剪接因子SRSF9的表达后,通过平板克隆、Transwell体外侵袭等实验检测剪接因子SRSF9下调后对细胞增殖、侵袭等生物学功能的影响。3.本研究第三部分通过将两株肺癌细胞系A549和H1299经过检测验证成功下调剪接因子SRSF9后的mRNA样本进行全长转录组测序,探索剪接因子SRSF9在肺癌细胞中的作用机制。[结 果]1.剪接因子SRSF9mRNA水平在64例肺癌患者病理组织中癌组织的表达水平为（3.85×10-3,2.81×10-3）高于癌旁组织（3.05×10-3,1.35×10-3）,p<0.01;剪接因子SRSF9mRNA水平在肺癌细胞系A549 中的表达量（7.1×10-3±2.96×10-4）、H1299 中的表达量（1.49×10-2±1.55×10-3）均高于在人胚肺二倍体细胞KMB17中的表达量（5.42×10-3±5.15×10-4）,p<0.05;剪接因子SRSF9mRNA水平表达量与男女性别、年龄大小、肿瘤病理类型以及TNM分期等均无相关性。2.慢病毒感染肺癌细胞下调剪接因子SRFS9的表达后,平板克隆实验结果显示肺癌细胞A549下调SRSF9S实验组细胞集落形成数目（226±17.47）低于对照组（426±22.19）,H1299细胞下调SRSF9实验组细胞集落形成数目（92±15.14）低于对照组（369±12.58）,结果有统计学差异（p<0.000）;Transwell体外侵袭实验结果显示肺癌细胞A549下调SRSF9S实验组穿过基质胶的细胞数目（81±6.11）低于对照组（246±11.06）,H1299细胞下调SRSF9S实验组穿过基质胶的细胞数目（98±15.04）低于对照组（406±16.5）,结果有统计学差异（p<0.000）。3.（1）选择性剪接事件5种类型在对照组shNC和实验组shSRSF9中差异均无统计学意义;（2）在A549细胞系表达上调的转录本有EFEMP1、FBXL2、PNN、RBM6,表达下调的转录本有ITGB1;H1299细胞系中表达上调的转录本有 TIAF1、QKI、EIF3E、LRRC41,表达下调的转录本有 ITGB1、MSN、PXN、RAB24、GEMIN7、PTP4A2、MRPL16、VMP1。这些转录本不仅与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭等能力有关,还参与调节细胞骨架,前体mRNA剪接等过程;（3）对shSRSF9组中发生特有选择性剪接事件涉及到的基因进行KEGG通路分析,发现A549细胞系中这些基因主要与亨廷顿氏舞蹈病、化学致癌作用、细胞色素P450对外源性药物代谢的影响等信号通路有关。在H1299细胞中发现这些基因主要参与了 RNA转运、核糖体、泛素介导的蛋白降解、细胞周期、血管平滑肌收缩等信号通路中。[结 论]1.剪接因子SRSF9mRNA水平在肺癌样本和肺癌A549、H1299细胞系中均高表达,但其表达水平与年龄、性别以及病理类型等没有相关性;2.剪接因子SRSF9促进肺癌细胞增殖、侵袭等恶性生物学行为;3.肺癌细胞SRSF9下调表达量后对发生5种选择性剪接事件的转录本数目无明显影响;4.肺癌细胞下调SRSF9表达量导致前体mRNA剪接、肿瘤细胞相关的增殖、迁移、侵袭、细胞骨架的转录本异常表达,并且与肺癌细胞增殖侵袭生物学功能一致;5.SRSF9表达量下调后肺癌细胞发生特有选择性剪切事件涉及到的基因主要与亨廷顿氏舞蹈病、RNA转运、泛素介导的蛋白降解等信号通路有关。
李静[5]（2019）在《Rbm14在小鼠早期胚胎发育过程中的功能研究》文中研究表明选择性剪接在真核生物mRNA前体成熟过程中普遍存在。据估计,在人体中,超过95%的基因会发生选择性剪接。通过选择性剪接,一个基因可以编码多种蛋白,这极大地提高了由基因组编码蛋白质的多样性。先前的报道证明,在发育异常时,可能会出现不正常的选择性剪接。选择性剪接是由反式作用RNA结合蛋白结合到mRNA前体转录本的顺式作用元件上调控的。剪接小体作为介导mRNA前体剪接的核心反式作用元件,由5个小核RNAs和多种RNA结合蛋白因子组成的。除了剪接小体,其他辅助性RNA结合蛋白,尤其是RNA识别基序（RNA Recognition Motif,RRM）,也参与了时空特异性选择性剪接事件的调控。RBM14是一种RNA结合蛋白,参与多种细胞功能和生物过程,比如转录共激活、纺锤体组装、病毒感染和干细胞分化等。最近,我们实验室的研究也报道了 RBM14 在小鼠胚胎干细胞（mouse Embryonic Stem Cells,mESCs）的多能性维持和中胚层分化中发挥重要作用。然而,RBM14在哺乳动物胚胎发育中的体内功能还不清楚。在成簇规律间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR/Cas9）和胚胎显微注射技术的介导下,我们得到了Rbm14单等位基因敲除小鼠,并将其雌雄小鼠进行交配。结果发现,Rbm14双等位基因敲除会导致小鼠胚胎致死。进一步的组织学分析表明,Rbm14敲除会导致上胚层细胞凋亡和mESCs细胞凋亡,以致小鼠胚胎发育阻滞在原肠胚阶段。机制研究发现,RBM14参与DNA损伤应答相关基因的选择性剪接,敲除RBM14会导致这些基因发生异常的选择性剪接,并造成mESCs中DNA损伤的积累。因此,我们研究发现,在小鼠早期胚胎发育过程中,RBM14通过调控与DDR相关基因的选择性剪接,在维持基因组DNA完整性中发挥了关键性作用。我们研究中的关键新发现包括:（1）Rbm14双等位基因敲除,造成小鼠早期胚胎致死。（2）Rbm14双等位基因敲除后,引起着床后胚胎上胚层细胞周期阻滞和细胞凋亡,导致早期胚胎发育中原肠运动紊乱。（3）Rbm14敲除,导致在mESCs中DNA损伤的积累。（4）RBM14与可变剪接因子相互作用,通过选择性剪接调控DDR相关基因。总之,本研究证明了 RBM14介导的DDR相关基因的选择性剪接对于小鼠早期胚胎发育中基因组完整性的维持是至关重要的。
胡光辉[6]（2019）在《第一部分 LKB1在结直肠癌中的功能研究第二部分 剪接异构体CHK1-S在肝癌中的作用及其临床意义》文中进行了进一步梳理LKB1,也称为丝氨酸/苏氨酸激酶11（STK11）,最早在Peutz-Jeghers综合征（PJS）中被鉴定失活突变。LKB1常与假激酶STRAD和支架蛋白M025形成复合物,以调节自身蛋白稳定性、激酶活性和亚细胞定位。LKB1可直接磷酸化AMPK和其他12种AMPK样激酶,参与调控细胞的生长、代谢、自噬和极性。大量研究表明LKB1为抑癌基因,其失活突变与多种肿瘤中发生发展相关,如肺癌、皮肤癌等。虽然人们研究表明LKB1在结直肠癌中的突变较低,但其低表达与结直肠癌患者不良预后相关。为研究LKB1在结直肠癌中的作用,首先我们利用Cas9技术构建稳定敲除LKB1的结直肠癌细胞株。利用CCK-8实验研究LKB1对结直肠癌细胞增殖的影响,结果发现LKB1的敲除对结直肠癌细胞增殖的影响不显着。我们用AOM/DSS诱导LKB1肠道条件敲除小鼠的结直肠形成肿瘤,发现LKB1条件性敲除小鼠肠道肿瘤数目和对照小鼠的结直肠肿瘤数目无明显差异。通过细胞的迁移和侵袭实验,我们发现LKB1的敲除促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭。通过小鼠尾静脉肺转移实验,发现LKB1的敲除促进结直肠癌细胞的肺转移。为了探讨LKB1的敲除如何促进结直肠癌细胞迁移和侵袭,我们使用RNA-seq测序,分别分析HCT116和HCT15两株细胞在LKB1敲除前后基因的差异表达情况。结果发现在两组细胞中有44个共同的差异表达基因,其中包括与结直肠癌相关的基因TNIK。为了探讨LKB1与TNIK间的调控关系,我们首先通过在结直肠癌细胞中敲除和过表达LKB1,发现LKB1能够负调控TNIK的表达;且LKB1激酶失活突变不能有效抑制TNIK的表达,表明LKB1负调控TNIK的表达依赖其激酶活性。为了明确TNIK对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响,我们首先构建稳定敲降TNIK的细胞。迁移和侵袭实验表明,敲降TNIK可以抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭。为了探究LKB1是否通过调控TNIK的表达影响结直肠癌细胞迁移和侵袭能力,我们在LKB1敲除的HCT116结直肠癌细胞中敲降TNIK的表达,体内外实验结果表明LKB1的敲除促进结直肠癌细胞的迁移、侵袭以及小鼠体内的肺转移部分依赖于TNIK的表达。为了进一步探讨TNIK影响结直肠癌细胞迁移和侵袭的机制,我们利用质谱分析了与TNIK作用的蛋白,结果发现TNIK可与细胞骨架相关蛋白ARHGAP29相互作用。