一、Progress in interspecies cloning of mammals（论文文献综述）
许承佳[1]（2021）在《气单胞菌属DNA条形码的筛选及锦鲤抗菌免疫应答分析》文中认为气单胞菌是一种广泛存在于水生环境中的人-畜-水生动物共患致病菌,DNA条形码可实现对气单胞菌的高效准确鉴定,为合理选择抗感染治疗用药提供科学准确的依据。频繁爆发的气单胞菌感染性病害严重危害人类健康,同时限制了养殖行业的发展。了解宿主免疫应答过程中发挥重要功能的基因和通路,探究免疫应答关键基因的序列结构信息可为药物靶点的发现与抗菌药物的研发提供研究基础,为致病菌的综合防治提供新思路。实验以33株气单胞菌为材料,利用设计的通用引物PCR扩增不同菌株的ppsA、recA和cpn60基因,获得序列的测序信息并分析。以PCR扩增成功率和测序成功率、遗传距离、DNA barcoding gap和系统发育树为评价标准,筛选通用性好、准确度高的条形码基因。我们发现cpn60基因的变异位点碱基占总碱基数比例最高,为27.68%,可提供更多的物种分辨信息;cpn60基因中97.9%序列的种内遗传距离小于0.04,而98.1%的序列种间遗传距离要大于0.04,且cpn60的种间遗传距离为13.3%,显着大于其种内遗传距离1.7%,条形码间隔比较明显,能有效地区分同属内的不同菌种。而recA基因的平均种间遗传距离为0.049,虽然也大于其平均种内遗传距离0.023,但recA基因出现了较大程度的遗传距离的重叠,没有出现非常明显的条形码间隙。而ppsA基因扩增测序成功率过低,通用性差,无法用于气单胞菌的鉴定。综上,cpn60基因可作为气单胞菌属的DNA条形码鉴定不同菌种。为探究宿主对病原刺激的免疫反应,我们对人工感染维氏气单胞菌24 h后的锦鲤脾脏进行了转录组测序。共筛选到373个差异表达基因（DEGs）,其中240个基因表达上调,133个基因表达下调。与炎症小体密切相关的NLRP3、CD11b、CD11c和IL-1β的表达水平显着上调。进一步的注释和富集分析表明,DEGs主要富集于吞噬体、细胞粘附分子、IL-17信号通路和抗原的加工和呈递。上述分子和信号通路可能在清除外来入侵病原体中发挥重要作用。为了验证RNA-seq数据的准确性,选取10个与免疫相关的基因进行RT-qPCR实验,结果表明它们的表达与RNAseq数据高度一致。此外,RT-qPCR也证实了与NLRP3炎性小体组装与激活相关的基因caspase-1、caspase-3、caspase-9、CARD以及ASC基因均表达上调,表明维氏气单胞菌的感染显着诱导宿主脾脏组织NLRP3炎性小体的组装和成熟。TLR4（Toll-like receptor 4）是脂多糖的主要受体,被刺激后可导致一系列炎症因子的释放,激活免疫应答。我们克隆得到锦鲤TLR4基因序列,其c DNA序列全长为1237 bp,开放阅读框为432 bp,编码143个氨基酸。生物信息学软件预测锦鲤TLR4氨基酸序列的分子量为16114.2,理论等电点为5.87。在与其他物种的比对中,锦鲤TLR4和鲤鱼TLR4的氨基酸序列相似性最高,为98.43%,表明锦鲤与同属的鲤鱼亲缘关系最近。组织表达分析显示,TLR4基因在免疫器官脾脏和肠中的表达量分别是肌肉组织的789倍和466倍。
梁宇[2]（2019）在《云南部分野生小型哺乳动物及广西家犬肉孢子虫的形态及分子特征》文中认为2017年3月-2018年12月,在云南省昆明市、大理州、迪庆州、德宏州和楚雄州的35个采样点共采集各种野生小型哺乳动物肌肉样品1153份,包括啮齿类23种1037份,食虫目4种96份,树鼩目1种20份;2017年10月,在广西壮族自治区玉林市农贸市场采集37份源于不同个体的家犬肌肉样品。在1153份源于不同个体的野生小型哺乳动物的肌肉样品中,检查到有肉孢子虫感染的计193份,自然感染率为16.74%（193/1153）,共鉴定出8种肉孢子虫:（1）黄毛鼠肉孢子虫新种（Sarcocystis losea n.sp.）,中间宿主包括黄毛鼠（Rattuslosea）、黄胸鼠（R.flavipectus）和褐家鼠（R.norvegicus）。光镜下包囊突起长指状,电镜下突起呈栅栏状,内无微管,包囊壁电镜类型为“10”型;GenBank中与其18SrDNA基因相似性最高的是鼠属（Rattus）的左氏肉孢子虫（S.zuoi）（平均相似度98.24%）;与其线粒体COX1基因相似度最高的是以东方鼠蛇（Pantherophis alleghaniensis）为终末宿主的1种未命名肉孢子虫（Sarcocystissp.）（平均相似度:94.97%）。（2）西姆里肉孢子虫（S.cvmruensis）,中间宿主包括屋顶鼠（R.rattus）、褐家鼠（R.norvegicus）、斑胸鼠（R.yunnanensis）、黄胸鼠（R.flavipectus）和大足鼠（R.nitidus）,光镜下该肉孢子虫包囊壁光滑,电镜下有小山丘状突起,包囊壁电镜类型为“Ⅰ型;GenBank中与其18S rDNA序列相似性最高的是屋顶鼠肉孢子虫（S.ratti）（平均相似度:99.96%）;与其线粒体COX1基因序列相似度最高的是西姆里肉孢子虫（S.cymruensis）（平均相似度:95.26%）。（3）社鼠肉狍子虫新种（S.confucianus n.sp.）,中间宿主包括社鼠（Niviventer confucianus）和黄胸鼠（R.flavipectus）,光镜下肉孢子虫包囊具有倾斜指状突起,电镜下突起有时候呈“T”型或者“蘑菇”型,突起内无微管,包囊壁电镜类型为“27”型;GenBank中与其18S rDNA基因相似性最高的是左氏肉孢子虫（S.zuoi）（平均相似度:97.14%）;与其线粒体COX1基因相似度最高的是以东方鼠蛇（P.alleghaniensis）为终末宿主的1种未命名肉孢子虫（Sarcocystis sp.）（平均相似度:95.15%）。（4）左氏肉孢子虫（S.zuoi）,中间宿主包括褐家鼠（R.norvegicus）、斑胸鼠（R.yunnanensis）、大足鼠（R.nitidus）和屋顶鼠（R.rattus）,光镜下包囊具有倾斜长指状突起。（5）齐氏肉孢子虫新种（S.chevieri n.sp.）,中间宿主为齐氏姬鼠（Apodemus chevieri）,光镜下包囊壁光滑,电镜下包囊壁表面小有的不规则的突起,包囊壁电镜类型为“18”型;GenBank中与其18SrDNA基因相似性最高的是在日本野生浣熊（Procyon lotor）血液中检测到的一种肉孢子虫未定种（Sarcocystis sp.）（平均相似度:98%）;与其线粒体COX1基因相似度最高的是以东方鼠蛇（P.alleghaniensis）为终末宿主的1种未命名肉孢子虫（Sarcocystis sp.）（平均相似度:99.57%）。（6）绒鼠肉孢子虫（S.eothenomysi）,中间宿主为小亚细亚绒鼠（Eothenomys miletus）,光镜下包囊壁光滑;GenBank中与其线粒体COX1基因相似度最高的是以东方鼠蛇（P.alleghaniensis）为终末宿主的1种未命名肉孢子虫（Sarcocystis sp.）（平均相似度:99.8%）。（7）（?）肉孢子虫（S.clethrionomyelaphis）,中间宿主为小亚细亚绒鼠（E.miletus）,光镜下包囊具有短指状突起;GenBank中与其线粒体COX1基因相似度最高的是以东方鼠蛇（P.alleghaniensis）为终末宿主的1种未命名肉孢子虫（Sarcocystis sp.）（平均相似度:94.47%）。（8）灰麝鼩肉孢子虫新种（S.attenuata.n.sp.）,中间宿主为灰麝鼩（Crocidura attenuata）,光镜下包囊具有舌状或花瓣状突起,电镜下突起形态不规则,内无微管,包囊壁电镜类型为“9”型;GenBank中与其18SrDNA基因相似度最高的是在左氏肉孢子虫（S.zuoi）（平均相似度:94.47%）;与其线粒体COX1基因相似度最高的是以东方鼠蛇（P.alleghaniensis）为终末宿主的1种未命名肉孢子虫（Sarcocystis sp.）（平均相似度:95.18%）。广西玉林市售犬肉的犬肉孢子虫（S.caninum）自然感染率为5.4%（2/37）,光镜下包囊壁有楔形小突起,电镜下突起呈不规则的网状,基质层厚,包囊壁电镜类型为“9型”。GenBank中与其18S rDNA、28S rDNA、线粒体COX1基因、ITS-1基因和RpoB基因相似度最高的是狐和狼的北极肉孢子虫（S.arctica）,对应的平均相似度分别为:99.98%、99.98%、99.8%、99.91%,和99.68%。基于分子系统进化分析,本次实验在小型哺乳动物肌肉内发现并命名的4个新物种:寄生于黄毛鼠（R.losea）、黄胸鼠（R.flavipectus）和褐家鼠（R.norvegicus）的黄毛鼠肉孢子虫新种（S.losea n.sp.）、寄生于齐氏姬鼠（A.chevieri）的齐氏肉孢子虫新种（S.chevieri n.sp.）、寄生于社鼠（N.confucianus）和黄胸鼠（R.flavipectus）的社鼠肉狍子虫新种（S.confucianus n.sp.）和寄生于灰麝鼩（C.attenuata）的灰麝鼩肉孢子虫新种（S.attenuata n.sp.）都与终末宿主为蛇的肉孢子虫聚群在一起,推测其终末宿主极有可能是蛇类;家犬肌肉中的犬肉孢子虫（S caninum）与终末宿主为猛禽的肉孢子虫聚群在一起,提示其终末宿主亦有可能是鸟类。
张泽鹏[3]（2019）在《哺乳动物MHC、TCR和Ig基因家族进化及其与生态位适应的关系探究》文中研究说明各种各样的病原微生物（细菌、真菌和病毒等）对机体的生长、发育和繁殖等过程造成潜在威胁。免疫系统是机体防御病原微生物入侵的有效武器,主要包括先天性免疫（innate immunity）与适应性免疫（adaptive immunity）。相对于先天免疫,适应性免疫反应一般在微生物等抗原物质刺激后诱发,并能与该抗原起特异性反应。其中,主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）作为抗原提呈分子参与适应性免疫应答,主要识别经树突细胞或巨噬细胞等处理后的抗原,并提呈给T细胞抗原受体（T cell receptor,TCR）激活T细胞以启动细胞免疫,最终释放细胞因子消灭抗原或者致使被感染细胞发生裂解。另外,免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）是适应性免疫中另一类重要的作用分子,介导体液免疫,可直接与游离抗原特异性结合以发挥免疫效应。在哺乳动物进化过程中,不同进化谱系具有不同生境、食性以及集群行为等。其中,鲸类是一类特化的水生哺乳动物,其陆生祖先从陆地重返海洋,这种特殊的进化历史为研究生境转换、食性转变引起的免疫适应机制提供理想模型。然而,是否这些生态因子的不同引起病原微生物差异,从而驱动不同哺乳动物进化谱系免疫系统的适应尚不清楚。因此,本研究以适应性免疫基因MHC、TCR和Ig基因家族为候选基因,从鲸类MHC与TCR的基因组结构,家族成员系统发生关系探究为基础,拓展到哺乳动物TCR和Ig基因数目进化及分子进化速率与生态因子（生境、食性与集群行为等）的相关性研究,以期揭示驱动TCR和Ig进化的主要生态因子并系统地为免疫基因家族在不同生态位下的进化机制提供分子遗传基础。MHC基因家族（包括I、II和III类基因）是目前发现的脊椎动物基因组中多态性最高的一类基因群。其中,MHC II类基因在种间具有较高同源性,且其主要负责识别与提呈外源性抗原,包括各种非己成分,如细菌产生的毒素。因此,MHC II类基因的进化更能反应机体对外界环境的免疫防御能力。为了探究鲸类生境转变过程中其MHC II类基因的进化模式,本研究对7种鲸类代表性物种的基因组扫描10个MHC II类基因座位（DRA、DRB、DQA、DQB、DPA、DPB、DOA、DOB、DMA和DMB）,共鉴定了76条基因序列。在10个基因座位中,DPA座位在鲸类中已经丢失,而DPB座位在7种鲸类中均只保留了部分编码片段,剩余的8个座位在鲸类中保留完整基因序列,除了DRB为多拷贝（2-4个拷贝）外,其余均为单拷贝。这些成功鉴定的基因座位在鲸类中的基因排布与其陆生近缘物种牛和羊相似,均表现为MHC IIa和IIb两个亚区域。然而,部分座位（DQA、DQB与DRB）的基因拷贝数与陆生动物存在差异,比如DRB在鲸类中为2-4个拷贝,但在陆生物种中为3-6个拷贝。将多拷贝座位DRB的序列进行系统发育重建,DRB1与DRB2支系位于拓扑最内部且仅含有鲸类序列,推测这两个基因是鲸类与偶蹄类分化后在适应水生生活过程中复制产生的新基因,这可能是受水生环境独特病原体驱动的结果。其中2/5的DRB2转变为假基因,1/2的DRB1在小须鲸中新复制产生。以上拓扑结构提示鲸偶蹄类DRB基因进化模式符合“生灭模型”（birth-and-death model）。在细胞免疫反应链中,TCR位于MHC下游,结合由MHC提呈的抗原激活T细胞进而产生免疫反应。根据肽链组成不同,TCR分为αβTCR和γδTCR,前者结合MHC提呈的抗原,后者可直接结合原始抗原。因此,γδTCR编码基因（TRG和TRD基因）的遗传进化更能反应鲸类生境转变过程中的免疫适应。我们在8种代表性鲸类基因组扫描TRG和TRD的所有胚系基因,包括可变区基因（variable,V）、连接区基因（joining,J）、多样性基因（diversity,D）和恒定区基因（constant,C）,共成功鉴定158条基因序列。其中TRG基因共有72条完整基因序列,包括38个TRGV、26个TRGJ和8个TRGC基因。此外,TRGC基因还鉴定到5个单独的外显子片段。TRD基因共有86个完整基因,包括31个TRDV、22个TRDD、25个TRDJ和8个TRDC基因。与牛和羊类似,鲸类TRG和TRD基因的基因组结构分别呈V-J-C和V-D-J-C-V排布。系统发育重建提示鲸类TRG和TRD基因的分化早于其与偶蹄类的分化。