一、端粒酶及其逆转录酶与肿瘤的发生（论文文献综述）
高贤明,曲会娟,单培培[1]（2021）在《纳米材料在口腔癌治疗中的应用研究进展》文中指出口腔癌是以致瘤性病毒为代表的外源性因素以及以机体免疫损害、个体DNA损伤及修复为代表的内源性因素综合导致的一种复杂的病理病变过程。针对口腔癌的治疗立足于分子遗传学角度进行靶向治疗,在获取减毒增效的同时还能提高患者的生活质量,这是临床口腔癌治疗最需要突破的瓶颈。纳米材料能够呈现出独特的分子表面积大,同时表面的反应活性则相对较高,且表面活性中心多,在分子代谢中的吸附能力强。在生物学领域应用中存在一定基础,但其在口腔癌治疗方面,存在较好的肿瘤细胞毒性作用和抑制增殖作用。本研究将纳米材料在肿瘤预防、治疗等方面中的应用进行综述,为该病未来的治疗提供新思路。
沈海龙[2]（2020）在《TERT在喉癌组织中的免疫组化表达及其临床意义》文中指出目的喉癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤,喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）占喉癌的90%以上。喉癌的5年生存率在过去40年里从66%下降到63%,因此对于喉癌的早期诊断和治疗十分重要。喉癌的特定生物标志物有助于喉癌的诊断、治疗及判断预后,但目前仍缺乏临床上广泛认可和使用的生物标志物。我们想要评估端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase,TERT）在LSCC中的表达及其与肿瘤侵袭和淋巴结转移的关系,以求发现新的喉癌标志物。方法我们收集了从2011年3月5日至2013年12月20在安徽医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科手术的64位经病理确诊为喉癌患者的标本。我们共收集了64例喉癌组织及其对应的癌旁组织。通过免疫组织化学方法检测TERT蛋白在喉癌组织及癌旁组织中的表达状况,采用Image-Pro Plus 6.0软件计算细胞染色强度的平均光密度值,在选定的面积一定时,平均光密度值越大,表示蛋白表达越强。用SPSS19.0分析TERT在不同组别中的表达差异,并根据对患者的5年随访情况进行生存分析。结果我们发现TERT蛋白主要在细胞质中表达,表现为棕黄色颗粒弥漫性分布,同时在细胞核中也有少量表达。TERT在喉癌组织中的表达强度明显高于对应的癌旁组织,差异有统计学意义（t=16.58,p<0.05）;喉癌组织中吸烟组TERT表达水平高于不吸烟组,差异具有统计学意义（t=2.06,p<0.05）;喉癌组织中饮酒组TERT表达水平高于不饮酒组,差异具有统计学意义（t=2.66,p<0.05）;喉癌组织中高分化组、中分化组和低分化组的TERT表达量逐渐增高,三个组别之间的差异具有统计学意义（F=20.50,p<0.05）;喉癌组织中临床分期为III+IV期组的TERT表达量明显高于I+II期组,二者差异具有统计学意义（t=5.22,p<0.05）;喉癌组织中淋巴结转移阳性组TERT表达水平明显高于淋巴结转移阴性组,二者差异具有统计学意义（t=6.88,p<0.05）。用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,TERT表达≥P50的死亡率（78.18%）明显高于TERT表达<P50（25.95%）的死亡率,差异有统计学意义（x2=18.33,P<0.0001）。Cox多因素分析显示TERT表达强度大于第50百分位数和复发是喉癌患者预后的独立的影响因素。结论1、在喉癌组织中,TERT蛋白的表达强度高于癌旁组织,提示TERT与喉鳞状细胞癌的发生有关。2、TERT的表达水平与喉癌患者的的吸烟史、饮酒史、临床分期、组织学分级以及淋巴结转移有关,提示TERT的过度表达与肿瘤的侵袭与转移有关。3、TERT过度表达的喉癌患者的生存率低于表达强度较低的患者,提示TERT的表达与喉癌患者的预后相关。4、在临床工作中,对TERT含量进行测定,可能有助于对喉癌的早期诊断、治疗和判断预后,TERT有望成为广泛使用的喉癌标志物和喉癌靶向治疗的新靶点。
孙玉萍[3]（2019）在《拟南芥端粒酶逆转录酶的非生物胁迫抗性功能及抗原表位特征》文中指出端粒酶是真核细胞中具有逆转录酶活性,能够合成端粒DNA的核糖核蛋白复合物,而端粒酶逆转录酶（Telomerase reverse transcriptase,TERT）是端粒酶的核心组分。研究表明,TERT具有基因表达调控、线粒体功能调节、胁迫应激保护等非端粒功能,但是研究主要集中于动物方面,而植物端粒酶逆转录酶是否具有非端粒功能仍不明确。因此,本文旨在研究AtTERT在拟南芥及大肠杆菌体内的非端粒功能,结果如下:构建拟南芥pCAMBIA2300-GFP-AtTERT真核表达载体,通过烟草瞬时表达及拟南芥稳定表达确定GFP-AtTERT融合蛋白主要定位于细胞核,在细胞质中也有较弱定位;对转AtTERT拟南芥进行非生物胁迫抗性分析显示,转AtTERT拟南芥较野生型及突变体拟南芥抗盐性增强,而渗透胁迫抗性无显着性变化。构建pET32a/pGEX-4T-1-AtTERT原核表达载体,遗传转化大肠杆菌,诱导表达可溶性AtTERT蛋白进行功能分析,结果显示转AtTERT大肠杆菌盐胁迫抗性、渗透胁迫抗性及过氧化氢耐受性增强,而其冷冻抗性减弱。以上结果表明,AtTERT在拟南芥及大肠杆菌非生物胁迫中发挥重要作用。基于AtTERT功能结构域预测,分别构建含有AtTERT不同功能结构域的原核表达载体pET32a-P1/2/3/4,诱导纯化蛋白后ELISA鉴定其抗原性,并探究AtTERT的保守功能结构域（P4）对大肠杆菌响应非生物胁迫的影响。Protean软件分析显示,AtTERT蛋白抗原表位最可能位于氨基酸肽链的N端及中部;ELISA鉴定显示,各融合蛋白均有反应信号,而仅含有保守功能结构域的P4蛋白抗原性最强;转P4大肠杆菌盐及渗透胁迫抗性均减弱。以上结果表明,AtTERT保持各结构域的完整性是保证其行使功能的结构基础。综上,本研究初步证明AtTERT具有非端粒功能,为继续深入研究TERT蛋白非端粒功能奠定基础。
袁陶燕[4]（2019）在《绍兴鸭端粒酶逆转录酶基因表达调控及内源性激活的研究》文中研究表明端粒酶逆转录酶基因（TERT）编码的蛋白是组成端粒酶的三个主要成分之一,是端粒酶活性的限速单位。端粒酶通过在端粒末端补充“TTAGGG”重复序列阻止细胞复制性衰老。本研究检测了鸭TERT（dTERT）,相对端粒酶活性（RTA）和相对端粒长度（RTL）在鸭早期发育阶段的时空分布特点。克隆了鸭TERT 5’-侧翼序列,研究了表观遗传特别是DNA甲基化对dTERT表达的调控作用。最后,基于双荧光素酶活性检测和生物信息学分析,选择靠近转录起始位点的近端调控区作为靶序列,利用CRISPR-Cas9技术内源性激活了鸭小肠上皮细胞中的TERT。结果如下:1.鸭TERTmRNA,相对端粒酶活性（RTA）和相对端粒长度（RTL）的时空分布特点在出生后7天雏鸭的所有8个测试组织（心脏、肝脏、脾脏、肾脏、小肠、腿肌、性腺和胰腺）中均检测到了TERTmRNA的表达。其中,TERT在小肠和肾脏中的表达水平最高,其次依次是心脏、腿肌、脾脏、胰腺,在性腺和肝脏中的表达水平最低。在肝脏发育过程中,dTERT的表达趋势先从E13（胚胎期13天）到E19增加,然后从E19到E26急剧下降,并在D7（出生后7天）达到最低水平。而在腿肌中,dTERT的表达水平从E13到E19变化不大,从E19到E26显着增加,从E26到D7明显减少。在所有测试的雏鸭（D7）组织中均检测到了相对端粒酶活性（RTA）,其中小肠中的端粒酶活性特别高,肾脏、心脏和胰腺中的端粒酶活性相对较低,端粒酶活性表现最低的是肝脏和腿肌。