有文章表明ARHAGP29可以抑制RhoA的活性,进而抑制促肌动蛋白解聚因子cofilin的磷酸化,使其发挥对肌动蛋白的解聚活性,最终加速细胞肌动蛋白骨架的重塑过程。我们在结直肠癌细胞中过表达TNIK或者缺失LKB1,结果发现cofilin的磷酸化水平都下降。此外,我们还使用免疫荧光检测肌动蛋白形成的伪足,结果发现在结直肠癌细胞中过表达TNIK或者缺失LKB1其细胞周围的伪足都明显增多。以上结果提示TNIK对细胞微丝骨架重塑可能在LKB1影响结直肠癌细胞的迁移和侵袭过程中起一定作用。此外,我们还初步探讨了 LKB1对肿瘤微环境中巨噬细胞的影响,肿瘤微环境中的巨噬细胞通常被分为两种极化形式,即抗肿瘤的M1型和促肿瘤的M2型。我们使用LKB1敲除的结直肠癌细胞条件培养基刺激巨噬细胞,通过Q-PCR和免疫荧光染色方法检测M1和M2的相关分子的表达,结果发现LKB1敲除的结直肠癌细胞条件培养基可诱导巨噬细胞的极性偏向于M2型的状态。综上,我们的研究结果表明,LKB1的敲除对结直肠癌细胞增殖的影响不显着,但其对结直肠癌细胞的转移能力显着增强。LKB1的敲除增强结直肠癌细胞的转移能力部分依赖于TNIK的表达和TNIK影响的细胞骨架重塑。本研究通过揭示LKB1的敲除增强结直肠癌细胞转移能力的可能机制,为结直肠癌的治疗提供新思路。此外,通过初步研究LKB1敲除的结直肠癌细胞条件培养基对巨噬细胞极性的影响,丰富了 LKB1在结直肠癌中的作用。基因的选择性剪接是pre-mRNA加工过程中选择性的包含或删除不同外显子和内含子,该过程可产生不同成熟的mRNA,极大丰富了基因转录组和蛋白组的多样性,据估计人类中高达94%的基因可发生选择性剪接。基因的选择性剪接参与组织特异性的形成和正常发育调控等正常生命活动。基因选择性剪接异常与人类多种疾病相关,包括肿瘤。基因的选择性剪接异常与肿瘤的发生发展密切相关,其剪接异构体也可作为肿瘤分子标记物和治疗的靶点。基因的选择性剪接异常参与肿瘤的发生发展是多方面的,包括细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤细胞的代谢、血管生成及肿瘤转移。目前基因剪接异常在多种肿瘤中被相继报道和研究,然而其在肝细胞癌中的研究还不是很多。为了研究肝癌中基因的剪接异常,我们使用HTA2.0基因芯片,分析术后2年内复发和未复发肝癌患者的肝癌组织样本各5例中基因选择性剪接差异,发现细胞周期相关的CHK1基因的差异剪接。CHK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,调节DNA损伤反应。在本研究中,我们检测了肝细胞癌（HCC）组织中选择性剪接体CHK1-S（3号外显子缺失）的mRNA水平。我们的结果显示,与配对的癌旁组织相比,CHK1-S在HCC组织中显着高表达。CHK1-S的高剪接率与术后HCC患者的无复发生存期（RFS）密切相关。为了进一步探究CHK1-S在HCC中的作用,我们使用CCK-8实验、EdU掺入实验和集落形成实验。结果显示,与正常CHK1（CHK1-L）相比,CHK1-S的过表达显着促进肝癌细胞的增殖。为了探讨CHK1-S的剪接机制,我们分析前面基因芯片数据中与剪接相关的基因,发现了可调控剪接因子活性的剪接因子激酶SRPK1存在表达差异,在肝癌组织中进一步验证其mRNA水平和蛋白水平,发现SRPK1在肝癌组织中的表达水平都显着高于其配对的癌旁组织,并且SRPK1的mRNA 水平与CHK1-S的水平正相关（P=0.016）。当我们HepG2和QSG-7701细胞中过表达SRPK1,发现可使CHK1-S的蛋白水平升高,这表明SRPK1参与调控CHK1-S剪接异构体的形成。总之,我们的研究表明,CHK1-S在肝癌中发挥癌基因的作用,其表达水平表达与RFS相关;SRPK1可介导CHK1-S在肝癌中的剪接。我们的研究结果提示表明CHK1-S的表达在HCC预后评估中具有潜在的应用价值,且剪接因子激酶SRPK1可作为潜在的治疗靶点。
孔旭[7]（2018）在《Rbm24调控心脏肌节组装及与心肌病关系的研究》文中指出目的研究出生后Rbm24在维持心脏结构和功能中的调控机制,探究Rbm24缺失与扩张型心肌病发生的关系以及潜在的发病机制。此外,深入分析Rbm24蛋白的磷酸化修饰机制以及Rbm24蛋白稳定性与心脏肌节组装的关系。为RNA结合蛋白调控的RNA剪接与扩张型心肌病发病机制提供更加全面的认知,通过改变Stk38/Rbm24蛋白活性揭示潜在的心肌病的发生机制提供了研究的新思路和途径。方法首先运用Cre-loxP系统构建Flper小鼠并与心脏特异表达的MHC-cre小鼠交配,得到Rbm24心脏特异敲除的小鼠。分别在RNA水平和蛋白水平上分析KO小鼠、杂合子小鼠心脏中Rbm24的敲除效率,进而确定后续实验研究的对象和时间点。此外,在组织学水平利用HE染色、Masson染色等技术分析KO小鼠心脏的结构变化,并且结合qPCR分析扩心病Marker以及心脏超声综合判断心脏疾病类型。利用RNA测序深入分析Rbm24缺失导致的选择性剪接的变化,并进行聚类分析。选择已报道的心肌病相关基因以及肌节相关基因进行RT-PCR具体验证分析。分别在细胞系HL-1以及原代心肌细胞中敲低Stk38表达,RT-PCR分析肌节相关基因的可变剪接,Western blot以及免疫荧光染色检测肌节的紊乱情况。此外,在沉默了 Stk38表达的心肌细胞系过表达Rbm24分析肌节组装的恢复。进行体外激酶实验分析Rbm24的磷酸化水平。同时,分别运用Stk38激酶活性的抑制剂BAPTA-AM或激活剂OA并结合免疫沉淀技术分析Rbm24的磷酸化水平以及Rbm24蛋白的稳定性。结果Rbm24的心脏条件性敲除小鼠在出生后第5天Rbm24已经完全敲除,而且两个月内全部死亡。检测相关疾病特异性marker,HE和Masson染色以及心脏功能检测证实,敲除Rbm24导致小鼠出生后发生扩张型心肌病,最终引起小鼠死亡。Rbm24缺失后引起一系列基因的选择性剪接,Rbm24主要调控的选择性剪接类型是Skipped exon（SE）。Rbm24作为选择性剪接的抑制因子调控心脏中特定基因的可变剪接,对被调控的基因进行生物学功能分析发现这些基因主要参与心肌细胞的骨架形成、肌节的组装、心肌的节律性收缩等方面。Rbm24缺失导致相关基因如Titin等肌节相关基因发生异常剪接,引起心肌细胞的肌节排列发生紊乱,肌节结构改变,心脏功能异常。心肌细胞中,Stk38的表达下降导致Rbm24蛋白的稳定性下降。体外激酶等实验证实Rbm24是一种磷酸化蛋白,其磷酸化水平受Stk38直接调节。使用Stk38激酶抑制剂或激活剂进一步研究阐明Rbm24蛋白稳定性以激酶活性依赖性方式进行调节。在心肌细胞中,Stk38的表达下降或激酶活性降低可引起肌节相关蛋白的减少,肌节组装的紊乱。结论心脏中特异敲除Rbm24导致小鼠发生扩张型心肌病死亡。Rbm24缺失引起一系列心肌相关基因发生异常可变剪接进而导致扩心病的发生。此外,在心肌细胞中Stk38通过磷酸化Rbm24增强其蛋白的稳定性进而调控心肌肌节的组装。这一发现将进一步加深我们对心脏肌节组装在生理和病理情况下的调节机制的理解,并通过调节Stk38/Rbm24蛋白活性的调控机制揭示了一种潜在的心肌病发生的新途径。
王洋[8]（2018）在《复杂疾病中选择性剪接对转录调控介导作用的研究》文中进行了进一步梳理转录水平的调控发生在基因表达的最初阶段,是基因表达过程中最重要的一步,而真核基因的转录伴随着RNA的剪接调控,因此,异常的剪接调控往往会对基因的转录过程产生干扰。近些年,随着共转录现象的发现,RNA选择性剪接的研究焦点逐渐由剪接事件的识别转向剪接机制的研究,并取得了一定的进展。但以往的研究主要是从序列层面和核小体定位、组蛋白修饰、DNA甲基化及非编码RNA等表观遗传层面阐述RNA选择性剪接的调控机制,对于选择性剪接在转录过程中介导作用的机制尚不清楚。随着下一代测序技术的普及与发展,海量数据的产生为全转录组范围研究选择性剪接调控机制带来了希望。本文总结了该领域目前所遇到的主要难点和瓶颈,基于高通量生物数据,建立数学模型,并围绕这些难点,以人类复杂疾病为研究对象,对转录调控过程中选择性剪接的介导调控机制以及选择性剪接的发生机制进行了研究,主要包括以下几个方面:（1）基于广义线性回归原理构建了选择性剪接介导转录调控模型,利用TCGA肾癌转录组测序数据,定量分析了不同剪接水平下转录因子活性变化,发现了选择性剪接对于转录因子与靶基因调控关系的介导作用。为深入研究选择性剪接在转录调控中的作用奠定了理论基础;该研究弥补了仅通过基因表达水平等单一因素来研究转录调控机制上的这一空缺,从而提高了选择性剪接在靶向治疗上应用的潜在可能。