运用系统发生相关性分析（Phylogenetic generalized least squares,PGLS）进一步探究鲸偶蹄目物种TRGV和TRDV基因数目进化与生境的关系,结果表明TRGV基因和TRDV基因数目与生境存在显着相关性（TRGV:R2=0.398,p=0.007;TRDV:R2=0.427,p=0.004）。为了进一步探讨是否整个哺乳动物谱系TCR基因数目进化受环境因子影响,我们选取37种代表性哺乳动物,探究TCR恒定区基因（TRC:TRAC、TRBC、TRGC和TRDC）和可变区基因（TRV:TRAV、TRBV、TRGV和TRDV）的进化与3种生态因子（生境、食性和集群行为）之间的关系。首先运用系统发育方差分析（phyANOVA）对TRC数目在3种生态因子的不同组间比较,结果表明TRC基因数目在4种生境分组（半水生、水生、陆生、飞行）间存在显着差异（p=0.030）,这种差异主要由TRGC基因数目在水生与半水生组间的显着差异（水生组vs.半水生组:1.5560 vs.5.400,p=0.006）以及飞行与半水生组间的显着差异（飞行组vs.半水生组:1.21 vs.5.400,p=0.006）引起。并且,生境越复杂的哺乳动物（如半水生生境的物种）,比仅占有一种生境的物种（如水生或陆生物种）倾向于拥有更多的TRGC数目。类似地,PGLS分析结果提示TRGC数目与生境存在显着相关性（R2=0.304,p<0.001）。以上结果表明哺乳动物TRC数目进化显着受生境影响。分子进化分析结果表明TRAC和TRDC基因进化速率（ω）在特定生态位类群中存在相反的趋势:以生境为例,TRAC:ω水生>ω飞行>ω陆生>ω半水生;TRDC:ω半水生>ω陆生>ω飞行>ω水生。以上结果提示,不同哺乳动物TRC基因免疫适应的策略可能主要是在增加TRGC基因家族数目与调谐TRAC和TRDC基因分子进化速率之间保持权衡。类似地,在3种生态因子（生境、食性与集群行为）中,TRV基因数目在生境与食性两种生态因子不同组间存在显着差异（p<0.05）。其中,TRAV基因数目在不同生境组间具有显着差异（p=0.027）,主要由水生组与陆生组间显着差异引起（水生组vs.陆生组:16.250 vs.64.222,p=0.030）。然而,TRBV数目在不同食性组间具有显着差异（p=0.011）,该差异表现在食肉组与食草组之间（食肉组vs.食草组:11.167 vs.42.400,p=0.010）。PGLS结果进一步揭示TRAV和TRBV数目与生境、食性显着相关（R2>0.13,p<0.05）。以上结果提示生境与食性转变引起的病原微生物差异影响TRAV与TRBV数目改变。αβT细胞为大部分物种体内最主要的T细胞群,主要介导细胞免疫、辅助体液免疫及参与免疫调节。本研究中,αβTCR的V基因（TRAV和TRBV）数目在生境和食性组间的差异以及相关性表明二者的数目进化受到生境与食性影响,同时也提示αβTCR在不同生境与食性哺乳动物免疫适应中的关键作用。另一方面,TRGV的基因数目不仅在群居与独居物种间差异显着（p=0.001）,并且该数目与集群行为具有显着相关性（R2>0.160,p<0.050）。此外,TRDV基因数目与生境也显着相关（R2>0.130,p<0.050）。以上结果表明TRGV和TRDV数目进化受到生境与集群行为二者的影响。尽管大部分哺乳动物外周血中γδT细胞含量较少,但其兼具先天性免疫与适应性免疫特性,在应对感染性疾病,创伤修复以及维持组织稳态方面具有重要作用。本研究中检测到编码γδTCR的TRDV、TRGC和TRGV基因数目分别与生境和集群行为具有显着相关性,提示γδT细胞在不同生境和集群行为哺乳动物免疫适应中占有重要地位。为了进一步探究细胞免疫的抗原受体TCR进化是否受到上游配体MHC的影响,运用PGLS分析哺乳动物MHC与TCR多样性之间的进化关系。结果发现TRAV和TRBV数目与DQB等位基因数目之间均存在显着正相关关系（TRAVDQB:R2=0.373,p=0.027;TRBVDQB:R2=0.311,p=0.048）,提示MHC与TCR存在协同进化。MHC丰富的多态性被部分学者认为是通过病原介导的平衡选择所维持,并且濒危物种通常具有较低的MHC多态性。TCR作为MHC下游受体,其庞大的分子多样性赋予个体对环境中数量众多、易于突变的病原体进行识别和应答的巨大潜力。本研究检测到MHC与TCR的协同进化模式表明机体MHC与TCR在应对环境抗原过程中相互影响,共同促进机体的免疫适应能力。为了进一步系统地探究影响适应性免疫抗原受体数目进化的主要生态因子,我们选取T细胞受体可变区基因家族（TRV）和免疫球蛋白可变区基因家族（IGV）在79种代表性哺乳动物中检测二者的进化与3种生态因子（生境、食性、集群行为）的关系。phyANOVA结果显示,TRAV基因家族数目在不同生境组间具有显着差异（p=0.016）,该差异主要由水生与陆生组间差异引起（水生组vs.陆生组:15.889 vs.57.725,p=0.006）。但不同食性组间TRBV基因数目的差异（p=0.006）主要表现为食肉与食草组间显着差异（食肉组vs.食草组:13.350 vs.35.230,p=0.010）。此外,PGLS分析检测到TRDV基因家族数目与生境之间存在微弱相关性（R2=0.050,p=0.047）。另一方面,IGV基因数目与生态位之间并没有检测到显着的相关性（p>0.05）,提示IGV进化可能受其他生态因子影响或者存在其他的进化模式,比如通过不同胚系基因排列多样化以及免疫球蛋白亚型多样性以产生免疫适应,尚需进一步深入研究。综上,生境与食性是影响哺乳动物抗原受体数目进化的主要生态因子。生境与食性差异带来的病原差异驱动抗原受体进化产生免疫适应,使机体能够应对多变环境中的病原微生物。综上,本论文以鲸类MHC与TCR家族基因组结构探究为基础,揭示哺乳动物MHC与TCR基因组结构在进化过程中比较保守。TRC基因数目进化受到生境影响,而TRV基因数目进化则受到生境与食性的共同影响。不同进化谱系哺乳动物TRC免疫适应的策略为权衡TRGC和TRAV基因数目与TRAC正选择强度以及平衡TRAC和TRDC基因进化速率。此外,TCR与MHC的协同进化提示二者在应对环境抗原过程中相互影响,共同促进机体的免疫适应能力。本研究为哺乳动物对不同环境的免疫适应提供了系统的分子基础,为深入理解适应性免疫基因家族进化提供了新的思路。
王配[4]（2016）在《版纳微型猪近交系四个精子发生关键基因家族的分离与功能研究》文中认为版纳微型猪近交系（BMI）是全球第一个大型哺乳类实验动物近交系,在生物和医学领域有广泛应用前景。但在35年的繁育过程中有多个亚系断代,前期研究发现主要是由一些公猪不育造成,这些不育公猪已成为阻碍其群体数目继续扩大的主要屏障,亟待解决。哺乳动物精子发生是曲精细管上皮细胞连续经历有丝分裂、减数分裂和精子形成,发育成完整形态精子的细胞分化过程,高度有序,涉及众多结构、功能基因调控。目前BMI精子发生机制的研究尚属空白,其公猪不育的机理尚不清楚,筛选和鉴定BMI精子发生关键基因,并研究其蛋白功能,有助于近交系精子发生机制的揭示和雄性不育分子诊断方法的建立,具有重要的理论意义和应用前景,也可为人类男性不育的研究提供参考。本研究选取国内外文献高频率报道的与哺乳动物雄性不育相关的精子发生关键基因家族为候选基因,这些基因包括睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族（包括TSSK1-4和TSSK6）、胞质分裂基因家族（包括Septin1-12和Septin14）、无精子症基因家族（包括DAZL和BOLL）和睾丸蛋白DEAD-box家族（包括DDX25和DDX3Y）。通过PCR和5’RACE技术获得其完整CDS序列,进一步对其序列特征、时空表达规律、启动子特征、表达产物的亚细胞定位进行研究,最后初步探索了利用RNA干扰和基因过表达技术研究DDX3Y基因的表达调控,从而为深入研究BMI精子发生的分子机理及调控机制奠定基础。取得的主要研究结果如下:1.基因克隆、生物信息学分析及组织表达谱研究克隆得到BMI TSSK家族、Septin家族、DAZ家族和DEAD-box蛋白家族共22个基因的cDNA序列,提交到GenBank获得了认证。特别地,相对于牛和人BOLL基因的翻译起始密码子ATG,BMI BOLL基因为AAG,发生了 T到A的突变,致使BOLL基因丢失了起始密码子,不能翻译成蛋白,提示BMIBOLL基因失去表达活性,可能变为假基因;大白猪、长白猪、黑猪与BMI的结果类似,推测猪BOLL基因起始密码子缺失可能具有普遍性,但有待进一步证实。其余21个候选基因编码的氨基酸序列与人的同源性达77%以上,高度保守,序列的相似性提示这些基因的功能在物种间具有相似性。在SMART数据库中对这些氨基酸序列进行可能的结构域搜索发现,TSSK家族均含STKc催化结构域,Septin家族均含Septin/CDCSeptin功能结构域,大部分成员在近C端含有coiled coil结构;DAZL含有RRM结构域和DAZ重复;DDX25和DDX3Y含有DEXDc和HELICc结构域。结构域是蛋白质分子中能独立存在的功能单位,结构域的存在提示我们研究的这些基因均是功能基因,参与BMI的生命活动。在TSSK家族和Septin家族多物种氨基酸序列同源性比对基础上,构建的系统进化树表明TSSK家族可分为3组（A、B和C）:Group A包含TSSK1和TSSK2,Group B包含TSSK3和TSSK6,Group C包含TSSK4;Septin家族也可分为3组（A、B和C）,Group A 包含 Septin6、8、10、11 和 Septin14,Group B 包含 Septin1、2、4、5 和 Septin7,Group C包含Septin3、9和Septin12。同一组内的成员,基因结构上具有更高的相似性,推测具有更加类似的功能。利用RT-PCR的方法证实上述22个基因的组织差异表达现象,14个基因（TSSK6、Septin1-11、DDX25和DDX3Y）在多种组织中都有转录。特别地,TSSK2、BOLL和DAZL为睾丸特异性表达基因;TSSK1、TSSK3、TSSK4、Septin12和Septin14基因为睾丸和精囊腺特异性表达基因;睾丸和精囊腺均为雄性动物的重要生殖器官,在这两种组织的特异表达提示这些基因在BMI生殖发育过程中可能发挥重要的功能。下一步就以睾TSSK2、Septin12、Septin14、DAZL、BOLL和DDX3Y基因为关键基因,深入研究其功能。2.发育表达谱、蛋白水平上的组织表达谱及启动子分析利用 qPCR 的方法证实 BMI TSSK2、Septin12、Septin14、BOLL 和 DAZL 基因的mRNA在初生公猪睾丸中不表达,在2.5月龄公猪睾丸中的表达量极显着提高（p<0.01）,5-18月龄间表达量无显着差异,至36月龄时有极显着下降,保持较低水平,与BMI精子发生时间基本一致,提示这些基因与BMI精子的发生具有关联性。进一步,对BMI TSSK2和DDX3Y基因进行原核表达,并利用其原核表达蛋白制备了特异性抗血清用于Western blot研究。Western blot结果证实了 TSSK2、Septin12、Septin14、DAZL和DDX3Y蛋白的天然存在;且TSSK2、DAZL和DDX3Y蛋白特异表达于睾丸,Septin12和14蛋白特异表达于睾丸和精囊腺组织。利用 PCR 扩增和克隆测序获得了 BMITSSK2、Septin12、Septin14、DAZL 和 DDX3Y基因的启动子区,发现TSSK2、DAZL和DDX3Y 5’侧翼区存在一个CpG岛,且位于启动子核心区域,为进一步从甲基化角度研究基因表达调控提供实验依据。3.细胞定位分析及BMI DDX3Y基因表达调控的初步探索细胞内定位结果显示TSSK2在线粒体和细胞核均有分布,主要在细胞核;Septin12和Septin14定位于核周围的线粒体;DAZL和DDX3Y定位于细胞核;与生物信息学预测的结果基本一致;每种细胞结构均含有一组特定的蛋白,具有特定的功能,细胞定位结果可为深入研究相关蛋白的生物学功能提供重要线索。利用过表达和RNAi技术初步探索了猪睾丸细胞系中DDX3Y基因的表达,结果表明:与对照组DDX3Y mRNA的表达相比,过表达组显着上调,干扰组显着下调,为后续深入研究奠定了基础。
王军政[5]（2015）在《鸭源禽流感病毒的分离鉴定及其聚合酶活性研究》文中研究表明AIV分为多种血清亚型,目前已鉴定出有17种HA亚型和10种NA亚型。几乎所有亚型的AIV都可以感染禽类,能感染人的AIV主要为H1、H3、H5、H6、H7、H9和H10亚型,其中以H5亚型最为常见。由于宿主范围的限制,AIV很少感染人类。然而,近年来禽流感H5N1亚型造成人类感染的病例却不断增加。虽然到目前为止,持续的AIV感染人类的病例尚未见报道,但在环境和机体免疫的选择压力下,禽流感H5亚型的适应性突变和不断的抗原漂移现象,可能导致其跨越物种屏障,实现在人群中传播。因此,加强对新发H5亚型AIV致病性和传播力的研究,对防控AIV的大规模传播具有至关重要的作用。本研究采集病死鸭病料,常规处理后接种于10日龄SPF鸡胚,收取24-96h内死亡鸡胚尿囊液,进行血凝和血凝抑制实验、核酸鉴定及HA和NA基因序列分析。结果表明,该分离株为H5N5亚型,命名为A/Duck/Changchun/01/2010。HA和NA基因进化分析显示,该毒株属于新型H5N5流感病毒2.3.2.1系,主要在东亚地区流行。该研究结果为进一步研究鸭源H5N5禽流感病毒的分子进化提供了重要信息。为进一步研究该分离毒株的进化特点,设计并合成扩增核蛋白（NP）基因、聚合酶蛋白（PB2、PB1、PA）基因的特异性引物,对核蛋白（NP）、聚合酶蛋白（PB2、PB1、PA）RNA进行反转录,并进行PCR扩增,获得分离毒株PB2、PB1、PA、NP基因序列。同时利用生物信息学软件或在线分析软件分析其信号肽、跨膜区和疏水性,并预测潜在的糖基化位点和磷酸化位点。对比分析后发现,该毒株与我国南方水禽主要流行的AIV同源性较高。禽流感病毒PB2基因的第627位氨基酸和第701位氨基酸对于AIV跨种间传播起到重要作用,为了解该病毒聚合酶活性及PB2基因的第627位氨基酸和第701位氨基酸突变后引起聚合酶活性变化情况。利用点突变技术,针对实验中测定的聚合酶基因序列设计酶切位点,对四个质粒进行双酶切,将酶切后的产物与表达载体进行连接,连接后分别对PB2基因的1879位和2101位碱基进行点突变,使禽流感病毒PB2基因第627位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸,第701位氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺。将聚合酶蛋白转染到293T细胞中,通过检测荧光活性值报告病毒聚合酶复合体的活性。结果表明,禽流感病毒A/duck/changchun/01/2010的聚合酶蛋白荧光值较低,PB2基因2101位碱基突变对聚合酶蛋白活性影响不大,PB2基因1879位碱基突变能提高聚合酶蛋白活性,两个碱基同时突变聚合酶蛋白活性明显提高。
