一、心脏动脉极的形成（论文文献综述）
崔金慧[1]（2021）在《大动脉转位候选基因DYNC2LI1的发现与功能学研究》文中指出目的通过遗传学分析及功能学研究发现新的大动脉转位候选基因。研究纤毛基因DYNC2LI1与大动脉转位发生的相关性,探讨该基因在心脏发育和流出道重塑过程中的关键作用。方法对381名散发大动脉转位患者进行全外显子组测序,与gnomAD数据库125748个个体构成病例-对照队列,利用基因负荷分析筛选候选基因。针对患者中发现的有害突变,进行突变功能分析:构建体外表达质粒并进行细胞转染,采用实时荧光定量PCR及Western blot检测不同Dync2li1突变体mRNA及蛋白质的表达情况。在NIH3T3成纤维细胞中通过siRNAs实验敲低目的基因,提取mRNA并对表达谱进行通路富集分析。构建Dync2li1基因敲除小鼠模型,观察胚胎期心脏表型及心脏组织纤毛形态,并对不同基因型的胚胎心脏组织进行转录组测序,探寻相关的分子与信号通路。结果与人群突变相比,大动脉转位组中DYNC2LI1基因突变负荷显着增加,提示DYNC2LI1基因突变与大动脉转位的发生存在必然联系。相比于野生型质粒,Dync2li1基因突变c.A239C,p.D80A的mRNA及蛋白的表达水平均显着降低,且差异有统计学意义（P<0.0001;P<0.01）;c.T240A,p.D80E 和 c.T389C,p.L130R 突变的mRNA的表达量同样明显降低（P<0.0001;P<0.05）,但蛋白表达没有明显差异（P>0.05）。对Dync2li1敲低后成纤维细胞的转录组分析发现,伪结构组装相关通路的基因表达显着上调;而与心脏结构发育及体轴形态等通路相关的基因表达发生下调。Dync2li1-/-小鼠在胚胎中期约11.5天前死亡。Dync2li1+/-和Dync2li1-/-小鼠胚胎呈现不同程度的生长发育缺陷:心脏环化异常,心包囊肿胀,神经管闭合缺陷,躯干前后轴分化异常。Dync2li1基因敲除小鼠胚胎心脏组织的纤毛长度变短。不同基因型胚胎的心脏组织的转录组测序结果显示,Dync2li1的敲除影响了心脏组织代谢等生物过程的调节,纤毛的结构以及囊泡参与的转运过程。结论与纤毛结构和功能相关的DYNC2LI1基因是大动脉转位的潜在致病基因。
陈文[2]（2020）在《心脏流出道畸形及其发育机制的研究》文中研究说明流出道发育异常所导致的心脏流出道畸形,是较为常见的一类先天性心脏病,严重危害人类生命健康。流出道的分隔和重塑异常是大多数流出道结构畸形,如法洛四联症,大动脉转位（Transposition of the Great Arteries,TGA）,右室双出口等形成的根本原因。造成流出道畸形的因素非常复杂,包括环境因素和遗传因素等。然而,目前我们对于流出道畸形发生发展的机制却并不清楚。流出道发育过程中的细胞多样性、细胞分化轨迹和细胞调控网络的研究,将为流出道畸形的病因学研究提供重要依据。因此,本课题首先利用人类流出道畸形TGA队列进行临床特征和遗传病因学研究,随后从流出道发育的角度,利用无偏倚、高精度的单细胞转录组测序技术,对流出道及其关键细胞谱系的发育过程进行了全面解析。在人类流出道遗传病因学的研究中,我们共招募了 249例TGA患者（含66个Trio家系）,并进行了全外显子组测序。对不同TGA亚型的病例进行临床特征分析发现,完全型TGA中的动脉导管未闭发生率（52.7%）和先天矫正型TGA中的右位心/中位心发生率（32.8%）明显高于其他亚型。此外,我们还发现TGA患者合并肺动脉瓣二瓣化的比例也相对较高（9.6%）。为了寻找相关致病基因,我们对测序结果进行了一系列的生物信息学筛选,获得了 82个候选基因,其中包括新发变异、功能丧失型变异、复合杂合和伴X连锁隐性变异。在这些候选基因中,除已知的先心病致病基因,如FOXH1,CITED2,我们还发现了 19个含有罕见破坏性变异的纤毛基因:例如,含有新发变异的DYNC2LI1。纤毛基因的大量富集充分显示了纤毛在TGA发病机制中的作用。另外,从整体而言,有高达33%的TGA先证者有一个以上的可能有害变异,这表明一部分TGA可能存在寡基因或多基因遗传模式。随后我们对流出道分隔的前、中、后,三个关键时期的细胞进行了单细胞转录组测序,对55611个单细胞数据分析发现其主要包括17个细胞亚型,共涉及6个细胞谱系。其中我们不仅发现了已被报道过的内皮-间充质转化的现象,而且还发现了间充质细胞向平滑肌细胞转化和心肌细胞向平滑肌细胞转化的现象。原位杂交结果显示,一组间充质细胞（Penk+）正在经历由间充质向平滑肌细胞的转变,这与流出道垫的融合有关。进一步,我们通过拟时间序列分析揭示了潜在细胞状态转换的动力学和涉及其中的关键转录调控因子。心脏神经脊细胞（Cardiac Neural Crest Cells,CNCC）在流出道的发育中具有重要作用,对神经脊细胞进行消融可引起多种流出道畸形。为研究CNCC对整个心脏发育的贡献及其发育进程,我们对胚胎期第10.5天至出生后第7天的8个发育阶段的共34131个小鼠心脏的CNCC进行了单细胞转录组测序。通过单细胞分析和单分子荧光原位杂交技术,我们证实了有一部分壁细胞来源于CNCC。此外,我们发现了从CNCC来源的周细胞到微血管平滑肌细胞的转变,并通过拟时间分析鉴定了转化过程中的调控基因。我们的研究发现,CNCC后代在迁移到心脏时已经具有分化到特定谱系的趋势。在CNCC后代中我们也观察到,神经嵴细胞的相关分子特征随着发育过程逐渐丧失。最后,我们对CNCC后代中的一些特殊亚群的分布进行了描述,例如,Penk+细胞主要分布在形成主肺动脉间隔的流出道垫中,它们都来源于CNCC。本研究对人类流出道畸形TGA的临床特征进行了系统性的总结和分析,对患者分层具有重要意义;同时,遗传分析的结果突出了纤毛基因的致病作用和TGA背后复杂的遗传结构。我们的研究结果不仅可以帮助改善TGA的产前诊断,也将在TGA患者的治疗和管理中起到重要指导作用。我们描绘了一个正常流出道及CNCC发育状态的参考图谱,发现了大动脉根部血管平滑肌谱系的多源性发育特征,首次证明心肌向血管平滑肌转分化的存在和神经脊细胞来源的壁细胞的存在。这些发现将为先心病的研究提供重要理论基础,并对先心病的细胞治疗产生重要意义。
黄姣[3]（2019）在《糖原贮积症GSD0和GSDV斑马鱼疾病模型的构建及其表型分析》文中研究指明心脏是脊椎动物中最早形成和发育的器官,其对于脊椎动物正常生长和发育至关重要。斑马鱼胚胎体外发育,胚体透明,便于内部器官的观察,成为研究心脏发育的良好模型。CRISPR/Cas9基因编辑技术,由于高效和简单等特点,目前已广泛应用于基因功能研究和疾病模型构建。糖原贮积症（glycogen storage disease,GSD）是一类糖原合成或分解障碍导致的疾病,根据突变基因不同,有十几种分型。主要累及组织为肝脏和肌肉。GYS1和GYS2突变会导致GSD0,PYGM突变会导致GSDⅤ,斑马鱼中的同源基因分别为gys1、gys2、pygma和pygmb。已有报道GSD0患者体内糖原不足,运动不耐受,甚至死于心脏骤停。目前还没有治疗糖原贮积症GSD的方法。本研究以斑马鱼为研究对象,利用CRISPR/Cas9技术敲除gys1、gys2、pygma和pygmb基因以构建GSD0和GSDⅤ疾病模型,为探索人类GSD的发病机制奠定基础。RNA结合蛋白家族中的RBPMS2在人类心脏中高表达,rbpms2a（RNA binding protein,mRNA processing factor 2a）和rbpms2b（RNA binding protein,mRNA processing factor 2b）双突变体的斑马鱼心脏发育异常,我们利用斑马鱼为研究对象,构建rbpms2a和rbpms2b单基因突变体,探索RNA结合蛋白对于心脏发育的调控作用。经检测,gys1和gys2的敲除效率在50%-70%之间,注射的胚胎养至成鱼,与野生斑马鱼外交,筛选嵌合子F0。嵌合子与野生型斑马鱼外交产生的后代为F1代,F1为杂合子。剪部分尾鳍,用碱裂法提取基因组、PCR、用T7E1酶切法检测杂合子,最终用TA克隆的方法确定F1的突变类型。经检测,gys1筛选到4种突变类型的杂合子F1,gys2筛选到3种突变类型的杂合子。将两种突变类型的F1分别自交,产生纯合子F2。最终获得gys1的两种突变类型纯合子:-7bp-/-和+13,-2bp-/-。gys2的两种突变类型纯合子:-4bp-/-和+4,+19,+17bp-/-。