（2）基于逻辑回归原理构建选择性剪接介导转录调控模型,利用TCGA脑胶质瘤转录组测序数据,分析选择性剪接在转录过程中对转录因子与靶基因的影响。由于基因调控的复杂性,某些转录因子与靶基因间的调控关系可能呈非线性相关。因此,在研究选择性剪接介导的转录调控过程中,“转录因子-靶基因-辅调节因子选择性剪接产物”所构成的三元调控关系会随着不同的因子变化而不同。为解决此困难,本部分基于逻辑回归分析方法构建数学模型,用以分析以选择性剪接为中心的三元调控关系,最后应用开源数据脑胶质瘤转录组测序数据对模型进行验证。预测结果显示,当转录辅调节因子在选择性剪接水平上发生改变时,会介导影响转录因子与靶基因间的调控关系。说明选择性剪接在转录调控中的介导作用是存在的,并且不依附于转录因子与靶基因间的实际调控关系。（3）应用乳腺癌转录组测序数据,对选择性剪接所介导的转录调控过程进行研究。MYC是一种经典的肿瘤发生激活因子,涉及多种人类癌症的发病机制,可以激活或抑制大量的靶点,MYC的异常调控将促进癌症的发生和发展,并通常会与不良预后结果密切相关。本部分以经典转录因子MYC为研究对象,有针对性挖掘乳腺癌中调控MYC转录活性的选择性剪接事件,对其所参与的信号通路与转录调控进行关联分析。研究结果显示,乳腺癌中FN1、MEN1的选择性剪接异构体的比例对MYC转录活性产生影响,改变细胞内FN1、MEN1的选择性剪接类型会对其蛋白结构的空间构象或核定位产生影响,最终介导影响乳腺癌细胞中MYC的转录过程。（4）应用阿尔兹海默症的转录组测序数据,对比分析了不同表达水平下、不同分子类型的辅调节因子对SRSF1靶RNA选择性剪接结果的影响。研究发现了 SNHG7和VASN的差异表达会影响SRSF1对靶RNA的剪接调控结果,对研究复杂疾病中选择性剪接的调控作用提供参考。研究结果显示,差异表达的介导调节因子SNHG7及VASN会影响SRSF1对靶RNA的剪接调控作用,SRSF1在细胞内的定位以及在蛋白水平上的相互作用也会受到影响,最终干扰SRSF1基因的调控过程。
姜春娃[9]（2017）在《肿瘤型PIAS3异构体的选择性剪接机制和功能研究》文中研究说明转录水平调控是联系基因和蛋白表达的纽带,mRNA选择性剪接是一种调控基因表达的重要转录后调控机制,能使相对有限的基因表达出非常复杂的蛋白产物,已经成为真核基因表达调控的研究热点之一。选择性剪接与肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤细胞通过选择性剪接改变某些基因的表达方式,使其转化为癌基因;或者通过选择性剪接机制改变抑癌基因的表达,使其失去肿瘤抑制作用;从而促进自身的生长增殖,逃避凋亡信号和免疫监视。选择性剪接对于肿瘤的意义研究,已经成为生命科学领域方兴未艾的研究热点。PIAS3作为促癌因子STAT3蛋白的抑制蛋白,发挥显着的抑癌功能。PIAS3能够阻止STAT3与下游靶基因启动子的结合,抑制STAT3的转录活性。作为转录调控因子,PIAS3参与对多种肿瘤关联信号,如MITF、NFκB、Smad信号的调节。研究表明,过表达PIAS3能够抑制多种肿瘤的增殖信号;提高肺癌、卵巢癌和子宫内膜癌细胞的药物敏感性,促进肿瘤细胞凋亡。然而,在不同的肿瘤中,PIAS3表达的研究结果令人费解;人们发现在多种癌组织中的PIAS3表达低于正常组织;也有研究表明,PIAS3在多种癌组织中表达上调;PIAS3在不同肿瘤,甚至相同肿瘤的表达的矛盾性,提示了PIAS3的表达可能存在更复杂的调节机制,需要深入研究。目前研究表明,小鼠PIAS3基因编码两个剪接型蛋白PIAS3α（64KD）和PIAS3β（68KD）;而人类的所有组织中只有一种PIAS3（68KD）。在本论文中,我们创新性的发现了一种存在于多种肿瘤细胞中的人类PIAS3短型异构体;这种肿瘤型PIAS3异构体是人类正常PIAS3基因选择性剪接的产物。我们探讨了这种选择性剪接的调控机制,并揭示了这种选择性剪接对肿瘤发生的生理意义。首先,我们发现人类肿瘤细胞表达一种缺失87-121位氨基酸的短型PIAS3剪接异构体。我们利用Western blot方法检测了人类前列腺组织和几种肿瘤细胞内PIAS3的表达情况;在人类前列腺增生组织中,我们检测到一条68KD大小的PIAS3蛋白条带的表达,而在所有五种肿瘤细胞中,我们检测到一条小于68KD的蛋白条带。通过克隆和测序,证明肿瘤细胞PIAS3缺失了位于EXON2上一段105bp的碱基序列（PIAS3Δ段mRNA）,编码87-121位共35个氨基酸。我们对人类两种PIAS3蛋白命名进行区分,将前列腺组织中68KD的蛋白命名长型PIAS3L,将各种肿瘤细胞中出现的64KD短型蛋白命名为PIAS3S。通过序列比对,证明人类两种PIAS3蛋白（PIAS3L和PIAS3S）与小鼠的两种PIAS3（PIAS3β和PIAS3α）的蛋白序列高度同源。然后,我们对人类两种PIAS3蛋白存在的机制进行了研究,发现了一种特异性的PIAS3选择性剪接机制。我们对PIAS3L和PIAS3S差别的Δ段mRNA 105bp碱基序列进行生物信息学分析,发现这段序列具备内含子的GT-AG边界法则特点,而且含有分支点A的结构特征,提示这段序列是一种潜在的内含子。我们发现在这个潜在的内含子序列中,存在着STAT3和雄激素受体AR潜在的结合位点的重合交叉。进而我们发现,长型PIAS3L的表达水平与组织/细胞内AR的表达水平一致,而短型PIAS3S的表达水平与组织/细胞内STAT3的表达水平一致。通过过表达和基因沉默实验,我们证明AR上调PIAS3L的蛋白水平和mRNA水平,而STAT3上调PIAS3S的蛋白水平和mRNA水平。接着,通过RIP实验,我们证明了STAT3和AR是新型的RNA结合蛋白,具有和PIAS3Δ段的105bp mRNA的结合能力,而AR能够拮抗STAT3的结合。进一步通过COIP实验,我们发现STAT3具有U2AF35的结合能力。因此,我们提供了一种STAT3介导的肿瘤型PIAS3S的形成机制的假说,即STAT3结合PIAS3Δ段mRNA,招募U2AF35到潜在内含子3’端位点的,从而促进PIAS3Δ段mRNA剪接,产生PIAS3S mRNA和肿瘤型PIAS3S蛋白;而AR结合在Δ段mRNA上从而阻止了STAT3和此段RNA的结合,抑制了PIAS3的选择性剪接。这是一种尚未见报道的新型剪接调控方式。在此基础上,我们揭示了这种PIAS3选择性剪接的病理生理学意义。STAT3信号和AR信号的异常活化是肿瘤,特别是前列腺癌发生的必要条件。我们比较了不同PIAS3剪接异构体对STAT3/AR信号通路的调控,发现长型PIAS3L显着抑制STAT3和AR介导报告基因的转录活性,而短型PIAS3S失去了抑制功能,PIAS3Δ段本身就发挥信号的抑制作用。进一步通过免疫共沉降实验和GST Pulldown实验发现,PIAS3Δ段在体内外都具有显着的STAT3/AR结合能力;长型PIAS3L与STAT3/AR具有显着的结合作用,而PIAS3S与STAT3/AR的结合作用很弱。我们通过免疫荧光实验研究了不同PIAS3剪接异构体对STAT3/AR细胞内定位的影响,我们发现PIAS3Δ段的存在是STAT3/AR不能进入细胞核的重要原因,这些结果证明PIAS3两种异构体的差异序列-PIAS3Δ段是PIAS3L发挥抑制STAT3/AR信号功能的关键结构域。进而,我们研究了不同PIAS3异构体对肿瘤细胞增殖与肿瘤发生的影响。我们发现PIAS3L或PIAS3Δ段具有显着地抑制前列腺癌细胞活力和克隆形成能力,抑制增殖标志蛋白BCL-2、PCNA、Ki67、CyclinD1和Survivin的表达。同时裸鼠异种移植实验表明,与对照组比较,短型PIAS3S对肿瘤发生和生长影响不显着,而长型PIAS3L和PIAS3Δ段显着地抑制了肿瘤的发生,PIAS3L和PIAS3Δ段接种后肿瘤的发生率仅为对照组的1/6,而且体积很小,提示了PIAS3Δ段对肿瘤发生的显着抑制效应。为了揭示不同PIAS3亚型与人类肿瘤的关联,我们收集了63例临床不同分期的前列腺癌样本,并利用特异识别长型PIAS3L的Δ段的抗体检测了前列腺癌组织内长型PIAS3L的表达水平。我们发现,在前列腺癌组织中,随着代表肿瘤恶性度GLEASON评分增高,长型PIAS3L表达减少,而PIAS3总体表达并未减少,提示了随着肿瘤恶性度的增加,PIAS3发生了选择性剪接增强。通过对63例患者十年间的生存率分析发现,PIAS3L强染色组生存率高,弱染色组生存率低,两者差别显着（p=0.019）,说明具有Δ段的长型PIAS3L是肿瘤患者生存良好的预测指标。我们还比较了前列腺增生组织与前列腺癌组织中长型PIAS3L表达水平与STAT3和AR表达的关联,发现随着肿瘤的进展,PIAS3L表达减少,STAT3和AR入核增加。这些结果证明,PIAS3Δ段的存在是PIAS3L抑制肿瘤信号活化,保证良好生存率的基础。本论文提供了一种肿瘤关联的PIAS3 mRNA选择性剪接的新机制,揭示了这种选择性剪接关联功能域（PIAS3Δ段）对PIAS3发挥肿瘤抑制功能的意义,为肿瘤的预测和治疗提供了新的靶点和靶向。