王利勤[6]（2010）在《小鼠—猪种间体细胞核移植研究》文中研究说明随着体细胞核移植（SCNT）研究的深入,种间体细胞核移植（iSCNT）开始受到越来越多的重视,并不断取得进展。大量研究发现,核供体细胞重编程不完全或者错误,可能是导致核移植失败的主要原因。种间体细胞核移植是研究核重编程分子机制、细胞核质互作关系和早期胚胎发育的重要模型；种间体细胞核移植研究也有助于濒危野生动物的保护,在农业、医学等领域都具有广阔的应用前景。本研究借助显微操作技术,以小鼠体细胞作为核供体细胞、猪体外成熟卵母细胞为核受体细胞,进行小鼠-猪种间体细胞核移植操作,所获种间克隆胚胎置于5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。旨在研究核供体细胞所需条件和受体卵母细胞所需条件对小鼠-猪种间克隆胚胎发育的影响,探索影响种间核移植操作的主要相关因素,以期建立种间克隆胚胎体外生产模型,为进一步研究核重编程及核质互作机理奠定基础。M16是常用的小鼠胚胎培养液,37℃是小鼠胚胎常用的培养温度；而猪胚胎常用的培养液和培养温度分别是NCSU-23和38.5℃。将小鼠-猪种间克隆胚胎分别在37℃、38.5℃条件下,又分别培养于M16和NCSU-23培养液中,研究供体还是受体所需培养条件对种间克隆胚胎发育的影响更大。根据上述结果,将获得的小鼠-猪种间克隆胚胎在优化条件下进行体外培养,进一步研究种间核移植的影响因素,包括核供体细胞来源、核供体细胞传代次数、操作液中添加细胞松弛素B处理及卵母细胞体外成熟培养时间等。试验结果如下：1.选择不同生理状态的小鼠进行超数排卵,分为阴门粉红色组和白色组,比较2组小鼠超数排卵成功率,结果显示阴门粉红小鼠的超排成功率为81.25%,高于阴门发白小鼠组（60.0%）。2.将2-细胞期小鼠-猪种间克隆胚胎、小鼠自然体内胚胎置于37℃、M16培养液中培养,研究种间克隆胚胎对于供体或受体细胞培养液的适应性。于培养1、2和7d观察2组胚胎在小鼠胚胎常规培养条件下的发育情况。结果显示种间克隆胚胎的发育能力明显低于小鼠自然体内胚胎,16-细胞与囊胚发育率分别为15.1%对80.9%和0.0%对27.7%（P<0.05）。3.将小鼠-猪种间克隆胚胎、猪体外受精（IVF）胚胎置于38.5℃、NCSU-23培养液中培养,研究种间克隆胚胎对于供体或受体细胞培养液的适应性。于培养1、2和7d观察2组胚胎在猪胚胎常规培养条件下的发育情况。结果显示种间克隆胚胎的发育能力要明显低于猪IVF胚胎（P<0.05）；iSCNT胚胎的16-细胞和囊胚发育率（9.6%和0.0%）,均显着低于IVF胚胎16-细胞和囊胚发育率（30.6%和17.3%）。4.选择NCSU-23作为小鼠-猪种间克隆胚胎培养基,分别置于38.5℃和37℃CO2培养箱中培养,于培养1、2和7d观察不同温度对iSCNT胚胎发育的影响。结果表明,两组卵裂率虽无显着差异,但iSCNT胚胎在38.5℃条件下的发育能力优于37℃组；8-细胞和16-细胞发育率分别为59%对29.7%和13.1%对4.7%,证明38.5℃是更适合小鼠-猪种间克隆胚胎发育的体外培养温度。5.选择38.5℃作为小鼠-猪iSCNT胚胎的培养温度,分别置于NCSU-23、M16两种培养液中培养,于1、2和7d观察不同培养液对iSCNT胚胎发育的影响。结果显示小鼠-猪iSCNT胚胎在NCSU-23培养液的发育能力高于M16培养液组；卵裂率与16-细胞发育率分别为71.2%对51.1%和10.9%对5.3%,表明NCSU-23培养液更适合小鼠-猪iSCNT胚胎的发育。6.分别用小鼠胎儿成纤维细胞、小鼠卵丘细胞及不同传代次数的小鼠胎儿成纤维细胞作为核供体细胞,将获得的iSCNT胚胎培养于38.5℃、NCSU-23培养液中,于培养1、2和7d观察克隆胚胎的发育情况。结果显示不同核供体细胞来源和2-4代的小鼠胎儿成纤维细胞来源的小鼠-猪种间克隆胚胎发育无明显差异（P>0.05）。7.在操作液中添加细胞松弛素B（CB）,比较CB处理卵母细胞或不处理对照组所获小鼠-猪iSCNT胚胎的发育情况。结果表明,添加或不添加CB处理,所获种间克隆胚卵裂率和16-细胞发育率无显着差异（分别为70.6%对71.1%和12.5%对14.8%；P>0.05）。8.比较42、44、46和48h猪卵母细胞的pbI排出率,以及对小鼠-猪种间克隆胚胎发育的影响,结果显示44h所获pbI排出率和种间克隆胚胎卵裂率最佳（分别为77.3%和76.1%）,为本试验条件下的最佳体外成熟培养时间。9.对所获部分16-细胞期体外受精胚胎和种间克隆胚胎进行FDA染色,鉴定其存活率,染色后均发出强绿色荧光,表明胚胎存活,所检iSCNT胚胎存活率为100%。
彭亚平[7]（2008）在《猪流感病毒和“猪—禽”流感重配病毒的拯救及其生物学特性的研究》文中研究说明猪流感（Swine Influenza,SI）是由猪流感病毒（Swine Influenza Virus,SIV）引起猪的一种急性、高度接触性的呼吸道传染病。SIV不仅可感染猪,同时也具有感染禽等鸟类和人、马等其他哺乳动物的能力。而猪可被禽流感病毒（Avian InfluenzaVirus,AIV）和人流感病毒感染,是流感病毒基因重组或重配的“混合器”和流感病毒新流行毒株产生的“孵育器”,因而猪是流感病毒“禽-哺乳动物”种间传播链中重要的中间宿主。SIV及猪的这些特征决定了它们在流感病毒种间传播中具有不可替代的地位,SIV在流感病毒的流行、跨种传播等方面的研究以及在公共卫生上都具有重要意义。本研究利用流感病毒8质粒拯救系统成功拯救了一株猪流感病毒以及两株“猪-禽”流感重配病毒,并比较两株重配病毒与其亲本毒之间的毒力差异。这为研究评估“猪-禽”流感重配病毒的风险以及流感病毒跨种传播提供了一定依据。主要研究结果如下:1.H1N1亚型猪流感病毒的拯救利用流感病毒8质粒拯救系统成功拯救出了猪流感病毒毒株A/Swine/TianJin/01/2004（H1N1）（A/S/TJ/04）。将猪流感病毒8个基因节段经RT-PCR合成cDNA后,分别克隆到RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ双向表达载体pHW2000中,构建成8个重组质粒。用8个重组质粒共转染COS-1细胞,30小时后加入TPCK-胰酶至终浓度0.5μg/mL。共转染48～72h后收获COS-1细胞及其上清,经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚。收获死亡鸡胚尿囊液并继续用SPF鸡胚传3代,得到有感染性的病毒。经血凝、血凝抑制试验、测序分析、电镜观察等均证实了A/S/TJ/04猪流感病毒的成功拯救,这为进一步研究猪流感病毒基因组结构与功能的关系、流感跨种传播的机制以及构建新型猪流感疫苗株奠定了基础。2.“猪-禽”流感重配病毒的拯救及其生物学特性的研究以流感病毒8质粒拯救系统为工具,分别将猪流感病毒毒株A/S/TJ/04的HA基因以及HA和NA基因用禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004（H5N1）（A/C/HB/04）的相应基因片段进行置换,构建了“7+1”型重配病毒T+H（HA）和“6+2”型重配病毒T+H（HA/NA）,并测定亲本毒和重配毒的EID50。以BALB/c小鼠为动物实验模型,各种病毒以106EID50的病毒量对小鼠进行攻毒,观察小鼠的存活率和体重变化情况,并在攻读后第3、6、12天取小鼠心、肺、脾、直肠和脑,计算组织体重比（即比重）,利用抗原捕捉ELISA检测方法检测各器官的病毒含量。通过对各攻毒组的数据进行比较,比较亲本毒株和重配毒株对小鼠感染致病能力的差异。结果显示,重配毒株对小鼠的致病力介于两亲本毒之间,强于猪流感病毒A/S/TJ/04而弱于禽流感病毒A/C/HB/04,其中重配毒株T+H（HA/NA）的致病力又强于T+H（HA）。结果表明猪流感病毒A/S/TJ/04在获得禽流感病毒A/C/HB/04的HA或HA和NA基因后致病力和组织嗜性都有所增强,在跨种传播和病毒流行方面具有一定的风险性,但同时也具有一定的限制性。
于海[8]（2008）在《中国部分地区猪流感病毒的分子流行病学研究》文中进行了进一步梳理猪流感（Swine influenza, SI）是由猪流感病毒（Swine influenza virus, SIV）引起的一种急性高度接触传染性的群发性猪呼吸道疾病,具有重要的兽医和人类公共卫生学意义。为了有效地配合SIV流行病学调查,本研究首先根据SIV的M、HA、NA基因设计了6对引物,分别用于SIV的诊断及H1、H3、H9、N1和N2亚型SIV的快速鉴定。所建立的SIV型和亚型RT-PCR检测方法有很好的特异性,可以检测到102103EID50的SIV,并在初步的临床样品检测中得到了应用。为了了解我国SI的流行情况,2005年～2007年,我们先后在黑龙江、河南、山东、浙江、安徽、江西、北京、广东、广西9个省份的不同猪场,进行了600份样品的采集,分离到22株SIV,其中H1N1亚型1株、H3N2亚型4株、H9N2亚型4株。为了检测这9株SIV对哺乳动物的致病性以及在哺乳动物群体内的水平传播能力,我们进行了小鼠致病性试验,试验结果表明:这9株SIV对小鼠的致病力较弱,不引起明显的临床症状,不具备在小鼠之间水平传播的能力,但在感染后的第4天和第8天可以在小鼠的肺组织中分离到病毒。古典H1N1亚型SIV和禽源H1N1亚型SIV广泛流行于世界范围内的猪群中。关于人源H1N1亚型SIV,世界范围内报道较少。2006年我们在广东省的一猪场分离到1株人源H1N1亚型SIV,并首次在中国进行相关报道。结合华中农业大学最近公布的2株人源H1N1亚型SIV的全基因序列,我们对这3株病毒进行了相关的遗传演化分析。3株SIV的8个基因片段核苷酸同源性分析结果表明,A/swine/Guangdong/96/06与2000年左右的人流感病毒有较高的同源性,8个基因片段核苷酸同源率在98.899.6%之间;A/swine/Tianjin/01/04和A/swine/Henan/01/06与1986年左右的人流感病毒有较高的同源性,8个基因片段核苷酸同源率在98.2100%之间。3株SIV的遗传演化分析结果及HA、NA氨基酸分析结果也均表明,这3株SIV都属于人源谱系的SIV,基本保留了人流感病毒的特性,分别起源于2000年左右的人流感病毒和1986年左右的人流感病毒。这些流感病毒的存在,特别是古老的人流感病毒在猪体内的存在,对我国流感病毒的生态分布和遗传演化研究具有非常重要的意义。猪具有同时感染禽流感病毒和人流感病毒的能力,被认为是新的流感病毒产生的中间宿主和基因混合器。本研究进行了1970～2006年44株H3N2亚型SIV的遗传演化分析,第一次全面总结和报道了完全人源的、二源重组的和三源重组的H3N2亚型SIV在我国猪群的相互存在。早在1970第一株完全人源的H3N2亚型SIV（Hong Kong/68-like）从台湾省的猪群中分离到,此后Victoria/75-like,Syndney/97-like,New York/99-like和Moscow/99-like的SIV陆续从我国的猪群中分离到;在1980年左右,2株三源重组的H3N2亚型SIV在我国出现,并已经被学者们报道;最近,二源重组的H3N2亚型SIV（HA和NA基因来自人流感病毒,PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因来自禽流感病毒）和三源重组的H3N2亚型SIV（HA和NA基因来自人流感病毒,NP基因来自古典的H1N1亚型SIV,PB2、PB1、PA、M和NS基因来自禽流感病毒）在我国猪群中被分离到。这些SIV的存在,特别是重组的SIV的存在,充分地证实了猪确实能作为流感病毒产生的“混合器”,具有重要的人类公共卫生意义,进一步强调了加强我国SIV监控的重要性。H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染禽,而且也可以感染猪和人。2007年3月,正值猪呼吸与繁殖综合征（PRRS）发病期间,我们在广西省多个猪场共采集50份左右临床样品,同时进行了PRRSV和SIV的RT-PCR检测,其中有4份样品PRRSV和SIV的检测结果都为阳性,并分离出相应的4株PRRSV和SIV,相应的SIV代表毒株命名为A/swine/Guangxi/7/07（H9N2）。序列分析表明,A/swine/Guangxi/7/07的8个基因片段与A/Pigeon/Nanchang/2-0641/00和A/Wild Duck/Nanchang/2-0480/00有较高的同源性,可能起源于A/Duck/Hong Kong/Y280/97-like H9N2亚型禽流感病毒。为了进一步了解我国禽源H9N2亚型SIV的遗传演化规律,我们从GenBank中调取了另外24株H9N2亚型SIV进行了相关的研究。遗传演化分析表明,这25株禽源H9N2亚型SIV可以划分10个基因型,其中B型的5株病毒起源于A/Duck/Hong Kong/Y280/97,C型的5株病毒起源于A/chicken/Shanghai/F/98,其余的15株存在复杂的重组现象。本研究使我们对我国禽源H9N2亚型SIV的分子进化有了全新的理解,为我国动物流感疫情监测及预防控制提供理论依据。为全面了解SI在我国的流行情况,我们在进行SIV分离鉴定的同时,也开展了SI的血清学调查。2005～2007年,我们先后在9个省份的不同猪场,进行了717份血清样品的采集。通过血凝抑制试验,我们进行人源H1、人源H3、禽源H5、禽源H9亚型SIV抗体的检测,阳性率分别为020.8%、29.697.1%、1.113.2%、6.531.6%,其中以人源H3亚型阳性率最高,说明人源H3亚型SIV可能在我国猪群中相当普遍;人源H1亚型SIV的抗体呈现较低的阳性率,表明人源H1亚型SIV可能零星感染中国的猪群;另外,我们也检测到了猪群中禽源H5和H9亚型流感病毒的抗体。H3亚型SIV是我国猪群流感病毒流行的主要亚型之一,为方便以后H3亚型SIV抗体的检测,我们表达了H3N2亚型SIV的HA1蛋白,建立了基于HA1蛋白的间接ELISA方法,并初步用于临床血清样品抗体的检测。近几年,H5N1亚型禽流感病毒已跨越了“猪-禽”的种间屏障,在我国猪群中存在。为了进一步研究禽源H5N1亚型SIV的致病机制及病毒的结构与功能,本研究选取一株背景清晰的SIV分离株（A/swine/Fujian/NP/01）进行反向遗传平台的构建。目前,我们已经获得了序列准确的8质粒,下游的病毒拯救工作还在继续进行当中。
