一、重组人纽表位肽12生物学活性测定方法的研究（论文文献综述）
李菲[1]（2019）在《结核分枝杆菌抗原致骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究暨烯醇化酶-1单克隆抗体制备与作用初步研究》文中提出结核分枝杆菌感染机体后主要激活CD4+T细胞和CD8+T细胞,CD4+T细胞分化为Th1型细胞,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子,激活巨噬细胞等细胞免疫应答,CD8+T细胞分化为CTL细胞直接杀伤靶细胞,发挥清除结核分枝杆菌的作用。然而耐药结核、痰菌阳性的纤维空洞型肺结核等重症结核病患者体内结核分枝杆菌长期慢性感染会导致机体免疫功能低下。我们实验室前期应用结核分枝杆菌抗原持续刺激模拟临床结核分枝杆菌持续感染的状态,发现结核分枝杆菌抗原持续刺激会导致T细胞耗竭,表现为T细胞受特异性抗原刺激后增殖能力下降、产生细胞因子IFN-γ和IL-2减少。在该结核分枝杆菌抗原持续刺激致T细胞耗竭的动物模型上,进一步对T细胞耗竭进行治疗研究,发现给予IL-2干预可逆转其耗竭状态。在上述研究基础上,我们进而拟研究抗原持续刺激导致T细胞耗竭过程中骨髓造血功能的变化。维持骨髓造血干细胞（HSC）及前体细胞稳态是机体维持正常造血功能及建立有效抗结核免疫应答的基础。骨髓HSC的分化增殖受GM-CSF、IL-2、IFN-γ等细胞因子的调节。研究发现淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）等病毒及细菌感染过程中,细胞因子IFN-γ持续分泌,可引起造血功能障碍。重症结核病出现免疫耗竭及骨髓造血功能障碍的研究较少,相关机制尚不清楚。目的:我们推测结核分枝杆菌抗原持续刺激情况下,刺激产生的细胞因子持续作用于骨髓,造成骨髓HSC及造血前体细胞功能异常。本实验继续应用前期我们实验室建立的结核分枝杆菌抗原持续刺激引起T细胞耗竭的动物模型,研究结核分枝杆菌抗原持续刺激对骨髓造血功能的影响。方法:为了研究结核分枝杆菌抗原持续刺激对骨髓造血及T细胞免疫功能的影响,本课题应用结核分枝杆菌抗原持续刺激小鼠,观察结核分枝杆菌抗原持续刺激过程中骨髓造血细胞增殖能力的变化,并分析与造血细胞分化相关转录因子表达水平的改变,评价结核抗原刺激诱导的免疫应答对骨髓造血功能的影响。在此基础上进一步研究IL-2治疗对骨髓造血功能的影响。（1）抗原刺激及IL-2治疗程序。考虑到生物安全等因素,本课题应用结核分枝杆菌抗原持续刺激模拟临床结核分枝杆菌持续感染对免疫系统和骨髓造血功能的影响。本研究首先用卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin,BCG）免疫C57BL/6小鼠,然后用结核分枝杆菌抗原ESAT-6、CFP-10联合融合蛋白Mtb10.4-HspX（MH）与佐剂DDA和Poly（I:C）持续刺激,每周一次,反复皮下注射。抗原反复刺激12周后检测到骨髓造血细胞（Lin-c-Kit+,LK细胞）增殖能力降低,抗原刺激22次后检测到明显的T细胞功能障碍。采用IL-2对T细胞及骨髓造血细胞增殖分化异常的小鼠进行干预治疗,研究IL-2治疗后骨髓造血细胞增殖及分化能力的改变。研究中,我们设立蛋白抗原强化免疫2次作为抗原短暂刺激组对照。同时设立佐剂对照组排除佐剂对T细胞及造血细胞功能的影响。（2）T细胞功能分析。通过流式细胞术、细胞因子胞内染色法检测脾脏CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ的水平;应用MHC Ⅰ类分子-抗原表位肽五聚体染色技术检测TB 10.4 4-12特异性的记忆性CD8+T细胞的数量。（3）骨髓造血细胞的功能分析。无菌分离骨髓细胞,应用EdU增殖试验检测造血细胞的增殖能力;用ELISA方法检测骨髓造血微环境中IFN-γ和IL-2的水平;磁珠分选造血细胞,并应用实时荧光定量RT-PCR检测造血细胞分化相关转录因子Batf2、IRF8、GATA2和NOTCH1的表达水平,分析抗原刺激对造血细胞分化的影响。（4）IL-2对骨髓造血细胞的治疗作用及机制分析。IL-2干预后,检测上述指标的变化,分析IL-2的治疗效果及机制。结果:（1）结核分枝杆菌抗原持续刺激对T细胞功能的影响。应用结核分枝杆菌蛋白抗原持续刺激小鼠,对细胞因子的检测发现,与抗原短暂刺激组相比,抗原持续刺激12周时,脾脏CD4+T细胞受特异性抗原刺激分泌较高水平的IFN-γ（p<0.05）,但IFN-γ在持续抗原刺激22周后下降;应用MHC抗原表位肽五聚体技术检测发现持续抗原刺激12～22周,脾脏中TB10.4 4-12特异性记忆性CD8+T细胞的数量相比抗原短暂刺激组明显减少（p<0.01）。（2）结核分枝杆菌抗原持续刺激对造血细胞功能的影响。应用结核分枝杆菌蛋白抗原持续刺激小鼠,抗原持续刺激12周时,骨髓造血微环境中IFN-γ的水平明显升高（p<0.05）,但IFN-γ在抗原持续刺激后期下降。EdU增殖试验表明,与抗原短暂刺激组相比,抗原持续刺激12周及22周后LK细胞的增殖能力降低（p<0.05）。骨髓c-Kit+的细胞群中转录因子的表达水平与佐剂对照组相比也发生了明显变化:决定髓系分化的转录因子Batf2和IRF8表达上调,而促进淋巴系细胞分化的转录因子NOTCH1表达下调。（3）IL-2的治疗作用。在给予小鼠结核分枝杆菌蛋白抗原持续刺激的同时,我们应用IL-2进行干预治疗。结果发现,IL-2干预后,骨髓造血微环境中IL-2的水平升高。相比抗原持续刺激组,IL-2处理可下调Batf2和IRF8的表达,上调GATA2和NOTCH1的表达,LK细胞的增殖能力回升（p<0.05）。同时,T细胞耗竭也得到逆转:CD4+T细胞分泌IFN-γ的水平升高（p<0.05）,脾脏TB10.4 4-12特异性记忆性CD8+T细胞的数量显着增加（p<0.05）。（4）JAK3-STAT5信号通路的研究。JAK3-STAT5信号转导通路对造血细胞分化增殖起调控作用。相比佐剂组,抗原持续刺激组中JAK3和STAT5 mRNA表达水平较低。IL-2治疗后,JAK3和STAT5表达明显增强。结论:结核分枝杆菌抗原刺激诱导IFN-γ分泌为主的Th1型免疫应答。结核分枝杆菌抗原持续刺激诱导IFN-γ水平在一定时间内增高造成骨髓LK细胞增殖能力降低,并上调髓系分化相关的转录因子Batf2和IRF8的表达;补充IL-2可增强LK细胞的增殖能力,上调淋巴系分化相关转录因子GATA2、NOTCH1的表达,维持骨髓造血的稳态。此外,IL-2上调JAK3和STAT5的表达,推测IL-2也通过上调JAK3-STAT5途径分子表达调节造血细胞的增殖分化。因此,结核分枝杆菌抗原持续刺激会影响造血作用,导致造血细胞增殖能力降低,髓系分化相关的转录因子表达增高,而IL-2治疗可维持骨髓造血的稳态。本实验首次研究了结核分枝杆菌抗原持续刺激对骨髓造血细胞发育分化的影响,揭示了结核分枝杆菌持续感染状态下结核病患者免疫功能低下的机制及骨髓造血功能的改变,为进一步研究重症肺结核的精准诊治提供了思路。