马振伐[10]（2016）在《SMG9剪接异构体的鉴定及其功能的初步研究》文中进行了进一步梳理在不断的进化过程中,真核生物为保证遗传信息的精确传递,机体内出现了许多mRNA质量监控机制。其中,无义介导的mRNA降解（nonsense-mediatedmRNA decay,NMD）是一种广泛存在的转录后调控机制。NMD不仅能够降解细胞内含提前终止密码子（premature termination codons,PTC）的异常mRNA,还能够调节哺乳动物细胞在不同生理条件下转录组和蛋白组的动态平衡。选择性剪接发生在前体mRNA的修饰过程中,使得一种基因可产生多种mRNA序列,即不同的剪接异构体。但并不是所有的剪接产物都能够翻译成正常蛋白质而发挥其功能,一定比例的剪接产物会携带PTC,在翻译过程中触发NMD途径发生降解。SMG9（nonsense mediated mRNA decay factor）是NMD通路中的重要因子,能够与SMG1形成复合体调控UPF1的磷酸化。我们在研究过程中发现,SMG9发生了选择性剪接且产生了一种新的异构体。我们对SMG9的新剪接异构体进行了鉴定,并对其在细胞内的表达及调控进行了分析。SMG9参与NMD通路,调控底物基因的表达,同时SMG9的自身表达也受到NMD通路的调控。这一发现,能够使我们更加深入的了解NMD过程及此过程中存在的反馈调节模式,为解析NMD分子机制提供理论依据。取得的主要研究结果如下:（1）发现并鉴定了 剪接异构体。其CDS区全长927bp,可编码308个氨基酸。我们将已经报道的SMG9记为SMG9a,本研究中新发现的剪接异构体记为SMG9b。（2）通过Q-PCR、WB等试验验证了 SMG9b的相对表达量,且SMG9bb在mRNA水平上表达量高于SMG9aa;而蛋白水平上,SMG9b的表达量低于SMG9a。（3）通过超表达、干扰试验发现SMG9a与SMG9b之间可能存在相互作用,即SMG9a表达量上升时,SMG9b也上升;SMG9a下降时,SMG9b同时下降,反之亦然。（4）生物信息学软件预测了作用于SMG9 CDS区的miR-4651,Q-PCR试验结果表明,miR-4651可抑制SMG9的表达。（5）超表达SMG9b导致NMD底物基因的表达下降,表明SMG9b参与NMD通路。特异干扰SMG9a、超表达SMG9b导致NMD底物基因下降,表明SMG9b可能是直接参与NMD通路。干扰UPF1导致SMG9b的表达量下降,表明SMG9b是NMD的底物,受NMD的反馈调节。以上结果表明,剪接异构体SMG9b虽与SMG9a在NMD中发挥相似功能,但其表达调控模式似乎更加复杂。SMG9b作为NMD的因子发挥作用的同时,其本身也是NMD的作用底物之一,这一发现使得NMD中的负反馈调节这一机制变得更加引人注目。
二、mRNA选择性剪接的分子机制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、mRNA选择性剪接的分子机制（论文提纲范文）
（1）功能基因PURA、RUVBL2和CASP8调控消化肿瘤进展的作用机制研究（论文提纲范文）
| 基金支持 |
| 缩略语索引表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 PURα在食管鳞癌组织中的表达与临床病理特征分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 1. 食管癌组织中PURA mRNA水平显着升高 |
| 2. 食管鳞癌组织中PURα蛋白水平显着升高 |
| 3. PURα高表达与AJCC分期和淋巴结转移正相关 |
| 4. PURα高表达的ESCC患者生存期更短 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 PURα影响食管癌生物学特性的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 1. 建立PURα稳定过表达和敲降的食管鳞癌细胞系 |
| 2. PURα促进体外食管癌细胞的增殖 |
| 3. PURα促进体外食管鳞癌细胞的迁移和侵袭 |
| 4. PURα促进体内食管鳞癌的肿瘤增殖和转移能力 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 PURα促进食管癌进展的机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 1. PURα调控食管鳞癌细胞转录组的RNA-seq分析 |
| 2. PURα调控食管鳞癌细胞EMT相关分子的转录 |
| 3. PURα上调EMT关键转录因子Snail2的表达 |
| 4. PURα通过促进Snail2的表达诱导食管鳞癌细胞发生EMT |
| 5. PURα通过调控Snail2促进食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力 |
| 6. PURα通过Snail2在体内诱导食管鳞癌细胞EMT转变 |
| 7. PURα调控SNAI2的转录活性 |
| 8 PURα直接与SNAI2的启动子区域结合 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 RUVBL2在肝细胞肝癌中的调控机制和生物学功能研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 1. 在肝癌组织中RUVBL2的mRNA水平显着升高 |
| 2. RUVBL2 mRNA水平与患者临床病理参数相关性分析 |
| 3. RUVBL2 mRNA水平与患者生存的相关性 |
| 4. 肝癌组织中RUVBL2 mRNA的异常转录调控 |
| 5. RUVBL2促进体外肝癌细胞的增殖 |
| 6. RUVBL2促进体外肝癌细胞的迁移和侵袭 |
| 7. RUVBL2激活HSP90-CDC37、AKT和ERK通路 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 CASP8基因单核苷酸多态性调控食管鳞癌易感性的机理研究 |
| 文献综述 选择性剪接与细胞癌变研究进展 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表的论文和获奖证书 |
（2）RNA加工因子CPSF6的表达纯化及PQBP1在剪接体组装过程中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 前体mRNA选择性剪接的研究概述 |
| 1.2.1 选择性剪接的定义及分子机制 |
| 1.2.2 选择性剪接的调控机制 |
| 1.2.3 选择性剪接的生物学意义 |
| 1.2.4 选择性剪接与人类疾病 |
| 1.3 PQBP1 分子研究概述 |
| 1.3.1 Renpenning综合征与PQBP1 |
| 1.3.2 PQBP1 的发现及分子结构 |
| 1.3.3 PQBP1 分子的主要功能研究 |
| 1.3.4 PQBP1 分子的研究展望 |
| 第二章 RNA加工因子CPSF6 的表达纯化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 质粒的构建 |
| 2.2.2 Sf9 细胞的培养 |
| 2.2.3 重组杆状病毒的构建 |
| 2.2.4 收获P1 病毒株 |
| 2.2.5 重组杆状病毒的扩增 |
| 2.2.6 融合蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.7 融合蛋白的原核表达纯化 |
| 2.2.8 亲和作用检测蛋白相互作用(GST pull-down) |
| 2.2.9 Western Blotting免疫印迹 |
| 2.3 实验结果和讨论 |
| 2.3.1 RNA加工因子CPSF6 的原核表达出现截短 |
| 2.3.2 密码子优化后的RNA加工因子CPSF6 仍无法获得全长蛋白 |
| 2.3.3 重组杆状病毒载体p Fast Bac-CPSF6 及重组杆粒Bac-CPSF6 构建 |
| 2.3.4 重组杆状病毒BV-CPSF6 P1 病毒株的获得 |