黄雅琼[9]（2008）在《猪体细胞核移植相关技术研究》文中指出1.探讨了猪卵母细胞体外成熟过程中减数分裂进程和卵母细胞的发育潜力。（1）不同直径卵泡内的卵母细胞的成熟进程及各时相出现的时间存在差异。直径＞2mm的卵泡内的卵母细胞体外培养16 h,大部分发生GVBD（germinal vesicle breakdown）;卵母细胞GV期的比率由0h的68.00%下降到16h的15.38%;成熟培养20h时,终变期（diakinesis,DK）的比率达到峰值（27.06%）,而MⅠ的峰值（69.69%）出现在培养后28h;成熟培养32～44h时,Ana-Ⅰ/Tel-Ⅰ期的比率达到最高（53.33%）;成熟培养48h时,MⅡ期的比率达到最大值（63.64%）。（2）不同直径卵泡的卵母细胞体外成熟后的孤雌发育能力不同。直径＜2mm、直径2～6mm、直径＞6mm的卵泡的卵母细胞的成熟率分别为5.12%,66.63%和46.72%;分裂率分别为1.42%,72.19%和58.54%;囊胚率分别为0、28.76%和23.13%。直径＜2mm和＞6mm卵泡内的卵母细胞的卵裂率明显低于直径2～6mm卵泡的卵母细胞的卵裂率（P＜0.05）。直径2～6mm卵泡内的卵母细胞体外成熟较快,体外发育潜能较高。2.探讨了激素和生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果发现,在成熟液中添加0.1μg/mL FSH的卵母细胞成熟率显着高于添加0.01IU/mL人绝经期促性腺激素（hMG）的卵母细胞成熟率（P＜0.05）,但两组间的分裂率和囊胚率差异不显着（P＞0.05）。猪卵母细胞分别在添加有0、10、30、50、70或90ng/mL表皮生长因子（EGF）的成熟液中成熟培养后进行孤雌激活,50ng/mL EGF组的成熟率达到66.89%,孤雌激活的分裂率达到84.90%,囊胚率达到30.20%,成熟率显着高于其余各组,分裂率和囊胚率高于对照组。在成熟液中添加10ng/mL胰岛素样生长因子（IGF-I）显着提高猪卵母细胞的第一极体排出率。在成熟液中同时添加50ng/mL EGF和10ng/mL IGF-I显着提高猪卵母细胞的孤雌发育能力（P＜0.05）。分别使用以TCM-199、NCSU-23（North Carolina State University-23,北卡大学胚胎培养液）和PZM-3为基础液的成熟液进行成熟培养猪卵母细胞,各组间在分裂率,成熟率和囊胚率方面差异不显着（P＞0.05）,表明均可用于猪卵母细胞的体外成熟和体外培养。3.系统探讨了孤雌激活方法对猪卵母细胞孤雌发育效果的影响。结果发现:（1）浓度为9%的乙醇（EH）激活处理10min效果好于15min;（2）用9%EH激活处理10min后,再用2μmol/L 6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）培养处理3～4h的卵母细胞分裂率及囊胚率分别为82.86%和22.86%,显着高于再用10μg/mL放线菌酮（CHX）+10mmol/L SrCL2(Sr2+)、10 mmol/L Sr2++2μmol/L 6-DMAP、10μ/mL CHX+2μmol/L6-DMAP或10μg/mL CHX+2μmol/L 6-DMAP+10 mmol/L Sr2+培养处理3～4h的卵母细胞。（3）比较几种激活方法（5μmol/L Ion激活处理5min,9%乙醇激活处理10min,50 v/mm和50μs的电脉冲2次）的猪卵母细胞孤雌激活效果发现,离子霉素（Ion）的猪卵母细胞孤雌激活效果最好,囊胚率达到37.50%。（4）卵母细胞周围的卵丘细胞层数对其成熟后的孤雌发育有显着影响,4～6层和6层以上卵丘-卵母细胞复合体成熟后的孤雌激活分裂率（68.99%和75.36%）和囊胚率（32.56%和37.68%）显着高于其它组（p＜0.05）。4.对猪卵丘细胞、胎儿成纤维细胞和睾丸间质细胞的分离和传代培养进行了系统研究。结果发现,猪卵丘细胞单层的生长需要5～6d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10～11d和8～9d。酶消化法和钢网过滤筛选法可获得猪睾丸间质细胞,猪睾丸间质细胞单层生长需要3～5d。猪胎儿成纤维细胞冷冻解冻后,复苏率为68.36%。通过培养和观察,猪胎儿成纤维细胞的生长形成有规则的生长曲线。5.对猪体细胞核移植的方法及影响因素进行了探索。（1）猪卵母细胞体外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h后,分别进行去核构建重构胚,结果发现,成熟44h和48h的卵母细胞核移植后的融合率（58.99%和56.51%）、卵裂率（67.52%和65.73%）和囊胚率（22.78%和15.96%）较高,其中卵龄为44h的分裂率与囊胚率显着高于卵龄为40h、36h、32h、28h的卵母细胞（P＜0.05）。卵龄为48h的融合率高于卵龄为52h的卵母细胞（P＜0.05）。（2）盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view系统去核法的去核率分别为76.33%,100.00%,98.40%,前者低于后两者（P＜0.05）;三种去核方法去核的卵母细胞核移植后,分裂率以Hoechest染色法较低（P＜0.05）,但融合率和囊胚率差异不显着（P＞0.05）。（3）不同注核方法（细胞质内注射法和透明带下注射法）的核移植效果研究结果显示,细胞质内注射和透明带下注射法的分裂率为（68.13%和60.37%）与囊胚率（6.44%和8.08%）差异均不显着（P＞0.05）。6.探讨了供体细胞种类及其培养处理方法对猪体细胞核移植效果的影响。（1）比较胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和卵丘细胞的核移植效果发现,胎儿成纤维细胞的融合率（64.74%）高于颗粒细胞（51.05%）和卵丘细胞（56.89%）,但三种细胞的卵裂率及囊胚率差异不显着（P＞0.05）。（2）不同代数的胎儿成纤维细胞的核移植效果的研究发现,6～9代的融合率显着高于3～5代和＞10代的成纤维细胞（P＞0.05）,但卵裂率和囊胚率差异不显着（P＞0.05）。（3）不同性别猪胎儿成纤维细胞核移植效果的研究发现:雄性胎儿成纤维细胞核移植的融合率和分裂率与雌性胎儿成纤维细胞相比差异不显着（P＞0.05）,但囊胚率显着低于雌性胎儿成纤维细胞（P＜0.05）。（4）100%长满汇合的胎儿成纤维细胞的核移植融合率高于70～80%汇合的胎儿成纤维细胞（P＜0.05）,分裂率高于血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞（P＜0.05）,但囊胚率差异不显着。（5）猪胎儿成纤维细胞冷冻解冻后的核移植分裂率和囊胚率均显着低于新鲜和4℃冷藏的细胞（P＜0.05）,虽然融合率无显着差异（P＞0.05）,表明猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植。（6）表面光滑的猪卵丘细胞做供体细胞的核移植后的分裂率和囊胚率均显着高于表面粗糙的猪卵丘细胞做供体细胞的核移植后的分裂率和囊胚率（P＜0.05）,虽然融合率差异不显着（P＞0.05）。（7）直径＜15μm的供体细胞核移植后的融合率显着低于直径＞30μm的供体细胞（P＜0.05）,直径20～3μm供体细胞核移植后的分裂率与囊胚率（63.73%和21.54%）较高。（8）组织块法和酶消化法分离得到的供体细胞所构建的重构胚在融合率、分裂率和囊胚率方面没有显着差异（P＞0.05）。
潘晓燕[10]（2008）在《盘羊—绵羊异种核移植技术程序的优化研究》文中提出盘羊是一种珍稀的野生保护动物,长期的过度猎杀是盘羊面临灭绝的主要因素,利用异种核移植技术来保护濒危动物极具发展潜力。本研究通过体外培养技术建立了盘羊的耳成纤维细胞系,以此为供体,绵羊卵母细胞为受体,利用显微操作技术构建了异种重构胚,通过对核移植各技术环节的优化,显着提高了胚胎的体外发育率,且将重构胚移植到代孕绵羊体内,其中有2只受体羊延迟到90 d后返情,最终未获得妊娠。1供体细胞系的建立采取新疆野生盘羊耳皮肤组织和新疆本地绵羊流产胎儿的皮肤组织,利用组织块培养法建立了盘羊和绵羊成纤维细胞系;由体外成熟的绵羊卵巢卵丘-卵母细胞复合体获取卵丘细胞,进行原代传代培养.通过对盘羊成纤维细胞、绵羊成纤维细胞和卵丘细胞三种细胞系的细胞生长曲线测定,发现盘羊皮肤成纤维细胞的潜伏期比绵羊成纤维细胞和卵丘细胞的潜伏期长,没有明显的平台期。生长曲线波动规则,符合成纤维细胞的体外生长特征,适合作为核移植供体细胞。为建立适合盘羊成纤维细胞的冷冻保存体系,本文研究了冷冻程序和冷冻液对盘羊皮肤成纤维细胞冷冻存活率的影响。选用3种不同的冷冻方法,程序1（先4℃冰箱预冷30 min,-20℃放置3 h,-70℃过夜,然后投入液氮中保存）冷冻细胞解冻后的存活率为95.2%,细胞的贴壁率在接种18 h后达到70%～80%,显着高于其它两个冷冻程序。在程序1中,将细胞在-20℃保存3～5 h,没有显着影响细胞的存活率,接种后细胞的生长状况也没有明显的差异。采用冷冻液1（50%FBS）对细胞进行冷冻,解冻后细胞的存活率显着高于冷冻液2（20%FBS）组,且前者细胞解冻接种的贴壁率也稍高于后者。结果表明,利用程序1,采用50%FBS的冷冻液对细胞进行冷冻保存,可以得到较高的解冻后细胞存活率。运用常规的染色体核型分析技术,对新疆珍稀野生盘羊和当地绵羊的染色体核型进行研究。结果表明:盘羊的染色体数2n=56,其中有27对常染色体和1对性染色体,1号和2号常染色体为中着丝粒染色体,其余的3～27号为端着丝粒染色体;X染色体为最大的端着丝粒染色体,Y染色体为最小的中着丝粒染色体.绵羊的二倍体染色体数2n=54,其中包括26对常染色体和1对性染色体,常染色体中1、2和3号为中着丝粒染色体,4～26号为端着丝粒染色体;X染色体为最大的端着丝粒染色体,Y染色体为最小的中着丝粒染色体。2盘羊异种重构胚的构建本试验比较了绵羊卵巢不同的保存温度、时间与保存液对卵母细胞孤雌发育能力的影响。结果表明,14～18℃保存15～17h的卵巢卵母细胞的成熟率（80.9%vs 82.2%）、孤雌激活后囊胚的发育率（21.0%vs 22.0%）与对照组间均无显着差异,采用生理盐水或D-PBS保存卵巢对卵母细胞的发育亦无显着影响;而将卵巢在4℃或25～30℃保存15～17 h却显着降低了卵母细胞的成熟率（61.9%vs 19%）与卵裂率（8.6%vs 9.1%）,没有发育到囊胚。从而得出,14～18℃的保存温度对卵巢的长时间保存是比较适宜的。受体卵母细胞去核是核移植关键步骤之一。盲吸法是最常采用的去核方法,化学辅助去核法则是利用秋水仙素处理卵母细胞,从而使卵母细胞形成一个包含浓缩染色体的胞质突起,利用去核针将其吸除,以达到去核目的。本文比较了在化学辅助去核法中,秋水仙素的浓度争作用时间对显示效果的影响;且对两种去核法的去核效率进行了探讨。结果表明:（1）成熟的卵母细胞在0.4μg/mL的秋水仙素溶液中分别孵育0.5 h和1 h,胞质突起率和去核率没有显着的差异,突起率可高达85.4%,去核率达到100%.（2）分别用0.2μg/mL和0.4μg/mL秋水仙素对卵母细胞处理0.5h,均能达到有效去核的目的。（3）卵母细胞体外成熟18～23 h,不会影响秋水仙素诱导胞质突起的比率和去核率;且对成熟21～23 h的卵母细胞采用化学辅助去核法去核,去核率显着高于盲吸去核法.（4）对成熟18～20 h的卵母细胞进行盲吸法或化学辅助法去核,重构胚的发育率没有显着差异。由此可见,化学辅助去核法（0.2μg/mL的秋水仙素处理0.5 h）可以高效快速地去核,且不影响重构胚的早期发育。另外,本试验还比较了不同的电融合程序、激活方法和胚胎培养液对异种重构胚发育的影响。结果显示:异种重构胚的适宜电融合参数为2个121～125 V/mm、40μs/次的直流电脉冲或2个126～130 V/mm、20μs/次的直流电脉冲;融合后,对未融合的重构胚以同样的融合参数再融合一次,不会影响重构胚的发育率,可得到更多的可用异种核移植胚胎。