一、微乳液凝胶固定化脂肪酶立体选择性研究（论文文献综述）
张黎明[1]（2020）在《固定化脂肪酶催化性能强化及其在维生素E琥珀酸酯转化中的应用研究》文中进行了进一步梳理维生素E琥珀酸酯是目前研究较为成熟的维生素E衍生物,其化学稳定性及许多功效较维生素E均有所改善,不但能弥补维生素E应用方面的不足,同时还能拓宽维生素E的应用领域。目前,在欧美和日本等发达国家,维生素E琥珀酸酯普遍应用在健康食品中,由于其较好的水溶性和稳定性,在绝大多数营养补充剂中（片剂和硬质胶囊形式）添加使用的维生素E均为维生素E琥珀酸酯。同时,用于食品、医药行业的维生素E琥珀酸酯主要是通过酶法催化合成的,本文以课题组之前研究筛选优化过的皱褶假丝酵母脂肪酶（Candida rugosa Lipase,CRL）为研究对象,通过化学修饰和固定化两种方法对酶学性质进行改善,获得高稳定性、高活性的固定化脂肪酶。将其应用到酶法催化合成维生素E琥珀酸酯中,并优化反应条件,以提高产率,从而降低生产成本。主要内容如下:（1）构建了一种基于金属有机骨架化合物（MOFs）ZIF-8前体分子修饰的新型固定化脂肪酶。首先,采用含有ZIF-8前体分子的2-甲基咪唑-4-羧酸对CRL进行化学修饰,修饰度为16.3%,修饰后的CRL催化活性较游离酶提高1.3倍。采用圆二色谱对修饰后的CRL进行表征,结果显示修饰后的CRL二级结构发生了改变,其α-螺旋含量增加到18.9%。将修饰后的CRL进一步用于原位合成固定化的CRL复合材料（mCRL-ZIF-8）。固定后,通过共价键固定的mCRL与通过物理包埋固定的CRL保持相似的活性。对其酶学性质进行研究,结果表明其存储稳定性、有机溶剂的耐受性及可重复使用性均得到改善。（2）制备了一种基于功能性离子液体修饰的新型脂肪酶纳米凝胶。首先,采用离子液体对CRL进行化学修饰,修饰度为19.5%,修饰后CRL的催化活性是游离CRL的1.2倍。圆二色谱结果表明,CRL分子发生了变化,CRL的α-螺旋含量增加到19.6%。修饰后的CRL进一步用于制备脂肪酶纳米凝胶,获得具有优异稳定性的CRL纳米凝胶。其pH和热稳定性,储存稳定性以及对有机溶剂的耐受性均得到了改善。CRL纳米凝胶在乙酸乙酯中的有机溶剂稳定性仍然保留了82.6%的催化活性,而游离CRL仅保留了14.8%。储存7周后,游离CRL仅保留了约17.53%的催化活性,但CRL纳米凝胶的活性几乎不受影响,剩余活性为97.26%。（3）优化了一种新的酶催化合成维生素E琥珀酸酯的方法。CRL纳米凝胶展现出了较高的产率,反应介质为最低Log P值的二甲亚砜（DMSO）时具有最高的产率。对其工艺条件（底物摩尔比、酶浓度、反应温度和反应时间）进行了优化,最优工艺条件为:底物摩尔比1:4,酶浓度6 mg/mL,反应温度55℃,反应时间15 h。在此条件下,产率达到了62.58%。
赵炯烽[2]（2019）在《高sn-1,3特异性脂肪酶ROL的制备、改造及应用》文中进行了进一步梳理甘油二酯是甘油上的两个羟基与两分子的脂肪酸酯化得到的产物,包括1,2-甘油二酯和1,3-甘油二酯两种形式。其中,富含1,3-甘油二酯的油脂具有防止肥胖、降血脂、降血压等多种生理功能,因而被认为是“特定健康用食品”。同时,1,3-甘油二酯又是合成一些化合物（如结构脂1,3-二油酰基-2-棕榈酰甘油酯等）的重要原料。由于天然油脂中1,3-甘油二酯的含量很低,所以其催化合成的研究显得尤为重要。在生物催化制备1,3-甘油二酯的研究中,往往由于酶的选择性、酶活力、反应程度和分离纯化等方面存在一定的缺陷,导致产品中1,3-甘油二酯的含量较低,这严重影响了产品的广泛应用。酰基迁移现象普遍存在于甘油二酯的制备和储存中。本论文首先研究了 1,3-甘油二酯在不同温度下的酰基迁移情况,初步确定酶法制备1,3-甘油二酯的温度为30℃。在此温度下,研究了不同脂肪酶的区域选择性,获得在催化油酸与甘油的酯化反应中具有最高的1,3-区域选择性的脂肪酶ROL（Rhizopus oryzaelipase）,其对1,3-甘油二酯的选择性>97%。为强化脂肪酶ROL在油酸与甘油的酯化反应体系中的催化性能和重复利用性能,设计并制备了粒径为15-20 nm的磁性纳米Fe3O4。通过硅烷偶联剂APTES和戊二醛的修饰,获得了表面带有醛基的磁性颗粒,并用于脂肪酶ROL的固定化。借助于表面活性剂蔗糖酯SE-11的界面激活效应,固定化脂肪酶的活力得到了大幅度的提高。在以p-NPB和p-NPP为底物时,其水解活性分别为游离酶的9.16倍和31.6倍。在此基础上,在1L的连续搅拌反应器中对纳米四氧化三铁固定化ROL催化的油酸与甘油的酯化反应进行了优化。当反应温度为30℃,反应体系真空度保持在500Pa以内,搅拌速度控制在400rpm,油酸与甘油的摩尔比为2.8:1,固定化酶的加入量为8‰（w/w）时,反应8h后产物中甘油单酯的含量小于3%（w/w）,1,3-二油酸甘油酯的含量在76%（w/w）左右。固定化酶重复利用55批后剩余约75%的活力。经过NaOH或者Na2CO3的皂化反应,除去过量的油酸,获得了纯度大于95%（w/w）的1,3-甘油二酯,产品回收率达到85%（w/w）。为了简化脂肪酶ROL的获取和改造过程,在毕赤酵母GS115中实现了其异源表达。考察了前导肽对其表达量和选择性的影响,发现带有前导肽基因的重组子在诱导96h时,发酵液中的酶活力达到了 311 U/ml,约为不带前导肽基因的重组子的2倍,且前者的1,3-区域选择性优于后者,Re%分别为>97%和92%。由于脂肪酶ROL的热稳定性较差,为拓宽其应用范围,对其进行了热稳定性改造。基于多序列比对结果,获得了两株热稳定性明显提高的突变体,分别为V209L和D262G（在55℃下的半衰期分别是原始酶的4.38和4.2倍）。其中209位的突变导致酶分子内氢键键长的减小,而262位引入甘氨酸,减轻了构象应变并消除了不利的空间相互作用,从而增强了蛋白质的热稳定性。借助在线设计网站DbD2的帮助,在ROL中引入了新的二硫键（E190C/E238C）,得到的突变体在60和65℃下的半衰期达到了原始酶的72.4和8.33倍。通过组合突变,获得四点突变体V209L/D262G/E190C/E238C,其在65℃下的半衰期达到了原始酶的20倍。同时,四点突变体对底物p-NPB的水解活力保持了与原始酶相当的水平。在成功实现酶的热稳定性改造后,通过增加其在毕赤酵母中的基因拷贝数,提高了其表达水平,3个拷贝的转化子在诱导96h后,酶活达到了 386U/ml,比单拷贝转化子高约25%。用纳米四氧化三铁对重组脂肪酶进行固定化,固定化酶的水解活力回收达到519.8%。该固定化酶在催化多种不同脂肪酸与甘油的酯化反应中,均表现出了优异的性能。进一步,我们尝试通过分子动力学模拟对脂肪酶ROL的选择性作合理的解释。通过分子动力学计算,发现脂肪酶ROL与两种甘油二酯形成酶-底物复合物时,其催化三联体中145Ser上的羟基氧原子与1,3-二油酸甘油酯的sn-1位羰基碳原子之间的距离约为3-3.5A左右,而与1,2-二油酸甘油酯的sn-1位羧基碳原子之间的距离超过5A,与2位羰基碳原子之间的距离达到了 8A;当1-油酸甘油酯与酶形成的复合物经过分子动力学模拟,其羰基碳原子与催化三联体的145Ser上的羟基氧原子之间的距离降至3A左右,小于2-油酸甘油酯的羰基碳原子与145Ser上羟基氧原子之间的距离。该理论较好地解释了脂肪酶ROL具有sn-1,3位区域选择性。