粟粒性肺结核是由于大量结核分枝杆菌在短时间内进入血液循环所引起的急性全身血行播散型结核病。其病情急且凶险、病死率较高。粟粒性肺结核患者由于体内结核分枝杆菌大量感染会导致机体造血功能障碍和免疫功能低下,但相关机制尚不清楚。目的:我们推测粟粒性肺结核是由大量结核分枝杆菌入血后,诱发T细胞过强的免疫反应,产生的细胞因子进一步作用于骨髓造血细胞,影响骨髓造血细胞的发育分化,淋巴细胞生成减少,最终引起机体免疫功能降低。为验证上述假设,本实验应用卡介苗（BCG）入血感染模拟临床粟粒性肺结核感染的免疫病理变化,研究其对骨髓造血系统和免疫系统的影响。方法:首先,调取临床粟粒性肺结核患者的病例资料,分析研究粟粒性肺结核临床病例外周血血细胞数量变化,研究骨髓造血功能的变化特点;其次,应用不同剂量BCG经尾静脉注射或滴鼻的方式感染小鼠,观察T细胞功能和骨髓造血功能的变化,并分析与造血细胞分化相关转录因子表达水平的改变,评价BCG感染对骨髓造血功能的影响和免疫应答特点,建立应用BCG感染模拟粟粒性结核造血功能受损的动物模型。（1）临床病例资料分析。分析2015年至2019年兰州市肺科医院收治入院的肺结核病例28,047例,其中粟粒性肺结核病例共118例。通过回顾性分析,研究粟粒性肺结核患者外周血血细胞数量变化。（2）BCG感染及IL-2治疗程序。根据文献报道及考虑到生物安全等因素,本课题应用大剂量BCG替代结核分枝杆菌感染小鼠来模拟临床粟粒性肺结核感染,首先用大剂量BCG（5×107 CFU/ml）分别以尾静脉注射和滴鼻的方式感染小鼠,分别于感染后3周、5周和8周,检测外周血血细胞数量、T细胞功能和骨髓造血细胞（LK细胞）增殖分化能力。研究中,设立低剂量BCG（5×105 CFU/ml）滴鼻感染小鼠作为对照,同时设PBS对照组排除外界因素和年龄对T细胞和骨髓造血细胞功能的影响。（3）外周血细胞数量、血清IFN-γ的水平和脏器指数的变化。将新鲜采集的小鼠血液加入抗凝管中,通过动物血液分析仪检测不同组血细胞数量的变化。未抗凝的外周血凝固后离心收集血清,用ELISA检测血清中IFN-γ的水平;通过称量脾脏、肝脏、肺脏及小鼠重量,观察BCG感染对脾脏指数、肝脏指数和肺脏指数的影响。（4）T细胞功能分析。通过ELISA检测脾脏淋巴细胞受BCG蛋白纯化衍生物（PPD）刺激后分泌IFN-γ和IL-2的水平;应用流式细胞术检测脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞表面表达抑制性受体PD-1的水平;应用EdU增殖试验检测脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞受PPD刺激后的增殖能力。（5）骨髓造血细胞的功能分析。无菌分离骨髓细胞并对其进行磁珠分选,得到LK细胞,用EdU增殖试验检测LK细胞的增殖能力;用ELISA的方法检测骨髓造血微环境中IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6和GM-CSF的水平;提取LK细胞的总RNA,并应用实时荧光定量RT-PCR检测LK细胞中转录因子Batf2、IRF8、GATA2和NOTCH1的表达水平,分析BC G感染对LK细胞分化的影响。（6）IL-2治疗作用分析。在大剂量BCG入血感染后,应用IL-2对发生T细胞耗竭及骨髓造血细胞增殖分化异常的小鼠进行干预治疗。IL-2干预后,检测上述指标的变化,分析IL-2的治疗效果及机制。结果:（1）临床病例资料分析。我们回顾性分析了 2015年至2019年兰州市肺科医院收治的结核病病例28,047例,其中粟粒性肺结核病例共118例。根据患者外周血血细胞检测结果分析患者各类血细胞变化,发现118例粟粒性肺结核患者中89%发生淋巴细胞减少（105例）、23%发生白细胞减少（27例）、8.5%发生中性粒细胞减少（10例）、49.2%发生血红蛋白减少（58例）、11%发生红细胞减少（13例）、8.5%发生血小板减少（10例）、全血细胞减少6例,占4.2%。以上数据表明粟粒性肺结核常继发淋巴细胞减少,其次可继发白细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少等各类血细胞减少症。（2）BCG感染对外周血血细胞数量和脏器指数的影响。在BCG感染后5周,与PBS组相比,大剂量BCG尾静脉注射组小鼠外周血白细胞、淋巴细胞和血小板减少,小鼠脾脏指数、肝脏指数和肺脏指数明显升高,提示脾脏、肝脏和肺脏明显肿大。（3）BCG感染对T细胞功能的影响。在BCG感染后3周、5周和8周,与PBS组、低剂量BCG滴鼻组和高剂量BCG滴鼻组相比,高剂量BCG尾静脉注射组脾脏CD8+T细胞明显高表达抑制性受体PD-1（p<0.05）。EdU增殖试验表明:低剂量BCG滴鼻组脾脏CD8+T细胞增殖能力明显强于其他组;相对于PBS组、低剂量BCG滴鼻组和高剂量BCG滴鼻组,高剂量BCG尾静脉注射组脾脏CD8+T细胞的增殖能力明显降低（p<0.05）。ELISA检测脾脏淋巴细胞受特异性抗原PPD刺激分泌IFN-γ和IL-2的水平,结果如下:在3-5周时高剂量BCG尾静脉注射组较低剂量BCG滴鼻组及PBS组产生较高水平的IFN-γ（p<0.05）,8周后产生IFN-γ的能力明显降低;在感染3-5周低剂量BCG感染组产生IL-2的水平高于PBS组和高剂量BCG尾静脉注射组（p<0.05）。（4）BCG感染对骨髓造血细胞功能的影响。在BCG感染后3周,高剂量BCG尾静脉注射组LK细胞增殖能力明显高于PBS组（p<0.01）,随后逐渐降低。骨髓上清液中细胞因子的变化如下:在BCG感染后5周,相比PBS组,高剂量BCG尾静脉注射组产生较高水平的IFN-γ和TNF-α（p<0.05）,IL-2、IL-6和GM-CSF的水平无明显变化,但低剂量BCG滴鼻组IL-2、IL-6和GM-CSF明显增高（p<0.05）。高剂量BCG尾静脉注射组骨髓LK细胞群中转录因子的表达水平与PBS对照组相比也发生了明显变化:髓系分化相关的转录因子Batf2和IRF8表达上调,而淋巴系分化相关的转录因子GATA2和NOTCH1表达下调。（5）IL-2的治疗作用。在大剂量BCG入血感染小鼠后,用IL-2进行干预治疗。结果发现,IL-2干预后,T细胞耗竭得以逆转。结论:回顾性分析临床粟粒性肺结核患者的病例资料,结果发现粟粒性肺结核患者会出现淋巴细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少等造血功能受损表现,和文献报道一致。应用小鼠模型研究发现,大剂量BCG入血感染可致外周血淋巴细胞和血小板减少,诱导骨髓造血微环境中细胞因子IFN-γ和TNF-α的水平增高,导致骨髓LK细胞增殖能力降低,并上调髓系分化相关的转录因子Batf2和IRF8的表达,下调淋巴系分化相关转录因子GATA2和NOTCH1的表达,最终导致T细胞耗竭。补充IL-2后T细胞耗竭有所逆转。本研究结合临床病例资料和动物实验研究,从骨髓造血细胞发育分化的角度揭示粟粒性肺结核免疫功能低下的机制及骨髓造血功能的改变,为粟粒性肺结核防治提供了参考。