卵母细胞成熟培养25 h和26 h激活组的囊胚率显着高于成熟培养24 h激活组:6-DMAP激活液作用2 h,激活效果较好;分别采用EH+6-DMAP或Iono+6-DMAP两种方法激活重构胚,Iono+6-DMAP试验组重构胚的卵裂率和囊胚率高于EH+6-DMAP试验组,但差异不显着。对孤雌胚和核移植胚进行体外培养,培养液改进后,孤雌胚的囊胚率有上升趋势,但差异不显着;胚胎培养液中添加10 ng/mL的EGF提高了重构胚的卵裂率和囊胚率,分别为87.4%和19.3%。3盘羊供体细胞对异种核移植效率的影响对传代的细胞进行细胞周期测定,随着汇合度的增加、汇合时间和血清饥饿时间的延长,G0/G1期细胞比例随之增加。以来自不同个体、不同代次、不同汇合度、不同血清饥饿时间、不同保存方式和不同光滑程度的盘羊成纤维细胞为核供体,以当地绵羊卵母细胞为受体,进行异种重构胚的构建。结果表明:（1）来自3只盘羊耳皮肤成纤维细胞的异种重构胚的卵裂率与囊胚率均无显着差异。（2）采用10代以内的细胞作为核供体,细胞代次不会影响重构胚的发育率。（3）以不同汇合度和汇合不同天数的盘羊成纤维细胞作为供体细胞,重构胚的卵裂率之间没有显着的差异,70%～80%汇合组、90%汇合组和100%汇合1 d组的重构胚的囊胚率显着高于100%汇合2～4 d组重构胚的囊胚率。（4）血清饥饿不同时间的盘羊成纤维细胞,对异种重构胚的发育率没有产生显着的影响。（5）将供体细胞4℃保存2 d,虽降低了卵裂率,但囊胚率没有受到显着影响。（6）选取表面光滑的细胞作为核供体,其融合率显着高于表面粗糙供体细胞组;两试验组重构胚的卵裂率之间没有显着差异,但表面光滑供体细胞组的囊胚率显着高于表面粗糙供体细胞组的囊胚率。因此,利用本试验中的3只盘羊耳成纤维细胞,选择培养到10代以内、70%～80%汇合后的光滑细胞用于构建异种重构胚,能得到较高的早期胚胎发育率。4不同类型胚胎的体外发育及胚胎移植利用孤雌激活技术、体外受精技术及体细胞核移植技术分别生产了不同类型的体外胚胎,比较了由不同生产方式引起的遗传物质差异对胚胎体外发育率及囊胚总细胞数的影响。同时,本试验还研究了季节、卵巢保存条件和培养液对PAEs和FC-NTEs发育能力的影响。结果表明:（1）PAEs、FC-NTEs、CC-NTEs、AC-NTEs和IVFEs的卵裂率没有显着差异;PAEs的囊胚率（23.4%）显着高于AC-NTEs（15.9%）组,其它三组差异不显着;FC-NTEs的囊胚细胞数（120）显着多于PAEs的囊胚细胞数（96）,与IVFEs的囊胚细胞数（107）没有显着差异。（2）繁殖季节卵巢的PAEs和FC-NTEs的发育率分别显着高于非繁殖季节的发育率。（3）卵巢在14～18℃保存15～17 h,没有影响PAEs的体外发育;却显着降低了FC-NTEs的卵裂率,且没有得到囊胚。（4）SOFaa和CR1aa培养基对PAEs和FC-NTEs的早期发育没有显着影响.（5）进行了一次异种重构胚的移植试验,成熟卵数57枚,核移植53枚,融合率为84.9%,卵裂率为77.8%,将卵裂的35枚胚胎移植到3只受体羊,其中有2只受体羊延迟到90 d后返情,最终未得到妊娠。由此可见,胚胎的体外生产方式和卵巢的来源对早期胚胎的质量和发育率有显着的影响,而SOFaa和CR1aa培养基对胚胎的生长发育影响不大;可以尝试利用异种核移植技术保护濒危动物。
二、Progress in interspecies cloning of mammals（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Progress in interspecies cloning of mammals（论文提纲范文）
（1）气单胞菌属DNA条形码的筛选及锦鲤抗菌免疫应答分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 气单胞菌 |
| 1.1.1 气单胞菌概述 |
| 1.1.2 气单胞菌检测技术 |
| 1.2 DNA条形码技术 |
| 1.2.1 DNA条形码技术概述 |
| 1.2.2 DNA条形码技术在细菌鉴定中的应用 |
| 1.3 锦鲤研究现状 |
| 1.4 硬骨鱼免疫学研究进展 |
| 1.4.1 硬骨鱼免疫系统 |
| 1.4.2 抗菌相关免疫因子 |
| 1.4.3 TLR4 研究概况 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 气单胞菌属DNA条形码的筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 气单胞菌DNA提取与引物设计 |
| 2.2.2 候选基因PCR扩增及测序 |
| 2.2.3 序列信息分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 PCR扩增及测序成功率 |
| 2.3.2 序列信息分析 |
| 2.3.3 种内和种间遗传距离分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 感染维氏气单胞菌的锦鲤脾脏转录组分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 菌株 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 实验试剂 |
| 3.1.5 主要数据库和软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 维氏气单胞菌的鉴定 |
| 3.2.2 维氏气单胞菌的活化与收集 |
| 3.2.3 锦鲤脾脏样本采集 |
| 3.2.4 RNA提取与质检 |
| 3.2.5 转录组测序 |
| 3.2.6 基因差异表达分析 |
| 3.2.7 qPCR验证转录组数据准确性 |
| 3.2.8 数据统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 维氏气单胞菌的鉴定 |
| 3.3.2 RNA质检 |
| 3.3.3 转录组测序数据统计 |
| 3.3.4 Unigene注释分析 |
| 3.3.5 差异表达基因的筛选与富集分析 |
| 3.3.6 qPCR验证转录组数据的准确性 |
| 3.3.7 NLRP3 炎性小体相关基因表达趋势 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 锦鲤TLR4 基因c DNA的克隆和序列分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 主要数据库与软件 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 锦鲤脾脏RNA提取与质检 |
| 4.2.2 第一链c DNA的制备 |
| 4.2.3 锦鲤TLR4 序列的克隆与分析 |
| 4.2.4 锦鲤TLR4 氨基酸序列分析 |
| 4.2.5 锦鲤TLR4 基因的组织分布 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 锦鲤TLR4 基因扩增 |
| 4.3.2 锦鲤TLR4 氨基酸序列分析 |
| 4.3.3 锦鲤TLR4 的系统进化树分析 |
| 4.3.4 锦鲤TLR4 蛋白3D模型的构建 |
| 4.3.5 TLR4 基因在锦鲤组织中的表达情况 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及专利 |
（2）云南部分野生小型哺乳动物及广西家犬肉孢子虫的形态及分子特征（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 肉孢子虫的研究史和分类地位 |
| 2 肉孢子虫的结构和生活史 |
| 2.1 结构 |
| 2.2 生活史 |
| 3 肉孢子虫的分类依据 |
| 4 野生小型哺乳动物肉孢子虫的研究背景及意义 |
| 4.1 野生鼠类肉孢子虫的研究背景 |
| 4.1.1 寄生于鼠属(Rattus)已命名的7种肉孢子虫 |
| 4.1.2 寄生于姬鼠属(Apodemus)已命名的1种肉孢子虫 |
| 4.1.3 寄生于绒鼠属(Eothenomys)已命名的2种肉孢子虫 |
| 4.2 野生食虫目肉孢子虫的研究背景 |
| 4.3 野生小型哺乳动物肉孢子虫的研究意义 |
| 5 犬肌肉肉孢子虫的研究背景及意义 |
| 5.1 犬肌肉肉孢子虫的研究背景 |
| 5.2 犬肌肉肉孢子虫的研究意义 |
| 第二章 云南省部分野生小型哺乳动物肉孢子虫的形态学和分子标记特征 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 野生小型哺乳动物肌肉样品的采集 |
| 2.2 野生小型哺乳动物(宿主)的鉴定 |
| 2.3 肉孢子虫包囊的光镜观察 |
| 2.4 制备肉孢子虫包囊的透射电镜材料及观察 |
| 2.5 分子生物学实验所需试剂与实验仪器 |
| 2.5.1 包囊DNA提取所需试剂 |
| 2.5.2 PCR扩增及检测电泳试剂 |
| 2.5.3 分子生物学实验所需试剂 |
| 2.5.4 实验所需主要仪器设备 |
| 2.6 分子实验方法 |
| 2.6.1 包囊DNA提取 |
| 2.6.2 基因的PCR扩增 |
| 2.6.3 PCR产物的纯化与回收 |
| 2.6.4 目的片段的连接与转化 |
| 2.6.5 阳性质粒DNA的PCR鉴定 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 野生小型哺乳动物肉孢子虫包囊的光镜和电镜形态 |
| 3.1.1 黄毛鼠肉孢子虫新种(S.losea n.sp.) |
| 3.1.2 西姆里肉孢子虫(S.cymruensis) |
| 3.1.3 社鼠肉孢子虫新种(S. confucianus n.sp.) |
| 3.1.4 左氏肉孢子虫(S.zuoi) |
| 3.1.5 齐氏肉孢子虫新种(S.chevieri n.sp.) |
| 3.1.6 绒鼠肉孢子虫(S.eothenomysi) |
| 3.1.7 (?)肉孢子虫(S.clethrionomyelaphis) |
| 3.1.8 灰麝鼩肉孢子虫新种(S.attenuata n.sp.) |
| 3.2 部分野生小型哺乳动物肉孢子虫的18S rDNA序列分析 |
| 3.3 部分野生小型哺乳动物肉孢子虫的线粒体COX1基因序列分析 |
| 3.4 部分野生小型哺乳动物肉孢子虫的18S rDNA和线粒体COX1基因序列的遗传距离分析 |
| 3.5 部分野生小型哺乳动物肉孢子虫的18S rDNA和线粒体COX1基因序列的分子系统学分析 |
| 3.5.1 部分野生小型哺乳动物肉孢子虫的18S rDNA序列分子系统学分析 |
| 3.5.2 部分野生小型哺乳动物肉孢子虫的线粒体COX1基因序列分子系统学分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 犬肌肉肉孢子虫的形态学和分子标记特征 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 家犬肌肉的收集 |
| 2.2 犬的肉孢子虫包囊的光镜观察 |
| 2.3 制备犬的肉孢子虫包囊的透射电镜材料及观察 |
| 2.4 实验所需试剂和实验仪器 |
| 2.4.1 包囊DNA提取所需试剂 |
| 2.4.2 PCR扩增及检测电泳试剂 |
| 2.4.3 分子生物学实验所需试剂 |
| 2.4.4 实验所需主要仪器设备 |
| 2.5 分子实验方法 |
| 2.5.1 包囊DNA提取 |
| 2.5.2 基因的PCR扩增 |
| 2.5.3 PCR产物的纯化与回收 |
| 2.5.4 目的片段的连接与转化 |
| 2.5.5 阳性质粒DNA的PCR鉴定 |
| 2.5.6 DNA测序 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 犬肉孢子虫(S caninum)的包囊形态 |
| 3.2 犬肉孢子虫(S.caninum)的18S rDNA序列分析 |
| 3.3 犬肉孢子虫(S.caninum)的28S rDNA序列分析 |
| 3.4 犬肉孢子虫(S. caninum)的线粒体COX1基因序列分析 |
| 3.5 犬肉孢子虫(S. caninum)的ITS-1基因序列分析 |
| 3.6 犬肉孢子虫(S. caninum)的RpoB基因序列分析 |
| 3.7 犬肉孢子虫(S. caninum)的18S rDNA、28S rDNA、线粒体COX1、ITS-1和RpoB基因序列的分子系统学分析 |
| 3.7.1 犬肉孢子虫(S. caninum)的18S rDNA序列的分子系统学分析 |
| 3.7.2 犬肉孢子虫(S.caninum)的28S rDNA序列的分子系统学分析 |
| 3.7.3 犬肉孢子虫(S. caninum)的线粒体COX1基因序列的分子系统学分析 |
| 3.7.4 犬肉孢子虫(S.caninum)的ITS-1基因序列的分子系统学分析 |
| 3.7.5 犬肉孢子虫(S. caninum)的RpoB基因序列的分子系统学分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间完成的科研成果 |
| 致谢 |
（3）哺乳动物MHC、TCR和Ig基因家族进化及其与生态位适应的关系探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 哺乳动物免疫系统分类与起源概述 |
| 1.2 主要组织相容性复合体概述 |
| 1.2.1 MHC分子结构与编码基因 |
| 1.2.2 MHC多态性 |
| 1.2.3 哺乳动物MHC研究进展 |
| 1.3 抗原受体概述 |
| 1.3.1 T细胞抗原受体 |
| 1.3.1.1 TCR分子结构 |