随着胚胎的发育,肝脏和腿肌中的RTA水平均显着下降。此外,雏鸭（D7）腿肌中的相对端粒长度（RTL）最长,其次是肾脏、小肠、肝脏、心脏和胰腺。从胚胎发育到出生阶段,肝脏中的RTL从E13到E26相对稳定,到D7时明显缩短。在腿肌中,RTL从E13到E26有小幅度的增加,而到D7时也显着缩短。2.鸭TERT 5’-侧翼序列的克隆及DNA甲基化调控研究克隆获得了2,413bp长的dTERT 5’-侧翼序列,并提交给GenBank（GenBank No.MH910094）。5’-RACE将转录起始位点定位到了-93bp处,定义为新的转录起始位点（+1）。生物信息学分析显示,鸭TERT5’调控区有三个CpG岛（S1,S2和S3）。亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）结果表明,与小肠（D7）或肝脏（E19）相比,dTERTmRNA表达量显着较低的肝脏（D7）在S1区具有更高的甲基化水平。荧光定量PCR结果显示,DNA甲基转移酶DNMT1表达水平在肝脏（D7）中显着高于其他两个组织。体外细胞实验表明,经过甲基转移酶抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine（5-aza-dC）处理后,鸭胚成纤维细胞（DEFs）和小肠上皮细胞（DIECs）中dTERT表达均显着增加,同时S1区的甲基化水平显着降低,上述实验进一步证明了dTERT受到DNA甲基化的表观遗传调控。此外,用组蛋白去乙酰化酶抑制剂trichostatinA（TSA）处理DEFs和DIECs后,也导致dTERT表达显着增加,提示组蛋白乙酰化也可能参与鸭TERT的转录调控。3.利用CRISPR-Cas9技术内源性激活鸭TERT双荧光素酶实验表明转录起始位点（+1）上游541bp是鸭TERT的核心启动子区,结合潜在转录因子位点的生物信息学分析,将-370/-150作为CRISPR/Cas9基因编辑的靶序列。用慢病毒法将10种Cas9-sgRNAs混合质粒转染DIECs后继续培养细胞,当培养到编辑后第5代时（CRISPR 5P）鸭TERT的表达有轻微上调。随着传代的进行,dTERT转录逐渐增强,直到在CRISPR13P时维持一个稳定的水平。当未编辑的DIECs进入衰老停滞时,CRISPR编辑的DIECs依然具有良好的细胞形态和增殖活性。Sanger测序显示,CRISPR 5P DIECs中所有sgRNAs都成功整合进鸭基因组,靶区域呈现出不同形式的基因突变。当培养到编辑后18代时,存活的CRISPR 18PDIECs中的优势突变是靶序列上74bp的缺失,而优势sgRNAs是sgRNAs2,sgRNAs7和sgRNAs9。检测RTA和RTL发现,CRIPSR编辑的DIECs中RTA被成功激活,但是并没有阻止端粒的缩短。荧光定量TERT潜在的靶基因表明,dTERT可能以一种端粒非依赖方式通过抑制衰老凋亡相关基因来维持细胞生长。最后,用LPS和poly（I:C）处理表明,CRISPR编辑的TERT被成功激活的鸭小肠上皮细胞依然具有正常的免疫反应功能。
彭杰[5]（2018）在《荧光纳米探针用于端粒酶活性分析》文中指出端粒酶是一种核糖核蛋白逆转录酶,通过将端粒重复序列（TTAGGG）添加到染色体的3’末端以维持细胞内端粒的长度。在正常的人体细胞中,端粒酶的活性受到严格地调控,而在肿瘤细胞中重新激活以维持细胞的无限增殖能力。由于端粒酶与细胞的永生和致癌作用密切相关,因此它被认为是一种有效的肿瘤标志物和抗癌治疗的靶标。端粒酶活性的测定对于人类癌症的早期诊断,肿瘤发展的研究和抗癌药物的筛选都具有重要的意义。临床检验诊断学领域一直以来将建立性能优异的端粒酶活性检测方法作为重要的研究内容,荧光生物传感器作为一种简单快速、高灵敏以及特异性好的检测手段,在生物分子的检测中得到了广泛的应用。具有独特光学特性的纳米材料的兴起和纳米技术的快速发展为新型的荧光生物传感器的构建提供了思路,使得纳米荧光生物传感器逐渐成为生物分子检测技术发展的新方向。本课题提出了将氧化石墨烯和磷化钴纳米材料作为高效的荧光猝灭剂,利用其大的比表面积、对核酸分子优异的选择性识别功能和良好生物相容性构建了新型的荧光生物传感器用于端粒酶活性的分析。实现对端粒酶活性的荧光检测以及活细胞中端粒酶的原位成像。主要内容如下:第二章,构建了基于氧化石墨烯传感平台的荧光纳米探针用于端粒酶活性的分析,实现了快速、灵敏、有选择性的检测端粒酶活性。同时,氧化石墨烯还可以作为荧光探针的载体,对活细胞内端粒酶活性进行分析。没有端粒酶时,荧光探针吸附于氧化石墨烯纳米片的表面,荧光被猝灭;当存在端粒酶时,端粒酶能够触发底物延伸出端粒序列,与荧光探针互补杂交形成稳定的双链DNA,这个过程能够引发荧光探针从氧化石墨烯的表面脱离出来,使得荧光信号恢复。根据荧光信号强度的变化,定量检测细胞提取物中端粒酶的活性。通过共聚焦成像技术,实现对细胞内端粒酶活性的监测。第三章,设计了具有特殊序列的发夹荧光探针,结合杂交链式扩增技术和磷化钴纳米线对DNA的选择结合能力和荧光猝灭效应,建立了基于杂交链式放大反应的磷化钴荧光纳米生物传感器检测端粒酶活性。荧光标记的发夹探针HP1与HP2首先吸附在磷化钴纳米线上,在端粒酶的作用下,底物延伸出一段DNA单链,打开发夹探针HP1,释放的HP1单链部分与新的HP2探针末端杂交,触发杂交链式反应,同时吸附在磷化钴纳米线上的荧光基团得到释放,经过多次的杂交链式反应,产生大量增强的荧光信号;没有端粒酶时,HP1的发夹结构不能打开,杂交链式反应不能进行,探针的荧光通过光致电子转移被纳米线高效猝灭,荧光信号强度低。同时我们还证明磷化钴纳米线生物传感器可应用于原位、实时的对细胞内端粒酶活性进行成像分析。
扎西潘多[6]（2018）在《质子泵抑制剂调控TERT基因表达进而抑制胃癌侵袭性的机制研究》文中研究指明背景:在我国各类癌症中,胃癌在男女性发病率与死亡率均位居前五位。由于胃癌早期筛查普及率不高,多数患者因未得到早期发现及诊治,就诊时已处于进展期,因而寻找有效的治疗胃癌的药物靶点极其重要。质子泵抑制剂广泛用于酸相关疾病的治疗,但近年来发现其在胃癌的治疗方面也具有一定的应用价值,但仍颇具争议。端粒酶作为生物细胞中一种重要的逆转录酶,它能够维持端粒的长度,使细胞无限制的增殖,导致肿瘤的发生发展。在端粒酶的组成成分中,端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcription,TERT）具有调控端粒酶活性的重要作用,90%以上的恶性肿瘤细胞中都高表达TERT基因,通过其逆转录酶活性促进肿瘤无限增殖。目的:本研究拟通过体内体外实验,观察质子泵抑制剂（泮托拉唑）对胃癌细胞中TERT基因表达的影响,阐明质子泵抑制剂通过调控TERT的表达来抑制胃癌细胞的侵袭性,为在以TERT为靶点的胃癌的治疗上提供新的思路及理论依据。方法:以胃癌细胞AGS、HGC27为研究对象,利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）和蛋白质免疫印迹法（Western Blot）观察胃癌细胞在接受泮托拉唑处理后,细胞内TERT的表达情况的变化。应用质粒构建技术,构建TERT启动子载体质粒,在胃癌细胞内转染进不同截断的TERT基因质粒载体,并接受泮托拉唑处理后,应用报告基因实验检测。Western Blot检测接受泮托拉唑处理后β-catenin的表达量,及上皮间质转化标志蛋白的表达变化。应用基因过表达技术,过表达TERT基因的表达,Western Blot检测过表达效果。Transwell迁移实验比较对照组与过表达TERT组胃癌细胞经泮托拉唑处理之后的迁移能力的变化,Western Blot检测并比较两组细胞上皮间质转化标志蛋白的表达变化。