李斌,王晶,裘立群,宋少芳[3]（2014）在《十六烷基三甲基溴化铵/聚乙二醇辛基苯基醚微乳液凝胶固定化脂肪酶催化水解消旋布洛芬辛酯》文中研究指明初步考察了水溶液中影响十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）/聚乙二醇辛基苯基醚（TX-100）微乳液凝胶（MBG）固定化脂肪酶催化水解消旋布洛芬辛酯的主要因素。结果表明,CTAB/TX-100 MBG固定化脂肪酶在水溶液中能顺利催化水解S-构型布洛芬辛酯生成S-构型布洛芬。随TX-100在EM（正丁醇与TX-100的混合物）中含量的增加,反应转化率（X）逐渐增大,而产物中S-构型布洛芬的对映体过量值（eei）有少许的降低;随凝胶含水量的增加,X及eei均呈钟罩形变化,二者最大值时对应的凝胶水含量为27.3%,且磷酸缓冲溶液对二者的影响要比溶解明胶的水大;X在反应初期（16 h内）增加明显,随反应时间的继续延长增加缓慢,24 h后趋于平衡,而eei随反应时间的延长呈逐渐降低的趋势;随固定化脂肪酶重复使用次数的增多,X在前3次中降幅不大,后几次中降幅逐渐增大,eei则呈逐渐稍微降低的趋势,重复使用10次后,二者分别降低了36.55%和0.52%。
郭丽涛,乐长高[4]（2012）在《离子液体中的酶催化反应》文中研究指明离子液体作为酶催化反应的介质正越来越多的受到关注,因为与传统有机溶剂和水相比,酶在离子液体中表现出了更好的活性、热稳定性、立体选择性、对映体选择性和可循环性。本文综述了近几年来脂肪酶、氧化还原酶、蛋白酶在离子液体中的催化反应。
宋少芳,王晶,时伟杰[5]（2011）在《CTAB/TX-100微乳液凝胶固定化脂肪酶的催化水解活性》文中研究表明以α-单硬脂酸甘油酯的水解反应为指示反应,初步研究了CTAB/TX-100微乳液凝胶（MBG）固定化脂肪酶的催化水解活性及其主要影响因素。结果表明,在水溶液中,CTAB/TX-100 MBG固定化脂肪酶能顺利地催化α-单硬脂酸甘油酯的水解反应,且反应后凝胶块仍能保持较好的机械强度。其催化水解活性在反应初期增加明显,随反应时间的延长增加缓慢,24h后不再变化;随TX-100在EM（正丁醇与TX-100的混合物,作为助表面活性剂用）中含量的增加逐渐升高;随凝胶中磷酸缓冲溶液含量的增加呈钟罩形变化,最大活性对应其含量为8.0%;几乎不受凝胶中溶解明胶的水含量的影响;前4次重复使用中变化不明显,后几次重复使用中降幅明显增大;重复使用9次后,共降低了32.5%。因此,CTAB/TX-100 MBG作为脂肪酶固定化载体可用于水溶液中的生物合成与生物转化反应,扩大了微乳液凝胶固定化脂肪酶的应用范围。
王晶,宋少芳,路福绥[6]（2011）在《十六烷基三甲基溴化铵/山梨醇酐硬脂酸酯微乳液凝胶固定化脂肪酶的催化活性及立体选择性》文中提出制备了能在水溶液中长时间稳定存在的十六烷基三甲基溴化铵/山梨醇酐硬脂酸酯（CTAB/Span-60）微乳液凝胶（MBG）,确定了Span-60在乳化剂EM（正丁醇与Span-60的混合物）中的质量分数范围;分别以正己酸与正己醇的酯化反应、α-单硬脂酸甘油酯的水解反应、消旋布洛芬与正辛醇的不对称酯化反应为指示反应,研究了CTAB/Span-60 MBG固定化脂肪酶的催化活性及立体选择性。结果表明,Span-60在EM中的质量分数小于57%时可形成机械强度较好的CTAB/Span-60 MBG;其固定化脂肪酶在有机溶剂中的酯化活性随EM中Span-60含量的增加先是逐渐增大,35%时最大,后又逐渐小幅度降低,在所考察的Span-60含量范围内均比在CTAB MBG中高;在水溶液中固定化脂肪酶能顺利催化α-单硬脂酸甘油酯的水解反应,24 h后反应转化率不再随反应时间的延长而增加,其水解活性在重复使用9次后仅降低13.68%,表明CTAB/Span-60MBG固定化脂肪酶能够顺利进行分离并重复使用;此体系的脂肪酶也选择性地催化生成S-构型布洛芬辛酯,产物对映体过量值（eee）随反应的进行缓缓下降,但降幅不大,即其立体选择性要比在CTAB MBG中高。因此,CTAB/Span-60 MBG作为脂肪酶固定化载体既可用于有机溶剂中又可用于水溶液中的生物合成与生物转化反应,扩大了微乳液凝胶固定化脂肪酶的应用范围。
颜超[7]（2011）在《油菜籽做酶源及离子液在拆分中的研究和氰醇Suzuki反应初步探索》文中研究表明植物果实中含有大量的酶,因此利用植物果实做酶源,探索其在不对称合成方面的应用具有一定的优势。本文利用油菜籽做酶源,对其在酯化、水解、去对称化,这三个方向上的手性拆分进行了一定研究。首先,利用一些已有的酮通过LiAlH4还原得到相应的醇类底物,格氏试剂与醛反应得到一系列含手性碳的醇,然后利用乙酸酐和醋酸乙烯酯等做酯化试剂检测油菜籽酶在酯化反应中的拆分效果；把上述所得到的醇利用在DMAP做催化剂、乙酸酐做酯化试剂的条件下合成相应的消旋酯化产物,此消旋产物在Na2HPO4/NaH2PO4做缓冲液、去离子水做溶剂的条件下检测油菜籽酶在水解反应中的拆分效果；利用丙二酸二乙酯和卤代烃之间的反应合成了一系列对称性酯化底物,通过对这些底物在油菜籽粕做酶源的条件下进行去对称化拆分反应的探索,并把反应条件进行了一定的优化处理；对称性酯化产物通过LiAlH4还原合成对称性醇,这些对称性醇通过在油菜籽酶中选择性酯化达到手性拆分的目的。我们发现油菜籽酶对一些常见的含手性碳的醇类酯化上面基本无效果；对一些常见的酯类水解效果甚微,但是对于那些对称性的双酯类选择性水解有一定的效果,由于产率较低,经过一定的条件优化,在温度20℃、pH值为6.0（Na2HPO4/NaH2PO4做缓冲液）下可以达到产率10%；但是油菜籽酶在对去称化上面有特别好的效果,特别是在对对称性双羟基选择性去对称化上面有很好的效果,最高产率可以达到10%,并且基本无杂质点和对两羟基同时保护的情况。随着催化剂绿色回收的概念,和离子液体在手性拆分的不断发现,我们决定把离子液体引入已有的脂肪酶拆分体系中去；在经过对各种类型的底物,条件的尝试下,发现在离子液存在下脂肪酶PS-30、P-30、APF-12,对氰醇类、a-CF3类底物,无催化效果。之后我们尝试找到一种能对氰醇羟基保护之后让其更加稳定的保护基,以期能适应Suzuki反应的各种条件；最终我们找到当氰醇使用THP在0℃以下使用对甲苯磺酸做催化剂的情况下,可以得到一种顺反异构体,它比一般的乙酰基对氰醇保护要稳定,在常温下基本不会发生分解的情况,弱碱和水相体系中也不会发生分解,但是当温度达到50℃以上会出现分解,其中对溴苯甲醛做底物时产率可以达到34%,之后我们在对其进行Suzuki偶联反应时仅生成的为联苯而未得到想要的产物。我们觉得可以采用更加稳定的苯丙氰醇类底物来做这个保护基,这样可以使得底物会更加稳定,这是本反应取得成功的关键。
吴伟军[8]（2010）在《酶法拆分2-芳基丙酸类药物的研究》文中认为布洛芬（Ibuprofen,2 （4异丁基苯基）丙酸）俗称芬必得,是一种重要的2芳基丙酸类非甾体抗炎药物,其消炎、镇痛、解热作用显着,不良反应较小。研究表明（S）布洛芬的药理活性为（R）布洛芬的100倍,且（R）布洛芬可能有毒副作用。为了提高药效,降低药物的毒副作用,减少并发症及正确评价药物,消旋布洛芬的立体拆分就显得尤为重要,并已成为当前研究的一个热点。目前,文献报道的生物法拆分2芳基丙酸类药物的途径主要是用酶或微生物进行立体选择性水解（酯、酰胺和腈）、酯化等。酶催化的有机反应具有条件温和、无环境污染、速率快、选择性高等优点。虽然非水相酶催化反应的后处理方便,但传统的有机溶剂限制了酶的活性和稳定性。人们一直试图解决酶的固定化和在有机溶剂中失活的问题。近年来,用表面活性剂包衣酶催化有机介质中的反应成为酶工程领域的新技术。而用离子液体代替传统的有机溶剂作为酶催化反应的介质,也受到人们越来越多的关注。本论文中采用了来源于Candida cylindrucea的脂肪酶,并对该脂肪酶催化布洛芬酯立体选择性水解反应体系进行了研究。首先,考察了在水饱和离子液体中游离酶催化的水解反应。结果表明,在[BMIM][BF4]离子液体中,最佳的反应条件为:pH 7.5,40℃,体系酶的含量为30 mg/ml时,反应体系的ee值和转化率达到最大值。同时,探索研究了微乳液凝胶固定化脂肪酶对水解反应的影响,在相同的实验条件下,与游离的脂肪酶相比酶的活性和立体选择性得到了提高。其次,制备合成了包衣用的谷氨酸二烷基酯并对脂肪酶进行包衣,考察了表面活性剂包衣脂肪酶在N,N二甲基甲酰胺和磷酸缓冲溶液组成的单相共溶体系中催化布洛芬酯选择性水解反应,对反应的各影响因素进行了评价,并确定了包衣脂肪酶催化的最佳反应条件:20%（v/v）DMF,pH 7.5,40 oC。同时,对表面活性剂包衣脂肪酶和无修饰天然酶的催化动力学参数进行了研究,结果表明脂肪酶经过包衣后在有机溶剂和缓冲液混溶体系中与游离酶相比具有更高的催化活性和的立体选择性。