| 1.3.1.2 TCR编码基因与基因重排 |
| 1.3.1.3 TCR多样性 |
| 1.3.2 免疫球蛋白 |
| 1.3.2.1 Ig分子结构 |
| 1.3.2.2 Ig编码基因与基因重排 |
| 1.3.2.3 Ig多样性 |
| 1.3.3 哺乳动物抗原受体研究进展 |
| 1.4 哺乳动物生态位多样性与免疫适应 |
| 1.5 鲸类免疫基因进化研究进展 |
| 1.5.1 鲸类起源与进化概述 |
| 1.5.2 鲸类免疫基因研究进展 |
| 1.6 以鲸类为例,探究哺乳动物免疫基因家族进化的目的和意义 |
| 第2章 鲸类主要组织相容性复合体MHC基因组结构与系统发生关系 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 MHC序列鉴定 |
| 2.2.2 MHC序列系统发育树重建 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 鲸类MHC Ⅱ类基因序列鉴定 |
| 2.3.2 鲸类MHC Ⅱ类座位基因组结构特点 |
| 2.3.3 鲸类MHC A基因和B基因的系统发生关系 |
| 2.3.4 MHC-DRB座位进化的“生灭模型” |
| 第3章 鲸类T细胞受体G座位和D座位基因组结构特点与进化分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 物种选取与序列鉴定 |
| 3.2.2 系统发育树重建 |
| 3.2.3 祖先状态重建 |
| 3.2.4 系统发育比较分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 鲸类TRG和TRD基因序列鉴定 |
| 3.3.2 鲸类TRG和TRD座位基因组结构 |
| 3.3.3 鲸类TRG和TRD座位基因系统发生关系 |
| 3.3.4 哺乳动物TRGC EX2进化模式 |
| 3.3.5 鲸偶蹄目TRGV和TRDV基因家族数目与生境相关性 |
| 第4章 哺乳动物T细胞抗原受体C基因和V基因进化与生态位适应的关系 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 物种选取与序列鉴定 |
| 4.2.2 系统发育树重建 |
| 4.2.3 系统发育比较分析 |
| 4.2.4 分子进化分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 TRC基因进化 |
| 4.3.1.1 TRC序列鉴定与分类 |
| 4.3.1.2 TRC基因数目与进化 |
| 4.3.1.3 不同生态位哺乳动物类群TRC基因数目差异 |
| 4.3.1.4 TRC基因数目与生态因子的相关性 |
| 4.3.1.5 哺乳动物TRC基因数目在生态位适应中的多样性进化 |
| 4.3.2 TRV基因进化 |
| 4.3.2.1 不同生态位哺乳动物TRV基因数目差异 |
| 4.3.2.2 TRV基因数目与生态因子的相关性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 哺乳动物以TRC和TRV适应生境与集群行为的两种分子机制 |
| 4.4.2 蝙蝠特殊的免疫适应机制 |
| 4.4.3 T细胞受体与物种免疫适应 |
| 第5章 哺乳动物MHC、TCR和BCR基因家族进化模式及其与生态位适应的关系 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 物种选取与序列来源 |
| 5.2.2 系统发育比较分析 |
| 5.2.3 系统发育树重建 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 哺乳动物MHC-αβ TCR协同进化 |
| 5.3.2 哺乳动物抗原受体TCR和BCR进化与生态位适应的关系 |
| 5.3.3 哺乳动物抗原受体TCR和BCR进化历史 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 哺乳动物MHC与 αβ TCR协同进化 |
| 5.4.2 生境与食性是驱动哺乳动物TRV数目进化的关键因子 |
| 第6章 总结与展望 |
| 附录A |
| 附录B |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（4）版纳微型猪近交系四个精子发生关键基因家族的分离与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 哺乳动物精子发生的研究进展 |
| 1.1.1 哺乳动物精子发生的时期和场所 |
| 1.1.2 哺乳动物精子发生过程和意义 |
| 1.1.3 哺乳动物精子的结构 |
| 1.1.4 哺乳动物精子发生过程的基因调控 |
| 1.2 哺乳动物雄性不育研究进展 |
| 1.2.1 犏牛雄性不育研究进展 |
| 1.2.2 国外猪(芬兰约克夏猪)雄性不育研究进展 |
| 1.2.3 版纳微型猪近交系雄性不育研究进展 |
| 1.3 本研究分离的四个精子发生关键基因家族的研究进展 |
| 1.3.1 睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族研究进展 |
| 1.3.2 胞质分裂基因家族研究进展 |
| 1.3.3 无精子症基因家族研究进展 |
| 1.3.4 DEAD-box蛋白家族研究进展 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 菌株和细胞 |
| 2.1.3 质粒和探针 |
| 2.2 主要化学药品及试剂 |
| 2.2.1 RNA分析所需试剂 |
| 2.2.2 原核表达及抗体制备所需试剂 |
| 2.2.3 蛋白分析所需试剂 |
| 2.2.4 启动子克隆所需试剂 |
| 2.2.5 亚细胞定位、RNAi和基因过表达实验所需试剂 |
| 2.3 主要溶液配制 |
| 2.4 主要实验仪器 |
| 2.5 版纳微型猪近交系四个精子发生关键基因家族分离与序列分析 |
| 2.5.1 组织总RNA的提取和制备 |
| 2.5.2 cDNA第一链合成 |
| 2.5.3 设计并合成PCR引物 |
| 2.5.4 PCR扩增及产物检测 |
| 2.5.5 PCR产物回收及测序 |
| 2.5.6 PCR纯化产物与pEASY-T5 Zero克隆载体连接 |
| 2.5.7 连接产物的转化、复苏和培养 |
| 2.5.8 菌液PCR鉴定和测序 |
| 2.5.9 序列的生物信息学分析 |
| 2.6 版纳微型猪近交系四个精子发生关键基因家族表达研究 |
| 2.6.1 半定量RT-PCR分析基因的多组织表达情况 |
| 2.6.2 qPCR分析基因发育表达情况 |
| 2.6.3 原核表达及抗血清制备 |
| 2.6.4 Western Blot(WB)检测基因蛋白表达水平 |
| 2.7 版纳微型猪近交系精子发生关键基因启动子克隆与序列分析 |
| 2.7.1 组织样中DNA的提取 |
| 2.7.2 5'RACE和启动子PCR扩增引物设计 |
| 2.7.3 5'RACE和启动子区PCR扩增及产物检测 |
| 2.7.4 启动子序列生物信息学分析 |
| 2.8 版纳微型猪近交系精子发生关键基因的亚细胞定位研究 |
| 2.8.1 引物设计及真核表达序列扩增 |
| 2.8.2 重组克隆载体的构建与鉴定 |
| 2.8.3 融合表达载体的构建和鉴定 |
| 2.8.4 ST细胞培养 |
| 2.8.5 融合表达载体转染及细胞荧光观察 |
| 2.9 版纳微型猪近交系DDX3Y基因过表达和RNAi |
| 2.9.1 引物设计及DDX3Y过表达序列扩增 |
| 2.9.2 重组克隆载体的构建与鉴定 |
| 2.9.3 DDX3Y过表达载体的构建和鉴定 |
| 2.9.4 ST细胞培养、过表达载体和siRNA探针转染 |
| 2.9.5 细胞中总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 2.9.6 qPCR检测细胞中DDX3Y的表达情况 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 版纳微型猪近交系四个精子发生关键基因家族分离与序列分析结果 |
| 3.1.1 组织总RNA提取 |
| 3.1.2 版纳微型猪近交系TSSK家族分离与序列分析 |
| 3.1.3 版纳微型猪近交系Septin家族分离与序列分析 |
| 3.1.4 版纳微型猪近交系DAZ家族分离与序列分析 |
| 3.1.5 版纳微型猪近交系DEAD-box蛋白家族分离与序列分析 |
| 3.2 版纳微型猪近交系四个精子发生关键基因家族表达研究结果 |
| 3.2.1 mRNA水平上的多组织表达情况 |
| 3.2.2 mRNA水平上的发育表达结果 |
| 3.2.3 原核表达和抗血清制备结果 |
| 3.2.4 蛋白水平上的多组织表达结果 |
| 3.3 版纳微型猪近交系精子发生关键基因启动子克隆与序列分析结果 |
| 3.3.1 Septin12和Septin14基因5'RACE PCR扩增结果 |
| 3.3.2 重组克隆载体菌液PCR鉴定结果 |
| 3.3.3 BMI Septin12和Septin14基因5'RACE序列分析 |
| 3.3.4 启动子序列PCR扩增结果 |
| 3.3.5 启动子序列分析结果 |
| 3.4 版纳微型猪近交系精子发生关键基因的亚细胞定位研究结果 |
| 3.4.1 真核表达序列扩增结果 |
| 3.4.2 重组克隆载体的鉴定结果 |
| 3.4.3 融合表达载体的鉴定结果 |
| 3.4.4 融合蛋白的亚细胞定位结果 |
| 3.5 版纳微型猪近交系DDX3Y基因的过表达和RNAi结果 |
| 3.5.1 DDX3Y过表达序列扩增结果 |
| 3.5.2 pEASY-T5-ZERO-DDX3Y-GBD 重组质粒的鉴定 |
| 3.5.3 pcDNA3.1-DDX3Y重组质粒的构建和鉴定 |
| 3.5.4 细胞总RNA电泳检测结果 |
| 3.5.5 干扰和过表达效率检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 版纳微型猪近交系四个精子发生关键基因家族蛋白结构域的分析 |
| 4.2 版纳微型猪近交系四个精子发生关键基因家族序列分析 |
| 4.3 版纳微型猪近交系四个精子发生关键基因家族染色体定位和基因组结构分析 |
| 4.4 版纳微型猪近交系四个精子发生关键基因家族表达分析 |
| 4.5 版纳微型猪近交系精子发生关键基因启动子区序列分析 |
| 4.6 版纳微型猪近交系精子发生关键基因亚细胞定位分析 |
| 4.7 版纳微型猪近交系DDX3Y基因的过表达和RNAi沉默效果分析 |
| 5 小结 |
| 5.1 主要研究成果 |
| 5.2 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间完成的科研成果 |
| 致谢 |
（5）鸭源禽流感病毒的分离鉴定及其聚合酶活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 前言 第一篇 文献综述 |
| 1 禽流感概述 |
| 2 禽流感病原学 |
| 2.1 理化学特性 |
| 2.2 培养特性 |
| 3 分子生物学特征 |
| 3.1 禽流感病毒基因组结构组特征 |
| 3.2 禽流感病毒编码的蛋白质及其功能 |
| 4 流行病学特征 |
| 4.1 传染源 |
| 4.2 传播途径 |
| 4.3 发病季节 |
| 4.4 生态学 |
| 4.5 水禽在禽流感病毒传播中的意义 |
| 5 临床症状与剖检特征 |
| 5.1 急性型 |
| 5.2 温和型 |
| 5.3 隐性型 |
| 5.4 病理变化 |
| 6 禽流感病毒的感染和分子致病机制 |
| 6.1 禽流感病毒的感染 |
| 6.2 分子致病机制 |
| 7 禽流感病毒的诊断 |
| 7.1 鉴别诊断 |
| 7.2 传统诊断技术 |
| 7.3 分子生物学诊断技术 第二篇 研究内容 |
| 第一章 鸭源H5N5亚型禽流感病毒的分离与鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料及其来源 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的分离 |
| 2.2 病毒的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒的分离培养结果 |
| 3.2 胶体金试纸条检测结果 |
| 3.3 形态学鉴定 |
| 3.4 血清学鉴定 |
| 3.5 PCR扩增结果 |
| 3.6 PCR产物纯化、克隆、PCR鉴定与测序结果 |
| 3.7 HA与NA基因序列分析鉴定 |
| 3.8 血凝素和神经氨酸酶的基因系统进化分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 本研究病毒的分离 |
| 4.2 关于鸭源禽流感病毒的形态学观察 |
| 4.3 关于鸭源禽流感病毒的鉴定 |
| 4.4 鸭流感病毒的HA与NA基因序列分析 |
| 5 小结 |
| 第二章 鸭源H5N5亚型禽流感病毒聚合酶基因序列测定与分析 |
| 1 材料 |
| 1.1.病毒毒株 |
| 1.2 感受肽工程菌与载体 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒培养 |
| 2.2 提取病毒总 RNA |
| 2.3 cDNA 的反转录 |
| 2.4 PCR扩增 |
| 2.5 胶回收 PCR 产物 |
| 2.6 连接与转化 PCR 产物 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 质粒提取 |