T细胞发育分化过程需要糖酵解和氧化磷酸化提供能量,尤其是效应T细胞的糖酵解代谢更为活跃。上一章研究我们发现大剂量BCG入血感染会使T细胞过度活化,导致T细胞耗竭的发生。我们推测抑制糖酵解,减轻T细胞的活化,有可能阻断T细胞耗竭的发生。糖酵解也是肿瘤代谢的重要特征。我们实验室前期通过蛋白质组学筛选到宫颈癌组织高表达糖酵解酶烯醇化酶1（ENO1）。用ShRNA干扰沉默ENO1基因的表达可明显降低宫颈癌Hela和SiHa细胞的成瘤能力及侵袭转移能力,说明抑制ENO1表达可以阻断糖酵解,从而起到治疗肿瘤的作用。目的:虽然应用shRNA干扰ENO1表达可抑制肿瘤生长,但RNA干扰技术受到病毒载体和运输系统的限制。为了促进临床应用,本课题拟制备ENO1的单克隆抗体,进一步研究其抗肿瘤作用。此外,前两章的研究发现结核分枝杆菌抗原持续刺激和大剂量BCG入血感染会导致T细胞功能低下甚至耗竭,如何扭转耗竭对于结核病防治有重要意义。细胞代谢变化可决定T细胞功能,因而细胞代谢被认为是T细胞功能和分化的关键调节因子。本研究制备ENO1的单克隆抗体,后期将进一步通过干预T细胞代谢,研究治疗T细胞耗竭的新方法和策略。方法:本课题拟用真核表达系统表达ENO1蛋白,纯化ENO1蛋白,制备ENO1单克隆抗体。预期ENO1的单克隆抗体通过干扰肿瘤细胞表面ENO1可以降低肿瘤细胞迁移侵袭能力。我们筛选有较强抗宫颈癌SiHa细胞迁移侵袭能力的ENO1单克隆抗体。对编码ENO1单克隆抗体的基因进行测序,将其可变区基因序列重组构建在腺相关病毒上。后续我们将对腺相关病毒表达抗体可变区蛋白多肽的功能进行鉴定,对ENO1单克隆抗体对糖酵解的抑制作用展开深入研究。（1）ENO1的克隆、表达和纯化方案一:以pET30a-ENO1质粒为模板,将ENO1基因克隆入真核表达载体pcDNA中,构建重组质粒pcDNA3.1-ENO1,并将pcDNA3.1-ENO1以瞬时转染的方式成功转入人胚肾细胞（HEK-293T细胞）中,表达出ENO1蛋白,并用Ni-NTA介质进行纯化。方案二:将pcDNA3.1-ENO1以稳定转染的方式成功转染入中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1细胞）中,表达和纯化ENO1蛋白。方案三:将ENO1基因克隆入杆状病毒表达载体pFastBac1中,转入昆虫细胞Sf9中,表达和纯化ENO1蛋白。（2）ENO1单克隆抗体的制备。用ENO1蛋白反复免疫BALB/c小鼠,取出抗体滴度较高的小鼠脾脏细胞,与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。对阳性杂交瘤细胞进行反复筛选,获得效价较高的杂交瘤细胞株,诱导腹水产生,纯化得到ENO1单克隆抗体。（3）ENO1单克隆抗体的抗肿瘤作用评价。采用细胞划痕实验和Transwell小室实验检测五个ENO1单克隆抗体对宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭能力的影响,筛选出效果最佳的ENO1单克隆抗体。（4）ENO1单克隆抗体可变区基因测序。分别提取五株杂交瘤细胞的RNA,通过RT-PCR获得相应的cDNA。基于抗体重链和轻链恒定区的已知序列设计3’-末端基因特异性引物,联合5’-末端的通用引物用于cDNA基因的PCR扩增,通过对扩增产物进行测序,获得ENO1单克隆抗体重链和轻链可变区基因序列。（5）腺相关病毒包装ENO1抗体的可变区基因。选择对宫颈癌细胞的迁移、侵袭能力有明显抑制效果的ENO1单克隆抗体H1的轻链和重链可变区基因,中间用Linker--（GGGGS）3连接,克隆在pAAV-MCS载体上,由公司合成,简称rAAV-H1。对AAV辅助病毒系统中的pHelper、pAAV-RC和rAAV-H1菌液进行复苏、保种和扩增,并大量抽提质粒,将其转染入AAV-293细胞中,观察其转染效率、收集病毒并进行滴度测定。同时,将带有绿色荧光蛋白的pAAV-IRES-ZsGreen1转入AAV293细胞中,作为空载体对照（rAAV-GFP）。结果:（1）ENO1蛋白表达与纯化。首先将pcDNA3.1-ENO1以瞬时转染的方式成功转染入HEK-293T细胞中,表达纯化ENO1蛋白,但蛋白得率太低;将pcDNA3.1-ENO1以稳定转染的方式成功转染入CHO-K1细胞中,表达纯化目的蛋白,同样蛋白得率太低;最后将ENO1基因克隆入pFastBac1中,转入Sf9细胞中,蛋白表达量高,纯化出高纯度的ENO1蛋白。（2）ENO1单克隆抗体制备。ENO1蛋白免疫小鼠后,通过杂交瘤技术成功筛选到5株效价较高的阳性杂交瘤细胞株,纯化获得相应的单克隆抗体。（3）ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移、侵袭作用的影响。应用细胞划痕实验和Transwell小室实验,初步评价5个ENO1单克隆抗体的抗肿瘤细胞迁移、侵袭作用。检测结果示五个ENO1单克隆抗体对宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭能力均有抑制作用,其中H1的抑制作用最强。（4）ENO1单克隆抗体可变区基因测序。在得到单克隆抗体的基础上,利用通用引物从杂交瘤细胞的RNA钓取抗体的重链和轻链可变区基因,对获得的抗体可变区基因进行测序,成功获得可变区基因序列。（5）腺相关病毒包装ENO1抗体的可变区基因。将得到的ENO1抗体重链和轻链可变区基因构建在腺相关病毒载体上,得到rAAV-H1。大量抽提得到浓度较高的pHelper、pAAV-RC和rAAV-H1质粒,将其转染入AAV293细胞中,结果示转染成功,且转染效率达到90%。结论:应用杆状病毒表达载体,成功表达和纯化出高纯度的ENO1蛋白;应用ENO1蛋白免疫小鼠,通过杂交瘤技术成功制备和筛选到5个高效价的ENO1单克隆抗体;通过ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞的迁移、侵袭能力的抑制作用评价,筛选出有明显抑制效果的ENO1单克隆抗体H1;成功获得ENO1单克隆抗体的可变区基因序列。将ENO1抗体的可变区基因重组到腺相关病毒载体上,得到rAAV-H1。ENO1单克隆抗体的制备和相关研究为下一步研究ENO1单克隆抗体抑制糖酵解抗肿瘤和T细胞耗竭作用奠定了基础。