| 2.3.5 融合蛋白His-CPSF6的Western Blot鉴定 |
| 2.3.6 融合蛋白His-CPSF6 的大量表达及纯化 |
| 2.3.7 融合蛋白His-CPSF6 生物学活性的鉴定 |
| 2.3.8 结果讨论 |
| 第三章 PQBP1 在剪接体组装过程中的作用研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 细胞total RNA提取、c DNA合成 |
| 3.2.2 质粒的构建 |
| 3.2.3 融合蛋白的表达纯化 |
| 3.2.4 融合蛋白浓度测定 |
| 3.2.5 蛋白质-蛋白质相互作用 |
| 3.2.6 细胞培养 |
| 3.2.7 细胞转染 |
| 3.2.8 细胞总蛋白提取和Western Blotting免疫印迹 |
| 3.2.9 地高辛标记RNA的体外合成和纯化 |
| 3.2.10 RNA结合蛋白MBP-MS2 融合蛋白的纯化 |
| 3.2.11 HeLa细胞核蛋白的提取 |
| 3.2.12 剪接体的体外组装 |
| 3.2.13 非变性琼脂糖凝胶电泳及Nortern Blot印迹 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 探究PQBP1 与剪接体激活因子PRPF19 间的互作关系 |
| 3.3.2 地高辛标记剪接底物的合成及鉴定 |
| 3.3.3 RNA结合蛋白MBP-MS2 融合蛋白的表达及纯化 |
| 3.3.4 MBP-MS2 融合蛋白的功能验证 |
| 3.3.5 结果讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）PQBP1参与剪接因子入核转运及mRNA选择性多聚腺苷酸化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 PQBP1 分子的研究概述 |
| 1.1.1 PQBP1 的发现 |
| 1.1.2 PQBP1 的结构特征 |
| 1.1.3 PQBP1 的功能研究 |
| 1.1.4 PQBP1 与人类疾病 |
| 1.2 前体MRNA3’末端加工的研究概述 |
| 1.2.1 多聚腺苷酸化加工的定义和分子机制 |
| 1.2.2 选择性多聚腺苷酸化(APA)的定义和分类 |
| 1.2.3 APA参与的生物学过程 |
| 1.2.4 APA位点选择的调控机制 |
| 1.2.5 APA与人类疾病 |
| 1.2.6 高通量测序技术在APA研究中的应用 |
| 1.2.7 APA的研究展望 |
| 1.3 本研究拟解决的问题 |
| 第二章 PQBP1 介导剪接因子TXNL4A入核转运的机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 抗体 |
| 2.2.2 重组质粒的构建 |
| 2.2.3 融合蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.4 体外蛋白质结合实验——GST pull-down |
| 2.2.5 Western Blot免疫印迹 |
| 2.2.6 细胞培养和细胞转染 |
| 2.2.7 细胞免疫荧光染色 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PQBP1的P244L突变导致它与TXNL4A的结合能力下降 |
| 2.3.2 PQBP1-TXNL4A相互作用促进TXNL4A的入核转运 |
| 2.3.3 核转运蛋白Kapβ2 介导PQBP1-TXNL4A复合物的入核转运 |
| 2.4 结果讨论 |
| 第三章 PQBP1 调控选择性多聚腺苷酸化的机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 抗体 |
| 3.2.2 重组质粒的构建 |
| 3.2.3 融合蛋白的表达 |
| 3.2.4 RNA的体外合成、修饰与纯化 |
| 3.2.5 蛋白质提取和Western Blot免疫印迹 |
| 3.2.6 蛋白质与蛋白质间相互作用的检测方法 |
| 3.2.7 蛋白质与蛋白质竞争性结合实验 |
| 3.2.8 蛋白质-RNA相互作用的检测方法——RNA pull-down assay |
| 3.2.9 蛋白质与RNA竞争性结合实验 |
| 3.2.10 Pqbp1fl/fl转基因小鼠的制备与鉴定 |
| 3.2.11 小鼠脑片的免疫荧光染色 |
| 3.2.12 细胞培养和细胞转染 |
| 3.2.13 PAS-Seq的建库流程 |
| 3.2.14 poly(A)位点的分析方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PQBP1 参与mRNA3’末端加工复合体的组成 |
| 3.3.2 PQBP1 影响神经系统中mRNA poly(A)位点的选择 |
| 3.3.3 PQBP1 调控mRNA poly(A)位点选择的分子机制 |
| 3.3.4 结果讨论与未来工作计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 科研成果 |
（4）剪接因子SRSF9在肺癌中表达及促进肺癌细胞增殖、侵袭能力研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 一剪接因子SRSF9在肺癌中表达水平及与临床资料相关性分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 二剪接因子SRSF9对肺癌细胞增殖、侵袭生物学行为研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 三肺癌细胞A549、H1299下调SRSF9表达量后转录组测序结果分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 SR蛋白家族对肿癯发生发展影响的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）Rbm14在小鼠早期胚胎发育过程中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 早期胚胎发育 |
| 1.1.1 第一次细胞命运决定: 内细胞团和滋养层的形成 |
| 1.1.2 第二次细胞命运决定: 上胚层与原始内胚层的分化 |
| 1.1.3 原肠运动与原肠胚的形成 |
| 1.2 选择性剪接 |
| 1.2.1 选择性剪接的机制 |
| 1.2.2 选择性剪接调控的生物学意义 |
| 1.2.3 选择性剪接的调控 |
| 1.3 RNA结合蛋白 |
| 1.3.1 RNA结合蛋白的RNA结合结构域 |
| 1.3.2 RNA结合蛋白的功能 |
| 1.4 Rbm14基因 |
| 1.5 基因组稳定性维持 |
| 1.5.1 DSB修复通路 |
| 1.5.2 选择性剪接对基因组稳定性的维持 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验耗材 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.1.5 工具酶 |
| 2.1.6 试剂盒 |
| 2.1.7 抗体 |
| 2.1.8 实验动物 |
| 2.1.9 实验细胞系 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 打靶Rbm14基因的sgRNA的筛选 |
| 2.2.2 Rbm14单等位基因敲除小鼠的获得 |
| 2.2.3 组织形态学观察 |
| 2.2.4 组织包埋 |
| 2.2.5 切片及捞片 |
| 2.2.6 苏木素和伊红染色 |
| 2.2.7 BrdU标记 |
| 2.2.8 免疫荧光染色 |
| 2.2.9 饲养层细胞的制备 |
| 2.2.10 小鼠ESCs细胞系的建立及基因型鉴定 |
| 2.2.11 细胞免疫荧光染色 |
| 2.2.12 CCK8细胞活度检测 |
| 2.2.13 免疫印迹 |
| 2.2.14 凋亡检测 |
| 2.2.15 细胞周期检测 |
| 2.2.16 单细胞凝胶电泳分析 |
| 2.2.17 免疫共沉淀 |
| 2.2.18 RNA抽提 |
| 2.2.19 RNA反转和半定量PCR |
| 2.2.20 RNA高通量测序和生物信息学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 Rbm14基因特异敲除小鼠的表征 |