| 2.9 基因的测序与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR结果 |
| 3.2 菌落PCR结果 |
| 3.3 鸭源 H5N5 亚型 AIV 的 PB2 基因生物信息学分析 |
| 3.4 H5N5亚型鸭源禽流感病毒PB1基因生物信息学分析 |
| 3.5 H5N5亚型鸭源禽流感病毒PA基因生物信息学分析 |
| 3.6 H5N5亚型鸭源禽流感病毒NP基因生物信息学分析 |
| 3.7 同源性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PB2、PB1、PA、NP基因生物信息学分析 |
| 4.2 PB2基因序列分析 |
| 4.3 PB1 基因序列分析 |
| 4.4 PA基因序列分析 |
| 4.5 NP基因序列分析 |
| 5 小结 |
| 第三章 鸭源禽流感病毒聚合酶活性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒毒株 |
| 1.2 载体、感受态细胞 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 PCR产物处理 |
| 2.2 载体处理 |
| 2.3 表达载体的构建 |
| 2.4 转化 |
| 2.5 菌落PCR鉴定 |
| 2.6 质粒提取 |
| 2.7 测序连接产物 |
| 2.8 PB2基因点突变 |
| 2.9 聚合酶蛋白活性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR产物双酶切 |
| 3.2 菌落PCR |
| 3.3 连接产物测序 |
| 3.4 PB2基因点突变 |
| 3.5 聚合酶蛋白活性检测 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 流感病毒的点突变 |
| 4.2 流感病毒突变后的聚合酶活性分析 |
| 5 小结 结论 参考文献 作者简介 致谢 |
（6）小鼠—猪种间体细胞核移植研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 简写及缩略语 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物体细胞核移植技术发展概况 |
| 1 哺乳动物细胞核移植技术研究简史 |
| 1.1 小鼠 |
| 1.2 牛 |
| 1.3 绵羊和山羊 |
| 1.4 猪 |
| 2 哺乳动物种间体细胞核移植技术研究简史 |
| 3 哺乳动物体细胞核移植关键技术 |
| 3.1 核供体细胞的制备 |
| 3.2 受体卵母细胞的准备 |
| 3.3 克隆胚胎的构建 |
| 3.4 克隆胚胎的培养 |
| 3.5 胚胎移植 |
| 4 体细胞核移植的应用与展望 |
| 4.1 克隆胚胎发育机理研究 |
| 4.2 转基因产品的生产 |
| 4.3 建立动物模型 |
| 4.4 治疗性克隆 |
| 4.5 扩大优良种群及拯救濒危动物 |
| 4.6 存在问题和展望 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第二章 小鼠-猪种间体细胞克隆胚胎的体外生产 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 主要试剂及药品 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 工具的制备 |
| 1.5 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 供体细胞的制备 |
| 2.2 受体卵母细胞准备 |
| 2.3 小鼠体内胚胎的采集 |
| 2.4 体外受精(IVF) |
| 2.5 构建小鼠-猪种间克隆胚胎 |
| 2.6 试验设计与分组 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠生理状态对超数排卵效果的影响 |
| 3.2 小鼠胚胎培养液对2-细胞期小鼠-猪种间克隆胚胎(ISCNT)发育的影响 |
| 3.3 猪胚胎培养液对小鼠-猪种间克隆胚胎(ISCNT)发育的影响 |
| 3.4 培养温度对小鼠-猪种间克隆胚胎发育的影响 |
| 3.5 不同培养液对小鼠-猪种间克隆胚胎发育的影响 |
| 3.6 核供体细胞及其传代次数对小鼠-猪种间克隆胚胎发育的影响 |
| 3.7 细胞松弛素B处理对小鼠-猪种间克隆胚发育的影响 |
| 3.8 卵母细胞体外成熟培养时间对其成熟及种间克隆胚发育的影响 |
| 3.9 小鼠-猪种间克隆胚胎的存活鉴定 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 溶液的配制 |
| 附录二 图版及说明 |
| 致谢 |
（7）猪流感病毒和“猪—禽”流感重配病毒的拯救及其生物学特性的研究（论文提纲范文）
| 目录 摘要 Abstract 缩略语表 第1章 文献综述 |
| 1.1 猪流感病毒概述 |
| 1.1.1 猪流感病毒的形态结构 |
| 1.1.2 猪流感病毒在世界范围的流行情况 |
| 1.1.3 猪流感病毒宿主特异性及其变异 |
| 1.1.4 猪流感病毒的种间传播 |
| 1.2 流感病毒的反向遗传操作技术 |
| 1.2.1 流感病毒反向遗传操作技术的历史与发展 |
| 1.2.2 流感病毒反向遗传技术的应用 第2章 H1N1亚型猪流感病毒的拯救 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 目的和意义 |
| 2.3 材料和方法 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.2 方法 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 质粒共转染及病毒的拯救 |
| 2.4.2 获救病毒在鸡胚中的传代 |
| 2.4.3 获救病毒的测序鉴定 |
| 2.4.4 获救病毒的电镜观察 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 8质粒拯救系统及其应用 |
| 2.5.2 影响流感病毒拯救效率的因素 |
| 2.5.3 关于获救病毒的鉴定 |
| 2.6 结论 第3章 "猪-禽"流感重配病毒的拯救及其生物学特性的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 目的和意义 |
| 3.3 材料和方法 |
| 3.3.1 材料 |
| 3.3.2 方法 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 病毒的拯救及血凝、血凝抑制鉴定 |
| 3.4.2 获救病毒在鸡胚中的传代 |
| 3.4.3 获救病毒的测序鉴定 |
| 3.4.4 病毒EID_(50)的测定 |
| 3.4.5 小鼠攻毒实验结果 |
| 3.4.6 各器官中病毒含量比较 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 亲本毒株的选择 |
| 3.5.2 重配病毒在鸡胚上的增殖 |
| 3.5.3 各毒株对小鼠致病性的比较 |
| 3.6 结论 参考文献 致谢 附录 |
（8）中国部分地区猪流感病毒的分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第一章 绪论 |
| 1.1 二十世纪三次流感大流行的回顾 |
| 1.1.1 西班牙流感 |
| 1.1.2 亚洲流感 |
| 1.1.3 香港流感 |
| 1.1.4 其它流感 |
| 1.2 猪流感概况 |
| 1.2.1 病原及早期历史 |
| 1.2.2 猪流感的兽医公共卫生学意义 |
| 1.2.3 猪流感的人类公共卫生学意义 |
| 1.3 猪流感病毒的分子生物学特性 |
| 1.3.1 猪流感病毒形态结构 |
| 1.3.2 猪流感病毒基因组的结构及其编码蛋白的功能 |
| 1.3.3 猪流感病毒的复制 |
| 1.3.4 猪流感病毒种间传播的分子机制 |
| 1.3.5 猪流感病毒的变异 |
| 1.4 猪流感病毒的流行病学研究进展 |
| 1.4.1 古典H1N1 亚型SIV |
| 1.4.2 人源SIV |
| 1.4.3 禽源SIV |
| 1.4.4 其它重组SIV |
| 1.5 本研究的目的和意义 第二章 猪流感病毒型和亚型 RT-PCR 检测方法的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 引物的设计及合成 |
| 2.1.4 病毒的增殖 |
| 2.1.5 病毒RNA 的提取及cDNA 的合成 |
| 2.1.6 PCR 扩增 |
| 2.1.7 特异性试验 |
| 2.1.8 敏感性试验 |
| 2.1.9 临床样品的检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 特异性试验结果 |
| 2.2.2 敏感性试验结果 |
| 2.2.3 临床样品的检测 |
| 2.3 讨论 第三章 猪流感病毒的分离鉴定及其生物学特性的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试剂 |
| 3.1.2 细胞 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.1.4 病料的采集和处理 |
| 3.1.5 病毒的分离 |
| 3.1.6 病毒的纯化 |
| 3.1.7 病毒亚型的鉴定 |
| 3.1.8 病毒感染力的滴定 |
| 3.1.9 小鼠致病性试验 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 病毒分离及亚型鉴定结果 |
| 3.2.2 病毒感染力的滴定 |
| 3.2.3 小鼠致病性实验 |
| 3.3 讨论 第四章 人源 H1N1 亚型猪流感病毒的遗传演化分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 毒株及其来源 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 引物 |
| 4.1.4 RNA 的提取与反转录 |
| 4.1.5 PCR 与目的片段的扩增 |
| 4.1.6 目的片段的克隆 |
| 4.1.7 序列测定 |
| 4.1.8 序列拼接与分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 序列测定结果 |
| 4.2.2 Blast 分析结果 |
| 4.2.3 HA 基因分析 |
| 4.2.4 NA 基因分析 |
| 4.2.5 PB2 基因分析 |
| 4.2.6 PB1 基因分析 |
| 4.2.7 PA 基因分析 |
| 4.2.8 NP 基因分析 |
| 4.2.9 M 基因分析 |
| 4.2.10 NS 基因分析 |
| 4.3 讨论 第五章 1970～2006 年中国 H3N2 亚型猪流感病毒分子进化的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试剂 |
| 5.1.2 毒株 |
| 5.1.3 毒株的地理分布 |
| 5.1.4 序列分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 测序结果 |
| 5.2.2 Blast 分析结果 |
| 5.2.3 HA 基因核苷酸遗传演化分析 |
| 5.2.4 HA 基因氨基酸序列分析 |
| 5.2.5 NA 基因的核苷酸遗传演化分析 |
| 5.2.6 PB2 基因核苷酸遗传演化分析 |
| 5.2.7 PB1 基因核苷酸遗传演化分析 |
| 5.2.8 PA 基因核苷酸遗传演化分析 |
| 5.2.9 NP 基因核苷酸遗传演化分析 |
| 5.2.10 M 基因核苷酸的遗传演化分析 |
| 5.2.11 NS 基因核苷酸的遗传演化分析 |
| 5.2.12 1970～2006 年中国H3N2 亚型SIV 基因型划分结果 |
| 5.3 讨论 第六章 禽源 H9N2 亚型猪流感病毒分子进化的研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试剂 |
| 6.1.2 临床样品 |
| 6.1.3 毒株的地理分布 |
| 6.1.4 序列分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 6.2.2 Blast 分析结果 |
| 6.2.3 HA 基因分析 |
| 6.2.4 NA 基因分析 |
| 6.2.5 PB2 基因系统进化分析 |
| 6.2.6 PB1 基因系统进化分析 |
| 6.2.7 PA 基因系统进化分析 |
| 6.2.8 NP 基因系统进化分析 |
| 6.2.9 M 基因系统进化分析 |
| 6.2.10 NS 基因系统进化分析 |
| 6.2.11 25 株禽源H9N2 亚型SIV 基因型划分结果 |
| 6.3 讨论 第七章 猪流感血清学调查的初步研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 血清样品的采集 |
| 7.1.2 血清样品的预处理 |
| 7.1.3 血清的检测 |
| 7.1.4 H3N2 亚型SIV 重组HA1 蛋白间接ELISA 方法的建立及初步应用 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 血清抗体检测结果 |