动物实验研究以HGC27为研究对象,BALB/c裸鼠为宿主动物,尾静脉注射建立胃癌肺转移瘤模型,待造模成功后,使用泮托拉唑灌胃治疗,待治疗结束后取裸鼠肺脏组织,观察对照组与处理组肺部有无转移结节,并进行常规病理切片HE染色,在光镜下观察肿瘤形态学变化。结果:经质子泵抑制剂（泮托拉唑）处理后,在蛋白水平及mRNA水平上均下调了胃癌细胞中TERT基因的表达（P<0.05）。萤光素酶报告基因检测发现泮托拉唑能够降低TERT基因上游3790bp处的启动子活性（P<0.05）,考虑TERT受泮托拉唑调控的启动子区域位于TERT基因上游2089bp～3790bp之间,通过数据库检索预测在此区域内可能与TERT启动子相结合的转录因子为STAT3,继而再利用荧光素酶报告基因检测发现经泮托拉唑处理后能够降低TERT基因启动子上游未突变的3790bp区域处的活性（P<0.05）,而TERT启动子上游3790bp处定点突变的区域的活性未受到影响,同时发现泮托拉唑能够下调细胞内总STAT3与磷酸化STAT3在蛋白水平的表达量（P<0.05）。此外,发现经泮托拉唑处理后,能够下调胃癌细胞内β-catenin以及间质标志物N-cadherin、vimentin、snail在蛋白水平的表达（P<0.05）,并且上调了上皮标志物E-cadherin的表达量。随后,在胃癌细胞中过表达TERT基因,并经泮托拉唑处理后,利用Transwell迁移实验,发现与阴性对照GFP组相比,过表达TERT组的胃癌细胞穿过滤孔膜到达下室的细胞数明显增加（P<0.05）,细胞迁移能力增强。进而通过western blot检测发现在胃癌细胞中过表达TERT能够上调间质标志物N-cadherin、vimentin及snail在蛋白水平的表达,并且下调了上皮标志物E-cadherin的表达（P<0.05）。体内实验中比较HGC27肺转移瘤模型中对照组与给药组肺脏组织转移结节,肉眼观察可见对照组肺脏组织上存在半透明样转移结节。HE切片光镜下观察发现相较于给药组,对照组可见明显转移灶。结论:质子泵抑制剂（泮托拉唑）能够通过抑制胃癌细胞中STAT3与TERT基因启动子的结合进而抑制TERT基因的表达。同时,泮托拉唑能够通过调控Wnt/β-catenin通路,抑制胃癌细胞上皮间质转化,减弱胃癌细胞的侵袭与迁移能力。但是,在胃癌细胞中过表达TERT基因后能够部分逆转质子泵抑制剂对胃癌细胞迁移能力。因此,我们认为质子泵抑制剂通过调控TERT基因的表达,从而抑制胃癌的侵袭与迁移能力,这可能是胃癌治疗的一个潜在新靶点。
刘元建[7]（2017）在《DNA功能化组装及其在生物分子检测中的应用研究》文中研究说明早期诊断和早期治疗是改善癌症患者的预后及降低其死亡率的关键所在。肿瘤标志物在其中发挥着重要作用。除了传统的肿瘤标志物,近年来许多新的且有效的生物分子标志物也相继被学者发现,其中包括基因甲基化、多种基因突变、端粒酶、血中循环DNA及microRNA。众多研究表明,以上几种生物分子标志物对癌症早期诊断及预测的敏感性,特异性均不低于传统标志物。因此,上述几种标志物极可能被广泛用于临床上对癌症的早期诊断、判断预后、和评价治疗效果。针对这一研究目的,本论文旨在研究DNA与贵金属纳米粒子,荧光、电化学活性物质等信号分子及生物大分子的组装方法,利用其对信号分子的高负载量以及可以在其不同位点同时精确组装几种不同生物分子的特性,设计合成了多种DNA纳米生物探针,构建生物分子标志物高灵敏、多组分同时检测的新方法。本论文的主要内容如下:1.金纳米粒子手性二聚体用于检测DNA甲基转移酶活性及其抑制剂利用DNA诱导金纳米粒子进行手性组装和限制性内切酶HpaⅡ检测DNA甲基转移酶活性及其抑制剂。首先,研究粒子尺寸和粒子间距对手性金纳米粒子二聚体手性信号的影响,筛选出手性信号最强的金纳米粒子二聚体作为DNA甲基转移酶的检测探针。然后利用限制性内切酶HpaⅡ可以识别并切断二聚体之间的5’-CCGG-3’核酸序列,从而破坏二聚体结构,手性信号减弱。如果有甲基转移酶M.SssI存在时,5’-CCGG-3’ DNA序列被甲基化为5’-CCmGG-3’,限制性内切酶HpaⅡ无法切断此甲基化序列,因而完整的金纳米粒子二聚体依然保持很强的手性信号。该方法具有宽的线性范围（0.5 U mL-1到150 U mL-1）、低的检测限（0.27 U mL-1）、高的选择性及良好的稳定性。同时,我们也用此方法评估了 5-氮杂胞嘧啶核苷和普鲁卡因对甲基转移酶的抑制效果。总的来说,此方法具有较好的准确度,特异性,灵敏度,可以检测血清样本,有益于临床诊断和药物开发。2.金纳米粒子手性二聚体用于检测8-羟基脱氧鸟苷以8-羟基脱氧鸟苷的核酸适体组装的金纳米粒子手性二聚体为信号探针,检测DNA氧化应激损伤的标志物:8-羟基脱氧鸟苷。首先利用8-羟基脱氧鸟苷的核酸适体组装金纳米粒子二聚体。透射电镜TEM可以观察到金纳米粒子二聚体的生成,CD光谱仪可以检测到此二聚体具有很强的手性信号。当溶液中含有检测物8-羟基脱氧鸟苷时,检测物会与其核酸适体结合,从而破坏二聚体结构,手性信号减弱。通过此方法我们可以定量检测0.05nM到2nM的8-羟基脱氧鸟苷,最低检测线为33 pM （信噪比为3）。同时,此方法可用于评估人血清样本中8-羟基脱氧鸟苷的含量。总的来说,此方法具有较好的准确度,特异性,灵敏度,可以检测血清样本,有益于临床诊断。3. DNA正四面体探针用于端粒酶活性的电化学检测以DNA正四面体纳米材料为基础,研究其在电化学检测肿瘤标志物端粒酶中的应用。在DNA正四面体的一个顶点引出端粒扩增引物,其他三个顶点修饰巯基,通过金硫键将此探针共价修饰到金电极表面。当端粒酶存在时,端粒酶特异性识别端粒引物,并在其3’末端扩增出（TTAGGG）x富G序列。该富G序列在钾离子和氯化血红素的作用下形成G-四链体,是一种具有类似辣根过氧化物酶催化性质的DNA模拟酶。该DNA模拟酶在过氧化氢的存在下催化苯胺聚合成具有电化学活性的聚苯胺。我们利用示差脉冲伏安法检测聚苯胺的电化学信号从而检测端粒酶活性。通过调节DNA正四面体探针的尺寸,可以控制相邻端粒引物的距离。当此距离接近端粒酶的尺寸时,端粒酶识别端粒引物并进行扩增的效率大大增强,从而我们可以得到最佳的电化学输出信号,显着提高检测灵敏度。利用此方法,可以评估MCF-7,A549, MDA-MB-231,HeLa等细胞中的端粒酶活性。该方法的最低检测限为1个细胞/10微升,检测范围为5到5000个细胞,与单链端粒引物探针相比,信号提高20倍。该方法用于检测膀胱癌患者尿样中脱落细胞的端粒酶活性时,得到的结果与临床病理检测结果一致。4.基于荧光共振能量转移效应同时检测三种与肺癌相关microRNA设计三种不同荧光素（Cy3, Cy3.5, Cy5）标记的核酸探针,对应识别三种microRNA（miRNA-155, miRNA-182, miRNA-197）,形成双螺旋核酸探针。核酸染料TOTO-1可以嵌入到核酸探针骨架中,通过单波长激发,将荧光共振能量转移给相应的荧光素,产生不同的荧光信号,实现多组分检测肿瘤标志物microRNA。显着提高相关肿瘤诊断的准确度。核酸染料TOTO-1本身在溶液中几乎不发出荧光信号,但当它嵌入到双链核酸骨架中时,其荧光信号显着提高约1000倍。其发射光谱与Cy3, Cy3.5, Cy5的激发光谱重叠,可以产生荧光共振能量转移效应。miRNA-155, miRNA-182, miRNA-197作为肺癌发病早期的标志物,在血浆中同时诊断出三种microRNA的存在,可以显着提高疾病诊断的准确度,为临床上疾病的早期诊断提供有效途径。因此多组分检测肿瘤标志物microRNA在生物医学和临床中具有广阔的应用前景。5.金纳米粒子比色法检测甲型流感病毒H3N2金纳米粒子表面功能化修饰抗血凝素单克隆抗体（mAb）,得到mAb-AuNPs探针。mAb-AuNPs探针通过抗血凝素单克隆抗体特异性识别甲型流感病毒囊膜表面富含的血凝素,从而得到探针/病毒组装体。该探针/病毒组装体上的金纳米粒子相邻很近,容易产生等离子共振耦合（SPR）效应,在紫外可见光谱上表现为金纳米粒子的最大吸收峰发生红移,裸眼可见组装体的溶液由红色变为蓝色。同时,利用透射电子显微镜（TEM）技术和动态光散射（DLS）技术对探针/病毒组装体进行表征。在最佳检测条件下,我们利用此方法可以最低检测出7.8 HAU的甲型流感病毒H3N2IAV （A/Brisbane/10/2007）。此方法展现出高特异性、准确性、稳定性。重要的是,此方法利用功能化金纳米粒子可以一步法检测流感病毒,紫外光谱读出信号,不需要进行信号放大。同时,此方法可以扩展应用到其他病原体的可视化检测。