张宇,黄建芳,徐萌,王宏,向军俭[2]（2018）在《FGF2人源化单抗E12及其联合顺铂/紫杉醇体外抑制乳腺癌细胞增殖作用的研究》文中研究指明目的:研究人源化FGF2单抗体E12体外联合化疗药物抑制乳腺癌肿瘤细胞增殖的作用。方法:分析人源化FGF2单抗可变区人源氨基酸序列比率;SDS-PAGE和HPLC检测单抗纯度;ELISA测定单抗效价;BSA法检测单抗浓度;CCK-8法检测单抗联合化疗药物对乳腺癌肿瘤细胞株的细胞增殖抑制作用;流式细胞术检测FGF2单抗联合化疗药物对乳腺癌细胞株的促凋亡作用;使用Discovery Studio 4.5软件对单抗的表位进行分析。结果:单抗可变区人源氨基酸序列比率重链为98.89%,轻链为100.00%;单抗纯度为99.02%;单抗ELISA效价为1/243 000;单抗浓度为8.74 mg/ml;CCK-8结果表明顺铂为10、5、2.5、0.625μg/ml时,单抗+顺铂组比顺铂组对MCF-7细胞抑制率提高了14.5%、10.4%、1.5%、0.5%;对MDAMB453细胞抑制率提高了15.5%、14.8%、13.0%、6.8%,紫杉醇为1.0、0.1、0.01μg/ml时,单抗+紫杉醇组比紫杉醇组对MCF-7细胞抑制率提高了14.5%、11.1%、9.3%,紫杉醇为0.1、0.01、0.001μg/ml时,单抗+紫杉醇组比紫杉醇组对MDAMB453细胞的抑制率提高了18.6%、19.9%、6.8%;流式结果表明,单抗、紫杉醇及单抗+紫杉醇组的MCF-7细胞在Annexin V/PI双阳性区所占比例提高了6.13%、7.36%和12.83%,同理MDA-MB453细胞所占比例提高了4.86%、7.1%和14.1%,单抗、顺铂及单抗+顺铂组MCF-7细胞在Annexin V/PI双阳性区所占比例提高了6.39%、9.46%和17.76%,同理MDA-MB453细胞所占比例提高了5.38%、9.06%和19.39%;表位分析结果表明FGF2单抗有效封闭FGF2与受体结合的部分位点。结论:FGF2人源单抗E12人源化程度较高;FGF2人源化单抗联合化疗药物相对单药组可较明显地提高肿瘤细胞增殖抑制作用以及促细胞凋亡作用;本研究为FGF2抗体药物研发提供了前期基础。
张宇[3]（2018）在《人源化FGF2单抗E12及其联合化疗药物体外抑制乳腺癌MCF7和MDA-MB453细胞增殖作用的研究》文中研究说明目的:对已获人源化FGF2单克隆抗体E12进行特性分析与鉴定;研究人源化FGF2单抗E12单独及联合顺铂和紫杉醇对乳腺癌细胞株MCF-7以及MDAMB453的细胞增殖抑制及促细胞凋亡作用;并分析人源化FGF2单抗E12生物学活性的分子机制。方法:1.对已获人源化FGF2单克隆抗体E12的人源化改造情况进行统计分析,使用SDS-PAGE和HPLC对单抗纯度进行分析,并用间接ELISA对单抗的效价进行检测,使用BCA法对人源化单抗的蛋白浓度进行检测;2.通过CCLE数据库分析肿瘤细胞株MDA-MB453和MCF7的FGF2以及FGFR基因的表达量;3.MTT法检测肿瘤细胞株MDA-MB453和MCF7对FGF2的敏感性,CCK8法检测FGF2单抗单独及联合化学治疗药物顺铂与紫杉醇对乳腺癌细胞株MDAMB453以及MCF-7的细胞增殖抑制作用;4.使用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染,检测FGF2单抗单独及联合化学治疗药物顺铂与紫杉醇对乳腺癌细胞株MDA-MB453以及MCF-7的促凋亡作用;5.使用Discovery Studio软件分析抗体的表位和FGF2的生物活性位点,通过比较两者的重合区域来对FGF2单抗生物学活性的分子机制进行解释,并对抗原抗体结合界面上的氨基酸进行虚拟突变,筛选到对结合起到重要贡献的氨基酸以及可能增加抗体亲和力的氨基酸突变组合。结果:1.抗人FGF2人源化抗体E12抗体可变区人类抗体氨基酸序列来源比率为重链达到98.89%,轻链达到了100%,SDS-PAGE和HPLC的纯度鉴定表明,抗体的纯度达到99.02%,ELISA检测则表明人源化单抗效价为0.004μg/ml,BCA法检测表明人源化单抗的浓度为8.74mg/ml;2.FGF2/FGFR1基因m RNA表达量在两株细胞中均为相对平均值高表达,FGF2对两株肿瘤细胞株均具有促进生长的作用,人源化FGF2单抗在浓度为500μg/ml时,对MCF-7的抑制率为32%,对MDA-MB453的抑制率为37%。顺铂浓度分别为0.625,2.5,5,10,μg/ml时,单抗顺铂联合组比顺铂单独组对MCF-7抑制率分别提高了14.5%,10.4%,1.5%,0.5%。对MDA-MB453抑制率分别提高了15.5%,14.8%,13.0%,6.8%。紫杉醇浓度分别为1.0,0.1,0.01,μg/ml时,单抗紫杉醇联合组比紫杉醇单独组对MCF-7抑制率分别提高了14.5%,11.1%,9.3%。紫杉醇浓度分别为0.1,0.01,0.001,μg/ml时,单抗紫杉醇联合组比紫杉醇单独组对MDAMB453细胞的抑制率分别提高了18.6%,19.9%,6.8%;3.流式细胞仪检测结果表明,与空白对照组相比,使用FGF2单抗,紫杉醇单独处理以及FGF2单抗+紫杉醇的联合组处理的MCF-7细胞在Annexin V/PI双阳性区域所占比例分别提高了6.13%,7.36%,12.83%,使用FGF2单抗,顺铂单独处理以及FGF2单抗+顺铂的联合组处理的MCF-7细胞在Annexin V/PI双阳性区域所占比例分别提高了6.39%,9.46%,17.76%,使用FGF2单抗,紫杉醇单独处理以及FGF2单抗+紫杉醇的联合组处理的MDA-MB453细胞在Annexin V/PI双阳性区域所占比例分别提高了4.86%,7.1%,14.1%,使用FGF2单抗,顺铂单独处理以及FGF2单抗+顺铂的联合组处理的MDA-MB453细胞在Annexin V/PI双阳性区域所占比例分别提高了5.38%,9.06%,19.39%。4.FGF2与FGF2单抗E12可变区同源建模结构的分子对接成功预测了L:ASN28,H:VAL38等氨基酸为抗体的表位。晶体结构分析鉴定了FGF2:HIS16等氨基酸为FGF2的生物活性部位。两者比较发现具有9个氨基酸重合部位。抗原抗体结合位点氨基酸的丙氨酸扫描确定了H:GLY111Y,H:GLY113等氨基酸为抗原抗体结合的重要氨基酸,后续的饱和突变确定了L:TYR38>TYRL,ASP114>ASP等突变组合可以作为提高抗体亲和力的候选突变。
刘斌[4]（2018）在《猪口蹄疫O型复合表位蛋白疫苗生产工艺研究》文中提出口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease,FMD）是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。2010年2月和2011年3月,O型缅甸98（Mya98）系和“新一轮”泛亚（PanAsia-1）系传入我国后迅速扩散,对我国养殖业和农村经济发展造成了巨大影响。我国防控FMD采取免疫与扑杀相结合的综合措施,免费对所用家畜进行灭活疫苗强制免疫,但因FMDV本身免疫原性弱,免疫持续期短,存在生物安全隐患,不利于FMD的净化等因素的限制,使得FMD防控工作很难开展。因此,更多的学者将目光投入了FMD基因工程疫苗的研究。本研究是将实验室构建的猪O型FMD基因工程菌进行工业化放大的生产工艺研究,通过检验对各个工艺流程进行效果评价,建立一套成熟、稳定的猪FMD O型复合表位蛋白疫苗的生产工艺流程。将保存菌种进行形态、酶切、目的蛋白表达及Western blot鉴定。分别从诱导条件、培养基、接种量、pH、补料方式等因素进行优化,使单位体积内培养液获得最大菌体数量。采用浊度法测量发酵液的光密度,计算菌体重量,来分析各个优化参数的效果。