一、非洲菊花瓣总RNA提取方法的改进（论文文献综述）
夏朝水,江斌,邓永生,陈玮婷,曹奕鸯[1]（2021）在《福建主栽非洲菊品种遗传多样性ISSR分析》文中研究表明利用ISSR技术对35份福建主栽非洲菊资源进行遗传多样性分析。从100条ISSR引物中筛选出多态性好的15条随机引物,分别对35份非洲菊资源基因组DNA进行扩增,共扩增得到78条清晰可辨条带,其中多态性条带70条,多态位点百分比达89.7%。利用DPS软件统计分析,结果表明,各品种间的遗传相似系数介于0.296 8～0.750 0,当阈值为0.420 0时,可将35个非洲菊分成4类。当遗传相似系数为0.491 4时,第I类非洲菊又可分为4个亚类。聚类结果表明,花心颜色和重瓣类型可以作为非洲菊亲缘关系分类的一种依据,同一搜集来源的品种有聚类到一起的趋势,这与农艺性状的聚类结果有一定的对应关系。
林福永[2]（2019）在《滇水金凤CHI与F3’H基因的克隆及表达分析》文中指出滇水金凤是凤仙花科凤仙花属一年生草本植物,主要分布在我国西南及华南地区,花型奇特,颜色绚丽,耐受性强,在园林上有一定的应用价值。花色作为观赏植物较为重要的性状,一直是园林园艺工作者最重要的育种目标之一,同时也是目前的研究热点之一。滇水金凤有白色、红色、粉色和深红色。本文主要针对滇水金凤花青素合成途径中的IuCHI与IuF3’H基因进行研究,采用RT-PCR和RACE-PCR技术分离克隆其cDNA全长,并采用qRT-PCR技术进行实时荧光定量表达,重点分析CHI与F3’H基因的序列特征及其在滇水金凤花色形成过程中的作用。通过实验获得成果如下:（1）以滇水金凤花瓣为材料,提取RNA采用RT-PCR逆转录成cDNA,通过3’-RACE、5’-RACE技术和DNA全基因组扩增获得两个滇水金凤IuCHI基因全长cDNA和内含子,分别命名为IuCHI1和IuCHI2,得到以下结果:IuCHI1基因的cDNA序列全长940bp,外显子741bp,包含三个内含子;IuCHI2基因的cDNA序列全长949bp,外显子747bp,包含三个内含子。通过构建系统发育树发现,IuCHI的两个拷贝聚为一支,分析其亲缘关系较近,在进化过程中比较保守。IuCHI1与IuCHI2的基因结构类似,均具有两个外显子和三个内含子,这与其亲缘关系近进化过程保守相符合。（2）以滇水金凤花瓣为材料,提取RNA采用RT-PCR逆转录成cDNA,通过3’-RACE、5’-RACE技术和DNA全基因组扩增获得三个滇水金凤IuF3’H基因全长cDNA和内含子,分别命名为IuF3’H1、IuF3’H2和IuF3’H3,得到以下结果:IuF3’H1基因的cDNA序列全长1683bp,外显子1560bp,包含两个内含子;IuF3’H2基因的cDNA序列全长1683bp,外显子1560bp,包含两个内含子;IuF3’H3基因的cDNA序列全长1586bp,外显子1560bp,包含两个内含子。通过构建系统发育树发现,IuF3’H2和IuF3’H3聚为一支,而IuF3’H1在另一分支里,推测IuF3’H1可能是IuF3’H2和IuF3’H3的旁系同源。（3）采用qRT-PCR技术对IuCHI基因与IuF3’H基因在红色和白色滇水金凤花的四个发育时期的荧光定量表达分析,可以发现,CHI基因在有色花红色滇水金凤的四个发育时期（花苞期、花苞开放期、盛花期、谢花期）的表达量呈现逐渐上升的趋势,推测CHI基因的表达量可能与红色花色苷的积累有着某种内在的关联;而在无色花白色滇水金凤的四个发育时期,CHI基因在第三时期的表达量最多,其它几个时期的表达量相对较少,推测可能与黄酮类物质的积累有关。F3’H基因在有色花红色滇水金凤每个时期的表达量都比在无色花白色滇水金凤中的表达量要高,推测F3’H的表达量与滇水金凤花色形成的色素积累有一定的关系。
何春艳[3]（2018）在《草地早熟禾花发育相关基因PpCHS1与PpSPL4的克隆和功能分析》文中研究表明本试验分析空间诱变草地早熟禾（Poapratensis L.）矮化突变体A16转录组发现萜类生物合成、植物激素代谢以及次级代谢产物相关通路上的基因转录水平与野生型差异显着,其中类黄酮物质合成关键基因CHS基因家族6个基因都发生变化,以PpCHS1差异最为明显,与花发育相关SPL基因家族含有5个基因,以PpSPL4差异最为明显。同时,本研究发现草地早熟禾空间矮化突变体A16类黄酮物质含量升高,花期推迟、种子颜色加深以及饱和度提高。因此选取PpCHS1和PpSPL4两个基因为研究对象。以草地早熟禾转录组数据为基础,克隆得到Pp-HS1基因cDNA序列。该基因包含查尔酮合成酶超基因家族保守区域,软件分析表明该蛋白属于疏水性蛋白,Ⅲ型聚酮合酶,具有同源二聚体结构,亚细胞定位结果显示该基因编码蛋白定位于细胞质。PpCHS1表达分析表明该基因可能参与草地早熟禾花发育黄酮类物质合成,并受到紫外线和高盐诱导,同时外施MeJA下持续高表达。该基因启动子区域包含多个核心启动子元件TATA-box、CAAT-box,光调控相关的作用元件,植物激素调控元件,以及干旱诱导以及类黄酮物质合成相关MYB转录因子反式作用因子调控序列等。说明该基因响应光、植物激素、以及MYB转录因子等诱导。构建PpCHS1基因植物表达载体,转化拟南芥,获得T2代转基因植株生长发育状况都未出现异常变化,但体内的类黄酮物质含量增加。这表明克隆的PpCHS1基因具有查尔酮合成酶生化功能,但具体生物功能还需进一步研究。本试验克隆得到PpSPL4基因。该基因含有SBP基因家族保守区域,与其他植物SBP基因相似度在67.83%以上。其开放阅读框为961 bp,编码326个氨基酸,等电点为9.07,高级结构分析表明该DNA结合蛋白与AtsSPL4基因相似度最高,亚细胞定位结果显示该基因编码蛋白定位于细胞核,草地早熟禾根状茎、根、茎、叶以及不同花期PpSPL4基因表达分析表明PpSPL4基因在草地早熟禾不同组织相对表达情况存在明显差异,花中相对表达量最高,同时PpSPL4基因受到GA和蔗糖诱导,说明该基因可能为草地早熟禾花发育过程中花芽分化和GA途径相关转录因子。SPL基因家族具有调控黄酮物质合成功能,但草地早熟禾PpSPL4基因是否具有相应功能,还需进一步深入研究。表达分析显示PpCHS1和PpSPL4都参与草地早熟禾花发育,研究PpCHS1和PpSPL4基因可为草地早熟禾种子育种机理研究与育种提供技术理论基础。
陈峥[4]（2017）在《‘华龙非洲菊’VIGS体系的建立及其在基因功能分析上的应用》文中指出非洲菊（Gerbera jamesonii Bolus）作为世界五大鲜切花之一而被广泛种植,然而我国却缺乏具有自主产权且受市场欢迎的非洲菊品种。传统的辐射、诱变或杂交育种技术周期长且缺乏方向性。分子育种不仅可以大大缩短育种周期,也可以定向地改良重要的观赏性状。分子育种需要鉴定基因的功能,然而非洲菊作为非模式物种,对其基因的功能研究还存在很大的挑战。病毒诱导基因沉默（VIGS）技术因其速度快,高通量,不需要遗传转化等优点而被广泛地应用于基因功能的研究。本研究首先应用高效液相色谱（HPLC）测定了台湾509非洲菊及其花色芽变新品种‘华龙非洲菊’（Gerbera jamesonii‘Hualong’）的花青素含量,利用qRT-PCR验证了实验室前期鉴定的差异表达基因并对其中6个基因在花芽发育过程中的表达变化进行了研究,然后构建了‘华龙非洲菊’的VIGS体系,并利用其分析了这些差异表达基因的潜在功能,主要研究成果如下:1、应用HPLC（高效液相色谱）法对两种非洲菊中五种花青素进行测定,两个非洲菊品种均含有天竺葵素3,5-葡萄糖苷（Pel 3,5-glu）、矮牵牛素3-葡萄糖苷（Pet 3-glu）、矢车菊素3-葡萄糖苷（Cya 3-glu）、锦葵素（Mal）;其中矢车菊素的含量最高,分别约为天竺葵素、矮牵牛素和锦葵素素的10倍、20倍和3倍,但两个品种中均未检测到芍药素（Peo）。‘华龙非洲菊’中的四种花青素含量均高于台湾509非洲菊。2、‘华龙非洲菊’和台湾509非洲菊基于转录组分析的与花色调控相关的11条差异表达基因实时荧光定量（qRT-PCR）验证表明,CHS（3个成员,2个CHS1和CHS4）、F3’H、F3H、F3’5’H、ANS、ANT、UFGT、PDS、GST的表达情况一致。除F3’5’H在‘华龙非洲菊’花瓣中的表达下调外,其余10个基因均表达上调。基因在不同发育时期的表达与花色的形成有一定的相关性。GhCHS1,GhCHS4的表达积累在花芽发育前期少,后期逐渐增加;GhCHS1在花芽发育第7期相对表达量达到峰值,GhCHS4在第10期相对表达量达到峰期,而后都呈现下调表达趋势。GhF3H、GhGST、GhF3’H、GhUFGT的表达几乎贯穿整个花芽发育过程,其中GhF3H、GhGST、GhUFGT在花芽发育第10期表达量达到峰期,呈现先上升后下降的表达模式,这可能与第11期盛放花朵步入衰老过程有关;而GhF3’H基因的表达模式无明显的规律性,其在花芽发育各个时期均有较高的相对表达量。3、构建了TRV2-LIC-GhPDS重组病毒载体并侵染‘华龙非洲菊’幼苗叶片,沉默PDS基因后,叶片出现光漂白现象,表明‘华龙非洲菊’的VIGS体系构建成功。进一步应用VIGS技术沉默了非洲菊的6个基因（GhCHS1、GhCHS4、GhF3H、GhF3’H、GhUFGT、GhGST）后,发现沉默后‘华龙非洲菊’舌状花瓣颜色出现不同程度变浅的表型,目的基因的表达水平均呈现不同程度的下调（83%-95%）。CHS和F3H基因是主导‘华龙非洲菊’花色苷生物合成积累的关键基因,有效促进类黄酮物质的积累,推测橙色系非洲菊舌状花瓣的花色形成前期主要由CHS1调控黄酮类物质积累,后期花色苷的积累主要由CHS4基因表达调控;F3’H和UFGT基因,其因转录活性高,有利于催化有色矢车菊素合成的前物质及花青素糖苷化稳定表达物质的积累而使‘华龙非洲菊’着色;GST主要参与‘华龙非洲菊’花色苷的转运;综上基因的表达差异是‘华龙非洲菊’花色变异的主要原因。本研究成功构建了‘华龙非洲菊’的VIGS技术体系,并成功应用于部分花色相关基因的功能分析。本体系的成功构建为全面研究非洲菊的基因功能奠定了基础,有利于实现并促进非洲菊的快速的定向分子育种。