常杏[8]（2017）在《端粒酶逆转录酶线粒体转位在肝癌细胞耐药中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的:化疗是肿瘤治疗广泛应用的手段之一,而化疗耐药是目前肿瘤治疗面临的一大难题,肿瘤耐药原因多种多样,机制仍然不清楚。人端粒酶（telomerase）是具有逆转录酶活性的核糖核酸酶,其中hTERT是最重要的催化亚单位。端粒酶以自身RNA为模板,合成端粒重复序列,从而维持染色体结构完整性及稳定性。端粒酶在生殖细胞、胚胎干细胞、肿瘤细胞核内高表达,而在正常体细胞中的活性被抑制,端粒酶可以填补DNA复制的缺陷,减少端粒在细胞分裂过程中的损耗,与肿瘤细胞无限增殖潜能密切相关。hTERT高表达与肿瘤细胞生物学行为密切相关,影响疾病的发展和预后。以往大多数有关hTERT研究主要集中于其细胞核内发挥逆转录酶活性维持端粒长度,在肿瘤细胞增殖、侵袭、转移及化疗耐药中的作用,而其非逆转录酶活性作用亦越来引起关注。研究发现,即便缺失其逆转录酶功能hTERT仍可促进细胞抗凋亡、DNA损伤修复,并参与干性维持和基因表达调控。亦有研究表明,hTERT可在线粒体定位序列引导下进入线粒体,与线粒体DNA（mtDNA）结合,影响mtDNA的稳定性。本课题组前期已发表研究表明随着肝癌细胞耐药能力的增加,线粒体hTERT表达亦逐渐增多,表明线粒体hTERT与肝癌细胞耐药密切相关,但机制不明。因此,阐明hTERT线粒体转位在肝癌细胞耐药中的作用,丰富hTERT在肝癌化疗耐药中的分子机制,将为肝癌治疗提供新的方法。方法:第一部分:端粒酶逆转录酶（hTERT）非逆转录酶活性影响肝癌细胞耐药的研究1、野生型hTERT（WThTERT）慢病毒转染细胞后,CCK-8法检测肝癌细胞化疗敏感性变化;2、将端粒酶活性缺失的DNhTERT（D711A且V712I）慢病毒转染细胞,TRAP实验检测端粒酶活性变化,CCK-8法检测端粒酶逆转录酶活性缺失对细胞耐药的影响;3、Western Blot及免疫荧光实验检测DNhTERT转染细胞后线粒体hTERT的表达及定位变化;4、构建肝癌耐药细胞株,Western Blot及免疫荧光实验检测耐药细胞中线粒体hTERT的表达情况;5、活细胞染色、流式细胞术、Western Blot检测耐药细胞干性相关特征变化情况;6、在端粒酶活性缺失的基础上（D711A且V712I）构建线粒体定位序列突变（MPEAPECRAVRSLLRSHYRE）的hTERT（NUChTERT）慢病毒转染细胞,Western Blot及免疫荧光实验检测线粒体hTERT的表达情况,CCK-8法检测NUChTERT对细胞耐药的影响;7、活细胞染色、萤光素酶实验、Western Blot实验检测NUChTERT对细胞线粒体膜电位（Δψm）、ROS、ATP、OCT-4干性相关指标的影响;第二部分线粒体hTERT通过抑制线粒体呼吸链复合物活性影响肝癌细胞耐药的研究1、比色法检测DNhTERT对肝癌细胞线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性的影响;2、比色法检测NUChTERT对肝癌细胞线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性的影响;结果:第一部分:端粒酶逆转录酶（hTERT）非逆转录酶活性影响肝癌细胞耐药的研究1、Huh7细胞转染WThTERT后,对化疗药物顺铂（CDDP）的抵抗增强。2、Huh7细胞转染DNhTERT后,仍然可以促进细胞对CDDP的抵抗。3、Huh7和U2OS细胞转染DNhTERT后,Western Blot实验发现线粒体hTERT表达增加,免疫荧光实验证实hTERT线粒体定位增多。4、构建HepG2、Huh7对CDDP的耐药细胞株,分别为HepG2/CDDP、Huh7/C2DDP,CCK-8实验检测细胞耐药指数明显升高,Western Blot实验检测分别与亲本细胞相比,耐药细胞线粒体hTERT表达增加,免疫荧光实验发现耐药细胞hTERT线粒体定位增多。5、使用TMRE（四甲基罗丹明乙酯）活细胞探针孵育亲本细胞HepG2、Huh7及耐药细胞HepG2/CDDP、Huh7/CDDP,激光共聚焦显微镜观察与亲本细胞相比,耐药细胞Δψm明显升高。流式细胞术检测发现与亲本细胞相比,耐药细胞干细胞表面marker CD133、Ep CAM阳性细胞比例增加。Western Blot证实与亲本细胞相比,耐药细胞干性相关因子OCT-4表达增加。6、Huh7细胞转染NUChTERT后,Western Blot实验与免疫荧光证实与DNhTERT细胞相比,NUChTERT线粒体表达明显降低,CCK-8法发现与DNhTERT细胞相比,NUChTERT对CDDP抵抗能力降低。7、使用活细胞探针TMRE、MitoSox孵育Huh7-control、Huh7-DNhTERT、Huh7-NUChTERT细胞后,激光共聚焦显微镜观察发现Huh7-DNhTERT细胞Δψm升高,ROS降低,萤光素酶实验发现ATP水平降低,Western Blot实验表明细胞干性相关因子OCT-4表达升高,而Huh7-NUChTERT细胞上述效应明显减弱。第二部分线粒体hTERT影响线粒体呼吸链复合物活性导致肝癌细胞耐药的研究1、Huh7细胞转染DNhTERT后,比色法检测线粒体呼吸链复合物活性发现,与对照细胞相比,DNhTERT转染细胞呼吸链复合物Ⅰ活性显着降低,而对呼吸链复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性无明显影响。2、Huh7细胞转染NUChTERT后,比色法检测发现NUChTERT可部分回复DNhTERT所导致的线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性的降低。研究结论:1、hTERT非逆转录酶活性亦参与了肝癌细胞化疗耐药;2、hTERT线粒体转位是肝癌细胞化疗耐药的重要原因;3、线粒体hTERT可通过抑制呼吸链复合物Ⅰ活性,抑制ROS、ATP生成,促进细胞干性化,最终导致肝癌细胞化疗耐药;综上所述,hTERT可在线粒体定位序列引导下定位于线粒体,通过抑制呼吸链复合物Ⅰ活性,从而抑制ROS、ATP生成,促进细胞干性化,最终导致肝癌细胞化疗耐药。