结果显示:发酵培养最适培养时间为8h,诱导时间为8h,诱导温度为37℃;培养基中最适磷酸盐浓度为100mmol/L,微量元素溶液为1mL/L;最适接种量为5%,pH为7.07.2,装液量30%;采用变指数-恒pH混合流加补料,补料液为氨水、甘油,其中甘油较葡萄糖更利于目的产物的获得。采用中空纤维系统对菌体进行收集,高压均质机不同压力对菌体进行破碎,对比破碎效果,将收集的包涵体通过裂解进行了亲和层析纯化,用不同浓度的咪唑进行洗脱,确定最佳的咪唑洗脱浓度为100 mM。分别选取不同温度、不同稀释速度对收集的纯化蛋白进行复性,通过检验复性后蛋白质的活性、浓度,确定最佳复性条件。最后进行过滤除菌分装。将获得的抗原样品进行无菌检验,通过BCA法检验蛋白浓度约为1 mg/mL,通过凝胶法检验蛋白内毒素含量小于50 EU/mL,利用间接血凝法检验蛋白活性为1:1024,表达产物经SDS-PAGE分析蛋白分子量为25.5ku,采用Image Lab软件分析蛋白纯度90%以上,Western Blot方法检测结果显示,转移至硝酸纤维素膜上与牛FMDV阳性血清反应,具有良好的反应性。参照现有口蹄疫灭活疫苗乳化工艺,选用ISA 206和ISA 201 VG油佐剂,分别用4.6:5.4、1:1、5.4:4.6的水相和油相比例进行乳化,制备疫苗。于28℃保存15个月,分别于第3、6、9、12、15个月取样,进行疫苗物理性状检验,并进行效力对比。结果显示:疫苗水相和油相最佳配制比例为1:1。疫苗的外观、剂型、稳定性和黏度均符合产品的质量要求,两种油佐剂制备的乳剂均能诱导免疫猪产生1:64以上的抗体,ISA 201 VG佐剂疫苗免疫猪产生抗体水平高于ISA 206油佐剂,ISA 201 VG佐剂各免疫剂量组均获得全保护。
李卓[5]（2017）在《人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定》文中研究说明肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）是一种以发热、出血、急性肾功能损害为特征的急性传染病,通常由汉坦病毒（Hantaviruses,HTV）感染引起,在世界范围内广泛分布,中国是世界上发病人数最多的国家,而陕西省为我国HFRS的高发地区之一。长期以来,我国通过对重点疫区人群进行疫苗接种预防HFRS的发生,因此需要对HFRS疫苗的免疫效果进行定期评价。抗汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）抗体特别是中和抗体（neutralizing antibody,NAb）可直接与HTNV结合,参与机体对病毒的免疫清除。鼠源性抗体因为异源性反应很难应用于人体,目前很少有人源性抗体用于HFRS的紧急预防和治疗,因此,制备具有潜在中和活性的人源性抗体十分必要。本研究在评价了HFRS抗体检测试剂盒和疫苗接种者免疫接种效果的基础上,建立了疫苗接种者的B淋巴母细胞系（Blymphoblastoid cell lines,BLCLs）。将NAb阳性的疫苗接种者和HFRS患者的BLCLs抗体基因重组到噬菌体载体上,建立噬菌体Fab抗体库,筛选HTNV特异性抗体和中和活性抗体,经表达、纯化和鉴定获得了具有潜在中和活性的人源性抗HTNV Fab抗体,为HFRS的紧急预防、治疗以及疾病的诊断提供新的途径。为此,我们进行了以下实验:第一部分:HFRS疫苗接种者和患者BLCLs的建立、筛选和克隆化首先,基于HTNV抗体检测的需要,评价了国产与进口HFRS IgG抗体ELISA试剂盒的性能,结果表明国产试剂盒敏感性高,进口试剂盒特异性强。然后,采集疫苗接种者的血液标本,应用EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）转化技术建立了70株疫苗接种者BLCLs,检测了疫苗接种者的血清标本和BLCLs培养上清中HTNV特异性抗体,评价了咸阳地区HFRS疫苗接种的免疫效果。疫苗接种人群血清中HTNV核蛋白（nucleocapsid protein,NP）特异的IgM、IgG抗体以及HTNV NAb的水平和阳性率明显升高,三者具有较好的相关性;最强烈的抗体分泌反应发生在接种疫苗后3个月,与血清检测结果一致,表明针对HFRS的疫苗免疫接种计划在中国西北地区人群中可以有效地诱导体液免疫应答。最后,明确了NAb阳性的BLCLs（占44%）并对BLCLs进行了克隆化,NAb阳性的35株BLCLs（HFRS疫苗接种者与科室保存的患者BLCLs）为构建具有潜在中和活性的噬菌体抗体库提供基因资源;BLCLs的成功克隆化有望为单克隆抗体制备开辟新的途径。第二部分:抗HTNV噬菌体Fab抗体库的构建和筛选提取NAb阳性BLCLs的mRNA并合成cDNA,应用噬菌体展示技术建立了库容量为1.3×109的抗HTNV噬菌体Fab抗体库,Fab的阳性插入率为95%,抗体序列正确率为68%。以HTNV全抗原为靶分子,用固相筛选法经过4轮“吸附-洗脱-扩增”,对洗脱的噬菌体滴度进行测定,结果显示回收率明显增加。筛选前随机克隆测序正确率为68%,第4轮筛选后随机克隆测序正确率为81%;筛选前多样性为95%,第4轮筛选后多样性为31%。经Phage-ELISA检测,最终从第3、4轮筛选的50个克隆中选出了15个序列正确的特异性强的HTNV噬菌体Fab抗体。通过此部分实验,我们成功构建了抗HTNV噬菌体Fab抗体库并对其进行了筛选。第三部分:人源性抗HTNV Fab抗体的可溶性表达和中和活性检测将第二部分筛选获得的特异性HTNV Fab噬菌体转染Ecoli.HB2151,诱导表达制备可溶性HTNV Fab抗体,并应用亲和层析法进行纯化。表达及纯化产物经还原电泳检测分析,发现在约25kDa处出现明显目的条带,与Fab的预期大小相符。间接ELISA表明这些可溶性HTNV Fab抗体均能与HTNV特异性结合。病毒中和实验结果显示3个Fab抗体具有中和活性。测序分析了15个Fab抗体轻链和重链可变区氨基酸序列,结果表明这些Fab抗体分属于6个抗体家族,大多数轻链和重链属于V3和V4家族,以IGKV3-20*01、IGHV4-59*01家族为主。同源性分析显示,3个具有中和活性的Fab抗体基因序列来自人胚系基因,未发现与其完全相同的抗体基因序列。第四部分:HTNV感染巨噬样人急性单核细胞白血病细胞系（differentiated THP-1,dTHP-1）诱导内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ER stress）反应HTV感染机体后可诱导强烈的免疫应答,但其致病机制尚未明确,我们从ER stress的角度,初步观测了HTNV感染对dTHP-1内质网应激的影响。检测结果显示HTNV感染dTHP-1细胞后,其内质网应激标志性分子葡萄糖调节蛋白（78kDa glucose-regulated protein,GRP78）的mRNA和蛋白水平、X盒结合蛋白1（X box-binding protein 1,XBP-1）的mRNA水平均明显升高,表明HTNV感染可以诱导dTHP-1启动ER Stress。而在病毒感染后2h,C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）的mRNA水平在病毒感染组与未感染组无明显差异;凋亡检测结果显示,HTNV感染dTHP-1 12h后细胞未发生明显凋亡;这些结果提示HTNV诱导的ER Stress在病毒感染早期（12h内）并未直接导致dTHP-1凋亡。