| 3.1.1 Rbm14单等位基因敲除小鼠的获得 |
| 3.1.2 Rbm14敲除导致小鼠胚胎期死亡 |
| 3.2 Rbm14敲除小鼠的胚胎发育 |
| 3.2.1 Rbm14敲除不影响胚胎从受精卵到着床前囊胚的发育 |
| 3.2.2 Rbm14敲除导致原肠胚发育阻滞 |
| 3.2.3 Rbm14抑制原条形成 |
| 3.2.4 Rbm14敲除导致着床后胚胎上胚层细胞周期阻滞和细胞凋亡 |
| 3.3 Rbm14敲除对小鼠胚胎干细胞的影响 |
| 3.3.1 Rbm14敲除抑制小鼠胚胎干细胞生长 |
| 3.3.2 Rbm14敲除导致小鼠胚胎干细胞细胞周期阻滞和细胞凋亡 |
| 3.4 Rbm14参与基因组DNA稳定性的维持 |
| 3.5 Rbm14调控DDR相关基因的选择性剪切 |
| 第四章 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（6）第一部分 LKB1在结直肠癌中的功能研究第二部分 剪接异构体CHK1-S在肝癌中的作用及其临床意义（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 第一部分 LKB1在结直肠癌中的功能研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 1 LKB1的敲除不显着影响结直肠癌细胞的增殖 |
| 1.1 稳定细胞系的构建 |
| 1.2 LKB1的敲除对结直肠癌细胞增殖能力的影响不明显 |
| 1.3 LKB1的肠道特异敲除不影响AOM/DSS诱导小鼠的成瘤数 |
| 2 LKB1的敲除增强结直肠癌细胞的转移能力 |
| 2.1 LKB1的敲除增强HCT116结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力 |
| 2.2 LKB1的敲除增强SW480结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力 |
| 2.3 LKB1的敲除增强HCT116结直肠癌细胞小鼠体内肺转移能力 |
| 2.4 LKB1影响结直肠癌细胞EMT的变化 |
| 2.5 LKB1的敲除促进结直肠癌细胞分泌降解基质的酶 |
| 3 LKB1调控TNIK的表达 |
| 3.1 LKB1调控TNIK的表达 |
| 3.2 AOM/DSS诱导的LKB1敲除小鼠的大肠组织中TNIK的蛋白上调表达 |
| 3.3 LKB1的激酶活性参与调控TNIK的表达 |
| 4 LKB1通过调控TNIK的表达影响结直肠癌细胞的转移能力 |
| 4.1 敲降TNIK抑制RKO结直肠癌细胞的迁移和侵袭 |
| 4.2 敲降TNIK抑制HCT116结直肠癌细胞的迁移和侵袭 |
| 4.3 LKB1通过调控TNIK的表达调控结直肠癌细胞的迁移能力 |
| 4.4 LKB1通过调控TNIK的表达影响结直肠癌细胞的侵袭能力 |
| 4.5 LKB1通过调控TNIK的表达影响结直肠癌细胞在小鼠体内肺转移能力 |
| 5 TNIK调控细胞骨架 |
| 5.1 TNIK与ARHGAP29相互作用 |
| 5.2 TNIK促进细胞骨架重塑 |
| 5.3 TNIK促进伪足的形成 |
| 6 LKB1的敲除促进结直肠癌细胞移植瘤的微血管生成 |
| 7 LKB1的敲除影响结直肠癌细胞条件培养基对巨噬细胞极性的诱导 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 剪接异构体CHK1-S在肝癌中的作用及其临床意义 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 1 生物信息学分析肝癌中基因剪接异构体差异 |
| 2 CHK1-S在肝癌组织中高表达且高剪接比率与患者术后的预后相关 |
| 3 CHK1-S促肝癌细胞增殖的能力强于CHK1-L |
| 4 SRPK1参与调控CHK1-S的剪接 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 资助基金 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）Rbm24调控心脏肌节组装及与心肌病关系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 心脏的肌节组装 |
| 1.1.1 肌节的结构 |
| 1.1.2 Titin与肌节的组装 |
| 1.2 RNA结合蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 RNA结合蛋白概述 |
| 1.2.2 RNA结合蛋白结构研究 |
| 1.2.3 RNA结合蛋白的功能研究 |
| 1.2.4 RNA结合蛋白研究方法与技术 |
| 1.3 RNA结合蛋白在心脏肌节组装以及心脏功能中的作用 |
| 1.3.1 Rbm20 |
| 1.3.2 Rbm4 |
| 1.3.3 Rbm38 |
| 1.3.4 Rbm24 |
| 1.4 遗传性心肌病 |
| 1.4.1 扩张型心肌病 |
| 1.4.2 肌节与扩心病发生 |
| 1.5 RNA结合蛋白在心肌病发生中的作用 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验所用细胞系 |
| 2.1.2 菌株以及表达载体 |
| 2.1.3 常用抗体 |
| 2.1.4 引物序列 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.3 实验内容与方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 过表达质粒的构建 |
| 2.3.3 质粒的提取 |
| 2.3.4 蛋白质免疫印迹实验 |
| 2.3.5 细胞免疫荧光实验 |
| 2.3.6 免疫共沉淀 |
| 2.3.7 免疫沉淀 |
| 2.3.8 磷酸化蛋白染色 |
| 2.3.9 体外激酶实验 |
| 2.3.10 总RNA的提取 |
| 2.3.11 RNA反转录 |
| 2.3.12 荧光定量PCR |
| 2.3.13 选择性剪接分析实验 |
| 2.3.14 基因敲除小鼠的构建 |
| 2.3.15 伊红-苏木素染色 |
| 2.3.16 Masson染色 |
| 2.3.17 组织免疫荧光 |
| 2.3.18 组织超显微结构分析 |
| 2.3.19 统计学分析 |
| 第三章 Rbm24特异性敲除导致扩张型心肌病发生的研究 |
| 3.1 Rbm24心脏特异性敲除小鼠的构建 |
| 3.2 Rbm24敲除小鼠的鉴定 |
| 3.3 杂合子小鼠(+/-)心脏中Rbm24的敲除效率 |
| 3.4 Rbm24敲除小鼠的生存率统计 |
| 3.5 敲除小鼠骨骼肌中Rbm24的表达无变化 |
| 3.6 敲除Rbm24导致心脏发生扩张型心肌病 |
| 3.7 Rbm24敲除小鼠心脏呈现高度纤维化 |
| 3.8 Rbm24调控的选择性剪接事件的功能性分析 |
| 3.9 敲除Rbm24导致心脏疾病相关基因异常剪接 |
| 3.10 敲除Rbm24引起心脏肌节结构紊乱 |
| 3.11 Rbm24调控Titin的选择性剪接 |
| 3.12 Rbm24是Titin选择性剪接发生的直接调控因子 |
| 3.13 讨论与展望 |
| 第四章 Stk38介导Rbm24蛋白稳定性进而调控心肌肌节组装的研究 |
| 4.1 Stk38影响Rbm24蛋白稳定性 |
| 4.2 Stk38影响Rbm24的蛋白功能 |
| 4.3 Stk38表达异常影响心肌细胞肌节的组装 |
| 4.4 Stk38通过Rbm24调控肌节组装 |
| 4.5 过表达Rbm24补偿shStk38调控的肌节紊乱 |
| 4.6 Rbm24是磷酸化蛋白 |
| 4.7 Stk38调控Rbm24蛋白磷酸化 |
| 4.8 磷酸化修饰提高Rbm24蛋白稳定性 |
| 4.9 讨论与展望 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 科研成果 |
| 致谢 |
（8）复杂疾病中选择性剪接对转录调控介导作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题的研究背景和意义 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究的目的与意义 |
| 1.2 课题相关背景知识介绍 |
| 1.2.1 基因表达 |