亓帅[5]（2017）在《甘菊和菊花头状花序上花发育相关基因表达模式分析》文中指出菊花（Chrysanthemum ×morifolium）的花是由舌状花和管状花两种小花着生在肉质花托上构成的头状花序。头状花序的结构非常复杂,由外到内分别为总苞、花托、舌状花、管状花,其中两种小花的分化和发育是栽培菊花千姿百态花型形成的基础。两类小花在相同的遗传背景下,在着生位置、性别、对称性、器官融合、色素成分上均存在显着差异。目前对于高等植物拟南芥（Arabidopsis taliana）和金鱼草（Antirrhinum majus）等模式植物的花发育调控模型已经有了较为明确的认识,但迄今为止,关于高等植物花器官发育的遗传调控模型尚无法解释菊花头状花序花器官的遗传调控模式,以及在相同遗传背景下两类小花分化和发育的调控机制,这也限制了菊花实现花型改良的定向育种。由于菊花遗传背景背景复杂,花型多变,本文作者以菊花近缘种之一的二倍体植物甘菊（Chrysanthemum lavandulifolium）作为研究头状花序结构的模式植物。以甘菊两类小花的分化入手,对头状花序上两类小花的不同发育阶段进行转录组测序分析,分离花器官发育相关基因并对其在甘菊和菊花头状花序上的表达模式进行研究;通过构建甘菊遗传转化体系以进行基因功能分析;运用酵母双杂交的方法对对花器官发育相关蛋白之间的互作模式进行探究。基于此,构建甘菊和菊花花器官发育的遗传调控模型。本研究获得了以下主要结果:（1）利用4个软件（Bestkeeper,NormFinder,GeNorm和Reffinder）对9个候选内参基因稳定性进行评估。结果表明,SAND（SAND family protein）在甘菊花发育过程中各组织间最稳定;大菊品种间SAND和PGK（Phosphoglyceratekinase）稳定性最高;小菊品种间PGK稳定性最高。同时作者还发现,在菊花不同品种内最佳的内参基因也存在差异:PGK基因在4个菊花品系（LFC2、LFC3、SC1、SC2）内部表现最好;F-box（F-box protein）、Actin（Actin related protein 2）、MTP（Metalloprotease）则分别为3个菊花品系（LFC1、LFC4、SC3）中稳定性最高。建议选择某一菊花品种时,有必要对该品种的内参基因进行筛选。此外,作者通过分析DFR（dihydroflavonol 4-reductase）和CYF（lycopene e-cyclase）同源基因的相对表达量验证内参基因的有效性。这一研究为菊花花发育相关基因表达研究提供了稳定的内参基因资源。（2）以两个发育阶段的甘菊舌状花和管状花为实验材料,运用新一代高通量测序技术（NGS）进行转录组分析。共获得47893条unigenes,平均长度达到1772bp。共有4161 1 条unigenes（86.88%）可以被Nt、Nr、KEGG、Swissprot和eggNOG中的一个数据库注释。分别比较不同发育阶段的舌状花和管状花,发现分别有16和411条unigenes在舌状花和管状花中高表达。比较两类小花的发育过程,上调的基因均多于下调的基因,说明更多的基因是随着花发育表达量升高的。（3）对两类小花的比较研究发现,ClCYC2-like基因、B类MADS-box基因ClAP3、ClP1在舌状花中表达量要高于管状花,而C类MADS-box基因ClAG1、ClAG2以及花粉发育相关基因在舌状花中的表达量低于管状花。通过对转录组的分析,作者还发现个别激素合成相关基因在两类小花不同发育阶段之间表现出规律的表达变化:一个赤霉素合成相关基因在两类小花中均可以随着发育而表达明显上调;生长素合成基因有八个unigenes表现出表达差异,其中四个随舌状花开放上调,四个随管状花开放上调;PIN是生长素相应的一类重要转录因子,PIN的表达随着管状花开放而上调;茉莉酸有四个基因在舌状花中随着开放上调,而细胞分裂素和乙烯各有两个基因和三个基因随舌状花开放下调。通过在菊花两类小花中的表达验证发现,菊花和甘菊舌状花与管状花间的基因表达模式相同。同时还发现,在菊花的桂瓣类小花中ClAG1、ClAG2、ClCYC2-like基因的表达水平介于舌状花与管状花之间。（4）从转录组数据中分离到11个甘菊花器官发育相关基因的cDNA全长,包括7个花器官发育的同源异型基因和CYC同源基因。对甘菊和菊花头状花序上7个不同的花器官（总苞、花托、胚珠、舌状花花冠、管状花花冠、雄蕊、雌蕊）的基因表达模式进行了探究。总苞中高表达的基因主要为DenFUL、ClCYC1和ClCYC3;花托中高表达的基因主要为DenFUL、ClAP2、ClSEP1、ClSEP3;舌状花花冠中高表达的基因包括ClAP3、ClPI、ClSEP1、ClSEP3和4个CYC2-like基因;管状花花冠中高表达的基因主要包括 ClAP3、ClPI、ClAG1、ClAG2、ClSEP1、ClSEP3和 DenFUL;ClAP2在雄蕊中明显高表达,其次还有ClCYC2和ClCYC4;雌蕊中高表达的基因主要包括DenFUL、ClAG1、ClAG2、ClSEP3和3个CYC2-like基因;胚珠中高表达的基因包括ClAP2、ClSEP1和3个CYC2-like基因。甘菊和菊花中花器官发育相关基因的表达模式基本一致。部分基因在甘菊和菊花中的表达模式也表现出一定差异,如ClAP2在甘菊胚珠中表达量最高,在小菊SC1中,雄蕊为表达量最高的器官;C类基因在菊花SC1中在胚珠和雌蕊的表达量均较高,而在甘菊胚珠中则较低。据此,作者提出高等植物花器官发育的同源异型基因在菊花头状花序的发育过程中表达分布方式与模式植物不同。（5）运用酵母双杂交的方式对蛋白之间的互作关系进行了分析。结果显示甘菊花器官发育相关多个蛋白之间可以通过相互作用形成二聚体,包括六对互作蛋白:DenFUL和 C1AG2、C1AP2和 C1SEP1、C1AP3 和 C1PI、C1CYC1 和 C1CYC2、DenFUL和C1CYC2、C1AP2和C1CYC1。此外,还有很多蛋白之间证明存在单向互作。由此说明菊花头状花序发育过程调控基因之间存在复杂的互作关系,即同源异型基因内部存在互作、ClCYC2-like基因成员之间存在互作、同源异型基因和ClCYC2-like基因成员之间也存在互作。（6）在已经建立的甘菊下胚轴再生体系的基础上,以甘菊下胚轴为外植体,对影响转化体系的5个因素进行筛选,尝试利用农杆菌介导的方法获得最佳转化体系。甘菊下胚轴在不经过预培养,农杆菌浓度OD600=0.4时浸染10 min,共培养2 d,延迟培养1 d时抗性芽分化率和转化率均最高。通过卡那霉素抗性筛选及PCR检测,获得45株PCR阳性植株,阳性转基因植株频率为5%,并获得6株PCR阳性转ClCYC3基因株系。建立甘菊高效的转化体系可以为后续基因功能验证提供很好的技术基础。根据上述研究结果,作者提出高等植物花器官发育相关同源基因在菊科植物头状花序上的表达发生了重新分布,其中CYC2-like基因、B类和C类MADS-box基因可能参与调控了甘菊和菊花头状花序两类小花的分化,并据此构建了菊花头状花序上花器官发育相关基因的表达模型。