杨根生[9]（2009）在《催化抗体制备及其用于选择性水解和不对称还原反应的研究》文中进行了进一步梳理催化抗体,也称抗体酶,是一类具有催化活性的免疫球蛋白。它兼具抗体的高度选择性和酶的高效催化性。催化抗体的研究和开发预示着生物催化剂可以通过人工设计与制备,由此开辟了一个崭新的模拟酶的研究方向,也成为生物催化和生物催化剂的一个新的研究领域,无论是在理论探索还是实践应用方面都具有极其广阔的前景,尤其在医学、生物学、制药学等学科中将产生重要的影响。催化抗体是多学科研究的交汇点,涉及了化学、生物学、生物技术、有机生物和药物研究等领域。催化抗体的优化设计和制备以及催化抗体的酶学性质和反应规律等是在发展催化抗体技术中的几个关键问题,需要深入探究。本文的主要目的就是要运用分子设计和制备手段来制得特定的催化抗体,为制备手性药物和手性药物中间体服务,重点考虑在非水介质中的应用研究。本文完成的主要工作如下:催化布洛芬甲酯选择性水解的催化抗体设计和制备。通过对布洛芬甲酯水解的机理分析,根据过渡态理论设计和合成了四面体含磷和含硫半抗原作为半抗原,并与牛血清蛋白（BSA）偶联制备成免疫源,经免疫和克隆成功筛选出具有催化加速选择性水解生成S-布洛芬的特异性催化抗体,其kcat/kuncat达到了1.6×104。通过对所筛选的催化抗体的酶学性质和反应性的考察,得到了催化抗体的最适pH和温度范围,分别为7.0～8.0和30～40℃。在对其热稳定性的考察中发现,催化抗体对热很敏感,超过55℃其催化活性基本消失。通过对催化抗体催化布洛芬甲酯的选择性反应动力学分析,建立了动力学方程。结果显示,尽管催化抗体与酶在形成的中间态不一样,但催化反应同样符合Michaelis-Menten的动力学规律,并拟合得到了动力学参数Km为28.31μmol·l-1,kcat为1.01 s-1。W/O型微乳液体系中催化抗体催化布洛芬甲酯选择性水解:探索了催化抗体在W/O型微乳液体系中的酶学性质,结果表明,催化抗体在W/O型微乳中保持着催化能力。影响催化抗体催化的反应初速度的最佳wo（体系中水和琥珀酸二辛酯磺酸钠（AOT）的摩尔比）为21,较适合的pH和温度为8.0和30～40℃。在分析了水不溶性的底物在微乳胶束体系内的物质分配和表面活性剂影响的基础上,对催化抗体作为催化剂在W/O型微乳液介质中的反应的动力学进行了探索研究,从理论上得到了在胶束体系中Vmax和kcatapp不变,而（?）较水相反应的Km有所增加。实验结果较好地验证了这个结论。在本研究的微乳体系中,表面活性剂对催化抗体的活性抑制为竞争性抑制,其Ki为1.5×10-3mol·l-1。共溶剂体系中催化抗体的催化消旋布洛芬甲酯的选择性水解反应:首次把由催化抗体催化消旋布洛芬甲酯的选择性水解反应用到共溶剂体系中。基于产物的转化率和对映选择性,考察了9种与水共溶的溶剂,建立了以N,N-二甲基甲酰胺为添加的共溶剂,加量为6%（v/v）和缓冲液组成的共溶剂体系。利用建立的共溶剂体系中溶剂疏水作用和底物及产物的良好分散作用,促进了反应的进程,在保持良好的对映选择性（ee>99%）基础上,有效地提高了转化率,使之达到了41.7%。通过考察催化抗体在共溶剂体系中动力学参数,说明了单相共溶剂体系对催化抗体的催化转化率的提高有着积极的作用。脂包衣的催化抗体在单相共溶剂体系中催化布洛芬甲酯的选择性水解:以催化活性为指标,得到了N,N-二甲基甲酰胺20%（v/v）和磷酸缓冲溶液组成的单相共溶剂反应体系。考察了用脂包衣催化抗体和脂包衣脂肪酶催化选择性水解布洛芬甲酯的实验。得到了最佳反应温度和pH值的范围分别是脂包衣催化抗体反应条件35～40℃和7.5～8.5,脂包衣脂肪酶的最适反应条件为:pH值为7.5,温度为40℃。在最适的反应条件下,用脂包衣的脂肪酶催化选择性水解拆分得到了S-布洛芬的最大转化率可达46.3%,对映选择率达241。脂包衣催化抗体的最大转化率可达44.5%,对映选择率>500。同时考察了脂包衣催化抗体和脂包衣脂肪酶的催化选择性水解的动力学,结果符合米氏动力学方程。其中Vmax为0.56mmol·min-1·g-1,Kcat为5.7min-1,比在水相和6%DMF加量的单相共溶剂体系催化水平明显有所提高。在脂包衣脂肪酶（250 mg/ml）,DMF 20%（v/v）,40℃,pH=7.5条件下,脂包衣脂肪酶催化布洛芬甲酯的选择性水解符合米氏方程。结果表明,脂包衣脂肪酶的Km只有没有包衣的天然酶的Km的一半,Vmax是未包衣的酶的1.4倍左右。脂包衣催化抗体在单相共溶剂体系中和在缓冲液中的失活动力学符合一级失活动力学模型,其失活反应方程为:（?）,在缓冲液中的失活反应方程为:（?）。催化抗体催化3-氯苯丙酮还原制备3-氯-苯丙醇:在分析了3-氯-苯丙酮不对称还原反应机理的基础上,根据半抗原设计的诱导和转换设计的原理,设计和合成了N-氧化物作为反应过渡态类似物作为半抗原,免疫并克隆化后筛选分离得到了一株能立体选择性催化3-氯-苯丙酮还原生成（S）-3-氯-苯丙醇的单克隆抗体。催化反应得到的ee值和转化率分别为96.2%和83.2%。通过对催化抗体催化3-氯-苯丙酮的不对称还原动力学过程的研究,得到其过程符合有序序列BiBi机制,经多步回归和计算得到了其速度方程:动力学方程与实验值较为符合。总之,本文围绕着催化选择性水解和不对称羰基还原的反应规律设计和制备了特异性催化抗体,考察了催化抗体在水介质和一些非水介质中的催化的酶学性质和反应性,并探索了各自的催化机理和动力学性质,实现了从催化抗体的设计与制备到反应性能考察的完整过程,为今后进一步深入研究催化抗体及其相关催化反应和作用机理奠定了一定的基础。
张爱军[10]（2008）在《荧光假单胞菌脂肪酶的克隆表达、酶学性质及其在手性拆分中的应用研究》文中提出假单胞菌脂肪酶在催化酯水解、酯合成和酯交换反应中常常表现出很高的选择性,因此广泛应用于制药和农药等许多领域中。多年来的研究表明,假单胞菌脂肪酶基因在E. coli中的表达大多以没有活性的包涵体形式存在,这极大地限制了经济而高效的E. coli表达系统在其表达上的应用。本论文中我们采用PCR的方法,从可降解有机溶剂的Pseudomonas fluorescens JCM5963菌株中成功克隆了一个新的脂肪酶基因PFL296,并以有活性的聚集体的形式在E. coli中实现了高水平的表达。通过对重组酶性质表征发现,PFL296编码的酶蛋白PFL的分子量是32 426 kD,最适温度为55℃,最适pH值为8.8,具有较好的低温水解能力和高温活性,具有较宽范围的pH稳定性以及碱性作用条件,因此具有作为洗涤剂用酶的应用潜力。重组PFL的另一个重要性质是在多种水溶性有机溶剂的存在下得到激活并保持稳定,对一些水不溶性的有机溶剂也具有一定的耐受性,这些特点使其具有很好的应用于有机合成的潜力。在此基础上,本文对重组PFL在立体选择性拆分（R, S）-2-[（2-甲基-6-乙基）苯基氨基]丙酸（（R, S）-NEMPA）和（R, S）-2-辛醇中的应用进行了研究。结果表明,重组酶的粗酶聚集体和全细胞酶制剂形式都分别表现出了较好的实际应用价值。
二、微乳液凝胶固定化脂肪酶立体选择性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、微乳液凝胶固定化脂肪酶立体选择性研究（论文提纲范文）
（1）固定化脂肪酶催化性能强化及其在维生素E琥珀酸酯转化中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脂肪酶 |
| 1.1.1 脂肪酶概述 |
| 1.1.2 脂肪酶催化机理 |
| 1.1.3 脂肪酶的应用及其存在的问题 |
| 1.2 固定化脂肪酶 |
| 1.2.1 固定化脂肪酶的制备方法 |
| 1.2.2 固定化脂肪酶的载体 |
| 1.3 纳米材料固定化脂肪酶 |