黄宇晨[6]（2017）在《鸡柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原AMA1蛋白亲和肽筛选及其抗球虫作用研究》文中研究说明鸡球虫是严重危害养禽业的病原体之一,导致养禽业经济损失巨大。尽管饲料添加药物的方式对球虫病的防控发挥了重要的保障作用,但随着鸡球虫抗药性、药物残留等一系列问题的产生,迫切需要寻找新的药物靶标分子从而开发新型药物。对疟原虫和弓形虫等寄生原虫的研究已经表明,顶复门原虫的顶膜抗原1（AMA1）是颇具应用前景的药物靶标。疟原虫、弓形虫等在侵入宿主细胞的过程中,AMA1发挥重要作用。但目前关于鸡柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）子孢子顶膜抗原1（Et AMAl）的功能的相关报道较少。本研究探索了Et AMA1胞外域重组蛋白（Ecto AMA1）亲和配体在球虫感染中的抑制作用。1. 以纯化并复性的原核重组Ecto AMA1蛋白为靶蛋白,利用噬菌体十二肽库对其进行四轮生物淘选。从第四轮洗脱物中随机选出30个噬菌体蓝斑,扩增后提取其核苷酸序列并测序,进而推导出多肽序列。结果显示:对靶分子进行四轮筛选后,得到5种亲和力较高的十二肽。选取高亲和力的两条多肽序列进行合成,命名为L肽和C肽,即为LPSYPGYYQITI（L）和CWTISLFGGVTQ（C）。间接ELISA结果表明,所合成两多肽与重组Ecto AMA1蛋白及Et AMA1蛋白均能够特异性结合。竞争ELISA结果表明,抗Ecto AMA1重组蛋白多克隆抗体能够抑制亲和噬菌体与重组Ecto AMA1的结合。2.对L肽和C肽体外抑制子孢子入侵细胞能力进行评价。首先用MTT法检测L、C两多肽对MDBK细胞的最大无毒浓度,确定最大无毒浓度为125μg/m L。使用pecoll梯度离心法纯化E.tenella子孢子,得到较为纯净的E.tenella子孢子,用CFDA-SE荧光探针标记纯化后的子孢子,利用标记有绿色荧光的子孢子（3×105个/孔）入侵MDBK（铺板量1×105个/孔）细胞10h,流式细胞仪检测多肽L、C分别在浓度为25μg/m L、50μg/m L、75μg/m L、100μg/m L、125μg/m L时抑制子孢子入侵的作用。结果表明:L肽及C肽对子孢子入侵MDBK细胞均具有一定的抑制作用。在不同浓度梯度下L肽作用均显着或极显着高于C肽（P<0.05或P<0.01）。3.对L肽和C肽体内抗球虫感染作用进行评价。1日龄雏鸡40只随机分为4组,每组10只,分别为PBS组、L肽处理组、C肽处理组以及攻虫对照组。21日龄时,L组、C组、攻虫对照组鸡每只口服感染1×104个E.tenella卵囊,在感染后02天（子孢子繁殖期）,L组口服L肽对应阳性噬菌体,每只每天1×1012 pfu;C组口服C肽对应噬菌体,每只每天1×1012pfu。攻虫后第8天剖杀全部鸡只,检测鸡增重变化、盲肠病变计分、盲肠眼观病变及病理组织病变、OPG及ACI等评价指标。结果显示:L组、C组各项指标均显着优于攻虫对照组（P<0.05）,L组与C组相比,L组各项指标均稍优于C组。PBS组、L组、C组、攻虫对照组抗球虫指数分别为200、164.45、153.64、119.45。4.应用Swiss-Model软件对Et AMA1进行三维模建。利用Autodock 4.2软件分别对L肽与Et AMA1、C肽与Et AMA1进行分子对接分析,研究Et AMA1在空间上与L肽和C肽结合方式。结果显示:同源建模评分达90分以上,模型结果合理可靠。L肽、C肽的氨基酸与Et AMA1活性中心氨基酸间均存在分子间氢键作用力与疏水作用力,L、C肽在空间上均能够与Ecto AMA1良好结合。综上,本实验结果表明,筛选出的两个Ecto AMA1重组蛋白亲和配体可以与Et AMA1良好结合,能够抑制E.tenella子孢子入侵宿主细胞并在抗球虫感染中起到一定的保护作用。研究为基于Et AMA1的鸡球虫病相关多肽疫苗研制提供了参考。
饶春明[7]（2016）在《我国重组药物质量控制技术体系的建立和应用研究》文中研究指明为确保生物技术药物安全和有效,国家食品药品监督管理总局发布了一系列法规和指南,中国食品药品检定研究院建立了有效的重组药物质量控制技术体系。笔者简要回顾生物技术制药领域重要发展阶段和我国重组药物研究开发情况,详细介绍我国30年来重组药物质量控制技术体系的建立和应用情况,内容包括:质量标准研究依据及法规要求,《中国药典》三部重组药物质量标准以及新版药典对重组药物质量控制的相关要求;1986年以来国家科技课题对中检院生物技术药质量控制技术体系的支持以及相关重组药物质量标准及其各类检定方法如生物学活性测定、蛋白含量测定、理化分析与蛋白结构鉴定、纯度与杂质测定等方法的建立与应用情况;生物学活性测定和含量测定国家标准品的研究建立以及用于肽图分析和等电点测定用的重组药物理化对照品质量标准建立和鉴定;2001年以来由重组药物室完成的包括注册检验、进口检验、抽验检验、委托检验、合同检验等各类生物技术药检验共计5 920批次检验报告结果分析。
赵一蓉[8]（2016）在《新型融合蛋白Pro-SIRPα的构建及生物学活性研究》文中指出跨膜糖蛋白CD47,属于免疫球蛋白超家族的一种跨膜蛋白,广泛表达于多组织细胞表面,如红细胞、血小板、淋巴细胞、肝细胞及肿瘤细胞等。其生理功能多样,参与细胞与胞外基质的相互作用,与细胞凋亡、增殖、迁移等细胞学过程关系密切并且参与肿瘤免疫逃逸的机制。目前,CD47这一靶点已用于研究治疗多种疾病如白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤及其他实体瘤。信号调节蛋白α（SIRPα,signal regulatory protein-α）,作为免疫球蛋白超家族膜蛋白的成员之一,是SIRP家族中一个典型的抑制性受体。其特异性的表达于髓系细胞如巨噬细胞、树突状细胞,以及神经细胞膜表面。CD47是SIRPα的天然配体,CD47-SIRPα信号通路在多种生理机制中发挥作用。其中,以在体内巨噬细胞吞噬过程中发挥的作用为最有特征性的。当巨噬细胞表面的SIRPα在与肿瘤细胞表面的CD47分子结合后,会介导“Don’t eat me”的信号,使肿瘤细胞免于巨噬细胞的吞噬,发生免疫逃逸,进而导致肿瘤进展。然而,在正常血液系统细胞表面也会有少量的CD47表达,CD47-SIRPα信号通路参与红细胞吞噬过程的调节,也一定程度上参与血小板及淋巴细胞的调节。因而,传统的抗CD47抗体类药物都会引起一定程度的血液系统副作用,从而影响靶向CD47抗体药物的临床应用前景。针对这一问题,本研究构建了可在肿瘤部位特异性释放封闭肽的高亲和力新型融合蛋白pro-SIRPα,并对其生物学活性进行了研究。