另外收集野生型斑马鱼早期发育15个时期的胚胎,利用qRT-PCR技术确定gys1和gys2在斑马鱼早期发育的表达情况。同时,我们还解剖了野生型斑马鱼成鱼的12个组织,利用qRT-PCR技术了解gys1和gys2在斑马鱼不同组织中的表达情况。PAS糖原染色实验比较野生型斑马鱼、gys1-/-和gys2-/-肌肉、心脏和肝脏中糖原累积差异。结果通过纯合子自交发现,gys1-/-自交产生的后代存活不超过48hpf（hours post fetilization）。gys2-/-自交产生的后代发育正常,没有异常死亡现象。胚胎qRT-PCR结果显示gys1和gys2在斑马鱼早期发育过程中高表达,在1-cell期表达量最高,gys1的表达量相对高于gys2。组织qRT-PCR结果显示gys1在斑马鱼全身组织中都表达,在肌肉中表达量最高,gys2在斑马鱼肝脏中特异性高表达。PAS糖原染色实验表明gys1-/-纯合子肌肉和心脏中没有糖原存在,gys2-/-纯合子肝脏组织中没有糖原存在,与人类GSD0症状相一致。pygma的敲除效率在40%-55%之间,pygmb的敲除效率为5%-15%。最终,获得pygma的两种突变类型的纯合子:+20,-6bp-/-和+1,-1,-11bp-/-,pygmb的两种突变类型的纯合子:+1bp-/-和-2bp-/-。纯合子内交产生的后代正常发育。胚胎qRT-PCR结果显示pygma和pygmb在斑马鱼胚胎发育前期几乎不表达,在后期表达量增多。但是相对来说,pygmb的表达量高于pygma。组织qRT-PCR结果显示pygma在斑马鱼肌肉组织中显着性高表达。pygmb在斑马鱼心脏、脑和眼睛中表达量很高。PAS实验结果显示pygma-/-和pygmb-/-体内糖原累积严重。rbpms2a的敲除效率为30%-60%,rbpms2b的敲除效率为15%-40%。最终筛选到rbpms2a的三种突变类型的杂合子:+8bp+/-,-5bp+/-和+12+94bp+/-。rbpms2b的三种突变类型的杂合子:+13bp+/--8bp+/-和-49bp+/-。胚胎qRT-PCR结果显示rbpms2a和rbpms2b在斑马鱼胚胎发育前期（1cell-shiled stage）高表达。组织qRT-PCR结果显示rbpms2a在斑马鱼心脏、脾脏、肌肉、鳃、眼睛和卵巢中高表达。rbpms2b在斑马鱼心脏和卵巢中高表达。胚胎原位杂交结果显示rbpms2a和rbpms2b在斑马鱼早期心室高表达。本实验构建了斑马鱼gys1、gys2、pygma、pygmb、rbpms2a和rbpms2b基因突变鱼系,为研究以上基因的功能奠定了基础。
刘钟颖,黄霞,李紫怡,杨子豪,袁白银[4]（2019）在《肌动蛋白细胞骨架在小鼠第二生心区祖细胞部署发育中的作用》文中研究表明脊椎动物心管起源于早期胚胎的生心中胚层细胞,随后从邻近的咽中胚层和内脏中胚层中逐渐添加第二生心区（second heart field, SHF）祖细胞而延长。SHF细胞向心管贡献受损,使心管不能最大限度地延长,导致一系列的心脏发育缺陷,包括最常见的右心室发育不良与流出道分隔旋转异常等先天性出生缺陷。SHF祖细胞构成非经典顶端-基底极性上皮,并具有顶部单纤毛、动态肌动蛋白（actin）富集基底端的丝状伪足等特点。本文总结了actin细胞骨架在小鼠SHF祖细胞部署发育过程中的研究进展,揭示actin细胞骨架在SHF祖细胞发育特别是SHF细胞向流出道部署过程中的重要性,以期为阐明和理解SHF祖细胞迁移、部署的细胞生物学特性提供一定的理论参考。
杨晓菲[5]（2018）在《TBX20基因启动子区甲基化在法洛四联症中的致病机制研究》文中研究指明研究背景先天性心脏病（Congenital heart disease,CHD）是最常见的出生缺陷之一,包括一系列的心血管畸形。目前认为是CHD患者的遗传因素和其相关的环境因素共同作用的结果。心脏发育是一个精细的过程,与心脏发育相关的基因表达都受到精细的调控。除了基因序列的变异可以导致基因表达水平改变外,环境因素通过表观遗传学机制在基因表达调控方面的重要作用受到越来越多的重视。表观遗传学（Epigenetics）机制包括甲基化修饰、微小RNA调控及组蛋白修饰等。其中甲基化修饰是目前研究最多的表观遗传学现象。DNA甲基化是最常见的基因表观修饰方式之一。它主要是指通过DNA甲基转移酶将S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到DNA胞嘧啶的5’位,形成5-甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因的序列,但是它可以调控基因的表达、维护染色体的完整性、调节DNA重组及某些基因的转录活性。启动子是位于结构基因5’端上游的DNA序列,能活化RNA聚合酶,使之与模板DNA准确的结合并控制基因转录的起始和表达程度。启动子对基因转录水平的调控主要表现为顺式作用元件、反式作用因子及RNA聚合酶三者之间的相互协同作用,其本质为DNA与蛋白质、蛋白质与蛋白质之间的相互作用。启动子区序列的变异可以通过影响转录因子等反式作用因子与顺式作用元件的结合而导致基因转录水平的变化。除了序列的变化,越来越多的研究表明基因启动子区DNA甲基化水平的改变能够调控基因的转录水平。启动子区CpG岛甲基化增高将影响基因的转录,进而抑制基因的表达及功能,而去甲基化则诱导基因的重新活化和表达。甲基化和去甲基化主要通过直接和间接两种机制控制基因的表达。直接机制是指CpG岛甲基化直接通过抑制RNA聚合酶活性或干扰某些转录因子与基因调控区的结合而抑制基因的表达。间接机制主要包括两种类型:1.基因启动子调控序列甲基化后与甲基化CpG结合蛋白结合,阻止该基因与其它转录因子形成转录复合物;2.基因启动子区DNA甲基化后通过改变染色质的结构进而阻碍基因DNA与转录因子结合。以往的研究表明,转录因子、信号分子、细胞粘附分子及离子通道分子是参与心脏发育的最主要有四类分子。其中,目前研究最多的是转录因子,包括锌指家族、同源结构域家族、T-box（TBX）家族、基本螺旋-环-螺旋和MADS区域家族等。转录因子是指能与核酸特异性序列相结合的蛋白质,通过识别和结合基因启动子区域的顺式作用元件从而调控基因的表达。转录因子作用于下游基因的同时也同时受上游诱导信号的调节,它们构成一个复杂而精确的网络对心脏的发育起重要的调节作用。T-box家族属发育调控相关转录因子家族,通过其特有的T-BOX区域参与多种生物的发育调控。T-box家族均具有一个大的DNA结合域T-BOX,与其结合的所有DNA序列都存在一致性序列TCACACCT即T半位点,因此编码该蛋白的基因称为T-box基因。T-box基因家族分为5个不同的亚家族,其中主要与心脏发育相关的有TBX1亚家族的TBX1、TBX18、TBX20及TBX2亚家族的TBX2、TBX3和TBX5。它们通过协同和竞争机制在心脏的发育过程中起着重要的作用。法洛四联症（tetralogy of Fallot,TOF）是最常见的紫甜型先心病,约占先天性心脏病的10%,是胚胎时期圆锥动脉干发育异常所致,肺动脉狭窄、室间隔缺损、主动脉骑跨和右心室肥厚是其主要的病理特征。法洛四联症患儿自然预后不佳,若未及时诊治大多在成年期前死于慢性缺氧导致的继发性心肌肥大和心力衰竭。即使手术纠治仍有少部分患儿因术后心律失常等并发症而发生猝死。法洛四联症作为临床最常见的圆锥动脉干畸形,部分患者存在染色体及基因的突变,但目前还没有明确致病基因的报道。目前认为与法洛四联症相关的基因有NKX2.5、TBX20、CX43、TBX1、GATA4、FOG2、TBX5、HIRA、RXAa、TGFβ 2、PAX3、VANGL2 等。TBX20的全称为T-box20,定位于7号染色体的短臂14区2带,属于转录因子TBX家族的TBX1亚家族。通过对小鼠胚胎的研究显示TBX20在心脏成环早期的心内膜垫有很强的表达,在后期的流出道、房室管及房间隔中隔前缘等心内膜垫结构的表达更加显着。目前TBX20是T-box家族发现的唯一可以在心内膜垫稳定和广泛表达的成员。而心内膜垫的异常发育可以导致多种先天性心脏病的发生,包括大动脉转位、右室双出道、法洛四联症、房室间隔缺损等。因此,TBX20基因是人类圆锥动脉干畸形候选基因之一。TBX2基因定位于染色体17q23,它在胚胎发育的各种组织和器官中广泛表达。TBX2异常表达小鼠常伴有流出道间隔缺损及心腔特异性基因的异常表达。