史倩倩[6]（2015）在《基于转录组测序滇牡丹花色形成分子调控机理研究》文中研究说明滇牡丹（Paeonia delavayi Franch.）为芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia）牡丹组（Sect.Moutan DC.）落叶亚灌木,是中国西南地区的特有种。滇牡丹具有丰富的花色变异,是一种极具观赏价值和开发潜力的野生花卉资源。本研究采用HPLC色素分析法、转录组测序和qRT-PCR方法,分析了滇牡丹不同花色主要花色素组分,筛选出滇牡丹花色素合成途径中的关键基因及转运基因,构建滇牡丹花色素代谢通路,从而探讨滇牡丹不同花色形成的分子机理,为制定高效的牡丹育种策略并为其分子辅助育种提供理论依据,。主要结果如下:（1）色素成分分析结果显示在黄色花花瓣中Chalcone2’G的含量最高,是其黄色形成的主要原因。黄色花花瓣花色参数受Km3G7G、Ap7Neo、Is3G和Chalcone2’G影响较大。在紫红色花瓣中,花青苷中的Pn3G5G、Pn3G、Cy3G是其紫红色形成的主要原因。黄色花瓣的花色素总含量在花发育早期不断上升,在‘透色期’达到最高峰,然后下降;紫红色花瓣的黄酮/查耳酮类总含量不断上升,在‘初开期’最高,然后下降,而花青苷总含量一直不断升高。（2）采用Illumina技术对滇牡丹花瓣转录组进行了测序和分析,经组装后共获得90,202个Unigene,平均长度721bp。经同源比对共有44,811个（49.68%）获得注释,并对这些基因进行了GO、COG、KEGG等分析。对黄牡丹和紫牡丹花瓣转录组中差异表达的6,855个Unigene进行分析,发现有3,430个上调基因和3,425个下调基因。在此基础上,通过表达差异分析和qRT-PCR验证,证明F3H、DFR、ANS和3GT的高表达在紫牡丹花瓣的花色形成中起关键作用,而THC2′GT、CHI和FNS II的高表达可促进黄牡丹中异杞柳苷的积累而使花瓣呈现黄色。另外还检测到了与花色素生物合成相关的表达差异的转录因子（R2R3-MYB,bHLH,WD40）。（3）筛选出了适用于不同花色牡丹在不同时期和不同组织的内参基因。当所有样本一起分析时,PP2A,UPL和UBQ被认为是最稳定的基因;helicase,TUA和EIF5A在不同组织,不同花色和不同发育时期的样本中表达也较稳定。根据geNorm的分析结果,在所有试验样本组合中,两个稳定性最好的内参基因组合进行标准化的效果最好。（4）利用qRT-PCR技术分析了滇牡丹转录组数据中差异表达基因中与花色形成相关的关键酶基因的表达模式,结果表明PlCHS3、PlCHI1、PlDFR1、PlF3H1、PlANS1主要负责紫红色的类黄酮合成,PlCHS1、PlCHI2、PlTHC2’GT、PlFNS1参与黄色花类黄酮合成途径,PlFLS1、Pl3GT1和Pl7GT1共同参与了黄色花和紫红色花类黄酮合成途径。并且推断出滇牡丹类黄酮合成途径:黄色花和紫红色花的类黄酮合成途径是两个不同的分支。（5）通过对转录组数据库中注释的MYB、bHLH和WDR转录因子进行筛选,发现PlbHLH3、PlWDR3、PlWDR18和PlMYB1通过调节滇牡丹类黄酮合成途径的下游结构基因,如PlDFR1、PlF3H1、Pl3GT1和PlANS1,调控滇牡丹花色素的合成。（6）本研究从滇牡丹中分离得到滇牡丹黄色花的谷胱甘肽转移酶（GST）基因家族的10个成员,其中PlGST5被推断为滇牡丹花色素相关转运体,可进一步用于花色素转运及积累机制的研究。综上所述,本研究首次分析了滇牡丹黄色花和紫红色花花瓣花色素各组分在花瓣发育过程中的变化趋势,并在滇牡丹黄色花和紫红色花花色值与花色素成分及含量的相关性分析基础上,运用Illumina测序技术对黄色花和紫红色花花瓣进行转录组测序,获得大量基因信息,其中包括类黄酮生物合成途径仍未开发的功能基因和转录因子。利用qRT-PCR技术分析了二者的类黄酮合成途径中差异基因的表达模式,花色形成相关转录因子的表达模式,并筛选出花色素转运体。这些结果对于今后加快利用滇牡丹这一珍稀基因资源开展牡丹分子育种的研究具有重要意义。
张雪,官丽莉,韩怡来,杨晶,杜林娜,李校堃[7]（2015）在《红花花瓣总RNA提取方法的比较研究》文中认为红花花瓣富含多糖、多酚和花色素苷等次生代谢产物,严重影响花瓣总RNA的提取。为探索适合红花花瓣总RNA的提取方法,以4种红花不同时期的花瓣为材料,通过对4种RNA提取方法,即RNA提取试剂盒、RNAiso Plus试剂法、改良的CTAB法和SDS法进行比较研究。结果表明:RNAiso Plus试剂法效果最好,提取的总RNA完整性好,纯度高、浓度高。通过RT-PCR验证,所提取的RNA达到基因克隆和实时定量PCR等分子生物学实验要求。
夏朝水[8]（2014）在《福建主栽非洲菊品种资源的综合评价与应用》文中研究表明非洲菊（Gerbera jamesonii Bolus）是世界五大鲜切花之一,在国内外市场上非常畅销,备受消费者的青睐。目前福建省主栽的非洲菊品种都是从外地引进,存在适应性较差、品种退化严重、缺乏自主研发的新品种等问题。因此,进行福建主栽非洲菊品种资源的评价与应用研究,对本省非洲菊的引种、资源评价、育种、生产推广等都有重要意义。本研究分析了福建主栽非洲菊品种资源农艺性状遗传多样性,并利用ISSR-PCR技术在分子水平上对其遗传多样性进行系统的研究；根据这两个研究结果结合市场分析,筛选4个非洲菊品种间进行育种试验研究。主要研究结果如下：1、农艺性状遗传多样性研究用系统聚类法对13个农艺性状指标进行分析,构建遗传距离树状图,发现当绝对值距离在37.5-58.6范围时,35份非洲菊资源根据叶片的长宽、花心颜色、花瓣类型等性状的不同分为3个类群；当绝对值距离在26.4-37.5之间时,第Ⅲ类群又可分为3个亚类,第Ⅰ亚类为叶长,叶宽,花梗,花序直径相比于别的类群更加短小绿心紫,第Ⅱ亚类共同特点花心黑色、花瓣数少于45片、外瓣长度较长,第Ⅲ亚类包含27份资源,根据瓣型、花心颜色及搜集地不同又可分为五小类。本试验通过对非洲菊农艺性状聚类分析结合表型分析发现,供试材料大致可根据瓣型、花心颜色的不同进行分类,且同一搜集地的大部份品种有聚类在一起的趋势。2、ISSR遗传多样性研究用ISSR技术对35份福建主栽非洲菊资源进行遗传多样性分析。从100条ISSR引物中筛选出多态性好的15条随机引物,分别对35份非洲菊资源基因组DNA进行扩增,共扩增得到78条清晰可辨条带,其中多态性带70条,多态位点百分比达89.7%。利用DPS软件统计分析,结果表明,各品种间的遗传相似系数介于0.2968-0.75之间,当阀值为0.42时,可将35个非洲菊分成4类。当遗传相似系数为0.4914时,第1类非洲菊又可分为4个亚类。聚类结果表明,花心颜色和重瓣类型可以作为非洲菊亲缘关系分类的一种依据,同一搜集来源的品种有聚类到一起的趋势,这与农艺性状的聚类结果有一定的对应关系。3、非洲菊部分性状的遗传研究利用不完全双列杂交原理把M20（重瓣）、S21（单瓣）、S24（半重瓣）和M32（半重瓣）四个非洲菊品种配制成12个组合,进行品种选育研究发现,单瓣或半重瓣品种与重瓣品种杂交的结籽率明显低于单瓣和半重瓣品种之间杂交的结籽率,且平均结籽数也低于后者；非洲菊种子的发芽率都不高,平均发芽率为46.4%,其中早S24×♂M32的种子发芽率最高为65.9%,♀S21×♂M32的种子发芽率最低为22.3%。通过观测非洲菊的花色、花心、花径、瓣型等性状,初步筛选出4个红色黑心系的新品种,并对其花色、瓣型、花心颜色、花梗长度与舌状花花瓣数进行数据观测及统计。
吴田,蓝增全[9]（2014）在《5种植物花瓣ACS基因的克隆与分析》文中认为分析已发表的植物1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）合成酶（ACS）基因序列,设计一对简并引物,在随机选择的非洲菊、月季、桂花、茶梅和山茶等5种植物花瓣cDNA中进行PCR扩增.结果表明,在5种植物花瓣中都能扩增出约800 bp的特异片段,登录GenBank发现均未被注册,因此将序列提交到GenBank并获得了序列号.在NCBI上进行Blast比对,发现所克隆的5个ACS基因均与其他植物花瓣的ACS基因有一定的序列相似性,最高达94%,最低为80%.将5个ACS基因的片段进行多序列比较分析,发现茶梅ACS基因与山茶ACS基因的序列差异最小,序列相似性达99%.本试验设计的ACS基因简并引物在植物中有一定的通用性,后续可以适当调整引物的简并度,以得到高通用性的简并引物.