| 1.3.1 纳米多孔材料-金属有机骨架化合物MOFs |
| 1.3.2 有机聚合物纳米材料 |
| 1.3.3 纳米结构酶催化剂的制备方法 |
| 1.4 维生素E琥珀酸酯 |
| 1.4.1 维生素E琥珀酸酯的理化性质、用途 |
| 1.4.2 维生素E琥珀酸酯的制备方法 |
| 1.5 本课题研究的主要目的、意义和主要内容 |
| 1.5.1 本课题研究的主要目的和意义 |
| 1.5.2 本课题研究的主要内容 |
| 第二章 金属有机骨架共轭脂肪酶的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.1 主要实验试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 化学修饰CRL |
| 2.3.2 BCA法测定蛋白质浓度 |
| 2.3.3 修饰度测定 |
| 2.3.4 酶活测定 |
| 2.3.5 制备固定化酶 |
| 2.3.6 动力学测试 |
| 2.3.7 稳定性测试 |
| 2.3.8 固定化酶表征 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 修饰酶的酶活及圆二色谱 |
| 2.4.2 固定化酶的表征结果 |
| 2.4.3 动力学参数 |
| 2.4.4 固定酶的稳定性 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 功能性离子液体改性脂肪酶纳米凝胶的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验试剂和仪器 |
| 3.2.1 主要实验试剂 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 1-乙烯基-3-乙酸基咪唑溴盐合成 |
| 3.3.2 化学修饰CRL |
| 3.3.3 蛋白浓度测定-BCA法 |
| 3.3.4 修饰度测定 |
| 3.3.5 酶活测定 |
| 3.3.6 原位合成脂肪酶纳米凝胶 |
| 3.3.7 脂肪酶纳米凝胶稳定性 |
| 3.3.8 固定化酶的表征 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 优化CRL修饰条件 |
| 3.4.2 修饰脂肪酶和脂肪酶纳米凝胶的表征结果 |
| 3.4.3 动力学参数 |
| 3.4.4 游离酶和脂肪酶纳米凝胶的稳定性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 固定化脂肪酶催化合成维生素E琥珀酸酯 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验试剂和仪器 |
| 4.2.1 主要实验试剂 |
| 4.2.2 主要实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 分析方法 |
| 4.3.2 维生素E和维生素E琥珀酸酯的标准曲线 |
| 4.3.4 底物摩尔比对产率的影响 |
| 4.3.5 酶浓度对产率的影响 |
| 4.3.6 温度对产率的影响 |
| 4.3.7 反应时间对产率的影响 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 不同固定化酶对产率的影响 |
| 4.4.2 反应介质对产率的影响 |
| 4.4.3 底物摩尔比对产率的影响 |
| 4.4.4 酶浓度对产率的影响 |
| 4.4.5 温度对产率的影响 |
| 4.4.6 反应时间对产率的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 主要研究结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位阶段发表的论文 |
（2）高sn-1,3特异性脂肪酶ROL的制备、改造及应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 甘油二酯的概述 |
| 1.1.1 甘油二酯的结构 |
| 1.1.2 甘油二酯的营养价值及应用 |
| 1.1.3 1,3-甘油二酯的制备方法 |
| 1.1.3.1 甘油解法制备1,3-甘油二酯 |
| 1.1.3.2 水解法制备1,3-甘油二酯 |
| 1.1.3.3 酯交换法制备1,3-甘油二酯 |
| 1.1.3.4 酯化法制备1,3-甘油二酯 |
| 1.1.4 甘油二酯的酰基迁移 |
| 1.2 脂肪酶的概述 |
| 1.2.1 脂肪酶概述 |
| 1.2.2 脂肪酶的结构特征和催化机理 |
| 1.2.3 脂肪酶的选择性 |
| 1.2.3.1 脂肪酸或酰基供体的选择性 |
| 1.2.3.2 区域或位置选择性 |
| 1.2.3.3 立体选择性 |
| 1.2.4 脂肪酶的界面激活效应 |
| 1.3 脂肪酶的固定化 |
| 1.3.1 吸附法 |
| 1.3.2 包埋法 |
| 1.3.3 共价交联法 |
| 1.3.4 偶联法 |
| 1.3.5 纳米材料在脂肪酶的固定化中的应用 |
| 1.4 脂肪酶的异源表达 |
| 1.5 酶的热稳定性改造 |
| 1.5.1 基于非理性设计的热稳定性改造 |
| 1.5.2 基于半理性设计的热稳定性改造 |
| 1.5.3 基于理性设计的热稳定性改造 |
| 1.5.3.1 基于二硫键的理性设计 |
| 1.5.3.2 基于同源比对的策略 |
| 1.5.3.3 基于温度因子的热稳定性改造 |
| 1.5.3.4 基于氨基酸残基极性的理性设计 |
| 1.5.3.5 酶的热稳定性改造的常用软件 |
| 1.5.4 分子动力学的应用 |
| 1.6 本课题的研究思路与主要内容 |
| 1.6.1 研究思路 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第二章 高选择性脂肪酶的筛选及其固定化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 分析方法 |
| 2.2.2.1 薄层层析法 |
| 2.2.2.2 高效液相色谱法 |
| 2.2.2.3 脂肪酶蛋白含量的测定 |
| 2.2.3 高区域选择性脂肪酶的筛选 |
| 2.2.3.1 1,3-甘油二酯酰基迁移的研究 |
| 2.2.3.2 脂肪酶的筛选 |
| 2.2.4 脂肪酶的固定化 |
| 2.2.4.1 纳米四氧化三铁的制备 |
| 2.2.4.2 纳米四氧化三铁的表面修饰 |
| 2.2.4.3 纳米四氧化三铁的表征 |
| 2.2.4.4 脂肪酶的固定化 |
| 2.2.4.5 脂肪酶活力的测定 |
| 2.2.5 固定化脂肪酶的酶学性质研究 |
| 2.2.5.1 pH对脂肪酶活力的影响 |
| 2.2.5.2 游离酶和固定化酶的底物特异性 |
| 2.2.5.3 游离酶和固定化酶的热稳定性 |
| 2.2.5.4 游离酶和固定化酶的动力学性质研究 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 不同温度下1,3-甘油二酯的酰基迁移 |
| 2.3.2 脂肪酶的筛选 |
| 2.3.3 脂肪酶ROL催化的油酸甘油的酯化反应 |
| 2.3.4 四氧化三铁载体的制备与表征 |
| 2.3.4.1 场发射透射电子显微镜(TEM)分析 |
| 2.3.4.2 傅利叶红外光谱(FT-IR)分析 |
| 2.3.4.3 X射线多晶衍射仪分析(XRD)分析 |
| 2.3.4.4 磁学性质分析 |
| 2.3.5 脂肪酶ROL的固定化 |
| 2.3.5.1 表面活性剂等添加剂对固定化的影响 |
| 2.3.5.2 pH对固定化的影响 |
| 2.3.5.3 蛋白质浓度对固定化的影响 |
| 2.3.5.4 蔗糖酯添加量对固定化的影响 |