以往的研究表明,TBX20可以促进心腔心肌特异性基因的表达而抑制TBX2的表达,对心腔心肌的增殖和分化起着至关重要的研究。Cai等认为BMP2是TBX20在房室管发育中的关键下游基因之一,他们认为TBX20不仅直接抑制TBX2的表达,而且通过BMP2信号通路间接促进了 TBX2的表达。先前的研究表明TBX20突变仅发生于少部分先天性心脏病患儿中,TBX20序列的改变并不能完全解释它在先天性心脏病中的致病作用。目前,对人类相关基因的甲基化研究主要集中在肿瘤组织中,而DNA甲基化在先天性心脏病中的致病作用研究甚少。研究目的1.检测法洛四联症患儿右室流出道心肌组织TBX20基因启动子区甲基化水平及TBX20基因mRNA及蛋白的表达。探讨TBX20基因启动子甲基化水平与TBX20基因表达的关系。2.检测TBX20基因相关因子TBX2及BMP2在法洛四联症患儿心肌组织的mRNA及蛋白表达。探讨TBX20与TBX2和BMP2之间的关系,并揭示它们在法洛四联症中的致病作用。3.探讨TBX20基因启动子区甲基化在法洛四联症的致病作用,为研究TBX20基因在法洛四联症的致病机制提出新的研究模式,进一步为先天性心脏病围产期筛查提供理论依据。研究方法1.利用NCBI网站查找TBX20启动子转录起始点上游2000 bp及下游1000 bp的序列。采用Methyl Primer Express Software vl.0查找TBX20基因启动子区CpG 岛分布情况。利用 Neural Network Promoter Prediction 查看 TBX20 基因核心启动子序列。利用JASPAR软件预测TBX20基因CpG岛区与其它转录因子的结合位点。2.选取23例法洛四联症患儿及5例意外死亡儿童的心脏右室流出道心肌组织为研究对象。采用重亚硫酸盐PCR测序方法检测TBX20基因启动子区的甲基化水平。采用荧光定量PCR检测TBX20基因及其相关因子TBX2、BMP2的mRNA表达。通过蛋白质印迹实验检测TBX20基因及其相关因子TBX2、BMP2的蛋白表达。3.统计分析:采用SPSS 22.0及GraphPad prism v5软件分析数据。正态分布数据以均值±标准差表示,非正态分布数据以中位数及四分位数表示。TBX20基因启动子区甲基化水平、mRNA及蛋白相对表达的正态数据采用t检验,非正态数据采用Mann-Whitney检验。采用Spearman检验TBX20与mRNA是否具有相关性,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.利用生物信息学网站及软件分析TBX20基因启动子（-400bp～-48bp）位于CpG岛内。该区域共含42个CpG位点,预测该区域含有多个转录因子结合位点（TFAP2、GATA5 及 TBX1/2/4/5 等）。2.法洛四联症组TBX20基因启动子区（-400bp～-48bp）总体甲基化水平较对照组降低（P=0.035）。在42个CpG位点中,法洛四联症组第26 CpG位点甲基化水平较对照组降低（P=0.016）。其余位点两组间差异无统计学意义。3.法洛四联症组右室流出道心肌组织TBX20基因mRNA表达较对照组明显增高（P<0.001）,差异有统计学意义。法洛四联症组右室流出道心肌组织TBX20启动子区（-400bp～-48bp）甲基化水平与其mRNA表达水平成负相关,r=0.81,P<0.001。法洛四联症组右室流出道心肌组织TBX20蛋白表达较对照组增高（P=0.008）,差异有统计学意义。4.法洛四联症组右室流出道心肌组织TBX2基因mRNA表达低于对照组,差异有统计学意义（P<0.001）。法洛四联症组右室流出道心肌组织BMP2基因mRNA表达与对照组相比无明显差异（P=0.082）。5.TBX2蛋白在法洛四联症组右室流出道心肌组织的表达低于对照组,差异有统计学意义（P=0.022）。法洛四联症组右室流出道心肌组织BMP2蛋白的表达与对照组相比差异无统计学意义（P=0.537）。结论1.TBX20基因启动子区（-400bp～-48bp）含有多个转录调节元件,该区域甲基化的降低可能影响了 TBX20基因启动子与TFAP2C的结合进而造成TBX20基因mRNA及蛋白表达增高。2.TBX20基因表达增高可以抑制TBX2基因mRNA及蛋白的表达。TBX20及TBX2基因的表达异常均可以导致心脏的发育异常,这可能是法洛四联症的致病机制之。3.TBX20基因启动子区的甲基化水平异常可能在法洛四联症发病中起重要作用。本研究为进一步探索TBX20基因在法洛四联症中的致病机制提出了新的研究模式,同时为先天性心脏病的围产期筛查提供了新的理论依据。
张彩宁[6]（2017）在《Notch信号通路在脐带间充质干细胞治疗扩张型心肌病鼠中的作用》文中研究说明目的探究Notch通路在人脐带间充质干细胞治疗扩张型心肌病鼠中的作用。方法1、人脐带间充质干细胞对γ-分泌酶抑制剂诱导的扩张型心肌病叙利亚金黄地鼠疾病模型的治疗作用雄性健康叙利亚金黄地鼠（简称地鼠）60只,随机分为正常组（15只）、实验组（分为DAPT组、DAPT对照组、干细胞组,各15只）。其中实验组地鼠每天进行腹腔注射γ-分泌酶抑制剂（DAPT）构建扩张型心肌病（DCM）模型,同时每周分别向DAPT对照组（即DMEM组）和干细胞组肌肉注射干细胞重悬培养液DMEM和人脐带间充质干细胞（h HUCMSCs）,应用超声心动图和血浆BNP水平评估地鼠心功能情况,采用HE染色和Masson染色观察心肌组织变化情况。2、检测人脐带间充质干细胞治疗扩张型心肌病大鼠后心肌组织Notch信号通路的活性110只SPF级健康、雄性SD大鼠随机分为正常组（20只）、扩张型心肌病组（简称DCM组,90只）。DCM组大鼠持续8周、每周1次经腹腔注射阿霉素构建扩张型心肌病模型,将建模成功后的60只DCM组大鼠随机分为DCM对照组（简称DMEM组）、h HUCMSCs低剂量组（简称低剂量组）、h HUCMSCs高剂量组（简称高剂量组）,分别经肌肉注射DMEM、低剂量干细胞和高剂量干细胞治疗。h HUCMSC治疗2周及4周后,应用超声心动图和血浆BNP水平评估地鼠心功能情况,采用Western Blot检测心肌组织NICD（或者N1ICD,Notch信号通路游离的胞内段）和Notch信号通路下游因子Hes1的蛋白含量。结果1、人脐带间充质干细胞对γ-分泌酶抑制剂诱导的扩张型心肌病叙利亚金黄地鼠的治疗作用超声心动图结果,注射药物前各组差异无统计学意义（P>0.05）;注射药物后DAPT组、DMEM组、干细胞组与正常组相比差异有统计学意义（P<0.01）,DAPT组、DMEM组与干细胞组相比差异有统计学意义（P<0.05）,而DAPT组和DMEM组无显着差异（P>0.05）。血浆BNP水平,注射药物后DAPT组、DMEM组与正常组、干细胞组相比差异有统计学意义（P<0.01）,而干细胞组较正常组无显着差异（P>0.05）。HE染色显示,与DAPT组和DMEM组相比,正常组和干细胞组心肌细胞水肿减轻,炎性细胞浸润减少,心肌纤维排列较整齐;Masson染色显示干细胞组心肌间蓝染的胶原纤维沉积减少。2、人脐带间充质干细胞治疗扩张型心肌病鼠心肌组织中Notch信号通路活性正常组大鼠治疗前、治疗2周及4周后超声心动图结果无显着差异（P>0.05）;h HUCMSCs移植2周后DMEM组、低剂量组及高剂量组治疗前后超声心动图超声结果无显着差异（P>0.05）;h HUCMSCs移植4周后DMEM组、低剂量组及高剂量组治疗前后LVEDD、LVESD无显着差异,而LVEF、LVFS差异显着,且DMEM组LVEF、LVFS低于低剂量组和高剂量组（P<0.05）。Western Blot检测结果显示治疗4周后各组之间心肌组织中NICD、Hes1蛋白含量差异无统计学意义（P>0.05）。结论1、h UCMSCs可有效改善Notch信号通路被抑制后引起的扩张型心肌病地鼠的心功能;2、阿霉素诱导的扩张型心肌病大鼠Notch信号通路活性较正常组无显着改变,肌肉注射h UCMSCs可明显改善心功能,但对心肌组织Notch信号通路的活性无显着影响。以上结果提示h UCMSCs对扩张型心肌病的修复作用不依赖于对Notch信号通路的调节。