褚云霞[10]（2014）在《不同DFR基因转化矮牵牛研究》文中进行了进一步梳理高等植物的花色主要受花色素控制，花色素主要由类黄酮、类胡萝卜素、生物碱三类物质组成，其中类黄酮包括原花青素、花青素苷、查尔酮等12类。在花青素苷合成途径中二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR）对花色素苷的最终形成起决定性作用。矮牵牛DFR主要催化DHM生成无色飞燕草素，对DHQ也有作用，而不能催化DHK，致使不存在天竺葵素的积累。小花矮牵牛是矮牵牛的同科近缘种，由于小花矮牵牛与矮牵牛亲缘关系较近，DFR基因转入更有希望改变矮牵牛花色。本研究克隆了2个不同花色矮牵牛株系的DFR，全长均为1473bp，最大开放读码框为1143bp，编码380个氨基酸。与NCBI公布的DFR-A相似性分别为93.8和99.6%，翻译后的氨基酸组成相似性为98.2%和100%，验证了矮牵牛DFR属Asp型。实时荧光PCR相对定量测定表明矮牵牛DFR在叶片中几乎无表达，在初开花瓣中表达量最大，而盛开花瓣中略有下降，花药中有极高的表达活性；除花药以外，DFR酶活性变化规律与表达基本一致，两者存在线性相关性。内源DFR酶活性在不同株系中表现差异较大，其中‘W115’中仅有较低酶活性，而‘Lx’中酶活性最大，‘2512’和‘9702’中的酶活性较接近，约为‘Lx’的1/10。UPLC测定中仅在‘9702’中检测到矢车菊素-3-葡萄糖苷及飞燕草素存在。通过RACE技术获得小花矮牵牛DFR cDNA序列，生物信息学分析发现CaDFR属于Asp型，第145位是谷氨酸。同时构建了小花矮牵牛、番茄、月季、非洲菊DFR基因的CaMV35S启动子正向表达载体，通过根癌农杆菌LBA4404对4个矮牵牛株系进行转化，以50mg/L卡那霉素为矮牵牛的筛选浓度。经PCR检测约57%抗性苗为阳性株，Southern杂交证实分别转入了1～5拷贝的外源基因。T0代花色改变明显，其中LH26·一个分枝花色不变，另一分枝则为白花带紫斑，‘LR25’为紫红色花，‘9R9’、‘9H33’花药变紫，花色为深红色，‘9T19’、‘9H31’花色为粉红相间的杂斑花，‘9R8·、‘9H30’红色花瓣带粉斑，‘9R12’花颜色加深同时在边缘出现一圈斑纹，‘9T18’则完全变为粉色花。21株‘WR’为粉色花，而且从花蕾幼期直到开花全过程中均为粉色，‘WR13·开出了一半白色一半粉色的花。对‘9H33’和‘9R9’的表达分析表明，外源DFR基因在矮牵牛中的表达远高于内源基因，最高可达64倍，在初开花瓣中都有相对高的表达，但峰值出现的时间因基因不同而有差异。不同来源的DFR在矮牵牛中的表达对酶活性影响不同。外源DFR基因的转入，可明显提高酶活性，同时使酶的合成提前，分别在初开花瓣或盛开花瓣中达到最高峰。DFR酶活性与颜色存在较大相关性，颜色越深酶活性越高，且紫色株系较红色株系具更高的酶活性。花青素苷的UPLC检测证实颜色加深的转化子‘9R9’、‘9H33’、‘9R12’在矢车菊素-3-葡萄糖苷含量大幅增加的同时，出现天竺葵素-3-葡萄糖苷吸收峰。在‘9702’转化子中，DFR酶活性与花青素苷含量呈现出正相关。T1代表型很明显，14株‘9H30’子代有4种表型；9R9·子代有5株开出了深红花瓣、紫色花药的花（与T0相似），5株花色与‘9702’相似。PCR检测结果表明：T1植株47.76%能检测到目的条带。可见，外源DFR基因在矮牵牛中可以遗传。
二、非洲菊花瓣总RNA提取方法的改进（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、非洲菊花瓣总RNA提取方法的改进（论文提纲范文）
（1）福建主栽非洲菊品种遗传多样性ISSR分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 基因组DNA的提取 |
| 1.2.2 引物筛选与PCR扩增 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ISSR随机引物的确定 |
| 2.2 ISSR扩增产物的多态性 |
| 2.3 聚类分析和亲缘关系 |
| 3 讨论 |
（2）滇水金凤CHI与F3’H基因的克隆及表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 花色苷生物合成途径 |
| 1.1.1 调节基因研究概况 |
| 1.1.2 结构基因研究概况 |
| 1.2 滇水金凤介绍及研究概况 |
| 1.3 研究的目的及意义 |
| 2 滇水金凤CHI基因的克隆及序列分析 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种和载体 |
| 2.1.3 主要药品 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 滇水金凤总RNA的提取 |
| 2.2.3 滇水金凤CHI基因3’端c DNA序列片段克隆 |
| 2.2.4 滇水金凤CHI基因5’端c DNA序列片段克隆 |
| 2.2.5 滇水金凤CHI基因PCR产物的检测和回收纯化 |
| 2.2.6 PCR产物连接 |
| 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.2.8 PCR产物转化 |
| 2.2.9 菌液鉴定 |
| 2.2.10 序列拼接 |
| 2.3 数据分析与软件应用 |
| 2.3.1 基因全长的拼接及序列分析 |
| 2.3.2 蛋白质结构特性分析 |
| 2.3.3 密码子偏好性分析 |
| 2.3.4 构建系统进化树 |
| 2.4 CHI基因分离克隆分析 |
| 2.4.1 滇水金凤总RNA电泳检测 |
| 2.4.2 滇水金凤CHI基因3’端c DNA克隆 |
| 2.4.3 滇水金凤CHI基因5’端c DNA克隆 |
| 2.4.4 滇水金凤CHI基因全长c DNA克隆 |
| 2.4.5 滇水金凤DNA电泳检测 |
| 2.4.6 滇水金凤CHI基因全长基因组DNA扩增 |
| 2.5 滇水金凤CHI基因蛋白质分析 |
| 2.5.1 蛋白质理化性质分析 |
| 2.5.2 密码子偏好性分析 |
| 2.5.3 蛋白质亲疏水性预测 |
| 2.5.4 信号肽结构分析结果 |
| 2.5.5 跨膜结构分析结果 |
| 2.5.6 蛋白质二级结构分析 |
| 2.5.7 蛋白质三级结构结构分析 |
| 2.6 滇水金凤CHI基因c DNA序列相似性分析 |
| 2.7 滇水金凤CHI基因的系统进化分析 |
| 3 滇水金凤F3'H基因的克隆及序列分析 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌种和载体 |
| 3.1.3 主要药品 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 滇水金凤总RNA的提取 |
| 3.2.3 滇水金凤F3'H基因3’端c DNA序列片段克隆 |
| 3.2.4 滇水金凤F3'H基因5’端c DNA序列片段克隆 |
| 3.2.5 滇水金凤F3'H基因PCR产物的检测和回收纯化 |
| 3.2.6 PCR产物连接 |
| 3.2.7 大肠杆菌感受态细胞 |
| 3.2.8 PCR产物转化 |
| 3.2.9 菌液鉴定 |
| 3.2.10 序列拼接 |
| 3.3 数据分析与软件应用 |
| 3.3.1 基因全长的拼接及序列分析 |
| 3.3.2 蛋白质结构特性分析 |
| 3.3.3 密码子偏好性分析 |
| 3.3.4 构建系统进化树 |
| 3.4 F3'H基因分离克隆分析 |
| 3.4.1 滇水金凤总RNA电泳检测 |
| 3.4.2 滇水金凤F3'H基因3’端c DNA克隆 |
| 3.4.3 滇水金凤F3'H基因5’端c DNA克隆 |
| 3.4.4 滇水金凤F3'H基因全长c DNA克隆 |
| 3.4.5 滇水金凤DNA电泳检测 |
| 3.4.6 滇水金凤F3'H基因全长基因组DNA扩增 |
| 3.5 滇水金凤F3'H基因蛋白质分析 |
| 3.5.1 蛋白质理化性质分析 |
| 3.5.2 密码子偏好性分析 |
| 3.5.3 蛋白质亲疏水性预测 |
| 3.5.4 信号肽结构分析结果 |
| 3.5.5 跨膜结构分析结果 |
| 3.5.6 蛋白质二级结构分析 |
| 3.5.7 蛋白质三级结构结构分析 |
| 3.6 滇水金凤F3'H基因c DNA序列相似性分析 |
| 3.7 滇水金凤F3'H基因的系统进化分析 |
| 4 滇水金凤CHI与 F3’H基因荧光定量表达分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验试剂 |
| 4.3 实验步骤 |
| 4.3.1 总RNA提取及完整性与纯度鉴定 |
| 4.3.2 c DNA第一链合成 |
| 4.3.3 引物设计 |
| 4.3.4 实时荧光定量PCR反应 |
| 4.3.5 荧光定量PCR检测 |
| 4.4 实验结果分析 |
| 4.4.1 RNA质量 |
| 4.4.2 滇水金凤CHI和 F3'H基因的表达特性 |
| 5 结论与讨论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附图 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