| 1.2.2 选择性剪接 |
| 1.2.3 高通量测序 |
| 1.3 国内外研究现状 |
| 1.3.1 选择性剪接机制的研究现状 |
| 1.3.2 选择性剪接生物信息学研究现状 |
| 1.3.3 选择性剪接与人类复杂疾病相关性研究现状 |
| 1.3.4 基因调控网络方法研究现状 |
| 1.4 论文主要研究内容与组织结构 |
| 1.4.1 主要研究内容和写作安排 |
| 1.4.2 论文组织结构 |
| 第2章 基于广义线性回归算法分析选择性剪接调控作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 选择性剪接事件数据分析与处理方法 |
| 2.2.1 应用MISO (Mixture of Isoforms)识别选择性剪接事件 |
| 2.2.2 UCSC Genome Browser数据库 |
| 2.2.3 选择性剪接事件数据分析与模型设计 |
| 2.3 选择性剪接介导调节的转录调控网络 |
| 2.3.1 介导调控关系的介绍 |
| 2.3.2 选择性剪接介导调控模型的构建 |
| 2.3.3 数据分析流程 |
| 2.4 数据的处理与获取 |
| 2.4.1 TCGA-KIRC RNA-seq数据的获取与处理 |
| 2.4.2 实验证实的转录因子-靶基因关系的获取 |
| 2.4.3 TCGA-KIRC组成型选择性剪接谱的计算 |
| 2.4.4 预测选择性剪接介导的转录调控关系 |
| 2.4.5 数据库及相关软件 |
| 2.5 结果分析 |
| 2.5.1 全局范围上分析转录活性与选择性剪接的相关性 |
| 2.5.2 GR转录因子活性受夺冠蛋白的选择性剪接的影响 |
| 2.5.3 MDM2的选择性剪接介导GR转录活性 |
| 2.5.4 TP53的选择性剪接介导GR转录活性 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 本章小结 |
| 第3章 基于逻辑回归方法研究选择性剪接的调控作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 方法及原理 |
| 3.2.1 逻辑回归原理 |
| 3.2.2 逻辑回归的主要用途 |
| 3.2.3 模型的构建 |
| 3.2.4 数据的离散化 |
| 3.2.5 显着性调控关系的选择性 |
| 3.2.6 调控功能分类 |
| 3.3 数据的获取与处理 |
| 3.3.1 数据来源及背景 |
| 3.3.2 数据处理流程 |
| 3.3.3 数据处理及分析 |
| 3.3.4 数据库及相关软件的使用 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 全局分析三元调控关系 |
| 3.4.2 基于模型识别影响ELK1转录活性的选择性剪接事件 |
| 3.4.3 APP与ELK1转录活性相关性分析 |
| 3.4.4 STK16与ELK1转录活性相关性分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 乳腺癌中选择性剪接介导MYC转录调控过程 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 数据的处理与分析 |
| 4.3 结果分析与讨论 |
| 4.3.1 影响MYC转录活性的选择性剪接事件的识别 |
| 4.3.2 选择性剪接产物功能及通路分析 |
| 4.4 FN1选择性剪接介导MYC转录活性机理 |
| 4.4.1 FN1选择性剪接与MYC转录活性相关性分析 |
| 4.4.2 FN1选择性剪接的基因功能分析 |
| 4.4.3 FN1选择性剪接的氨基酸序列分析 |
| 4.4.4 FN1选择性剪接的蛋白结构分析 |
| 4.5 MEN1选择性剪接与MYC转录活性相关性分析 |
| 4.5.1 MEN1选择性剪接与MYC转录活性相关性分析 |
| 4.5.2 MEN1选择性剪接的基因功能分析 |
| 4.5.3 MEN1选择性剪接的氨基酸序列分析 |
| 4.5.4 MEN1选择性剪接的蛋白结构分析 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 转录辅调节因子依赖的SRSF1对MRNA选择性剪接的调控作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.1.1 SR蛋白家族研究背景 |
| 5.1.2 SRSF1的研究背景 |
| 5.1.3 实验数据来源 |
| 5.2 数据处理与分析 |
| 5.2.1 文库构建及测序 |
| 5.2.2 RNA-seq数据样本的获取 |
| 5.2.3 RNA-seq数据预处理 |
| 5.2.4 读段映射 |
| 5.2.5 基因表达定量分析 |
| 5.2.6 选择性剪接表达分析 |
| 5.2.7 SRSF1靶基因数据的获取 |
| 5.3 SRSF1调控网络的构建 |
| 5.3.1 调控关系的构建及分析流程 |
| 5.3.2 数据筛选标准 |
| 5.4 结果分析与讨论 |
| 5.4.1 SRSF1三元调控关系的识别与分类 |
| 5.4.2 调控网络及其功能特征分析 |
| 5.5 LNcRNA介导影响SRSF1的剪接调控活性 |
| 5.5.1 SNHG7-SRSF1介导影响RNA的剪接模式 |
| 5.5.2 SNHG7介导影响SRSF1剪接调控的分析 |
| 5.5.3 MALAT1-SRSF1介导影响RNA的剪接模式 |
| 5.5.4 MALAT1介导影响SRSF1剪接调控的分析 |
| 5.6 编码蛋白基因介导影响SRSF1的剪接调控活性 |
| 5.6.1 VASN介导影响RNA的剪接模式 |
| 5.6.2 VASN介导影响SRSF1剪接调控的分析 |
| 5.7 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文和取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）肿瘤型PIAS3异构体的选择性剪接机制和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1.1 mRNA选择性剪接是肿瘤发生发展的重要分子事件 |
| 1.1.1 选择性剪接的基本过程和分类 |
| 1.1.2 选择性剪接的调控 |
| 1.1.3 选择性剪接是调控肿瘤发生发展的重要分子事件 |
| 1.2 PIAS蛋白家族参与多种转录信号调控 |
| 1.2.1 PIAS蛋白家族经典结构 |
| 1.2.2 PIAS蛋白家族参与转录调控 |
| 1.3 PIAS3 作为STAT3 的抑制蛋白发挥肿瘤抑制作用 |
| 1.3.1 PIAS3 结构和剪接异构体研究 |
| 1.3.2 PIAS3 亚细胞内定位 |
| 1.3.3 PIAS3与STAT3 信号通路 |
| 1.3.4 PIAS3 与雄激素受体等甾体类激素受体信号通路 |
| 1.3.5 PIAS3 能够参与多种其他肿瘤关联的信号调节 |
| 1.3.6 PIAS3 表达调控与肿瘤关联研究进展 |
| 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 大肠杆菌菌株 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 抗体 |
| 2.1.5 试剂 |
| 2.1.6 裸鼠 |
| 2.1.7 组织样本 |
| 2.1.8 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学方法 |
| 2.2.2 分子生物学实验方法 |
| 2.2.3 细胞生物学实验方法 |
| 实验结果与分析 |
| 第一部分 人类肿瘤细胞表达一种缺失87-121 位氨基酸的短型PIAS3 异构体 |
| 3.1. 肿瘤细胞表达一种较短的PIAS3 蛋白型式 |
| 3.2 肿瘤细胞中较短的PIAS3 蛋白型式,是PIAS3 选择性剪接异构体 |
| 第二部分 AR和 STAT3 作为新型的RNA结合蛋白调控PIAS3 的选择性剪接 |
| 3.2.1 AR是长型PIAS3L表达的必要因素 |
| 3.2.2 STAT3 参与短型PIAS3S表达的调节 |
| 3.2.3 STAT3 作为新型RBP结合PIAS3 pre-mRNA,AR拮抗此作用 |
| 3.2.4 STAT3 蛋白能够招募U2AF35,启动PIAS3 mRNA的剪接 |
| 第三部分 PIAS3 剪接异构体对AR信号和STAT3 信号通路的反馈调控研究 |