| 2.3.5.5 固定化时间对固定化的影响 |
| 2.3.6 固定化酶和游离酶的性质比较 |
| 2.3.6.1 pH对游离酶和固定化酶比活力的影响 |
| 2.3.6.2 固定化酶和游离酶的底物特异性比较 |
| 2.3.6.3 固定化酶和游离酶的热稳定性比较 |
| 2.3.6.4 固定化酶和游离酶的水解动力学研究 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 固定化脂肪酶催化制备高纯度1,3-二油酸甘油酯 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 反应装置的设计 |
| 3.2.3 固定化脂肪酶催化制备1,3-二油酸甘油酯的单因素优化 |
| 3.2.4 固定化酶的重复利用 |
| 3.2.5 反应产物的分离纯化 |
| 3.2.5.1 甲醇结晶法 |
| 3.2.5.2 乙醇结晶法 |
| 3.2.5.3 碱中和法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 Fe_3O_4固定化酶制备高纯度1,3-二油酸甘油酯 |
| 3.3.1.1 不同摩尔比的油酸甘油对酯化反应的影响 |
| 3.3.1.2 温度对酯化反应的影响 |
| 3.3.1.3 固定化酶的添加量对酯化反应的影响 |
| 3.3.1.4 除水方式对酯化反应的影响 |
| 3.3.1.5 反应体系真空度对酯化反应的影响 |
| 3.3.1.6 搅拌速度对反应的影响 |
| 3.3.1.7 游离酶和固定化酶酯化效果的比较 |
| 3.3.2 游离酶和固定化酶的重复利用性能 |
| 3.3.3 酯化产物的分离纯化 |
| 3.3.3.1 结晶法 |
| 3.3.3.2 碱中和法 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 脂肪酶ROL在毕赤酵母中的异源表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 质粒和菌种 |
| 4.2.2 试剂和试剂盒 |
| 4.2.3 试剂的配制 |
| 4.2.4 培养基的配制 |
| 4.2.5 实验方法 |
| 4.2.5.1 基因的获取和密码子优化 |
| 4.2.5.2 重组质粒的构建和大肠杆菌的转化 |
| 4.2.5.3 线性化质粒的准备 |
| 4.2.5.4 毕赤酵母感受态的制备 |
| 4.2.5.5 毕赤酵母的电转化及筛选 |
| 4.2.5.6 毕赤酵母重组子的验证 |
| 4.2.5.7 重组毕赤酵母的诱导表达 |
| 4.2.5.8 毕赤酵母发酵液的酶活力测定 |
| 4.2.5.9 SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 4.2.5.10 重组脂肪酶的区域选择性测定 |
| 4.2.5.11 重组脂肪酶的性质研究 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 密码子的优化结果 |
| 4.3.2 重组质粒的构建 |
| 4.3.3 毕赤酵母的电转化结果 |
| 4.3.4 脂肪酶ROL的异源表达结果 |
| 4.3.5 重组脂肪酶ROL催化的区域选择性 |
| 4.3.6 脂肪酶ProROL的性质研究 |
| 4.3.6.1 脂肪酶ProROL的最适反应pH |
| 4.3.6.2 脂肪酶ProROL的最适反应温度 |
| 4.3.6.3 脂肪酶ProROL的热稳定性 |
| 4.3.6.4 脂肪酶ProROL的溶剂耐受性 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 脂肪酶ROL的热稳定性改造及表达强化 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 质粒和菌种 |
| 5.2.2 试剂和试剂盒 |
| 5.2.3 试剂的配制 |
| 5.2.4 培养基的配制 |
| 5.2.5 实验方法 |
| 5.2.5.1 多序列比对 |
| 5.2.5.2 二硫键的设计 |
| 5.2.5.3 突变方法 |
| 5.2.5.4 重组大肠杆菌的构建 |
| 5.2.5.5 重组毕赤酵母的构建及高拷贝重组子的筛选 |
| 5.2.5.6 脂肪酶ROL的诱导表达 |
| 5.2.5.7 酶的热稳定性等性质的测定 |
| 5.2.5.8 突变体的同源建模 |
| 5.2.5.9 脂肪酶ROL及其突变体的分子动力学(MD)模拟 |
| 5.2.5.10 热稳定性强化的突变体的应用初探 |
| 5.3 结果和讨论 |
| 5.3.1 多序列比对结果 |
| 5.3.2 基于同源建模的理论分析 |
| 5.3.3 二硫键的理性设计 |
| 5.3.4 ProROL和E190C/E238C在分子水平上的构象变化 |
| 5.3.5 通过热点和二硫键的组合突变提高热稳定性 |
| 5.3.6 四点组合突变体热稳定性提高的机理解释 |
| 5.3.7 四点突变体的酶学性质 |
| 5.3.7.1 最适pH |
| 5.3.7.2 最适反应温度 |
| 5.3.7.3 溶剂耐受性 |
| 5.3.7.4 动力学常数 |
| 5.3.8 四点突变体高拷贝转化子的筛选和诱导表达 |
| 5.3.8.1 高拷贝转化子的筛选 |
| 5.3.8.2 不同拷贝数的转化子的诱导表达 |
| 5.3.9 四点突变体的固定化和应用初探 |
| 5.3.9.1 四点突变体(V209L/D262G/E190C/E238C)的固定化 |
| 5.3.9.2 四点突变体及其固定化酶的应用 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 脂肪酶ROL的区域选择性机制 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 口袋打开的脂肪酶结构的同源建模 |
| 6.2.2 蛋白和配体文件的准备 |
| 6.2.3 蛋白质-配体的分子对接 |
| 6.2.4 蛋白质-配体的分子动力学(MD)模拟 |
| 6.2.5 分子动力学计算结果的分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 脂肪酶ROL的同源建模 |
| 6.3.2 脂肪酶ROL的区域选择性机理解释 |
| 6.3.2.1 脂肪酶ROL与甘油二酯的分子对接 |
| 6.3.2.2 酶与甘油二酯复合物的分子动力学模拟结果 |
| 6.3.2.3 脂肪酶ROL与甘油单酯的对接 |
| 6.3.2.4 酶与甘油单酯复合物的分子动力学模拟结果 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 根据毕赤酵母密码子偏好性做优化的脂肪酶ROL的基因序列 |
| 附录Ⅱ 脂肪酶ROL完整的氨基酸序列 |
| 附录Ⅲ 本论文所用的仪器设备列表 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
（3）十六烷基三甲基溴化铵/聚乙二醇辛基苯基醚微乳液凝胶固定化脂肪酶催化水解消旋布洛芬辛酯（论文提纲范文）
| 1 实验部分 |
| 1.1 试剂和仪器 |
| 1.2 微乳液凝胶及其固定化脂肪酶的制备 |
| 1.3 消旋布洛芬辛酯的水解反应 |
| 1.4 反应产物的测定及反应转化率和产物对映体过量值的计算 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 TX-100含量的影响 |
| 2.2 微乳液凝胶含水量的影响 |
| 2.3 反应时间的确定 |
| 2.4 MBG固定化脂肪酶重复使用次数的影响 |
| 3 结论 |
（4）离子液体中的酶催化反应（论文提纲范文）
| 1 离子液体中的酶催化反应 |