（3）草地早熟禾花发育相关基因PpCHS1与PpSPL4的克隆和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 类黄酮物质的合成 |
| 1.1.2 类黄酮物质合成的调控 |
| 1.1.3 类黄酮物质生物功能与植物生长发育相关研究进展 |
| 1.1.3.1 类黄酮物质作为生长素调节剂 |
| 1.1.3.2 类黄酮物质参与种子形成过程 |
| 1.1.3.3 类黄酮物质参与植物果实发育 |
| 1.1.3.4 类黄酮物质参与植物花粉发育 |
| 1.1.3.5 类黄酮物质与花色 |
| 1.1.3.6 类黄酮物质还参与植物与微生物交流和感化作用 |
| 1.1.3.7 类黄酮物质参与植物胁迫 |
| 1.1.4 CHS基因研究进展 |
| 1.1.5 SPL基因研究进展 |
| 1.2 研究内容、目的与意义 |
| 1.3 技术路线 |
| 2 空间诱变草地早熟禾突变体类黄酮物质变化相关分析及花期、种子特性观察 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 植物材料种植方法 |
| 2.2.2 空间诱变草地早熟禾突变体转录组数据分析 |
| 2.2.3 空间诱变草地早熟禾突变体类黄酮物质含量测定 |
| 2.2.4 空间诱变草地早熟禾突变体测定花期、育性观察 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 空间诱变草地早熟禾突变体转录组数据分析 |
| 2.3.2 空间诱变草地早熟禾突变体类黄酮物质总量测定 |
| 2.3.3 空间诱变草地早熟禾突变体测定花期、种子特性观察 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 空间诱变草地早熟禾突变体转录组数据分析 |
| 2.4.2 空间诱变草地早熟禾突变体类黄酮物质升高 |
| 2.4.3 空间诱变草地早熟禾突变体测定花期、种子特性观察 |
| 3 草地早熟禾PpCHS1、PpSPL4基因克隆及生物信息学分析 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 植物材料种植 |
| 3.2.2 草地早熟禾RNA的提取和cDNA合成 |
| 3.2.3 草地早熟禾cDNA的合成 |
| 3.2.4 PpCHS1基因克隆 |
| 3.2.5 PpCHS1基因的ORF框克隆 |
| 3.2.6 PpSPL4基因克隆 |
| 3.2.7 PpCHS1、PpSPL4基因生物信息学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PpCHS1cDNA序列 |
| 3.3.2 PpCHS1编码蛋白生物信息学分析 |
| 3.3.3 PpCHS1编码蛋白序列比对分析 |
| 3.3.4 PpCHS1编码蛋白进化树分析 |
| 3.3.5 PpSPL4 cDNA序列 |
| 3.3.6 PpSPL4编码蛋白生物信息学分析 |
| 3.3.7 PpSPL4编码蛋白序列比对分析 |
| 3.3.8 PpSPL4编码蛋白进化树分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 基因克隆 |
| 3.4.2 基因生物信息学分析 |
| 3.4.2.1 PpCHS1基因生物信息学分析 |
| 3.4.2.2 PpSPL4基因生物信息学分析 |
| 4 草地早熟禾PpCHS1基因启动子克隆和分析 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 CTAB法提取草地早熟禾DNA |
| 4.2.2 PpCHS1基因启动子序列分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 启动子克隆 |
| 4.4.2 PpCHS1基因启动子序列分析 |
| 5 草地早熟禾PpCHS1、PpSPL4基因表达分析 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 材料处理 |
| 5.2.2 PpCHS1、PpSPL4基因实时荧光定量 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 PpCHS1基因表达分析 |
| 5.3.1.1 PpCHS1组织表达模式 |
| 5.3.1.2 PpCHS1在外源诱导下表达分析 |
| 5.3.2 PpSPL4表达分析 |
| 5.3.2.1 PpSPL4组织表达模式 |
| 5.3.2.2 PpSPL4外源诱导下表达分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 PpCHS1基因外源诱导与功能分析 |
| 5.4.2 PpSPL4基因组织表达分析和外源诱导 |
| 6 草地早熟禾PpCHS1、PpSPL4基因表达载体构建及亚细胞定位 |
| 6.1 材料与试剂 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 GFP植物表达载体的构建 |
| 6.2.2 PpCHS1植物表达载体的构建 |
| 6.2.3 PpSPL4植物表达载体的构建 |
| 6.2.4 质粒的提取 |
| 6.2.5 农杆菌GV1301感受态的制备 |
| 6.2.6 农杆菌落PCR鉴定及测序 |
| 6.2.7 烟草瞬时表达进行亚细胞定位 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 植物表达载体转化农杆菌GV3101菌株鉴定 |
| 6.3.2 PpCHS1基因编码蛋白的亚细胞定位 |
| 6.3.3 PpSPL4基因编码蛋白的亚细胞定位 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 PpCHS1基因亚细胞定位 |
| 6.4.2 PpSPL4基因亚细胞定位 |
| 7 草地早熟禾PpCHS1基因对拟南芥转化及分析 |
| 7.1 材料与试剂 |
| 7.2 试验方法 |
| 7.2.1 拟南芥种植方法 |
| 7.2.2 拟南芥花序侵染法 |
| 7.2.3 T_1代转基因拟南芥筛选 |
| 7.2.4 T_2代转基因拟南芥筛选 |
| 7.2.4.1 T_2代转基因拟南芥抗性筛选 |
| 7.2.4.2 DNA水平检测 |
| 7.2.4.3 mRNA水平检测 |
| 7.2.5 观察获得T_2代转基因植株生长情况 |
| 7.2.6 转基因拟南芥中总类黄酮物质测定 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 转基因拟南芥筛选 |
| 7.3.2 T_2代转基因拟南芥筛选DNA水平鉴定 |
| 7.3.3 T_2代转基因拟南芥筛选mRNA水平鉴定 |
| 7.3.4 观察获得的T_2代转基因植株的生长情况 |
| 7.3.5 T_2代转基因拟南芥中总类黄酮物质测定 |
| 7.4 讨论 |
| 7.4.1 拟南芥花序转化法 |
| 7.4.2 草地早熟禾PpCHS1基因在拟南芥中异位表达 |
| 8 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录 |
| 致谢 |
（4）‘华龙非洲菊’VIGS体系的建立及其在基因功能分析上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词及英汉对照 |
| 1. 前言 |
| 1.1 观赏植物育种研究进展概述 |
| 1.1.1 传统育种 |
| 1.1.2 分子育种 |
| 1.2 观赏植物基因功能的研究方法 |
| 1.2.1 基因转导技术在植物基因功能研究中应用 |
| 1.2.2 VIGS技术在观赏植物基因功能研究中应用 |
| 1.2.3 CRISPR-Cas9基因编辑技术在基因功能研究中应用 |
| 1.3 非洲菊品种选育及基因功能研究进展 |
| 1.3.1 非洲菊品种选育进展 |
| 1.3.2 非洲菊基因功能研究进展 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 缓冲液与培养基 |
| 2.1.5 PCR引物 |
| 2.1.6 实验仪器 |
| 2.2 HPLC测非洲菊花瓣中花青素含量 |
| 2.3 非洲菊花瓣总RNA的提取及检测 |
| 2.3.1 实验器材的处理和药品配制 |
| 2.3.2 RNA的提取步骤及检测 |
| 2.4 非洲菊候选DEGs的qRT-PCR验证 |
| 2.4.1 非洲菊花瓣总RNA提取 |
| 2.4.2 cDNA合成 |
| 2.4.3 qRT-PCR引物设计 |
| 2.4.4 荧光定量PCR(Real-time PCR) |