黄超[9]（2017）在《TGF-β1诱导肠上皮表型转变相关表观遗传机制及中药单体干预》文中进行了进一步梳理背景和目的大肠癌（CRC）对人类生活健康构成了极大的危险,深入了解肠癌发生发展机制及开发有效药物的形势已刻不容缓。研究发现肿瘤微环境（TME）中的肿瘤细胞与基质细胞通过其分泌到微环境中的转化生长因子-β（TGF-β）发生串扰从而促进基质细胞之间的表型转变,而且研究发现在表型转变过程中伴随有表观遗传学的改变,而组蛋白修饰作为表观遗传学中的重要成分因结构特性因而可通过各种化学基团修饰对周围环境进行即时快速响应,因此组蛋白修饰可能参与了细胞表型转变相关机制。中药单体吴茱萸碱和小檗碱对肿瘤细胞均具有较强的抗肿瘤活性,然而对其具体的抗癌机制尚不明确,因此,本研究旨在通过TGF-β1体外诱导结肠上皮细胞系NCM460构建表型转变模型探讨组蛋白修饰变化机制以及吴茱萸碱和小檗碱的干预效应。方法将含有10ng/mlTGF-β 1培养基培养永生化结肠上皮细胞系NCM460至15天（d）后采用细胞免疫荧光进行细胞表型标志物E-cadherin、ZO-1和vimentin的免疫荧光检测,同时采用免疫印迹（westernblotting）对此三种表型标志物及表型相关转录因子Snail和Slug的蛋白表达进行了测定。为了探索细胞表型转变中染色体不稳定及组蛋白修饰模式的变化,分别采用分选式流式细胞仪（FACS）和western blotting检测TGF-β 1诱导表型转变后的细胞中非整倍体细胞百分比情况和五种组蛋白修饰标记物（H3K4me2、H3K4me3、H3K9me2、H3K9ac、H3K27me3）蛋白表达水平。为了探讨左金丸主要活性成分吴茱萸碱和小檗碱对TGF-β 1的生物学效应的干预作用,将TGF-β 1诱导表型转变后的细胞进行不同浓度吴茱萸碱（5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml）和小檗碱（50μg/ml、75μg/ml和100μg/ml）处理后72h后,分别按照上述方法检测表型标志物及Snail、Slug表达,非整倍体细胞百分比变化以及异常组蛋白修饰模式的影响。结果（1）TGF-β 1对NCM460细胞表型转变及中药单体干预的影响10ng/mlTGF-β 1诱导NCM460细胞15d后细胞发生了 EMT样表型转变,细胞呈现出纺锤样的形态学改变,同时上皮细胞标志物E-cadherin和紧密连接复合物ZO-1的表达出现显着下调,而间质性标志物vimentin的表达出现了明显升高,其荧光强度与光密度值与未加入TGF-β 1处理的细胞相比差异具有统计学意义（P<0.05）。此外与TGF-β 1诱导表型转变相关的转录因子Snail和Slug也出现了显着上调（P<0.05）。而加入不同浓度吴茱萸碱和小檗碱处理72h后,均能不同程度上调E-cadherin和ZO-1和下调vimentin表达,表明吴茱萸碱和小檗碱可对抗TGF-β1引起的细胞表型转变效应。（2）表型转变中TGF-β1对细胞中非整倍体性的影响及中药单体的干预效应NCM460细胞受到10ng/mlTGF-β 1诱导15d发生表型转变后,非整倍体细胞数百分比明显高于阴性对照组（P<0.05）,整倍体亚群分析显示,转化细胞中亚二倍体.细胞数明显多于超二倍体和多倍体数目（P<0.05）,而诱导20d和25天后细胞中分别以超二倍体和多倍体细胞为主。但是经高浓度和中浓度的吴茱萸碱和小檗碱处理72h后,非整倍体细胞数（亚二倍体和超二倍体）与对照组相比均出现了显着的减少（P<0.05）。（3）TGF-β1诱导表型转变中组蛋白修饰变化及中药单体干预的影响与对照组细胞相比,TGF-β 1诱导表型转变细胞中H3K4me2、H3K4me3、H3K9me2、H3K9ac和H3K27me3均出现了显着互不相同的变化,其中H3K4me2、H3K9me2和H3K9ac的表达显着上调（P<0.05）,而H3K4me3和H3K27me3的表达出现了明显下调反应（P<0.05）。然而H3K4me3和H3K27me3的表达经吴茱萸碱和小檗碱处理出现了不同程度的上调,而H3K9me2和H3K9ac的表达呈现出不同程度下调,但是H3K4me2的表达经10μg/ml吴茱萸碱和100μg/ml以及50μg/ml小檗碱处理后下调。结论（1）结肠上皮细胞在体外受TGF-β 1诱导表型转变后出现了非整倍体性的染色体不稳定以及异常组蛋白修饰,表明TGF-β1可能通过与组蛋白修饰相关机制从而导致基因组不稳定性而发挥出促表型转变效应。（2）一定浓度吴茱萸碱和小檗碱可能通过多机制包括稳定染色体数目或调控异常组蛋白修饰模式而发挥出一定的抗肿瘤活性作用。
李龙飞,周红妹,马大川,李一帆,汉丽梅[10]（2016）在《中药抑制肿瘤细胞端粒酶活性的研究进展》文中研究说明肿瘤严重威胁着人类健康,近年来癌症患者不断增多且死亡率逐年上升。中药以其安全性高、价格低、毒副作用小等优点成为抗肿瘤的首选药物。研究证实,肿瘤细胞与端粒酶之间存在相互激发的关系,肿瘤细胞缺乏端粒酶调节机制,一旦端粒酶活性被激活,肿瘤细胞将会有无限增殖的能力。因此,抑制肿瘤细胞端粒酶活性可作为治疗肿瘤的方法之一。文章将从中药的几种有效成分及复方中药对肿瘤细胞端粒酶活性的抑制作用作一综述,探讨中药抑制肿瘤细胞端粒酶活性的研究进展及其应用前景。
二、端粒酶及其逆转录酶与肿瘤的发生（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、端粒酶及其逆转录酶与肿瘤的发生（论文提纲范文）
（1）纳米材料在口腔癌治疗中的应用研究进展（论文提纲范文）
| 1 口腔癌及其分子生物遗传学机制 |
| 2 纳米材料的生物学领域应用及与口腔癌的关系 |
| 2.1纳米材料在口腔癌预防方面中的应用 |
| 2.2纳米材料在口腔癌治疗方面中的应用 |
| 2.3纳米载药材料在口腔癌中的应用 |
| 2.4纳米材料在口腔癌基因治疗中的应用 |
| 3 小结 |
（2）TERT在喉癌组织中的免疫组化表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 2.资料与方法 |
| 2.1 临床资料及标本来源 |
| 2.2 实验试剂及设备 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 蜡块制作 |
| 2.3.2 免疫组化 |
| 2.4 免疫组化定量分析 |
| 2.5 病例随访情况 |
| 2.6 数据分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 研究对象的临床特征 |
| 3.2 TERT的免疫组化表达 |
| 3.3 生存分析 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 喉鳞状细胞癌生物标志物的研究进展 |
| 参考文献 |
（3）拟南芥端粒酶逆转录酶的非生物胁迫抗性功能及抗原表位特征（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 端粒酶概述 |
| 1.2 非端粒功能 |
| 1.3 端粒酶与逆转录酶 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 AtTERT在拟南芥超表达及其对非生物胁迫抗性的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料及耗材 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 引物序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒模板克隆拟南芥AtTERT基因 |
| 2.2.2 构建pCAMBIA2300-GFP-AtTERT真核表达载体 |
| 2.2.3 AtTERT蛋白的烟草瞬时表达 |
| 2.2.4 侵染转化拟南芥 |
| 2.2.5 PCR鉴定转AtTERT拟南芥T_1代植株 |
| 2.2.6 转基因拟南芥AtTERT蛋白细胞定位观察 |
| 2.2.7 筛选转AtTERT拟南芥纯合株系 |
| 2.2.8 筛选转AtTERT拟南芥高表达株系 |
| 2.2.9 鉴定AtTERT突变体 |
| 2.2.10 转AtTERT拟南芥非生物胁迫处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 质粒模板克隆拟南芥AtTERT基因 |