马希睿[7]（2017）在《Gata6在斑马鱼胰腺和心脏发育中的功能研究》文中进行了进一步梳理胰腺是脊椎动物中参与营养代谢和血糖平衡的重要器官。心血管系统负责氧气、二氧化碳、营养物质和代谢废物的运输及调节内稳态。斑马鱼为小型亚热带淡水鱼,胚胎体外发育,胚胎透明易观察,单次产量高,成熟周期短,易于饲养等优势使其成为理想的脊椎动物模型,可用于消化器官和心血管系统发育。在斑马鱼中胰腺由背侧胰芽（dorsal bud）和腹侧胰芽（ventral bud）融合发育而来,背侧胰芽在24hpf出现,主要发育成内分泌细胞（endocrine）,腹侧胰芽在34hpf开始出现,主要发育成外分泌细胞（exocrine）及少部分内分泌细胞。心脏则是由两侧的心肌祖细胞向背侧中线迁移并融合形成圆锥状,心内膜祖细胞在圆锥体中间,当圆锥转变成心脏管后心内膜祖细胞将形成心内膜细胞并形成空腔。这两个器官形成受一系列动态变化的信号和转录因子精确调控,gata6在这两个器官中均有表达,这暗示着gata6可能参与调控胰腺和心脏的发育,但是到目前为止gata6参与调控胰腺和心脏发育的具体分子机制尚未完全阐释。gata6是GATA锌指结构转录因子家族一员,主要负责中胚层和内胚层的特化与分化。为了研究gata6在胰腺和心脏发育中的功能,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了gata6,并获得了两个在外显子2上分别删除5个和20个碱基的突变体,其突变型mRNA含有早熟终止密码子,编码蛋白都为截短蛋白,缺失结合DNA的锌指结构域。在gata6△20/△20中前肠发育缺陷、肝脏偏小及外分泌胰腺严重缺失,在3dpf的突变体中trypsin标记的分化的外胰为两小团分散的组织。为研究外分泌胰腺祖细胞的发育状况,我们将gata6△20/+杂交至Tg（ptf1a:GFP）背景上,连续观察发现野生型腹侧胰腺祖细胞只形成一个腹侧胰芽并且长大,然而在突变体中形成两个分离的腹侧胰芽,其正常生长也受到抑制。上述结果表明在在gata6突变体中腹侧胰芽异位生长且生长受到抑制。前期研究结果表明LPM迁移缺陷可能会导致外分泌胰腺发育缺陷,为了探究腹侧胰芽不能融合的原因,我们检测了LPM的迁移情况,突变体中LPM迁移正常。文献表明在小鼠中shh异位表达会导致外分泌胰腺发育缺陷,我们检测了shha的表达水平,shha在突变体中的内胚层异位过表达,为研究此异位表达是否为导致胰腺发育缺陷的原因,我们用cyclopamine抑制Hedgehog信号通路,但是不能挽救突变体的外胰腺缺陷。gata6影响外分泌胰腺发育的机制需要进一步探索研究。我们还研究了gata6在心脏发育过程中的功能,观察发现在野生型中24hpf开始出现血液循环,然而在突变体此时没有血液循环,但是心跳正常,为了进一步研究心脏发育状况,我们借助转基因鱼Tg（flk1:GFP）发现突变体的心脏流出道（outflow tract）的内皮细胞相互紧靠,没有形成能够通过血液细胞的空腔。在随后的观察中发现大约70%的突变体会在26hpf到48hpf之间恢复血液循环。前期研究表明基因突变体中可能存在遗传补偿效应,我们检测发现gata5在突变体的心脏中表达水平明显上升。在突变体中适量敲降gata5可以显着降低突变体恢复血流的比例,并且适量注射gata5 mRNA可以逆转此结果。文献报道血管形成空腔的机制存在一种内皮细胞聚集成棒状结构后内皮细胞极化分开再形成空腔的模式,这种血管形成主要是通过VE-cadherin—PKC—Factin—myosin II途径。为验证斑马鱼中心脏流出道中空腔形成分子机制是否符合这种模式,我们用Blebbistatin、Latrunculin B和Nocodazole分别处理22hpf的野生型胚胎,分别抑制myosinII、F-actin和microtubule,发现用这三种药都能使心脏流出道不能形成空腔,我们检测了36hpf时心脏流出道中PKC表达量,我们发现sibling中PKC表达量更高,恢复血液循环的突变体比没有恢复的突变体有更高的PKC表达量,gata6/gata5可能是通过直接调控PKC的表达量来控制心脏流出道中的空腔的形成。综上所述,我们的研究为探索gata6在胰腺和心血脏发育提供了新的信息。
许智慧[8]（2016）在《转录因子TBX3在小鼠胚胎动脉囊及弓动脉发育过程中的表达》文中研究说明背景:小鼠胚胎发育第8天,随着左、右心管合并为一条心管,心管的动脉端与动脉囊相联。动脉囊先后共发出6对弓动脉,弓动脉起源于动脉囊终止于背主动脉最终发育成特定形态的动脉。六对弓动脉不同时出现,第一、二对弓动脉很早消失退化,第五对发育不全并退化,在小鼠胚胎时期我们主要观察第三、第四和第六对弓动脉。胚胎发育过程中三对咽弓动脉形成主动脉弓和大部分支动脉。所有的弓动脉经过重塑,正确地建立了胚胎和出生后的循环系统。非对称性的演化和留存的特定弓动脉参与重塑过程。主动脉弓由动脉囊、左侧第四弓动脉和左侧背主动脉形成。右侧第四弓动脉变成头臂干和右锁骨下动脉的近侧端。左侧第六弓动脉重塑为肺动脉干和动脉导管,而右侧第六弓动脉退化并最终消失。左,右第三弓动脉形成双侧颈总动脉。动脉囊能否正确的分隔关系到是否可以形成正常形态的弓动脉,以及弓动脉的重塑和参与其他动脉的形态发生。T-box所含有的转录因子调控胚胎发育的多个方面,包括心脏的形态发生和模式;在人类和小鼠缺失或者突变一定数量的T-box基因会导致先天性心脏缺陷。至少有七个家庭成员在哺乳类心脏发育过程中表达。转录因子TBX3参与细胞的发育,增殖,衰老,细胞周期的结束和细胞的凋亡。先前已报道,TBX3纯合突变的胚胎与同窝幼崽相比较其总体发育迟缓。TBX3表达缺失会导致心脏畸形包括房室管细胞的过度增殖,心室不完全分隔,右心室双流出道和主动脉弓形成延迟。在小鼠心脏,TBX3的表达最先在心脏循环开始的流出道被发现。其表达可以描述发育中的心脏传导系统,房室管心内膜垫和流出道间充质。动脉囊与流出道的远端相延续,流出道的形态发生与动脉囊的分隔密切相关。在咽前间充质中表达的TBX3阳性细胞和心脏神经嵴细胞共同填充流出道并参与流出道的分隔。以往对TBX3的研究多集中在胚胎心脏中枢传导系统中,TBX3基因敲除或基因突变会导致小鼠工作心肌特异性基因在窦房结、房室结和房室束等中枢传导系心肌异位表达,或在心室或心房形成异位节律点;以及对人类尺骨和乳腺的作用,tbx3基因突变导致人类尺—乳综合征。虽有报道tbx3基因敲除或突变的小鼠会引起流出道出现严重畸形,包括主动脉弓和主肺动脉干的异常;但在以往的报道中多见第二生心区isl-1阳性咽前间充质细胞对动脉囊的分隔。对tbx3在第二生心区的时空表达虽有描述但与动脉囊的分隔报道却较少。在发育中的心脏,转录因子tbx3主要表达在中枢传导系的心肌前体细胞。本实验用α-平滑肌肌动蛋白抗体（α-sma）标记发育中心肌及平滑肌,用isl-1抗体标记心肌前体细胞,用tbx3抗体显示转录因子tbx3表达和动脉囊、弓动脉发育的关系。用免疫组织化学方法观察了3种蛋白质在e912小鼠胚胎第二生心区的时空表达特征,以探讨其在动脉囊及弓动脉发育过程中的可能作用,为先天性弓动脉发育畸形提供实验依据。目的:探讨在小鼠胚胎早期发育过程中转录因子tbx3（t-boxtranscriptionfactor3）和动脉囊及弓动脉发育的关系。方法:对胚龄912天（e9e12）的小鼠胚胎心脏做连续的石蜡切片,抗转录因子tbx3抗体、抗胰岛因子-1（isl-1）抗体、抗α-平滑肌肌动蛋白（α-sma）抗体对切片进行免疫组织化学染色。结果:在胚龄9天,呼吸内胚层isl-1和tbx3细胞阳性表达并在此聚集,流出道呈管状,在流出道的远段isl-1阳性细胞向近段延伸并逐渐表达α-sma。在胚龄10天,流出道进一步增长,阳性α-sma细胞延伸至心包腔的背侧壁与脏壁中胚层返折处。咽内胚层中isl-1阳性细胞数量增多,鳃弓核心间充质isl-1阳性细胞增殖添加到动脉囊和第三弓动脉联接处。咽两侧tbx3细胞呈现强阳性表达。在动脉囊和第三弓动脉相交接处出现tbx3和isl-1阳性细胞。在胚龄11天,α-sma由流出道延伸至整个动脉囊壁。isl-1阳性咽前间充质细胞围绕呼吸内胚层形成对称的特征性锥体形结构,由动脉囊背侧壁突入动脉囊腔,形成主肺动脉隔原基,在该锥体结构有TBX3阳性细胞表达。随着第二生心区间充质细胞数目的增加,TBX3阳性细胞在咽前间充质中明显增多,ISL-1阳性细胞不断的增殖添加到锥体结构。锥体结构纵向延长,进一步分隔动脉囊,形成第四和第六对弓动脉;在第四和第六对弓动脉周围可见明显的TBX3阳性细胞。在胚龄12天,流出道缩短,TBX3与ISL-1的阳性细胞主要集中于咽前间充质,动脉囊分隔为升主动脉及肺动脉干,流出道远端α-SMA表达止于大动脉根部。结论:传导系的阳性心肌前体细胞TBX3和第二生心区（SHF）来源的胰岛因子-1（ISL-1）阳性心前体细胞参与动脉囊形态发生。胚龄10天时,TBX3和ISL-1阳性细胞共同参与动脉囊与第三对弓动脉的分隔。胚龄11天时,ISL-1阳性间充质细胞参与主肺动脉隔的形成,在第四和第六弓动脉周围可见TBX3细胞阳性表达。到胚龄12天时,主肺动脉干壁出现α-SMA阳性细胞开始向平滑肌方向分化。