| 2.5 ‘华龙非洲菊’花芽发育11个时期六个花色基因的表达 |
| 2.5.1 非洲菊花芽生长发育11个时期的采样标注 |
| 2.5.2 Real-time PCR相对定量方法检测六个DEGs候选基因的表达 |
| 2.6 部分候选DEGs的TRV2-LIC-X病毒载体构建 |
| 2.6.1 目的片段与目的载体连接 |
| 2.6.2 连接产物导入大肠杆菌 |
| 2.6.3 阳性克隆鉴定 |
| 2.6.4 重组载体导入农杆菌 |
| 2.7 ‘华龙非洲菊’VIGS体系建立及其花芽的农杆菌侵染 |
| 2.7.1 农杆菌侵染液的配制 |
| 2.7.2 非洲菊VIGS体系建立 |
| 2.7.3 ‘华龙非洲菊’花芽的农杆菌侵染 |
| 2.8 SEM电镜扫描TRV病毒侵染后花瓣表层细胞结构 |
| 2.8.1 样品的固定 |
| 2.8.2 SEM扫描电镜样品制备 |
| 2.8.3 SEM冷场扫描电镜观察 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 两种非洲菊花瓣中花青素含量测定 |
| 3.2 非洲菊候选DEGs基因的qRT-PCR验证结果 |
| 3.2.1 非洲菊花瓣总RNA的检验结果 |
| 3.2.2 非洲菊候选DEGs基因序列的引物筛选 |
| 3.2.3 候选DEGs基因的qRT-PCR验证结果 |
| 3.3 ‘华龙非洲菊’11 个花芽发育时期六个花色基因的表达规律 |
| 3.3.1 ‘华龙非洲菊’11 个花芽发育时期的花瓣总RNA质量检测 |
| 3.3.2 花色基因在花芽发育11个时期的表达模式 |
| 3.4 部分候选基因TRV2-LIC-X重组载体构建 |
| 3.5 ‘华龙非洲菊’的VIGS体系建立结果 |
| 3.5.1 VIGS沉默GhPDS基因对非洲菊幼苗叶片的影响 |
| 3.5.2 VIGS沉默GhPDS非洲菊叶片RNA质量检测 |
| 3.5.3 VIGS体系建立的qRT-PCR验证 |
| 3.6 VIGS沉默部分候选DEGs花色相关基因 |
| 3.6.1 TRV病毒农杆菌侵染‘华龙非洲菊’花芽 |
| 3.6.2 VIGS沉默花色相关基因后非洲菊花瓣总RNA质量检测 |
| 3.6.3 VIGS沉默花色基因的qRT-PCR验证 |
| 3.7 SEM电镜扫描TRV病毒侵染后花瓣表层细胞结构变化 |
| 4. 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 两种非洲菊花青素含量差异 |
| 4.1.2 候选基因的qRT-PCR验证 |
| 4.1.3 非洲菊花发育过程中花色基因表达特性 |
| 4.1.4 ‘华龙非洲菊’的VIGS体系建立 |
| 4.1.5 VIGS沉默探究‘华龙非洲菊’花色变异分子机制 |
| 4.1.6 VIGS沉默对非洲菊花瓣表层结构的影响 |
| 4.2 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
（5）甘菊和菊花头状花序上花发育相关基因表达模式分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1. 引言 |
| 1.1 菊花独特的花器官特性 |
| 1.2 花器官发育的遗传调控模型 |
| 1.2.1 花器官发育模型的发展 |
| 1.2.2 A类基因 |
| 1.2.3 B类基因 |
| 1.2.4 C类和D类基因 |
| 1.2.5 E类基因 |
| 1.3 CYC2基因家族在高等植物花对称性中的调控机制 |
| 1.4 高等植物花发育调控转录因子间复杂的调控网络 |
| 1.5 激素对植物花发育的作用 |
| 1.6 菊科植物头状花序的调控机制研究进展 |
| 1.6.1 菊科植物中同源异型基因研究进展 |
| 1.6.2 菊科植物CYC基因研究进展 |
| 1.6.3 非洲菊花器官发育模型研究进展 |
| 1.7 花发育分子机制研究中的技术和方法 |
| 1.7.1 转录组测序 |
| 1.7.2 基因表达模式分析 |
| 1.7.3 酵母双杂交分析蛋白互作 |
| 1.7.4 转基因技术 |
| 1.8 本研究的设计思想 |
| 1.8.1 本研究的目的和意义 |
| 1.8.2 研究目标 |
| 1.8.3 拟解决的关键科学问题 |
| 1.8.4 研究内容 |
| 1.9 本研究的技术路线 |
| 2. 甘菊和菊花花发育过程稳定内参基因的筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 菊花栽培品种 |
| 2.1.3 总RNA分离和cDNA合成 |
| 2.1.4 内参基因的筛选 |
| 2.1.5 PCR引物的设计和扩增效率试验 |
| 2.1.6 实时定量RT-PCR分析 |
| 2.1.7 数据分析 |
| 2.1.8 内参基因验证 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 内参基因的特性分析 |
| 2.2.2 内参基因的稳定性 |
| 2.2.3 品种内部内参分析 |
| 2.2.4 内参基因的验证 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 不同计算方法对基因稳定性的影响 |
| 2.3.2 内参基因稳定性分析 |
| 2.3.3 内参基因稳定性验证 |
| 2.4 小结 |
| 3. 甘菊头状花序上两类小花的转录组分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 RNA提取和转录组分析用的样本文库构建 |
| 3.1.3 从头组装和序列注释 |
| 3.1.4 基因差异表达分析 |
| 3.1.5 转录因子筛选和统计 |
| 3.1.6 实时荧光定量PCR |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 转录组测序和组装 |
| 3.2.2 功能注释 |
| 3.2.3 GO分类和KEGG通路分析 |
| 3.2.4 注释和样本中基因表达 |
| 3.2.5 转录因子分析 |
| 3.2.6 花发育相关基因 |
| 3.2.7 样本间差异表达基因统计 |
| 3.2.8 CYC2-like基因在舌状花中高表达 |
| 3.2.9 B类和C类MADS-box基因的差异表达 |
| 3.2.10 B类、C类花器官发育同源基因和CYC2-like基因在菊花中的表达模式验证 |
| 3.2.11 桂瓣类菊花基因表达分析 |
| 3.2.12 其他差异表达基因 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 利用转录组测序研究高等植物花器官发育 |
| 3.3.2 甘菊不同类型小花的差异表达基因 |
| 3.3.3 甘菊两类小花发育过程中的差异表达基因 |
| 3.4 小结 |
| 4. 花器官发育相关基因分离和表达模式分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 序列结构特征和系统进化分析 |
| 4.1.3 CYC同源基因启动子序列扩增 |
| 4.1.4 实时荧光定量PCR |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 序列结构特征和系统进化分析 |
| 4.2.2 甘菊CYC同源基因启动子元件分析 |
| 4.2.3 花器官发育同源基因在甘菊和菊花花器官中的表达模式 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 甘菊和菊花头状花序结构 |
| 4.3.2 高等植物花器官调控基因定位表达 |
| 4.4 小结 |
| 5. 酵母双杂交验证花器官发育蛋白之间的互作关系 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 菌株、载体和试剂 |
| 5.1.2 表达载体构建 |
| 5.1.3 酵母感受态制备 |
| 5.1.4 诱饵表达载体(BD载体)自激活活性的检测 |
| 5.1.5 AD载体和BD载体共转化酵母感受态 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 BD载体自激活活性的检测 |
| 5.2.2 蛋白之间的互作关系 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 酵母双杂交分析蛋白互作 |
| 5.3.2 花器官发育基因调控网络 |
| 5.4 小结 |
| 6. 甘菊下胚轴遗传转化体系的构建和转基因研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 工程菌液制备 |