| 7.2.2 H3N2 亚型SIV 重组HA1 蛋白间接ELISA 方法的建立及初步应用 |
| 7.3 讨论 第八章 禽源 H5N1 亚型猪流感病毒反向遗传平台的构建 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 试剂 |
| 8.1.2 毒株 |
| 8.1.3 载体 |
| 8.1.4 引物 |
| 8.1.5 RNA 提取与反转录 |
| 8.1.6 八质粒系统的构建 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 酶切鉴定 8 质粒系统 |
| 8.2.2 PCR 鉴定 8 质粒系统 |
| 8.3 讨论 第九章 全文结论 参考文献 附录 致谢 作者简历 |
（9）猪体细胞核移植相关技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物核移植技术研究进展 |
| 1.核移植研究历史回顾 |
| 2.核移植技术程序 |
| 3.核移植胚胎的发育机理 |
| 4.影响核移植效果的因素 |
| 5.不同动物的核移植发展现状 |
| 6.核移植技术当前面临的问题 |
| 7.体细胞核移植的发展前景 |
| 8.核移植技术所生产的转基因食品安全性 |
| 9.体细胞核移植技术展望 |
| 10.结束语 |
| 第二部分 实验部分 |
| 第二章 猪卵母细胞体外成熟过程中减数分裂进程的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 猪卵母细胞体外成熟培养体系建立与优化 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第四章 激活方法对猪卵母细胞孤雌发育的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第五章 猪核移植供体细胞分离与传代培养 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第六章 猪体细胞核移植方法的摸索 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第七章 供体细胞种类及其培养处理方法对猪体细胞核移植效果的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写—中文对照表 |
| 图片与说明 |
| 个人简历 |
| 文献发表情况 |
| 致谢 |
（10）盘羊—绵羊异种核移植技术程序的优化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 略语中英文对照 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 体细胞核移植的研究进展 |
| 1 体细胞核移植技术的发展历程 |
| 1.1 胚胎细胞核移植 |
| 1.2 体细胞核移植 |
| 2 体细胞核移植技术方法的研究进展 |
| 2.1 显微操作的核移植方法 |
| 2.1.1 Dolly法 |
| 2.1.2 火奴鲁鲁法 |
| 2.1.3 损伤修复法 |
| 2.1.4 连续核移植法 |
| 2.1.5 化学去核—显微操作法 |
| 2.2 手工操作(handmade)的体细胞核移植方法 |
| 2.2.1 正向体细胞核移植(先去核再融合) |
| 2.2.2 反向体细胞核移植(先融合后去核) |
| 2.3 手工操作与显微操作相结合的体细胞核移植方法 |
| 3 体细胞核移植机理的研究 |
| 3.1 细胞周期 |
| 3.1.1 受体胞质中MPF的调控 |
| 3.1.2 供体细胞的周期 |
| 3.2 卵胞质对供体核的重编程 |
| 3.3 基因组表观遗传修饰的变化 |
| 3.3.1 重构胚核重编程中甲基化变化 |
| 3.3.2 重构胚的基因印迹与X染色体失活 |
| 3.4 端粒 |
| 第二章 异种体细胞核移植的研究进展 |
| 1 异种核移植技术的研究历史与现状 |
| 1.1 以早期胚胎细胞为供核细胞的异种核移植 |
| 1.2 以体细胞为供核细胞的异种核移植 |
| 2 影响异种核移植效率的因素 |
| 2.1 供体细胞的准备 |
| 2.1.1 供体动物的年龄 |
| 2.1.2 供体动物的性别 |
| 2.1.3 供体细胞的培养代数 |
| 2.1.4 供体细胞的种类 |
| 2.1.5 供体细胞的冷冻与冷藏对核移植效果的影响 |
| 2.1.6 供体细胞的处理方法 |
| 2.2 受体卵母细胞的准备 |
| 2.2.1 卵母细胞的来源 |
| 2.2.2 受体卵母细胞的选择 |
| 2.2.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 2.2.4 卵母细胞的去核 |
| 2.3 细胞核的移植 |
| 2.4 重构胚的融合 |
| 2.4.1 化学融合 |
| 2.4.2 病毒融合 |
| 2.4.3 电融合 |
| 2.5 重构胚的激活 |
| 2.5.1 化学激活 |
| 2.5.2 电激活 |
| 2.5.3 精子提取物激活 |
| 2.6 重构胚的培养 |
| 3 异种体细胞核移植中的线粒体遗传规律 |
| 4 异种核移植存在的问题和可能的解决方法 |
| 4.1 存在的问题 |
| 4.2 可能的解决方法 |
| 5 异种核移植的应用前景 |
| 5.1 在医学领域中的应用 |
| 5.2 在畜牧业生产上的应用 |
| 5.3 拯救濒危动物 |
| 5.4 促进基础生物科学的发展 |
| 5.5 生产转基因动物 |
| 第三章 盘羊—绵羊异种核移植的理论基础及研究意义 |
| 1 盘羊现状 |
| 1.1 盘羊简介 |
| 1.2 盘羊在中国的生存现状 |
| 2 盘羊—绵羊异种核移植研究的意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第四章 供体细胞系的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验动物 |
| 1.1.2 主要仪器用品 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要溶液的配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 细胞的原代培养 |
| 1.2.2 培养细胞的传代 |
| 1.2.3 细胞生长曲线绘制 |
| 1.2.4 培养细胞的冷冻保存及复苏 |
| 1.2.5 染色体核型分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 培养细胞的一般形态观察 |
| 2.2 培养细胞的体外生长规律 |
| 2.3 冷冻方法和冷冻液对解冻后细胞存活率的影响 |
| 2.4 盘羊和绵羊染色体的核型分析 |
| 2.4.1 盘羊和绵羊的染色体数目 |
| 2.4.2 盘羊和绵羊的染色体形态及核型分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 供体细胞的体外培养及冷冻保存 |
| 3.2 供体细胞的染色体分析 |
| 参考文献 |
| 第五章 盘羊异种重构胚的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 主要仪器用品 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要溶液的配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 绵羊卵巢的采集 |
| 1.2.2 卵巢卵母细胞的收集 |
| 1.2.3 卵母细胞的体外成熟培养 |
| 1.2.4 成熟检查 |
| 1.2.5 成熟卵母细胞的去核 |
| 1.2.6 移核 |
| 1.2.7 融合 |
| 1.2.8 成熟卵母细胞或重构胚的激活处理 |
| 1.2.9 胚胎的体外培养 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 保存15-17 h的卵巢卵母细胞发育能力的研究 |
| 2.1.1 卵巢保存温度对卵母细胞发育能力的影响 |
| 2.1.2 卵巢保存液对卵母细胞发育能力的影响 |
| 2.2 盲吸去核法和化学辅助去核法对核移植胚效率的影响 |
| 2.2.1 秋水仙素处理时间对化学辅助法去核率的影响 |
| 2.2.2 秋水仙素处理浓度对化学辅助法去核率的影响 |
| 2.2.3 盲吸去核法与化学辅助去核法的去核率比较 |
| 2.2.4 盲吸去核法与化学辅助去核法对重构胚发育的影响 |
| 2.3 电融合方式对核移植效率的影响 |
| 2.3.1 不同的融合方案对重构胚发育的影响 |
| 2.3.2 不同的融合次数对重构胚发育的影响 |
| 2.4 激活方式对孤雌胚和核移植胚发育的影响 |
| 2.4.1 成熟培养时间对孤雌胚体外发育的影响 |
| 2.4.2 6—DMAP的作用时间对孤雌胚体外发育的影响 |
| 2.4.3 激活方法对盘羊—绵羊异种重构胚发育的影响 |
| 2.5 培养液的改进对孤雌胚和核移植胚发育的影响 |
| 2.5.1 改进的培养液对孤雌胚体外发育的影响 |
| 2.5.2 EGF对核移植胚发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 绵羊卵巢的保存 |
| 3.2 卵母细胞的去核 |
| 3.3 重构胚的电融合 |
| 3.4 卵母细胞与重构胚的激活 |
| 3.5 胚胎的体外培养 |
| 参考文献 |
| 第六章 盘羊供体细胞对异种核移植效率的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 主要仪器用品 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要溶液的配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 培养细胞的饥饿处理 |
| 1.2.2 细胞周期测定 |
| 1.2.3 盘羊—绵羊异种重构胚的构建 |
| 1.2.4 试验设计 |
| 1.2.5 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 供体动物的个体对重构胚发育的影响 |
| 2.2 供体细胞的代次对重构胚发育的影响 |
| 2.3 供体细胞的汇合度对重构胚发育的影响 |
| 2.4 不同血清饥饿时间对重构胚发育的影响 |
| 2.5 供体细胞的保存方式对重构胚发育的影响 |
| 2.6 供体细胞的状态对重构胚发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 不同生产方式胚胎的体外发育率比较及重构胚的移植试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 主要仪器用品 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要溶液 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 绵羊卵母细胞体外成熟 |
| 1.2.2 卵母细胞孤雌激活 |
| 1.2.3 体外受精 |
| 1.2.4 体细胞核移植 |
| 1.2.5 囊胚的细胞计数 |
| 1.2.6 胚胎移植 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.4 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同生产方式胚胎的体外发育率比较 |
| 2.2 不同季节的绵羊卵巢对PAEs和FC-NTEs体外发育能力的影响 |
| 2.3 低温长时间保存的绵羊卵巢对PAEs和FC-NTEs体外发育能力的影响 |
| 2.4 SOFaa和CR1aa培养基对PAEs和FC-NTEs体外发育能力的影响 |
| 2.5 盘羊—绵羊异种重构胚的移植结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新之处 |
| 攻读学位期间发表及待发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、Progress in interspecies cloning of mammals（论文参考文献）
- [1]气单胞菌属DNA条形码的筛选及锦鲤抗菌免疫应答分析[D]. 许承佳. 广东药科大学, 2021(02)
- [2]云南部分野生小型哺乳动物及广西家犬肉孢子虫的形态及分子特征[D]. 梁宇. 云南大学, 2019(03)
- [3]哺乳动物MHC、TCR和Ig基因家族进化及其与生态位适应的关系探究[D]. 张泽鹏. 南京师范大学, 2019
- [4]版纳微型猪近交系四个精子发生关键基因家族的分离与功能研究[D]. 王配. 云南大学, 2016(06)
- [5]鸭源禽流感病毒的分离鉴定及其聚合酶活性研究[D]. 王军政. 吉林农业大学, 2015(02)
- [6]小鼠—猪种间体细胞核移植研究[D]. 王利勤. 南京农业大学, 2010(07)
- [7]猪流感病毒和“猪—禽”流感重配病毒的拯救及其生物学特性的研究[D]. 彭亚平. 华中农业大学, 2008(03)
- [8]中国部分地区猪流感病毒的分子流行病学研究[D]. 于海. 中国农业科学院, 2008(10)
- [9]猪体细胞核移植相关技术研究[D]. 黄雅琼. 广西大学, 2008(12)
- [10]盘羊—绵羊异种核移植技术程序的优化研究[D]. 潘晓燕. 南京农业大学, 2008(08)