首先利用噬菌体表面展示肽库技术筛选得到与突变型信号调节蛋白SIRPα-cv1活性区特异性结合的短肽（12肽）,作为封闭肽（masking peptide）降低SIRPα-cv1与CD47的结合亲和力,从而减少SIRPα-cv1与非肿瘤部位的CD47结合的可能,减少“抗原沉默”（antigen sink effect）现象的发生。然后,通过含有尿激酶（uPA）酶切位点的柔性多肽linker将封闭肽连接在SIRPα-cv1融合蛋白的氨基末端（N-端）,构建为完整的pro-SIRPα。在肿瘤微环境下,linker在uPA酶的作用下水解,释放前端短肽,暴露pro-SIRPα与CD47的结合位点,从而起到竞争性结合CD47的作用,有效抑制肿瘤的进展。体外实验中,本研究通过竞争ELISA验证了pro-SIRPα前端封闭肽是否具有封闭效应。实验结果表明:由于氨基端封闭肽的存在,pro-SIRPα与CD47的结合能力显着下降。而用肿瘤微环境中富含的uPA酶水解后,pro-SIRPα氨基末端的linker断裂,使得封闭肽脱离并暴露出完整的SIRPα-cv1,恢复与CD47的结合能力。因此,由于封闭肽的存在,新型融合蛋白pro-SIRPα对肿瘤组织的特异性得到了明显的提高,减少了其与正常血液系统细胞的结合,降低了潜在的血液毒性以及可能引起的抗原沉默（antigen sink effect）现象。此外,本研究还证实,与单独应用抗EGFR的单抗相比,uPA处理后的pro-SIRPα与抗EGFR-单抗联用可显着增强巨噬细胞对A431肿瘤细胞的吞噬作用。靶向阻断肿瘤部位的CD47-SIRPα信号通路,可有效促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。而pro-SIRPα的研制可能为肿瘤靶向治疗提供新的策略。
杨宁[9]（2016）在《抗COX-2人源单链抗体的作用机制研究》文中认为COX-2（Cyclooxygenase-2）是催化花生四烯酸转化为前列腺素类物质的关键限速酶,它参与了机体的许多病理生理过程,如促进肿瘤的发生发展,促进血管生成,促进炎症进程,增强肿瘤细胞的耐药性等。因此,COX-2已经成为肿瘤治疗的靶点。由于针对COX-2的抑制剂在临床应用中会有严重的毒副作用,所以亟待建立以COX-2为靶点的靶向、安全、高效的肿瘤治疗的新策略。而单链抗体凭借其高亲和力、高特异性、组织穿透力强、免疫原性小等优点,已经在临床上以多种形式被应用,在肿瘤诊断和治疗中具有独特的优势。本实验室在前期研究的基础上,已经成功制备了能在体内外特异性结合COX-2,并抑制其生物学活性的人源单链抗体,内质网滞留型的抗COX-2胞内单链抗体有效抑制肿瘤细胞的生长增殖、迁移、体外侵袭能力,并且能够促进肿瘤细胞的凋亡。但是对于抗COX-2单链抗体与COX-2分子间相互识别、相互作用的分子机制尚不清楚。因此本研究利用噬菌体环七肽库筛选技术、同源建模与分子对接等方法对COX-2和单链抗体之间的相互作用关键位点进行预测分析,主要结果如下:1.我们利用大肠杆菌BL21和HB2151分别成功表达纯化了纯度达95%以上的具有较好活性的COX-2和抗COX-2单链抗体;2.温度梯度ELISA实验发现,COX-2与抗COX-2人源单链抗体的结合活性随着处理COX-2的温度升高而下降,当温度达到100℃时,抗原蛋白完全丧失了与抗体结合的活性,这说明100℃时,COX-2蛋白的空间构象已经完全被破坏,不再具有与单链抗体结合的能力,进而表明抗COX-2人源单链抗体识别的COX-2的表位为构象表位;3.以抗COX-2人源单链抗体为靶蛋白,经过连续4轮的环七肽库筛选,获得了 36个能够与抗COX-2人源单链抗体蛋白特异性结合的噬菌斑克隆。将36个克隆的DNA连入pMD-18T载体中,通过测序,共得到了 19个有效小肽序列;4.小肽序列经分析得到三个模拟位（KRTMREN、PGA和TSKG）,发现三个模拟位分别与COX-2上的511-537、514-527和521-533位氨基酸具有高度的同源性。鉴于这些模拟位在位置上具有部分重合,我们根据这些模拟位得出模拟表位肽序列KRPTMEGASKGN,这个基序与COX-2上511-537位的氨基酸具有高度同源性。所以我们推测,KRPTMEGASKGN可能参与COX-2的表位形成,在抗COX-2单链抗体与COX-2相互识别中发挥重要作用;5.小肽的同源建模及与单链抗体的分子对接实验表明,部分小肽能够与单链抗体的VH和VL的CDR区93-98、160-162、182-186、228-232位氨基酸结合,而这些小肽序列中包含了我们筛选到的三组基序,这进一步支持了我们筛选的模拟表位KRPTMEGASKGN可能参与COX-2的表位形成的推测;6.将模拟表位肽基序与COX-2酶活性部位的关键氨基酸进行比对发现,我们获得的模拟表位肽序列中包含COX-2酶活性关键部位上的部分氨基酸,因此我们推测抗COX-2人源单链抗体通过与这些关键位点相互作用,进而抑制COX-2的活性。综上所述,我们通过噬菌体环七肽库筛选结合计算机模拟方法预测了 COX-2与单链抗体相互作用的表位,初步推测抗COX-2单链抗体抑制COX-2功能的可能机制,这为以COX-2为靶点的抗体肿瘤治疗奠定了分子基础。
武艳[10]（2015）在《抗Cyclin D1胞内抗体的抑瘤效应及其分子机制研究》文中研究说明肝细胞癌（HCC）是在世界范围内最普遍,致死率位居第二的恶性肿瘤,严重危害人类的健康,目前尚缺乏有效治疗手段。我国是肝癌的高发区,而且肝癌的发病率也在逐年递增,因此寻求有效肝癌防治策略的研究具有重要的科学价值和社会意义。肝癌一般是由肝炎病毒引起的慢性肝炎和肝硬化转化而来,并且在病变过程中常伴随CyclinD1的过表达,促进CDK4的活化,促进肝细胞增殖。Cyclin D1基因的过度表达与包括肝癌在内的多种肿瘤的发生、发展、预后密切相关,已确定为一种重要的癌基因,是肿瘤治疗的重要靶点。单链抗体是具有抗原结合活性的小抗体片段。具有分子小,易于进入组织细胞,免疫原性小,易于大量生产和工程修饰等特点,具有较好的应用前景。尤其是新兴的胞内抗体技术通过对scFv的N端或C端进行修饰后可以特异性地干扰或阻断细胞内重要靶蛋白的活性和功能,使得单链抗体显现出巨大的应用潜能。本实验室前期工作中以Cyclin D1为靶点,筛选到了能特异性结合Cyclin D1蛋白的人源单链抗体AD9,并且采用胞内抗体技术,制备了基于AD9内质网滞留型抗Cyclin D1胞内抗体ER-ADκ。研究发现,内质网滞留型抗Cyclin D1胞内抗体,能在细胞内结合并抑制CyclinD1活性,抑制乳腺癌等肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡,抑制肿瘤细胞迁移。但该胞内抗体能否有效抑制肝癌细胞的增殖,目前尚不清楚。另外该抗体是如何与抗原相互作用,进而如何改变CyclinD1的下游信号传递,抑制肿瘤细胞增殖的分子机制均有待于进一步揭示。为此,本论文就抗CyclinD1胞内抗体的肝癌生长抑制效应及其分子机制开展了相关研究,取得如下结果:首先通过细胞实验和动物模型实验,探究内质网滞留型抗CyclinD1胞内抗体的体内外抑制肝癌生长和增殖效应。