柳江燕[9]（2012）在《HOXA1基因突变与先天性心脏病关系的研究》文中进行了进一步梳理先天性心脏病（Congenital heart disease, CHD）是人类最常见的新生儿出生缺陷性疾病之一。在过去数十年中,许多研究致力于先心病遗传学研究,检测出一些致病性基因。HOXA1基因是同源盒基因家族中表达最早的基因,在胚胎发育中具有重要作用。近期研究显示,HOXA1在心血管系统的形成中发挥先前没有被认识到的作用,然而至今还没有看到先天性心脏病人群中HOXA1研究的相关报道。本研究拟分别对散发性室间隔缺损儿童和复杂先心病核心家系进行HOXA1致病性突变的检测,了解其与人类心脏发育的关系,为探讨HOXA1在先心病中的作用提供新的见解目的：对中国汉族人群中散发性心室间隔缺损儿童HOXA1基因编码链的突变研究。方法：收集340例非综合征室间隔缺损儿童患者和200例正常健康儿童外周血,进行DNA抽提、PCR扩增HOXA1基因编码链并DNA测序检测突变。结果：在全部室间隔缺损儿童中未发现致病性非同义突变。2例肌部室间隔缺损患者中发现2种新型同义突变（c. C210T,p. His70His; c. T861A, p. Arg287Arg）,其中一种同义突变位于HOXA1基因同源框中。在8例室缺患儿和5例正常儿童中发现杂合性单个组氨酸缺失变异（c.211213delCAC, p. H71del）;在7例患儿和4例对照中发现连续三个组氨酸缺失变异的杂合子（c.205213delCACCACCAC, p. H69H71del）,这两种组氨酸缺失变异杂合子在病例组与对照组中的基因频率统计学无显着性差异,均为先前已经报道过的多态现象。结论：非综合征性室间隔缺损不是HOXA1基因突变的孤立表型,散发先天性心脏病人群中并不适合进行HOXA1基因的突变分析。目的：对中国汉族人群中复杂性先天性心脏病核心家系HOXA1基因编码链的突变研究方法：收集168例复杂性先天性心脏病患者及其父代血液标本和100例正常健康儿童外周血标本,进行DNA抽提、PCR扩增HOXA1基因编码链并DNA测序检测突变。结果：在一位8个月大的完全性房室间隔缺损患儿中发现一种新型纯和聚组氨酸缺失变异（c.211213delCAC; p.H71del）。超声心动图显示受累女婴心房下部、心室上部和肌部室间隔明显缺损。这一纯和缺失变异导致其编码的蛋白质在69-71位组氨酸缺失,在正常对照组中没有发现。在突变基因携带者表型正常的父亲和母亲的DNA中鉴定出这一缺失变异的杂合子,其父母为近亲结婚。我们还在复杂先心病儿童、患者亲代与正常人中发现2种单个和多个组氨酸延伸变异（c.211213insCAC, p.H71ins; c.205213insCACCACCAC, p. H69H71ins）,其中一个多组氨酸延伸变异是首次报告。此外,在前一部分研究中报告过的杂合聚组氨酸缺失变异在这一部分研究组和正常对照中也有被检测出来。结论：新型HOXA1纯和聚组氨酸缺失突变可能是复杂性先天性心脏病的致病性突变。HOXA1基因突变是人类非综合征性复杂性先心病十分罕见的致病原因,并不推荐在散发的来自非近亲结婚家庭的病例中进行突变分析。HOXA1聚组氨酸序列功能的确立还需要更进一步的研究。
邓海燕[10]（2012）在《miR-1介导Notch信号通路调控大鼠MSCs向心肌样细胞分化的研究》文中研究指明目的和意义移植骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）治疗缺血性心肌病已成为一大热点。研究表明肌特异性miR-1在调控细胞肌分化方面起着关键作用。Notch信号通路参与调控众多细胞生命过程，包括细胞增殖、凋亡和分化。有报道Notch信号通路与miRNAs之间相互作用，miRNAs调控Notch信号通路发挥生物学作用。基于此，我们假设转导miR-1至大鼠MSCs内并调控Notch信号通路来促进MSCs分化为心肌样细胞，为缺血性心肌病的细胞治疗提供可能。方法采用全骨髓贴壁培养法从大鼠骨髓中获得MSCs并观察细胞形态，流式细胞学鉴定MSCs；同时合成携带GFP过表达miR-1慢病毒转导系统(MSCsmiR-1)，对照组只携带GFP；将过表达miR-1慢病毒系统转导大鼠MSCs并培养15天,光镜下观察转导后细胞形态变化；在第0、4、6、15天qRT-PCR检测miR-1、心肌相关基因GATA-4、α-actin、cTnI和Connexin43（Cx43）及Notch信号通路相关基因mRNA的表达变化；免疫荧光观察cTnI和Cx43的表达；Western blotting检测α-actin的蛋白表达。结果原代细胞呈长梭形、漩涡状生长，流式细胞学检测结果显示98%以上细胞表达CD44和CD29，1%以下表达CD45；与对照组相比，MSCsmiR-1组的miR-1的含量明显增高；转导miR-1后，MSCsmiR-1组高表达心肌相关基因：包括GATA-4、α-actin、cTnI和Cx43；转染4天后免疫荧光即可检测cTnI和Cx43在MSCsmiR-1组的一些细胞中表达，并在第15天时表达最强；Western blotting更进一步证实了α-actin在MSCsmiR-1组中的表达。观察转导前后Notch信号通路基因的mRNA水平变化发现，miR-1通过调控配体Jagged1来促进分化；Jagged1的mRNA水平下调负性调控MSCs的肌细胞分化过程，同时我们观察到了Notch1、Notch3和Hey2的mRNA水平下调，这说明，miR-1促进的肌分化过程伴随着Notch信号通路的Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2mRNA水平的显着下调Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2是肌分化过程中Notch信号通路的关键因子，这也许可以用来调控干细胞命运。结论转导miR-1至大鼠MSCs中可促使其向心肌样细胞的分化并伴随下调Notch信号通路Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2的mRNA水平。
二、心脏动脉极的形成（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、心脏动脉极的形成（论文提纲范文）
（1）大动脉转位候选基因DYNC2LI1的发现与功能学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验设备、试剂与耗材 |
| 2.1.1 主要设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要耗材和器械 |
| 2.2 患者样本收取与处理 |
| 2.2.1 患者纳入与排除标准 |
| 2.2.2 血液样本采集和处理 |
| 2.2.3 血液样本DNA提取 |
| 2.2.4 DNA样本的浓度测量与质量控制 |
| 2.3 候选基因的发现 |
| 2.3.1 全外显子组测序 |
| 2.3.2 基因突变负荷分析 |
| 2.3.3 Sanger测序验证 |
| 2.4 体外表达分析 |
| 2.4.1 pIRES2-EGFP-Dync2li1质粒的构建 |
| 2.4.1.1 获得Dync2li1的cDNA序列 |
| 2.4.1.2 CDS区全长克隆 |
| 2.4.1.3 CDS两端加酶切位点 |
| 2.4.1.4 CDS成环 |
| 2.4.1.5 以环状CDS为模板“#突变导入引物”为引物进行PCR扩增 |
| 2.4.1.6 突变产物成环 |
| 2.4.1.7 突变后的CDS两端加酶切位点 |
| 2.4.1.8 针对载体及目的DNA进行酶切处理并回收 |
| 2.4.1.9 将不同突变的目的DNA分别与载体相连接 |
| 2.4.1.10 将连接产物转入大肠杆菌,挑取单克隆并测序 |
| 2.4.2 NIH 3T3细胞的复苏与培养 |
| 2.4.3 pIRES2-EGFP-Dync2li1质粒的转染及表达量分析 |