| 3.3.1 PIAS3 剪接异构体对AR信号通路的调控 |
| 3.3.2 PIAS3 剪接异构体对STAT3 信号通路的调控 |
| 第四部分 不同PIAS3 剪接异构体对肿瘤细胞增殖与肿瘤发生的影响 |
| 第五部分 长型PIAS3L的表达水平与临床前列腺癌的恶性度与生存率密切相关 |
| 讨论 |
| 4.1 在肿瘤中,PIAS3 发生选择性剪接的重要意义 |
| 4.2 在肿瘤中,PIAS3 发生选择性剪接的调控是一种新的调控机制 |
| 4.3 PIAS3 剪接和STAT3 信号通路的相互调节作用 |
| 4.4 PIAS3 剪接和AR信号通路的相互调节作用 |
| 4.5 PIAS3LΔ段是PIAS3 发挥抑癌作用的核心区域 |
| 主要结论 |
| 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 英文缩写词 |
| 致谢 |
| 在校期间公开发表论文和专利 |
（10）SMG9剪接异构体的鉴定及其功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 真核生物mRNA的稳定性与质量监控机制 |
| 2 无义介导的mRNA降解及其研究进展 |
| 2.1 NMD的作用因子 |
| 2.2 NMD过程中PTC的识别 |
| 2.3 NMD相关疾病及最新研究成果 |
| 3 mRNA的选择性剪接 |
| 3.1 前体mRNA的加工修饰 |
| 3.2 mRNA选择性剪接分子机制 |
| 3.3 选择性剪接与NMD的协作 |
| 4 SMG9研究进展 |
| 4.1 SMG9的发现与结构特点 |
| 4.2 SMG9生物学功能 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二章 材料方法 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 实验样品 |
| 1.1.1 细胞样品 |
| 1.1.2 菌株与载体 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂及药品 |
| 1.3.1 实验室常用试剂(盒) |
| 1.3.2 细胞培养试验试剂 |
| 1.3.3 Western bolt主要试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.4.1 转化所用溶液的配制 |
| 1.4.2 细胞培养所用试剂 |
| 1.4.3 WB试验所用试剂 |
| 1.5 主要应用到的生物信息学网站和分析软件 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 SMG9剪接异构体的鉴定 |
| 2.1.1 HEK-293T/Hela细胞的复苏与培养 |
| 2.1.2 细胞总RNA的提取及质量检测 |
| 2.1.3 cDNA的制备 |
| 2.1.4 cDNA的检测 |
| 2.1.5 SMG9基因片段的扩增 |
| 2.1.5.1 SMG9全长引物设计 |
| 2.1.5.2 高保真酶扩增SMG9片段 |
| 2.1.5.3 SMG9剪接异构体的克隆鉴定 |
| 2.2 SMG9剪接异构体的表达分析 |
| 2.2.1 SMG9a、SMG9b的定量引物设计 |
| 2.2.2 Q-PCR分析SMG9b的表达验证 |
| 2.2.3 WB检测SMG9b的表达验证 |
| 2.2.3.1 真核表达载体的构建 |
| 2.2.3.2 细胞的转染 |
| 2.2.3.3 细胞总蛋白的提取及浓度测定 |
| 2.2.3.4 Western blot具体步骤 |
| 2.2.4 SMG9b荧光蛋白的检测 |
| 2.2.4.1 SMG9b-EGFP真核表达载体的构建 |
| 2.2.4.2 细胞的转染 |
| 2.2.4.3 荧光显微镜下观察荧光 |
| 2.3 SMG9a、SMG9b的相互影响 |
| 2.3.1 超表达SMG9a、SMG9b的相互影响 |
| 2.3.2 干扰SMG9a,检测对SMG9b的影响 |
| 2.3.3 miR-4651对SMG9a、SMG9b的调控 |
| 2.3.3.1 miR-4651的预测 |
| 2.3.3.2 双荧光素酶报告试验 |
| 2.3.3.3 Q-PCR检测miRNA对SMG9a、SMG9b表达的影响 |
| 2.3.3.4 WB检测miRNA对SMG9a、SMG9b表达的影响 |
| 2.4 SMG9b对NMD的影响 |
| 2.4.1 超表达SMG9a、SMG9b对NMD底物的影响 |
| 2.4.1.1 细胞转染 |
| 2.4.1.2 Q-PCR检测底物基因的mRNA变化 |
| 2.4.1.3 WB检测底物基因的蛋白水平变化 |
| 2.4.2 干扰SMG9a,超表达SMG9b对NMD底物的影响 |
| 2.4.2.1 细胞转染 |
| 2.4.2.2 Q-PCR检测底物基因的mRNA变化 |
| 2.4.2.3 WB检测底物基因的蛋白水平变化 |
| 2.5 干扰UPF1对SMG9b的影响 |
| 2.5.1 干扰片段的设计 |
| 2.5.2 细胞转染 |
| 2.5.3 Q-PCR检测底物基因的mRNA变化 |
| 2.5.4 WB检测底物基因的蛋白水平变化 |
| 第三章 结果分析 |
| 1 SMG9剪接异构体的鉴定 |
| 1.1 总RNA的提取和质量控制 |
| 1.2 cDNA的合成和质量检测 |
| 1.3 SMG9全长基因的扩增及新剪接异构体的鉴定 |
| 2 SMG9b的表达分析 |
| 2.1 SMG9b在转录水平的表达情况 |
| 2.2 SMG9b在蛋白水平的表达情况 |
| 2.2.1 SMG9b-HA表达载体的构建 |
| 2.2.2 Q-PCR检测超表达效果 |
| 2.2.3 Western Blot检测目的蛋白的表达 |
| 2.2.4 SMG9b荧光蛋白的检测 |
| 3 SMG9a、SMG9b表达的相互影响 |
| 3.1 超表达试验对SMG9a、SMG9b表达的影响 |
| 3.2 干扰SMG9a对SMG9b的表达量的影响 |
| 4 miR-4651对SMG9a、SMG9b表达的影响 |
| 4.1 双荧光素酶报告基因的检测结果 |
| 4.2 Q-PCR检测miR-4651对SMG9a、、SMG9b表达的影响 |
| 4.3 Western Blot检测miR-4651对SMG9表达的影响 |
| 5 SMG9b对NMD的影响 |
| 5.1 超表达SMG9b对NMD底物基因的调节 |
| 5.2 干扰SMG9a、超表达SMG9b对NMD底物基因的调节 |
| 6 NMD调节SMG9b的表达 |
| 第四章 讨论 |
| 1 SMG9剪接异构体的鉴定与表达分析 |
| 2 SMG9a、SMG9b表达的相互影响 |
| 3 SMG9b与NMD的关系 |
| 第五章 小结 |
| 1 本研究的主要结果 |
| 2 本研究的创新之处 |
| 3 本研究的不足及下一步试验计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、mRNA选择性剪接的分子机制（论文参考文献）
- [1]功能基因PURA、RUVBL2和CASP8调控消化肿瘤进展的作用机制研究[D]. 高佳佳. 北京协和医学院, 2021
- [2]RNA加工因子CPSF6的表达纯化及PQBP1在剪接体组装过程中的作用研究[D]. 窦琳霞. 东南大学, 2020
- [3]PQBP1参与剪接因子入核转运及mRNA选择性多聚腺苷酸化的机制研究[D]. 刘娴. 东南大学, 2020
- [4]剪接因子SRSF9在肺癌中表达及促进肺癌细胞增殖、侵袭能力研究[D]. 李梦仙. 昆明医科大学, 2020(02)
- [5]Rbm14在小鼠早期胚胎发育过程中的功能研究[D]. 李静. 中国科学技术大学, 2019(01)
- [6]第一部分 LKB1在结直肠癌中的功能研究第二部分 剪接异构体CHK1-S在肝癌中的作用及其临床意义[D]. 胡光辉. 北京协和医学院, 2019
- [7]Rbm24调控心脏肌节组装及与心肌病关系的研究[D]. 孔旭. 厦门大学, 2018(06)
- [8]复杂疾病中选择性剪接对转录调控介导作用的研究[D]. 王洋. 哈尔滨工程大学, 2018(04)
- [9]肿瘤型PIAS3异构体的选择性剪接机制和功能研究[D]. 姜春娃. 东北师范大学, 2017(05)
- [10]SMG9剪接异构体的鉴定及其功能的初步研究[D]. 马振伐. 华中农业大学, 2016(05)