| 6.1.3 甘菊下胚轴的获得 |
| 6.1.4 甘菊下胚轴及愈伤组织抗生素敏感程度试验 |
| 6.1.5 影响农杆菌转化效率的因素 |
| 6.1.6 转基因植株检测和分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 卡那霉素适宜筛选浓度的确定 |
| 6.2.2 预培养时间对转化率的影响 |
| 6.2.3 菌液浓度对转化率的影响 |
| 6.2.4 浸染时间对转化率的影响 |
| 6.2.5 共培养时间对转化率的影响 |
| 6.2.6 延迟培养时间对转化率的影响 |
| 6.2.7 转基因植株的获得 |
| 6.2.8 转基因株系检测和分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 转基因材料受体选择 |
| 6.3.2 影响转化率的主要因素 |
| 6.4 小结 |
| 7. 结论与展望 |
| 7.1 甘菊和菊花头状花序的基因调控模型 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 后续研究工作展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 获得的研究成果 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
（6）基于转录组测序滇牡丹花色形成分子调控机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 花色形成调控机理的国内外研究现状 |
| 1.2.1 花色素的种类 |
| 1.2.2 类黄酮化合物的生物合成及基因表达调控 |
| 1.2.3 花色素苷的转录调控 |
| 1.3 牡丹花色形成机理研究现状 |
| 1.4 滇牡丹花色研究现状 |
| 1.5 高通量测序技术 |
| 1.6 研究目标和主要研究内容 |
| 1.6.1 研究目标 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.7 研究技术路线 |
| 第二章 滇牡丹花瓣不同发育时期花色及类黄酮成分测定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 试验结果 |
| 2.2.2 讨论 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 滇牡丹花瓣转录组测序与分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 总RNA提取，cDNA文库构建及测序 |
| 3.1.3 组装和序列分析 |
| 3.1.4 功能注释 |
| 3.1.5 RNA-Seq基因表达分析 |
| 3.1.6 差异表达基因的qRT-PCR验证 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 试验结果 |
| 3.2.2 讨论 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 滇牡丹实时定量PCR内参基因筛选 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 总RNA提取与cDNA合成 |
| 4.1.3 候选内参基因选择 |
| 4.1.4 PCR引物设计和扩增效率检测 |
| 4.1.5 实时定量PCR |
| 4.1.6 统计分析 |
| 4.1.7 PsCHS1和PsCHI1验证 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 试验结果 |
| 4.2.2 讨论 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 滇牡丹类黄酮合成途径结构基因的表达分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 滇牡丹类黄酮合成途径相关关键酶的筛选 |
| 5.1.3 RNA提取 |
| 5.1.4 qRT-PCR引物设计 |
| 5.1.5 qRT-PCR反应 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 试验结果 |
| 5.2.2 讨论 |
| 5.3 小结 |
| 第六章 调控滇牡丹类黄酮合成途径转录因子的表达分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 基因全长序列的克隆 |
| 6.1.3 生物信息学分析 |
| 6.1.4 qRT-PCR表达分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 试验结果 |
| 6.2.2 讨论 |
| 6.3 小结 |
| 第七章 滇牡丹谷胱甘肽转移酶基因GST的分离及表达分析 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试验材料 |
| 7.1.2 总RNA提取及目的基因全长序列的克隆 |
| 7.1.3 生物信息学 |
| 7.1.4 表达模式分析 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 试验结果 |
| 7.2.2 讨论 |
| 7.3 小结 |
| 第八章 结论 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间的学术研究 |
| 致谢 |
（7）红花花瓣总RNA提取方法的比较研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 红花花瓣总 RNA 的提取 |
| 1.3 总 RNA 质量检测 |
| 1.4 RT-PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA纯度及浓度测定 |
| 2.2 总 RNA 凝胶电泳分析 |
| 2.3 不同方法提取的 RNA 的 RT-PCR 分析 |
| 3 结论与讨论 |
（8）福建主栽非洲菊品种资源的综合评价与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 第二章 非洲菊研究综述 |
| 第一节 非洲菊种质资源搜集 |
| 1 非洲菊种质资源在国内外的研究概况 |
| 2 非洲菊在国内外的种植情况 |
| 2.1 国外非洲菊种植概况 |
| 2.2 国内非洲菊的种植情况 |
| 2.3 福建省非洲菊的种植现状 |
| 第二节 非洲菊种质资源的评价 |
| 1 非洲菊种质资源引种保存及适应性研究概况 |
| 2 非洲菊种质资源主要性状评价 |
| 3 非洲菊花色素组分与形态结构方面研究成果 |
| 第三节 非洲菊种质资源遗传多样性分析 |
| 1 非洲菊农艺性状相关性研究进展 |
| 2 非洲菊分子标记遗传多样性研究进展 |
| 第四节 非洲菊品种选育研究进展 |
| 1 杂交育种 |
| 2 倍性育种 |
| 3 诱变育种 |
| 4 转基因 |
| 第三章 福建主栽非洲菊品种资源遗传多样性研究 |
| 第一节 非洲菊品种资源的农艺性状遗传多样性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 田间试验设计 |
| 1.3 试验数据采集 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第二节 福建主栽非洲菊品种遗传多样性ISSR分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 基因组DNA的提取 |
| 1.5 ISSR反应体系与引物筛选 |
| 1.5.1 PCR反应的组成 |
| 1.5.2 ISSR反应程序 |
| 1.5.3 引物的筛选 |
| 1.6 电泳与观察 |
| 1.7 聚类分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ISSR随机引物的确定 |
| 2.2 ISSR扩增产物的多态性 |
| 2.3 聚类分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 非洲菊部分性状的遗传研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 种子的播种与移栽 |