| 1.1 脂肪酶 |
| 1.2 氧化还原酶 |
| 1.3 蛋白酶 |
| 2 结语 |
（5）CTAB/TX-100微乳液凝胶固定化脂肪酶的催化水解活性（论文提纲范文）
| 1 实验部分 |
| 1.1 试剂和仪器 |
| 1.2 MBG及其固定化脂肪酶的制备 |
| 1.3 酶催化水解反应 |
| 1.4 反应产物的测定及酶催化水解活性的表示 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 反应时间的影响 |
| 2.2 EM中TX-100含量的影响 |
| 2.3 MBG中含水量的影响 |
| 2.4 重复使用的影响 |
| 3 结论 |
（6）十六烷基三甲基溴化铵/山梨醇酐硬脂酸酯微乳液凝胶固定化脂肪酶的催化活性及立体选择性（论文提纲范文）
| 1 实验部分 |
| 1.1 试剂和仪器 |
| 1.2 MBG及其固定化脂肪酶的制备 |
| 1.3 酶催化反应 |
| 1.4 反应转化率的测定 |
| 1.5 对映体过量值的测定 |
| 1.6 酶催化活性及立体选择性表示 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 CTAB/Span-60 MBG的物理特性 |
| 2.2 酯化活性 |
| 2.3 酯水解活性 |
| 2.4 立体选择性 |
| 3 结论 |
（7）油菜籽做酶源及离子液在拆分中的研究和氰醇Suzuki反应初步探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 手性及其研究意义 |
| 1.2 拆分方法的研究进展 |
| 1.3 酶催化拆分体系的研究进展 |
| 1.4 酶立体选择性调控的研究进展 |
| 第二章 油菜籽做酶源在化学反应中的探索 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 酶源的选定 |
| 2.3 酶源的制作 |
| 2.4 探索酶活性方法的选择 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 离子液在氰醇拆分上的研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 在离子液中拆分氰醇的研究 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 Suzuki偶联反应合成芳基氰醇类化合物 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 Suzuki偶联反应合成芳基氰醇类化合物 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 全文总结及展望 |
| 实验部分 |
| 新化合数据一览表 |
| 已知化合物一览表 |
| 参考文献 |
| 化合物术语缩写一览 |
| 攻读硕士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（8）酶法拆分2-芳基丙酸类药物的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 脂肪酶的研究进展 |
| 1.2.1 脂肪酶概述 |
| 1.2.2 脂肪酶的催化机制 |
| 1.2.3 脂肪酶的修饰 |
| 1.2.4 脂肪酶的应用 |
| 1.3 离子液体的研究进展 |
| 1.3.1 离子液体概述 |
| 1.3.2 离子液体的发展 |
| 1.3.3 离子液体的特点 |
| 1.3.4 离子液体的合成方法 |
| 1.3.5 脂肪酶在离子液体中的应用 |
| 1.4 2 芳基丙酸类手性药物的拆分研究进展 |
| 1.4.1 2 芳基丙酸类手性药物概述 |
| 1.4.2 手性药物的制备方法 |
| 1.4.3 2 芳基丙酸类药物的制备方法 |
| 1.5 本论文的研究思路及基本内容 |
| 第二章 原料的制备 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 离子液体的制备 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 制备方法 |
| 2.2.4 结果与分析 |
| 2.3 (R,S) 布洛芬甲酯的制备 |
| 2.3.1 材料与试剂 |
| 2.3.2 实验仪器 |
| 2.3.3 制备方法 |
| 2.3.4 结果与分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 离子液体中脂肪酶催化拆分布洛芬酯 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 布洛芬甲酯的酶法选择性水解 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 缓冲溶液中脂肪酶选择性水解布洛芬甲酯 |
| 3.2.4 离子液体中脂肪酶选择性水解布洛芬甲酯 |
| 3.2.5 离子液体中固定化脂肪酶选择性水解布洛芬甲酯 |
| 3.3 实验结果分析方法 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 不同离子液体介质对酶催化布洛芬甲酯选择性水解的影响 |
| 3.4.2 温度对酶催化布洛芬甲酯选择性水解的影响 |
| 3.4.3 缓冲液pH 值对酶催化布洛芬甲酯选择性水解的影响 |
| 3.4.4 不同酶量对酶催化布洛芬甲酯选择性水解的影响 |
| 3.4.5 探索研究微乳液凝胶固定化脂肪酶对布洛芬甲酯选择性水解的影响 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 包衣脂肪酶催化拆分布洛芬酯 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 包衣的制备 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 包衣的制备 |
| 4.2.4 结果与分析 |
| 4.3 包衣脂肪酶的制备 |
| 4.3.1 材料与试剂 |
| 4.3.2 实验仪器 |
| 4.3.3 制备方法 |
| 4.3.4 结果与分析 |
| 4.4 包衣脂肪酶选择性水解布洛芬甲酯 |
| 4.4.1 材料与试剂 |
| 4.4.2 实验仪器 |
| 4.4.3 水-有机溶剂单相体系中包衣脂肪酶选择性水解布洛芬甲酯.. |
| 4.5 实验结果分析方法 |
| 4.6 结果与分析 |
| 4.6.1 不同有机溶剂对包衣脂肪酶催化布洛芬甲酯选择性水解的影响 |
| 4.6.2 溶剂含量对包衣脂肪酶催化布洛芬甲酯选择性水解的影响 |
| 4.6.3 温度对包衣脂肪酶催化布洛芬甲酯选择性水解的影响 |
| 4.6.4 缓冲液pH 值对包衣脂肪酶催化布洛芬甲酯选择性水解的影响 |
| 4.6.5 包衣脂肪酶催化布洛芬甲酯选择性水解的时间进程 |
| 4.6.6 包衣脂肪酶催化布洛芬甲酯选择性水解的动力学参数分析 |
| 4.7 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表的论文情况 |
（9）催化抗体制备及其用于选择性水解和不对称还原反应的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 手性药物及其制备研究概况 |
| 1.1.1 手性药物的地位和意义 |
| 1.1.2 手性药物的制备方法概要 |
| 1.2 布洛芬的手性制备 |
| 1.2.1 布洛芬药物的特性 |
| 1.2.2 S-(+)-布洛芬的制备方法 |
| 1.3 生物法催化羰基不对称还原的制备手性醇研究 |
| 1.3.1 纯酶催化潜手性酮还原 |
| 1.3.2 微生物催化潜手性酮还原 |