| 2.4.3.1 细胞转染 |
| 2.4.3.2 样本准备 |
| 2.4.3.3 RNA提取 |
| 2.4.3.4 逆转录 |
| 2.4.3.5 实时荧光定量PCR |
| 2.4.3.6 Western Blot |
| 2.4.4 Dync2li1基因沉默 |
| 2.4.4.1 合成阳性对照siRNA,阴性对照siRNA(非靶向)及Dync2li1靶向siRNA |
| 2.4.4.2 siRNA转染 |
| 2.4.4.4 RNA提取 |
| 2.4.4.5 RNA完整性初步检测 |
| 2.4.4.6 逆转录 |
| 2.4.4.7 实时荧光定量PCR验证 |
| 2.4.5 转录组测序 |
| 2.5 在体功能学研究 |
| 2.5.1 小鼠模型构建 |
| 2.5.2 小鼠胚胎表型观察及心脏免疫染色 |
| 2.5.2.1 胚胎取材、固定 |
| 2.5.2.2 基因型鉴定 |
| 2.5.2.3 基因型判断标准 |
| 2.5.2.4 小鼠胚胎组织脱水 |
| 2.5.2.5 组织包埋 |
| 2.5.2.6 组织石蜡切片 |
| 2.5.2.7 免疫荧光染色 |
| 2.5.2.8 共聚焦显微镜观察并成像 |
| 2.5.3 小鼠胚胎心脏转录组测序 |
| 2.5.3.1 小鼠胚胎取材 |
| 2.5.3.2 基因型鉴定 |
| 2.5.3.3 胚胎心脏取材 |
| 2.5.3.4 TRIzo1法提取胚胎心脏总RNA |
| 2.5.3.5 RNA完整性初步检测 |
| 2.5.3.6 转录组测序 |
| 2.6 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 DYNC2LI1有害突变的发现 |
| 3.2 携带DYNC2LI1突变患者的临床表型 |
| 3.3 不同突变质粒转染的细胞中Dync2li1基因mRNA的表达 |
| 3.4 不同突变质粒转染的细胞中DYNC2LI1蛋白的表达 |
| 3.5 Dync2li1基因沉默后信号通路的富集分析 |
| 3.6 Dync2li1基因敲除小鼠胚胎表型分析 |
| 3.7 Dync2li1基因敲除小鼠胚胎心脏纤毛的染色 |
| 3.8 Dync2li1~(-/-)和Dync2li1~(+/-)胚胎分别与Dync2li1~(+/+)对照胚胎心脏之间的差异表达基因 |
| 第四章 讨论 |
| 综述 心脏流出道的发育研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 流出道的胚胎起源 |
| 2.1 心脏祖细胞 |
| 2.2. 心内膜垫 |
| 2.3. 心脏神经嵴 |
| 3. 影响流出道发育的因素 |
| 3.1 视黄酸信号 |
| 3.1.1 RA是心脏祖细胞分化为OFT心肌所必需的 |
| 3.1.2 细胞RA信号对于不同来源的心肌细胞的影响 |
| 3.2 其它转录因子或细胞信号通路 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）心脏流出道畸形及其发育机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语英汉对照 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 心脏流出道发育 |
| 1.2.1 心脏流出道的结构变化 |
| 1.2.2 第二生心区与流出道发育 |
| 1.2.3 心脏神经脊细胞与流出道发育 |
| 1.3 先天性流出道畸形——大动脉转位 |
| 1.4 本论文主要的研究目标及技术路线图 |
| 1.4.1 本论文主要的研究目标 |
| 1.4.3 本论文的主要研究技术路线图 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 患者样本材料与方法 |
| 2.1.1 Trio样本处理 |
| 2.1.2 DNA提取 |
| 2.1.2.1 样本准备 |
| 2.1.2.2 血细胞DNA提取操作过程 |
| 2.1.2.3 样本质量检测与保存 |
| 2.1.3 患者的纳入与排除标准 |
| 2.1.4 全外显子组文库制备与测序 |
| 2.1.5 生物信息学处理与分析 |
| 2.1.6 Sanger测序验证 |
| 2.2 动物实验材料与方法 |
| 2.2.0 小鼠心脏流出道单细胞制备 |
| 2.2.1 小鼠心脏神经脊单细胞制备 |
| 2.2.2 单细胞文库制备与测序 |
| 2.2.3 生物信息学处理与分析 |
| 2.2.4 单分子荧光原位杂交验证 |
| 2.2.4.1 样本前处理 |
| 2.2.4.2 单分子原位杂交 |
| 2.2.4.3 组织镜检与成像 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 大动脉转位的临床特征和遗传病因 |
| 3.1.1 大动脉转位病例临床特征 |
| 3.1.2 纤毛基因异常是大动脉转位的主要遗传病因 |
| 3.1.2.1 新发突变相关的致病基因 |
| 3.1.2.2 纤毛通路高度富集功能丧失型变异 |
| 3.1.2.3 复合杂合致病基因 |
| 3.1.2.4 X连锁隐性突变 |
| 3.1.2.5 常染色体显性或隐性突变 |
| 3.1.2.6 大动脉转位遗传结构的复杂性 |
| 3.1.3 讨论 |
| 3.2 心脏流出道与心脏神经脊发育单细胞图谱 |
| 3.2.1 心脏流出道发育过程单细胞图谱 |
| 3.2.1.1 心脏流出道发育过程中的细胞多样性和异质性 |
| 3.2.1.2 血管平滑肌细胞呈多源性发育特征 |
| 3.2.1.3 血管平滑肌细胞转分化过程中的关键因子 |
| 3.2.1.4 平滑肌细胞多源性化的发育特征验证 |
| 3.2.2 心脏神经脊细胞单细胞图谱 |
| 3.2.2.1 心脏神经脊细胞后代的空间分布 |
| 3.2.2.2 心脏神经脊细胞在发育过程中的细胞谱系和转录状态 |
| 3.2.2.3 心脏神经脊细胞来源的周细胞转化为微血管平滑肌细胞 |
| 3.2.2.4 心脏神经脊细胞后代在发育过程中转录组变化动态 |
| 3.2.2.5 心脏神经脊细胞后代的代表性细胞亚群 |
| 3.2.3 讨论 |
| 第4章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 先天性心脏病的遗传学研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（3）糖原贮积症GSD0和GSDV斑马鱼疾病模型的构建及其表型分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 人类心脏发育及先天性心脏病 |
| 1.2 斑马鱼作为模式生物的优势及其心脏发育 |
| 1.3 CRISPR/Cas9 基因编辑技术及其在疾病模型中的应用 |
| 1.4 糖原贮积症的种类和研究现状 |
| 1.5 rbpms2a和 rbpms2b简介 |
| 1.6 科学假设及研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 斑马鱼的来源及养殖条件 |
| 2.2 质粒 |
| 2.3 实验相关试剂 |
| 2.4 实验相关仪器 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 敲除靶点和检测用上下游引物的设计 |
| 2.5.2 gRNA的合成 |
| 2.5.3 野生型亲本的筛选 |
| 2.5.4 Cas9 蛋白和g RNA显微注射及敲除效率检测 |
| 2.5.5 F_0 基因敲除嵌合体的筛选 |
| 2.5.6 F_1 成鱼突变类型的检测 |
| 2.5.7 纯合子的筛选及表型观察 |
| 2.5.8 qRT-PCR实验 |
| 2.5.9 PAS糖原染色实验 |
| 2.5.10 原位杂交(In-situ Hybridization)实验 |
| 第三章 糖原贮积症GSD0 基因gys1和gys2 斑马鱼疾病模型的构建及其表型分析 |
| 3.1 gys1和gys2 基因敲除纯合突变体的构建 |
| 3.1.1 敲除靶点和检测用上下游引物的设计 |
| 3.1.2 显微注射及敲除效率检测 |
| 3.1.3 F_0 可遗传性成鱼筛选 |