| 2.3.2 构建pCAMBIA2300-GFP-AtTERT真核表达载体 |
| 2.3.4 AtTERT蛋白主要定位于细胞核 |
| 2.3.5 转AtTERT拟南芥植株非生物胁迫分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 AtTERT转化大肠杆菌及其对非生物胁迫抗性的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 材料及耗材 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 引物序列 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 无缝克隆法构建pET32a/pGEX-4T-1-AtTERT原核表达载体 |
| 3.2.2 AtTERT蛋白诱导表达及鉴定 |
| 3.2.3 AtTERT对大肠杆菌生长特性的影响 |
| 3.2.4 转AtTERT大肠杆菌非生物胁迫抗性检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 构建pET32a/ pGEX-4T-1-AtTERT原核表达载体 |
| 3.3.2 AtTERT蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 3.3.3 AtTERT抑制大肠杆菌的生长 |
| 3.3.4 转AtTERT大肠杆菌对非生物胁迫响应 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 AtTERT诱导表达条件优化 |
| 3.4.2 AtTERT在大肠杆菌非生物胁迫中发挥重要作用 |
| 4 AtTERT蛋白抗原表位特征及其抗原性 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 材料及耗材 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 引物序列 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 AtTERT蛋白潜在抗原表位预测 |
| 4.2.2 缺失不同功能结构域的AtTERT突变体 |
| 4.2.3 无缝克隆法构建pET32a-P1/P2/P3/P4原核表达载体 |
| 4.2.4 Trx-His-P1/P2/P3/P4-His融合蛋白原核表达及鉴定 |
| 4.2.5 优化Trx- His -P1/P2/P3/P4- His融合蛋白纯化条件 |
| 4.2.6 ELISA试剂盒鉴定分段融合蛋白抗原性 |
| 4.2.7 P4对大肠杆菌响应盐胁迫及渗透胁迫影响 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 AtTERT蛋白抗原表位预测 |
| 4.3.2 无缝克隆法构建pET32a-P1/P2/P3/P4原核表达载体 |
| 4.3.3 Trx- His -P1/P2/P3/P4-His融合蛋白原核表达及鉴定 |
| 4.3.4 Trx-His-P1/P2/P3/P4-His融合蛋白纯化条件优化 |
| 4.3.5 AtTERT分段融合蛋白抗原性 |
| 4.3.7 P4降低大肠杆菌盐胁迫及渗透胁迫抗性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 AtTERT抗原表位预测显示主要位于肽链N端及中部 |
| 4.4.2 AtTERT的保守功能结构域抗原性最强 |
| 4.4.3 AtTERT保守功能结构域降低大肠杆菌盐及渗透胁迫抗性 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录 |
| 致谢 |
（4）绍兴鸭端粒酶逆转录酶基因表达调控及内源性激活的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 常见英文缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 端粒和端粒酶 |
| 1.1 端粒和端粒酶的研究历史 |
| 1.2 端粒 |
| 1.3 端粒酶 |
| 2 端粒酶逆转录酶基因(TERT) |
| 2.1 TERT作用机制 |
| 2.2 TERT调控机制 |
| 2.3 TERT外源性调控 |
| 3 CRISPR-Cas9基因组编辑技术 |
| 3.1 细菌获得性免疫系统 |
| 3.2 CRISPR-Cas9介导的基因组编辑 |
| 3.3 CRISPR-Cas9用于非编码元件筛选 |
| 3.4 CRISPR-Cas9技术在禽类上的研究进展 |
| 4 本文主要研究内容及意义 |
| 4.1 研究目的和意义 |
| 4.2 主要研究内容 |
| 第二章 鸭TERT基因,相对端粒酶活性和相对端粒长度的时空分布特点 |
| 1 引言 |
| 2 试验仪器与材料 |
| 2.1 鸭组织样品 |
| 2.2 主要试剂及配制 |
| 2.3 主要试验仪器 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 鸭各组织样品总RNA提取 |
| 3.2 RNA反转录成cDNA |
| 3.3 实时荧光定量PCR检测鸭TERT表达 |
| 3.4 鸭相对端粒酶活性(RTA)检测 |
| 3.5 鸭各组织DNA提取 |
| 3.6 鸭相对端粒长度(RTL)检测 |
| 3.7 统计分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 TERT在鸭发育早期阶段的时空表达分布 |
| 4.2 相对端粒酶活性(RTA)在鸭发育早期阶段的时空分布 |
| 4.3 相对端粒长度(RTL)在鸭发育早期阶段的时空分布 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 鸭TERT基因5'-侧翼序列克隆和DNA甲基化调控 |
| 1 引言 |
| 2 试验仪器与材料 |
| 2.1 细胞 |
| 2.2 主要试剂及配制 |
| 2.3 主要试验仪器 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 鸭TERT 5'-侧翼序列克隆 |
| 3.2 5'-RACE确定转录起始位点 |
| 3.3 鸭TERT 5'-侧翼序列CpG岛预测 |
| 3.4 细胞组织DNA提取 |
| 3.5 亚硫酸氢盐测序法检测DNA甲基化 |
| 3.6 细胞培养及处理 |
| 3.7 基因的定量检测 |
| 3.8 统计分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 鸭TERT基因5'侧翼序列扩增 |
| 4.2 5'-RACE鉴定新的转录起始位点 |
| 4.3 鸭TERT启动子区CpG岛预测 |
| 4.4 鸭组织TERT启动子区DNA甲基化分析 |
| 4.5 DNA甲基转移酶差异表达分析 |
| 4.6 鸭胚成纤维细胞分离及dTERT定量 |
| 4.7 甲基转移酶抑制剂诱导鸭TERT表达 |
| 4.8 组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导鸭TERT表达 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 CRISPR-Cas9技术内源性激活鸭TERT表达 |
| 1 引言 |
| 2 试验仪器与材料 |
| 2.1 细胞系及质粒 |
| 2.2 主要试剂及配制 |