| 1.4 性状的观测记录与统计 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 结实率与种子发芽率分析 |
| 2.2 非洲菊实生苗的部分性状的遗传分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 试验材料图 |
| 附录Ⅱ 13个农艺性状测试数据 |
| 附录Ⅲ 文中所用缩略语与部分试剂配方 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）5种植物花瓣ACS基因的克隆与分析（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1.1材料 |
| 1.2方法 |
| 2结果与分析 |
| 2.1 RNA的提取质量 |
| 2.2 ACS基因片段的克隆 |
| 2.3序列分析 |
| 3讨论 |
| 3.1提取高质量的RNA是进行基因克隆的关键 |
| 3.2简并引物的设计 |
（10）不同DFR基因转化矮牵牛研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 花色素的成分及合成 |
| 1.2 矮牵牛的起源及育种概况 |
| 1.3 矮牵牛育种目标 |
| 1.4 矮牵牛的花色相关基因研究 |
| 1.5 矮牵牛的花色基因工程研究 |
| 1.6 矮牵牛遗传转化方法发展 |
| 1.7 小花矮牵牛与矮牵牛关系 |
| 1.8 本研究目的与意义 |
| 第二章 矮牵牛 DFR 基因分离及表达特性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 DFR 基因克隆 |
| 2.1.4 DFR 基因表达相对定量测定 |
| 2.1.5 DFR 酶活性测定 |
| 2.1.6 不同株系矮牵牛花色素苷含量的测定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RNA 提取 |
| 2.2.2 矮牵牛 DFR 基因分离 |
| 2.2.3 矮牵牛 DFR 特性分析 |
| 2.2.4 矮牵牛 DFR 基因表达组织特异性分析 |
| 2.2.5 矮牵牛 DFR 酶活性组织特异性分析 |
| 2.2.6 DFR 酶活性与 DFR mRNA 相关性 |
| 2.2.7 矮牵牛中花青素苷含量 UPLC 检测方法优化 |
| 2.2.8 不同矮牵牛株系中花青素苷含量测定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 四种植物 DFR 基因克隆及表达载体构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 四种植物 DFR 基因克隆 |
| 3.1.2 表达载体构建 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 四种植物来源 DFR 基因克隆 |
| 3.2.2 DFR 表达载体构建 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 DFR 基因 CDS 区的获取 |
| 3.3.2 RNA 提取适宜时期及方法探讨 |
| 3.3.3 基于 SMART 试剂盒的 RACE 操作 |
| 3.3.4 CaDFR 的特点分析 |
| 3.3.5 外源 DNA 对大肠杆菌转化效率的影响 |
| 3.3.6 质粒的量对大肠杆菌转化效率的影响 |
| 3.3.7 扩增外源基因中酶的选择 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 矮牵牛转化及转化子鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试剂与引物 |
| 4.1.3 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 受体材料生物学特征 |
| 4.2.2 矮牵牛种子无菌萌发 |
| 4.2.3 矮牵牛卡那霉素选择压的确定 |
| 4.2.4 农杆菌介导的叶盘法转化矮牵牛 |
| 4.2.5 炼苗成活率影响因素 |
| 4.2.6 转化植株的检测鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 共培养后 MS 液体培养基振荡抑菌对外植体活力的影响 |
| 4.3.2 适宜的抗生素种类筛选 |
| 4.3.3 适宜的头孢霉素浓度 |
| 4.3.4 延迟培养对转化的影响 |
| 4.3.5 生根培养中的筛选剂添加的必要性 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 转化子表型观察及表达测定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 DFR 基因表达相对定量测定 |
| 5.1.2 DFR 酶活性测定 |
| 5.1.3 转化子花色素苷含量的测定 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 DFR 表达相对定量检测标准曲线绘制 |
| 5.2.2 ‘9702’转入不同 DFR 基因表型及表达分析 |
| 5.2.3 ‘Lx’转入不同 DFR 基因表型及表达分析 |
| 5.2.4 ‘2512’转入不同基因表型及表达分析 |
| 5.2.5 ‘W115’转入不同 DFR 基因表型及表达分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 不同来源 DFR 对矮牵牛花色的影响 |
| 5.3.2 外源基因在矮牵牛的表达不同的可能原因 |
| 5.3.3 ‘LH26’表型的可能原因 |
| 5.3.4 飞燕草色素的 UPLC 检测 |
| 5.3.5 UPLC 检测单一花青素苷标准品的可能性 |
| 5.3.6 外源基因拷贝数对花色的影响 |
| 5.3.7 DFR mRNA 相对浓度与外源基因拷贝数的关系 |
| 5.3.8 调节基因 AN2 对花色的影响 |
| 5.3.9 花药中 DFR 基因的表达 |
| 5.3.10 DFR 酶活性与花青素苷含量相关性分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 转化子遗传稳定性观测 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 转基因矮牵牛 T1 代生物学表型 |
| 6.2.2 PCR 检测结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 T1 代种子发芽率低的可能原因 |
| 6.3.2 T1 代种子性状分离的原因 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 本文总结 |
| 7.1 研究的主要结论 |
| 7.2 研究的创新点 |
| 7.3 研究中发现的问题 |
| 7.4 今后工作展望 |
| 附录 |
| 附录1：符号说明 |
| 附录2：本研究中使用的主要仪器设备 |
| 附录3：分离的 DFR 序列 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的论文 |
四、非洲菊花瓣总RNA提取方法的改进（论文参考文献）
- [1]福建主栽非洲菊品种遗传多样性ISSR分析[J]. 夏朝水,江斌,邓永生,陈玮婷,曹奕鸯. 福建农业科技, 2021(01)
- [2]滇水金凤CHI与F3’H基因的克隆及表达分析[D]. 林福永. 西南林业大学, 2019(08)
- [3]草地早熟禾花发育相关基因PpCHS1与PpSPL4的克隆和功能分析[D]. 何春艳. 北京林业大学, 2018(04)
- [4]‘华龙非洲菊’VIGS体系的建立及其在基因功能分析上的应用[D]. 陈峥. 华南农业大学, 2017(08)
- [5]甘菊和菊花头状花序上花发育相关基因表达模式分析[D]. 亓帅. 北京林业大学, 2017
- [6]基于转录组测序滇牡丹花色形成分子调控机理研究[D]. 史倩倩. 中国林业科学研究院, 2015(05)
- [7]红花花瓣总RNA提取方法的比较研究[J]. 张雪,官丽莉,韩怡来,杨晶,杜林娜,李校堃. 黑龙江农业科学, 2015(02)
- [8]福建主栽非洲菊品种资源的综合评价与应用[D]. 夏朝水. 福建农林大学, 2014(03)
- [9]5种植物花瓣ACS基因的克隆与分析[J]. 吴田,蓝增全. 福建农林大学学报(自然科学版), 2014(01)
- [10]不同DFR基因转化矮牵牛研究[D]. 褚云霞. 上海交通大学, 2014(01)