| 1.4 催化抗体的研究进展 |
| 1.4.1 半抗原的设计方法 |
| 1.4.2 提高催化抗体的活性的方法研究进展 |
| 1.4.3 催化抗体催化立体选择性水解和还原的研究进展 |
| 1.5 催化抗体应用的价值与存在的问题及本文的研究思路 |
| 1.5.1 催化抗体应用的价值 |
| 1.5.2 催化抗体应用存在问题及分析 |
| 1.5.3 本文的研究内容与研究思路 |
| 第二章 半抗原的设计、合成及底物制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.3 半抗原的设计 |
| 2.3.1 半抗原的设计思路 |
| 2.3.2 半抗原的结构分析 |
| 2.4 半抗原和抑制剂的合成 |
| 2.4.1 含磷半抗原HP1的合成 |
| 2.4.2 半抗原HP2的合成 |
| 2.4.3 半抗原HS1的合成 |
| 2.4.4 半抗原HS2的合成 |
| 2.5 抑制剂的合成 |
| 2.5.1 含磷抗原的抑制剂的合成 |
| 2.5.2 含硫抗原的抑制剂的合成 |
| 2.6 底物布洛芬甲酯的合成 |
| 2.7 小结 |
| 第三章 活性催化抗体的制备 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 免疫抗原的制备 |
| 3.3.2 偶联抗原的鉴定 |
| 3.3.3 动物免疫 |
| 3.3.4 细胞融合 |
| 3.3.5 杂交瘤细胞的筛选及克隆化 |
| 3.3.6 腹水的制备与抗体的纯化 |
| 3.3.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 |
| 3.3.8 抗体浓度的确定 |
| 3.3.9 水解动力学的测定 |
| 3.3.10 分析测定方法 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 目标抗原的制备 |
| 3.4.2 催化抗体的筛选 |
| 3.4.3 单克隆抗体的筛选 |
| 3.4.4 杂交瘤细胞的建立和单克隆抗体的纯化 |
| 3.4.5 单克隆抗体的类型和亚类鉴定 |
| 3.4.6 催化抗体的水解动力学 |
| 3.4.7 半抗原结构对免疫产生抗体催化水解能力的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 催化抗体的酶学和催化性能 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和仪器 |
| 4.2.1 主要实验材料 |
| 4.2.2 主要实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 稳定性实验 |
| 4.3.2 选择性水解实验方法 |
| 4.3.3 底物和产物的分析测定方法 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 温度的影响 |
| 4.4.2 pH的影响 |
| 4.4.3 底物浓度的影响 |
| 4.4.4 搅拌速度的影响 |
| 4.4.5 选择性水解动力学 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 微乳体系中催化抗体的酶学特性 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 主要实验材料 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 水相中催化抗体催化布洛芬甲酯选择性水解 |
| 5.3.2 W/O微乳液中催化抗体催化布洛芬甲酯选择性水解 |
| 5.3.3 动力学参数的确定 |
| 5.3.4 分析检测方法 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 W/O微乳液中催化抗体催化布洛芬甲酯选择性水解的影响因素 |
| 5.4.2 W/O微乳中催化抗体催化水解的动力学 |
| 5.4.3 W/O微乳液中AOT浓度对水解活性的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 单相共溶体系催化抗体催化选择性水解 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与仪器 |
| 6.2.1 主要材料 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 水相中催化抗体催化布洛芬甲酯水解 |
| 6.3.2 单相共溶体系中催化抗体催化布洛芬甲酯水解 |
| 6.3.3 分析方法 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 共溶剂对催化抗体催化布洛芬甲酯水解的影响 |
| 6.4.2 温度对催化抗体活性的影响 |
| 6.4.3 缓冲溶液的pH和离子强度对催化抗体活性的影响 |
| 6.4.4 转速对催化抗体活性的影响 |
| 6.4.5 催化抗体催化拆分布洛芬甲酯的时间进程 |
| 6.4.6 动力学参数求解和分析 |
| 6.4.7 脂肪酶和催化抗体催化拆分布洛芬酯的比较 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 脂包衣催化抗体催化布洛芬酯选择性水解 |
| 7.1 引 言 |
| 7.2 材料与试剂 |
| 7.2.1 材料与仪器 |
| 7.2.2 主要实验仪器 |
| 7.3 试验方法 |
| 7.3.1 包衣用的脂的合成 |
| 7.3.2 脂包衣催化抗体和脂包衣脂肪酶的制备 |
| 7.3.3 蛋白含量的测定 |
| 7.3.4 脂包衣催化抗体和脂包衣脂肪酶催化布洛芬选择性水解 |
| 7.3.5 分析测试 |
| 7.4 结果与讨论 |
| 7.4.1 有机溶剂对脂包衣催化抗体和脂包衣脂肪酶催化水解的影响 |
| 7.4.2 温度和缓冲液中的pH值的影响 |
| 7.4.3 脂包衣催化抗体和脂包衣脂肪酶催化水解布洛芬甲酯的时间进程 |
| 7.4.4 选择性水解动力学 |
| 7.4.5 失活动力学 |
| 7.5 本章小结 |
| 第八章 催化抗体催化3-氯-苯丙酮不对称还原 |
| 8.1 引 言 |
| 8.2 材料与仪器 |
| 8.2.1 实验材料 |
| 8.2.2 实验仪器 |
| 8.3 实验方法 |
| 8.3.1 催化抗体催化3-氯-1-苯丙酮还原 |
| 8.3.2 S.cerevisiae CGMCC 2266细胞催化3-氯-1-苯丙酮还原 |
| 8.3.3 分析方法 |
| 8.4 实验结果与讨论 |
| 8.4.1 半抗原设计与合成及抗原的合成 |
| 8.4.2 免疫与催化抗体的制备 |
| 8.4.3 催化抗体催化还原 |
| 8.4.4 催化抗体催化还原反应的机理和动力学 |
| 8.4.5 S.cerevisiae CGMCC 2266催化3-氯-苯丙酮还原生成(S)-3-氯-苯丙醇 |
| 8.4.6 两种方法的比较 |
| 8.5 本章小结 |
| 第九章 结论与建议 |
| 9.1 结论 |
| 9.2 建议 |
| 参考文献 |
| 附录1:主要缩写和符号注释表 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
（10）荧光假单胞菌脂肪酶的克隆表达、酶学性质及其在手性拆分中的应用研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 脂肪酶的研究进展 |
| 1.1.1 脂肪酶简介 |
| 1.1.2 脂肪酶的结构特征 |
| 1.1.3 脂肪酶的催化机制 |
| 1.1.4 脂肪酶的分类 |
| 1.2 假单胞菌脂肪酶的研究进展 |
| 1.2.1 假单胞菌简介 |