| 3.1.4 F_1 突变类型的检测 |
| 3.1.5 纯合子的筛选及表型观察 |
| 3.2 PAS糖原染色实验 |
| 3.3 胚胎早期发育时间点qRT-PCR |
| 3.4 组织qRT-PCR |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 糖原贮积症GSDⅤ基因pygma和 pygmb斑马鱼疾病模型的构建及其表型分析 |
| 4.1 pygma和 pygmb基因敲除纯合突变体的构建 |
| 4.1.1 敲除靶点和检测用上下游引物的设计 |
| 4.1.2 显微注射及敲除效率检测 |
| 4.1.3 F_0 可遗传性成鱼筛选 |
| 4.1.4 F_1 突变类型的检测 |
| 4.1.5 纯合子的筛选及表型观察 |
| 4.2 PAS糖原染色实验 |
| 4.3 胚胎早期发育时间点qRT-PCR |
| 4.4 组织qRT-PCR |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 斑马鱼rbpms2a和 rbpms2b基因突变鱼系的构建 |
| 5.1 rbpma2a和 rbpms2b基因敲除纯合突变体的构建 |
| 5.1.1 敲除靶点和检测用上下游引物的设计 |
| 5.1.2 显微注射及敲除效率检测 |
| 5.1.3 F_0 可遗传性成鱼筛选 |
| 5.1.4 F_1 突变类型的检测 |
| 5.1.5 纯合子的获得 |
| 5.2 胚胎早期发育时间点qRT-PCR |
| 5.3 组织qRT-PCR |
| 5.4 胚胎原位杂交 |
| 5.5 讨论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（4）肌动蛋白细胞骨架在小鼠第二生心区祖细胞部署发育中的作用（论文提纲范文）
| 1 小鼠心脏第二生心区 |
| 1.1 第一生心区与第二生心区 |
| 1.2 第二生心区的发现及性质 |
| 2 肌动蛋白细胞骨架 |
| 2.1 Actin细胞骨架及其解聚和加聚动态 |
| 2.2 Actin细胞骨架在细胞迁移、横纹肌中的调控作用 |
| 2.2.1 Actin细胞骨架与细胞迁移 |
| 2.2.2 横纹肌中的actin细胞骨架 |
| 3 Actin细胞骨架在第二生心区祖细胞部署发育中的调控作用 |
| 3.1 Wnt5a-Dvl-PCP通路与SHF祖细胞actin细胞骨架 |
| 3.2 TBX1与SHF祖细胞actin细胞骨架 |
| 3.3 Arid3b与SHF祖细胞actin细胞骨架 |
| 3.4 WDR1与SHF祖细胞actin细胞骨架 |
| 4 结语与展望 |
（5）TBX20基因启动子区甲基化在法洛四联症中的致病机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 研究背景 |
| 第一部分 TBX20基因在法洛四联症患者心肌组织中甲基化及表达差异的研究 |
| 前言 |
| 资料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 TBX20基因相关因子TBX2及BMP2在TOF患者心肌组织的表达研究 |
| 前言 |
| 资料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 学位论文评审及答辩情况表 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 英语文章Ⅰ |
| 英语文章Ⅱ |
（6）Notch信号通路在脐带间充质干细胞治疗扩张型心肌病鼠中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部 分材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 地鼠DCM模型与h UCMSCs治疗用主要试剂 |
| 1.3 HE及Masson染色主要试剂 |
| 1.4 主要设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验分组及实验给药方式 |
| 2.2 超声心动图检查鉴定DCM模型 |
| 2.3 测定地鼠血浆脑利钠肽含量鉴定DCM模型 |
| 2.4 HE染色和Masson染色评估心肌细胞排列及胶原纤维排列 |
| 2.5 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1 DCM地鼠建模后情况 |
| 1.1 一般情况 |
| 1.1.1 生存率变化 |
| 1.1.2 体质量变化 |
| 1.2 各组地鼠超声心动图结果 |
| 1.3 各组地鼠血浆BNP水平 |
| 1.4 HE染色结果 |
| 1.5 Masson染色结果 |
| 讨论 |
| 1 γ-分泌酶抑制剂与扩张型心肌病 |
| 2 DAPT诱导的扩张型心肌病心功能评估 |
| 3 DAPT诱导的扩张型心肌病心肌形态评估 |
| 4 研究不足之处 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部 分材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 DCM模型与h UCMSCs治疗用主要试剂 |
| 1.3 Western Blot检测用主要试剂 |
| 1.4 主要设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DCM大鼠模型 |
| 2.1.1 实验分组及阿霉素给药方式 |
| 2.1.2 超声心动图检查鉴定DCM模型 |
| 2.1.3 测定大鼠血浆脑利钠肽含量鉴定DCM模型 |
| 2.2 hUCMSCs治疗DCM大鼠 |
| 2.2.1 实验分组及干细胞给药方式 |
| 2.2.2 超声心动图检查评估h UCMSCs治疗效果 |
| 2.2.3 测定血浆BNP含量评估h UCMSCs治疗效果 |
| 2.3 Western Blot评估Notch信号通路活化情况 |
| 2.3.1 提取心肌组织中的蛋白 |
| 2.3.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.3.3 SDS-PAGE电泳 |
| 2.3.4 转膜 |
| 2.3.5 显影 |
| 2.4 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1 DCM大鼠建模后情况 |
| 1.1 一般情况 |
| 1.1.1 生存率变化 |
| 1.1.2 体质量变化 |
| 1.2 正常组与模型组大鼠超声心动图结果 |
| 1.3 正常组与模型组大鼠血浆BNP水平 |
| 2 肌肉注射h UCMSCs对DCM大鼠治疗情况 |
| 2.1 肌肉注射h UCMSCs后大鼠一般情况 |
| 2.2 四组大鼠超声心动图结果 |
| 2.3 肌肉注射h UCMSCs后大鼠血浆BNP水平 |
| 3 Notch信号通路下游蛋白表达水平 |
| 3.1 NICD蛋白表达水平 |
| 3.2 Hes1蛋白表达水平 |
| 讨论 |
| 1 阿霉素诱导的扩张型心肌病 |
| 2 h UCMSCs对DCM大鼠的修复作用 |
| 3 Notch通路在h UCMSCs治疗DCM大鼠中的作用 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Notch通路与心室发育和疾病 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（7）Gata6在斑马鱼胰腺和心脏发育中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 斑马鱼的胰腺发育 |
| 1.1.1 斑马鱼胰腺结构及形态发生 |
| 1.1.2 参与胰腺发生的信号通路 |
| 1.1.3 斑马鱼胰腺细胞的分化 |
| 1.1.4 胰腺疾病 |
| 1.2 斑马鱼的心脏发育 |
| 1.2.1 心脏细胞的特化及迁移 |
| 1.2.2 心肌管的延伸及环化 |
| 1.2.3 心脏中瓣膜的形成 |
| 1.2.4 心肌细胞的重塑 |
| 1.2.5 血管形成方式 |