| 2.3 主要试验仪器 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 EGFP表达载体构建 |
| 3.2 质粒转染 |
| 3.3 5’端系列缺失双荧光素酶载体构建 |
| 3.4 转录活性区域生物信息学分析 |
| 3.5 sgRNAs设计 |
| 3.6 LentiCRISPR v2-sgRNA表达载体构建 |
| 3.7 嘌呤霉素最适筛选浓度确定 |
| 3.8 慢病毒包装 |
| 3.9 慢病毒感染鸭小肠上皮细胞 |
| 3.10 TERT,RTA,RTL分析 |
| 3.11 CRISPR靶区域Sanger测序 |
| 3.12 sgRNA富集分析 |
| 3.13 LPS,Poly(I:C)细胞处理 |
| 3.14 统计分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 启动子驱动的EGFP表达载体构建及在293T细胞中的活性检测 |
| 4.2 鸭TERT启动子双荧光素酶载体构建及转录活性检测 |
| 4.3 鸭TERT启动子转录活性区域生物信息学分析 |
| 4.4 LentiCRISPR v2-sgRNAs表达载体小库的构建 |
| 4.5 鸭小肠上皮细胞嘌呤霉素筛选浓度确定 |
| 4.6 荧光定量PCR检测基因编辑后鸭TERT表达 |
| 4.7 CRISPR靶区域Sanger测序分析 |
| 4.8 sgRNA富集分析 |
| 4.9 相对端粒酶活性(RTA)和相对端粒长度(RTL)分析 |
| 4.10 细胞表型和相关基因定量 |
| 4.11 LPS和Poly(I:C)处理诱导免疫反应 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 论文创新点及后续研究展望 |
| 1 创新点 |
| 2 后续研究展望 |
| 参考文献 |
| 读博期间发表（录用）论文 |
（5）荧光纳米探针用于端粒酶活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 纳米生物传感器概述 |
| 1.1.1 纳米材料在荧光生物传感器上的应用 |
| 1.1.2 基于金纳米粒子的荧光传感器 |
| 1.1.3 基于碳纳米材料的荧光传感器 |
| 1.1.4 基于过渡金属磷化物的荧光传感器 |
| 1.2 信号放大技术在生物传感器中的应用 |
| 1.2.1 核酸杂交链式反应 |
| 1.2.2 滚环扩增放大反应 |
| 1.2.3 链置换扩增放大反应 |
| 1.3 端粒酶活性检测方法 |
| 1.3.1 端粒和端粒酶 |
| 1.3.2 端粒酶的检测方法 |
| 1.3.3 活细胞中端粒酶活性的检测 |
| 1.4 本论文的选题依据及设计思路 |
| 第2章 基于氧化石墨烯的荧光探针用于端粒酶活性的分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 细胞培养和端粒酶提取 |
| 2.2.3 端粒酶延伸反应和荧光检测 |
| 2.2.4 凝胶电泳分析 |
| 2.2.5 癌细胞中端粒酶的原位成像 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 工作机理 |
| 2.3.2 定量检测癌细胞提取物中端粒酶的活性 |
| 2.3.3 特异性的评估和抑制剂的考察 |
| 2.3.4 原位检测细胞内端粒酶活性 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 CoP纳米线结合杂交链式扩增技术用于端粒酶活性的高灵敏检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂和仪器 |
| 3.2.2 CoP纳米线的制备 |
| 3.2.3 端粒酶延伸和杂交链式反应 |
| 3.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析实验 |
| 3.2.5 癌细胞中端粒酶的原位成像 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 CoP纳米线用于端粒酶活性检测的设计原理 |
| 3.3.2 磷化钴纳米线的合成表征 |
| 3.3.3 实验机理验证 |
| 3.3.4 实验条件的优化 |
| 3.3.5 癌细胞提取物中端粒酶活性的测定 |
| 3.3.6 基于CoP纳米线的传感平台的选择性 |
| 3.3.7 端粒酶抑制剂研究 |
| 3.3.8 细胞内端粒酶活性成像研究 |
| 3.3.9 端粒酶响应的动力学考察 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（6）质子泵抑制剂调控TERT基因表达进而抑制胃癌侵袭性的机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 质子泵抑制剂与肿瘤 |
| 1.2 端粒酶逆转录酶与肿瘤 |
| 1.3 结论和展望 |
| 第二章 体外实验 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 小结 |
| 2.6 讨论 |
| 第三章 体内实验 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 小结 |
| 3.6 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）DNA功能化组装及其在生物分子检测中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 肿瘤标志物 |
| 1.2.1 肿瘤标志物简介及分类 |
| 1.2.2 肿瘤标志物的来源 |
| 1.2.3 肿瘤标志物主要检测方法概述 |
| 1.3 金纳米粒子 |
| 1.3.1 金纳米粒子的性质 |
| 1.3.2 金纳米粒子的制备 |
| 1.3.3 金纳米粒子的表面修饰 |
| 1.3.4 金纳米粒子在分析检测中的应用研究 |
| 1.4 DNA纳米结构研究进展 |
| 1.4.1 DNA纳米结构自组装 |
| 1.4.2 DNA功能化修饰 |
| 1.4.3 DNA纳米技术的应用 |
| 1.5 本论文的主要研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 金纳米粒子手性二聚体用于检测DNA甲基转移酶活性及其抑制剂 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 金纳米粒子的制备 |
| 2.2.4 DNA功能化金纳米粒子 |
| 2.2.5 金纳米粒子二聚体的组装 |
| 2.2.6 DNA甲基转移酶活性的圆二色谱检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 金纳米粒子及其二聚体的制备与表征 |
| 2.3.2 金纳米粒子二聚体的手性增强机制研究 |
| 2.3.3 DNA甲基转移酶M.SssI温育时间的优化 |
| 2.3.4 DNA甲基转移酶M.SssI的CD检测 |
| 2.3.5 Au_2-Au_3二聚体手性传感器的特异性 |
| 2.3.6 Au_2-Au_3二聚体手性传感器用于评估DNA甲基转移酶M.SssI抑制剂的活性 |