| 1.2.2 假单胞菌脂肪酶的分泌机制研究 |
| 1.2.3 假单胞菌脂肪酶基因的克隆及表达 |
| 1.2.4 假单胞菌脂肪酶的生化性质 |
| 1.2.5 有机溶剂稳定性 |
| 1.3 脂肪酶聚集行为分析 |
| 1.3.1 脂肪酶聚集的普遍性 |
| 1.3.2 脂肪酶聚集的原因 |
| 1.3.3 脂肪酶聚集体性质的变化 |
| 1.4 全细胞生物催化剂的制备和应用 |
| 1.4.1 全细胞生物催化剂的特点 |
| 1.4.2 提高细胞膜通透性 |
| 1.4.3 全细胞生物催化剂的应用 |
| 1.5 脂肪酶催化手性拆分 |
| 1.5.1 手性普遍性和重要性 |
| 1.5.2 手性化合物的拆分策略 |
| 1.5.3 脂肪酶催化的动力学拆分基础 |
| 1.5.4 提高脂肪酶催化立体选择性的方法 |
| 1.6 本课题的科学意义、设计思路和创新点 |
| 1.7 参考文献 |
| 第二章 假单胞荧光菌脂肪酶基因的克隆 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 数据库中假单胞脂肪酶的分类 |
| 2.3.2 脂肪酶简并引物的设计 |
| 2.3.3 Pseudomonas. fluorescens JCM 5963 的培养 |
| 2.3.4 Pseudomonas. fluorescens JCM 5963 基因组的提取 |
| 2.3.5 脂肪酶基因的PCR扩增 |
| 2.3.6 重组质粒的构建 |
| 2.3.7 重组质粒的转化和及鉴定 |
| 2.3.8 重组质粒的序列测定 |
| 2.4 小结 |
| 2.5 参考文献 |
| 第三章 蛋白质序列分析和结构预测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 生物信息学工具和网络资源 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 序列同源性分析 |
| 3.2.2.2 同源模建 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 蛋白序列的motif搜索 |
| 3.3.2 蛋白序列的一级结构分析 |
| 3.3.3 蛋白序列的二级结构预测 |
| 3.3.4 序列同源性分析及进化关系 |
| 3.3.5 同源模建 |
| 3.4 小结 |
| 3.5 参考文献 |
| 第四章 重组 PFL 的优化表达 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 表达工程菌的筛选和鉴定 |
| 4.3.2 表达载体及宿主菌株的优化 |
| 4.3.3 IPTG诱导条件的优化 |
| 4.3.4 工程菌诱导表达曲线的绘制 |
| 4.3.5 培养基的优化 |
| 4.4 小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 第五章 PFL的分离纯化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 目的蛋白的表达与纯化 |
| 5.3.1.1 酶在粗提液中的聚集现象 |
| 5.3.1.2 粗酶液的制备 |
| 5.3.1.3 Ni-NTA亲和层析纯化 |
| 5.3.2 非变性电泳和活力染色 |
| 5.3.3 凝胶过滤层析测蛋白分子量 |
| 5.4 小结 |
| 5.5 参考文献 |
| 第六章 重组PFL的基本酶学性质 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 温度对酶活的影响 |
| 6.3.2 pH对酶活的影响 |
| 6.3.3 底物对酶的影响 |
| 6.3.4 动力学常数测定 |
| 6.3.5 金属离子对酶的影响 |
| 6.3.6 胆酸钠盐对酶活的影响 |
| 6.3.7 有机溶剂对酶的影响 |
| 6.4 小结 |
| 6.5 参考文献 |
| 第七章 重组PFL催化拆分(R, S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料和方法 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验方法 |
| 7.2.2.1 重组PFL全细胞酶制剂的制备 |
| 7.2.2.2 重组PFL粗酶聚集体制剂和纯酶制剂的制备 |
| 7.2.2.3 酶催化(R, S)-NEMPA-ME的酯水解反应 |
| 7.2.2.4 毛细管柱的准备 |
| 7.2.2.5 NEMPA 转化率（C）的检测 |
| 7.2.2.6 NEMPA对映体过量值（eep）的检测 |
| 7.2.2.7 立体选择性比率（E）的计算 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 不同酶制剂形式的比较 |
| 7.3.2 酶加入量对催化拆分反应的影响 |
| 7.3.3 温度对催化拆分反应的影响 |
| 7.3.4 pH对催化拆分反应的影响 |
| 7.3.5 有机溶剂对酶活性和立体选择性的影响 |
| 7.3.6 CEA-rPFL的重复使用 |
| 7.4 小结 |
| 7.5 参考文献 |
| 第八章 重组PFL催化拆分手性2-辛醇的研究 |
| 8.1 引言 |
| 8.2 材料和方法 |
| 8.2.1 实验材料 |
| 8.2.2 实验方法 |
| 8.2.2.1 酶催化(R, S)-2-辛醇的酯交换反应 |
| 8.2.2.2 底物转化率的测定 |
| 8.2.2 3 2-辛醇的光学纯度(ees)的测定 |
| 8.2.2.4 立体选择性比率(E)的测定 |
| 8.3 结果与讨论 |
| 8.3.1 酶的活性比较和加入量的确定 |
| 8.3.2 重组PFL酶制剂的催化活性和立体选择性比较 |
| 8.3.3 WC-rPFL催化拆分应反应条件的优化 |
| 8.3.3.1 底物摩尔比 |
| 8.3.3.2 温度的影响 |
| 8.3.3.3 水活度的影响 |
| 8.3.3.4 有机溶剂的影响 |
| 8.3.4 WC-rPFL催化拆分(R, S)2-辛醇反应进程 |
| 8.3.5 WC-rPFL的重复使用 |
| 8.4 小结 |
| 8.5 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
四、微乳液凝胶固定化脂肪酶立体选择性研究（论文参考文献）
- [1]固定化脂肪酶催化性能强化及其在维生素E琥珀酸酯转化中的应用研究[D]. 张黎明. 江苏大学, 2020(02)
- [2]高sn-1,3特异性脂肪酶ROL的制备、改造及应用[D]. 赵炯烽. 浙江大学, 2019(03)
- [3]十六烷基三甲基溴化铵/聚乙二醇辛基苯基醚微乳液凝胶固定化脂肪酶催化水解消旋布洛芬辛酯[J]. 李斌,王晶,裘立群,宋少芳. 应用化学, 2014(09)
- [4]离子液体中的酶催化反应[J]. 郭丽涛,乐长高. 化学通报, 2012(05)
- [5]CTAB/TX-100微乳液凝胶固定化脂肪酶的催化水解活性[J]. 宋少芳,王晶,时伟杰. 化学通报, 2011(10)
- [6]十六烷基三甲基溴化铵/山梨醇酐硬脂酸酯微乳液凝胶固定化脂肪酶的催化活性及立体选择性[J]. 王晶,宋少芳,路福绥. 应用化学, 2011(04)
- [7]油菜籽做酶源及离子液在拆分中的研究和氰醇Suzuki反应初步探索[D]. 颜超. 东华大学, 2011(07)
- [8]酶法拆分2-芳基丙酸类药物的研究[D]. 吴伟军. 浙江工业大学, 2010(08)
- [9]催化抗体制备及其用于选择性水解和不对称还原反应的研究[D]. 杨根生. 浙江大学, 2009(12)
- [10]荧光假单胞菌脂肪酶的克隆表达、酶学性质及其在手性拆分中的应用研究[D]. 张爱军. 吉林大学, 2008(07)