| 1.3 研究目的 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 斑马鱼及其饲养 |
| 2.2 实验仪器、试剂、材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 斑马鱼基因组DNA的提取（NaOH法） |
| 2.3.2 斑马鱼基因组DNA的提取（NP40法） |
| 2.3.3 斑马鱼基因组DNA的提取（SDS法） |
| 2.3.4 斑马鱼RNA提取 |
| 2.3.5 Taq DNA聚合酶制备 |
| 2.3.6 DH5α感受态细胞制备及转化 |
| 2.3.7 PCR |
| 2.3.8 PCR产物清洁 |
| 2.3.9 DNA琼脂糖凝胶电泳及切胶回收 |
| 2.3.10 质粒克隆 |
| 2.3.11 大肠杆菌中质粒提取 |
| 2.3.12 cDNA制备 |
| 2.3.13 RNA探针制备 |
| 2.3.14 mRNA制备 |
| 2.3.15 显微注射 |
| 2.3.16 全胚原位杂交（WISH） |
| 2.3.17 免疫组化（IHC） |
| 2.3.18 冰冻切片 |
| 2.3.19 药物处理 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 gata6突变体的获得及初步消化器官表型分析 |
| 3.2.2 gata6突变体中腹侧胰芽发育缺陷 |
| 3.2.3 gata6突变体中LPM迁移情况 |
| 3.2.4 gata6突变体中Hedgehog信号异常表达 |
| 3.2.5 gata6突变体中心脏流出道发育缺陷 |
| 3.2.6 gata6突变体中gata5的补偿效应 |
| 3.2.7 心脏流出道中空腔形成方式探究 |
| 第四章 总结与讨论 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 斑马鱼腹侧胰芽发育 |
| 4.2.2 gata6调控心脏流出道形成 |
| 4.2.3 研究的新颖性及意义 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文及参与课题 |
（8）转录因子TBX3在小鼠胚胎动脉囊及弓动脉发育过程中的表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本制作 |
| 1.2 免疫组织化学染色PAP法染色 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果 |
| 个人简历 |
（9）HOXA1基因突变与先天性心脏病关系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 0.1 先天性心脏病流行病学调查概况 |
| 0.2 心脏形态学发生的分子机制 |
| 0.2.1 心脏祖细胞定位于胚线前方 |
| 0.2.2 管状心的形成 |
| 0.2.3 第一心域和第二心域 |
| 0.2.4 心脏沿前-后轴向的形成 |
| 0.2.5 心脏左右不对称结构的调控 |
| 0.2.6 心脏成环的分子调控 |
| 0.2.7 心腔形成的转录控制 |
| 0.3 先天性心脏病遗传学研究 |
| 0.3.1 先天性心脏病致病基因识别的分子遗传学技术 |
| 0.3.2 转录因子和信号分子在先天性心脏病中的作用 |
| 0.4 HOX基因的结构与功能 |
| 0.5 HOXA1基因的结构与表达特征 |
| 0.6 HOXA1在先天性心脏病中的研究进展 |
| 第一部分 HOXA1基因在散发型室间隔缺损儿童中突变分析 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 实验材料与方法 |
| 1.2.1 研究对象 |
| 1.2.2 试剂和仪器 |
| 1.2.3 实验方法 |
| 1.2.4 实验步骤 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 PCR结果 |
| 1.3.2 DNA测序结果 |
| 1.3.3 多态位点统计学分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二部分 HOXA1基因在复杂先天性心脏病核心家系中的突变分析 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 实验步骤 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 DNA测序结果 |
| 2.3.2 HOXA1基因五种脊椎动物间聚组氨酸序列保守性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的论文和完成的科研工作 |
| 致谢 |
（10）miR-1介导Notch信号通路调控大鼠MSCs向心肌样细胞分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 器材的灭菌、去 RNA 酶处理 |
| 2.2.2 相关液体的配制 |
| 2.2.3 大鼠 MSCs 分离、扩增培养及鉴定 |
| 2.2.4 大鼠 miR-1 慢病毒过表达载体构建和鉴定 |
| 2.2.5 重组慢病毒载体转染大鼠 MSCs 效率检测 |
| 2.2.6 qRT-PCR 检测心肌相关基因和 Notch 信号通路基因的表达 |
| 2.2.7 免疫细胞化学染色检测 cTnI 和 Cx43 的表达 |
| 2.2.8 Western blotting 检测 α-actin 的表达 |
| 2.3 统计学处理 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 大鼠 MSCs 生长特点 |
| 3.2 大鼠 MSCs 鉴定结果 |
| 3.3 miR-1 慢病毒过表达载体构建 |
| 3.3.1 线性化载体构建 |
| 3.3.2 慢病毒过表达载体鉴定 |
| 3.3.3 miR-1 慢病毒过表达载体包装与滴度检测 |
| 3.3.4 miR-1 慢病毒过表达载体感染大鼠 MSCs 效果 |
| 3.3.5 qRT-PCR 检测 miR-1 的表达结果 |
| 3.4 过表达 miR-1 的慢病毒转染 MSCs 结果 |
| 3.4.1 MSCs 的 miR-1 表达变化 |
| 3.5 心肌相关基因的 mRNA 表达变化 |
| 3.6 免疫荧光观察 cTnI 和 Cx43 的表达 |
| 3.7 Western blotting 检测 α-actin 的表达 |
| 3.8 Notch 信号通路基因的 mRNA 表达水平变化 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论及展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
四、心脏动脉极的形成（论文参考文献）
- [1]大动脉转位候选基因DYNC2LI1的发现与功能学研究[D]. 崔金慧. 北京协和医学院, 2021
- [2]心脏流出道畸形及其发育机制的研究[D]. 陈文. 北京协和医学院, 2020(05)
- [3]糖原贮积症GSD0和GSDV斑马鱼疾病模型的构建及其表型分析[D]. 黄姣. 上海海洋大学, 2019(07)
- [4]肌动蛋白细胞骨架在小鼠第二生心区祖细胞部署发育中的作用[J]. 刘钟颖,黄霞,李紫怡,杨子豪,袁白银. 遗传, 2019(02)
- [5]TBX20基因启动子区甲基化在法洛四联症中的致病机制研究[D]. 杨晓菲. 山东大学, 2018(02)
- [6]Notch信号通路在脐带间充质干细胞治疗扩张型心肌病鼠中的作用[D]. 张彩宁. 青岛大学, 2017(01)
- [7]Gata6在斑马鱼胰腺和心脏发育中的功能研究[D]. 马希睿. 西南大学, 2017(02)
- [8]转录因子TBX3在小鼠胚胎动脉囊及弓动脉发育过程中的表达[D]. 许智慧. 山西医科大学, 2016(08)
- [9]HOXA1基因突变与先天性心脏病关系的研究[D]. 柳江燕. 兰州大学, 2012(04)
- [10]miR-1介导Notch信号通路调控大鼠MSCs向心肌样细胞分化的研究[D]. 邓海燕. 南昌大学, 2012(03)