| 2.3.7 人血清中测定M.SssI甲基转移酶的活性 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 金纳米粒子手性二聚体用于检测8-羟基脱氧鸟苷 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 金纳米粒子手性二聚体传感器的构建用于8-OHdG的检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 材料的表征 |
| 3.3.2 8-OHdG与aptamer温育时间的优化 |
| 3.3.4 8-OHdG的检测 |
| 3.3.5 8-OHdG检测的特异性和在人血清样本中分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 DNA正四面体探针用于端粒酶活性的电化学检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 肿瘤细胞培养和端粒酶提取 |
| 4.2.4 免疫传感器的构建 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 Hemin/G-quadruplex/DTS-primer/Au电极的表征 |
| 4.3.2 DNA正四面体探针尺寸对生物传感器信号的影响 |
| 4.3.3 端粒酶的定量检测 |
| 4.3.4 实际样本检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 基于荧光共振能量转移效应同时检测三种与肺癌相关microRNA |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 核酸染料TOTO-1的荧光性质 |
| 5.2.3 单组分miRNA的检测 |
| 5.2.4 多组分miRNA的检测 |
| 5.2.5 实验仪器 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 核酸染料TOTO-1和荧光素Cy3,Cy3.5,Cy5的荧光性质 |
| 5.3.2 单组分检测miRNA |
| 5.3.3 荧光光谱串扰校正 |
| 5.3.4 血清样品中测定miRNA的浓度 |
| 5.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 金纳米粒子比色法检测甲型流感病毒H3N2 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 实验试剂 |
| 6.2.2 功能化金纳米粒子探针的制备 |
| 6.2.3 H3N2 IAV的检测 |
| 6.2.4 实验仪器 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 金纳米粒子探针比色法检测H3N2 IAV的原理验证 |
| 6.3.2 条件优化 |
| 6.3.3 特异性和稳定性 |
| 6.3.4 定量检测H3N2 IAV |
| 6.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 本论文的后续工作与展望 |
| 博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）端粒酶逆转录酶线粒体转位在肝癌细胞耐药中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 端粒酶逆转录酶（hTERT）非逆转录酶活性影响肝癌细胞耐药的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 hTERT线粒体转位影响呼吸链复合物活性导致肝癌细胞耐药 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 线粒体对肿瘤干细胞的影响 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）TGF-β1诱导肠上皮表型转变相关表观遗传机制及中药单体干预（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一章 肿瘤微环境内的TGF-β在肿瘤发生发展中的研究进展 |
| 第二章 组蛋白修饰在肿瘤发生中的研究进展 |
| 第三章 吴茱萸碱和小檗碱抗肿瘤活性机制研究进展 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 第一章 大肠上皮细胞表型转变体外模型的构建 |
| 第一节 NCM460细胞系的基本生物学特性 |
| 第二节 TGF-β1体外诱导NCM460细胞构建表型转变模型 |
| 第二章 TGF-β1诱导的NCM460细胞模型中染色体不稳定性的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 TGF-β1诱导的NCM460细胞模型中组蛋白修饰模式的变化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 中药单体吴茱萸碱和小檗碱对TGF-β1诱导NCM460细胞表型转变的干预效应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 中药单体吴茱萸碱和小檗碱对TGF-β1诱导的NCM460细胞模型中染色体不稳定性的干预效应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章 中药单体吴茱萸碱和小檗碱对TGF-β1诱导的NCM460细胞模型中组蛋白修饰模式变化的干预效应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 总结与展望 |
| 研究结论 |
| 本研究创新之处 |
| 本研究不足及改进之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 详细摘要 |
（10）中药抑制肿瘤细胞端粒酶活性的研究进展（论文提纲范文）
| 1 端粒酶与肿瘤 |
| 1.1 端粒酶 |
| 1.2 端粒酶活性与肿瘤 |
| 2 端粒酶与抗肿瘤中药 |
| 2.1 单味中药及中药有效成分对端粒酶活性的影响 |
| 2.1.1 生物碱类 |
| 2.1.2 黄酮类 |
| 2.1.3 苷类 |
| 2.1.4 其他类 |
| 2.2 中药复方对端粒酶活性的影响 |
| 3 小结 |
四、端粒酶及其逆转录酶与肿瘤的发生（论文参考文献）
- [1]纳米材料在口腔癌治疗中的应用研究进展[J]. 高贤明,曲会娟,单培培. 癌症进展, 2021(21)
- [2]TERT在喉癌组织中的免疫组化表达及其临床意义[D]. 沈海龙. 安徽医科大学, 2020(02)
- [3]拟南芥端粒酶逆转录酶的非生物胁迫抗性功能及抗原表位特征[D]. 孙玉萍. 北京林业大学, 2019(01)
- [4]绍兴鸭端粒酶逆转录酶基因表达调控及内源性激活的研究[D]. 袁陶燕. 浙江大学, 2019(01)
- [5]荧光纳米探针用于端粒酶活性分析[D]. 彭杰. 南昌大学, 2018(12)
- [6]质子泵抑制剂调控TERT基因表达进而抑制胃癌侵袭性的机制研究[D]. 扎西潘多. 南京大学, 2018(01)
- [7]DNA功能化组装及其在生物分子检测中的应用研究[D]. 刘元建. 东南大学, 2017(02)
- [8]端粒酶逆转录酶线粒体转位在肝癌细胞耐药中的作用及机制研究[D]. 常杏. 第三军医大学, 2017(04)
- [9]TGF-β1诱导肠上皮表型转变相关表观遗传机制及中药单体干预[D]. 黄超. 广州中医药大学, 2017(01)
- [10]中药抑制肿瘤细胞端粒酶活性的研究进展[J]. 李龙飞,周红妹,马大川,李一帆,汉丽梅. 黑龙江畜牧兽医, 2016(21)