结果表明,ER-ADκ能有效结合细胞内的CyclinDl蛋白,引起HepG2细胞周期G1/S期阻滞,诱导HepG2细胞的凋亡,并且pBg-ER-ADK治疗后显着抑制裸鼠异体移植瘤体的生长。其次通过噬菌体随机肽库筛选、计算机模拟结合突变验证实验分析,确定抗原抗体相互作用模式及关键氨基酸,揭示抗原抗体相互作用的分子基础。噬菌体随机肽库筛选确定的模拟表位与Cyclin D1的29-33,93-96,111-114位氨基酸具有高度同源性,Cyclin D1缺失突变体实验表明,AD9与Cyclin D1的相互作用表位分布在N-末端1-120位氨基酸之间。并且通过计算机辅助的同源建模和分子对接发现抗原抗体相互作用的关键氨基酸为Asn24,Lys33,Lysl12,Met113,Lys114,Glu115,这些位点的定点突变也证明除Glu115外,其余氨基酸位点均参与了 Cyclin D1与AD9的结合,并且Lys112在其中担任着极其重要的作用。由此,我们猜测ER-ADκ抑制细胞增殖可能是通过阻碍Cyclin D1通过Lys112与CDK4的结合实现的。最后通过肿瘤细胞内抗原抗体相互作用分析,验证关键氨基酸及关键分子的作用,初步提出抗Cyclin D1胞内抗体抑制肿瘤细胞增殖的分子机制。HepG2细胞的免疫共沉淀实验结果表明,ER-ADκ能抑制Cyclin D1与CDK4的结合,降低pRB蛋白的磷酸化水平,实时定量PCR结果显示,ER-ADκ的表达下调CDK1,CDK4,IL-6,gp130,Bcl-2,c-Met,survivin等促进细胞增殖的相关基因的表达水平,并上调p21,p27,p53等抑制细胞增殖的相关基因的mRNA水平。综上所述实验结果,ER-ADκ通过与Cyclin D1的结合抑制CDK4的结合和激酶活性,抑制pRB的招募和磷酸化,从而影响下游一系列细胞增殖调控基因表达水平的改变,抑制肝癌细胞的生长和增殖。本项研究为以Cylin D1为靶点的抗Cyclin D1胞内抗体肿瘤临床治疗提供了实验依据。
二、重组人纽表位肽12生物学活性测定方法的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组人纽表位肽12生物学活性测定方法的研究（论文提纲范文）
（1）结核分枝杆菌抗原致骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究暨烯醇化酶-1单克隆抗体制备与作用初步研究（论文提纲范文）
| 缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 结核病与免疫耗竭 |
| 1.1.2 T细胞免疫耗竭 |
| 1.1.3 骨髓造血干细胞及其增殖分化调节 |
| 1.1.4 分枝杆菌感染可影响造血干细胞的分化 |
| 1.1.5 造血干细胞功能障碍与T细胞耗竭 |
| 1.1.6 选题思路 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料和仪器 |
| 1.2.2 实验对象 |
| 1.2.3 实验方法 |
| 1.2.3.1 BCG的培养 |
| 1.2.3.2 SDS-PAGE蛋白电泳相关试剂配制及方法 |
| 1.2.3.3 蛋白抗原制备 |
| 1.2.3.4 结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓造血细胞增殖分化异常模型的建立 |
| 1.2.3.5 IL-2对骨髓造血细胞增殖分化异常的干预治疗 |
| 1.2.4 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 BCG的培养 |
| 1.3.2 蛋白抗原的制备 |
| 1.3.3 结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓造血细胞增殖分化异常模型的检测结果 |
| 1.3.3.1 结核分枝杆菌抗原持续刺激致脾脏抗原特异性CD4~+T细胞分泌IFN-γ水平降低 |
| 1.3.3.2 结核分枝杆菌抗原持续刺激致TB10.4 _(4-12)特异性的记忆性CD8~+T细胞数量减少 |
| 1.3.3.3 结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓LK细胞增殖能力下降 |
| 1.3.4 IL-2对骨髓造血细胞增殖分化异常的治疗作用 |
| 1.3.4.1 IL-2治疗使脾脏抗原特异性CD4~+ T细胞分泌IFN-γ水平升高 |
| 1.3.4.2 IL-2治疗使TB10.4 _(4-12)特异性的CD8~+记忆性T细胞数量增加 |
| 1.3.4.3 IL-2治疗后骨髓LK细胞的增殖能力回升 |
| 1.3.4.4 结核分枝杆菌抗原持续刺激和IL-2治疗后,骨髓造血细胞转录因子的变化 |
| 1.3.4.5 结核分枝杆菌抗原持续刺激和IL-2治疗后,骨髓造血微环境中细胞因子的变化 |
| 1.3.4.6 结核分枝杆菌抗原持续刺激和IL-2治疗后,JAK3和STAT5的表达上调 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 应用结核分枝杆菌抗原持续刺激模拟结核分枝杆菌感染引起的免疫病理损伤 |
| 1.4.2 骨髓造血细胞的表型鉴定 |
| 1.4.3 骨髓造血细胞与T细胞互相作用 |
| 1.4.4 结核分枝杆菌抗原持续刺激对细胞因子IFN-γ和IL-2分泌的影响 |
| 1.4.5 IFN-γ对骨髓造血干细胞的调节作用 |
| 1.4.6 IL-2对骨髓造血干细胞的调节作用 |
| 1.4.7 不同结核分枝杆菌抗原诱导T细胞耗竭的能力不同 |
| 1.4.8 骨髓造血细胞增殖分化异常与T细胞耗竭的关系 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 粟粒性肺结核的临床病例分析和BCG感染诱导骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.1.1 粟粒性肺结核与骨髓造血功能障碍 |
| 2.1.2 分枝杆菌感染与造血干细胞分化 |
| 2.1.3 细胞因子网络对造血干细胞增殖分化的调节作用 |
| 2.1.4 选题思路 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料和仪器 |
| 2.2.2 实验对象 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.3.1 BCG感染动物模型的建立 |
| 2.2.3.2 IL-2对大剂量BCG入血感染小鼠的干预治疗 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 病例分析 |
| 2.3.2 BCG感染动物模型免疫检测结果 |
| 2.3.2.1 大剂量BCG入血感染致白细胞、淋巴细胞和血小板减少 |
| 2.3.2.2 大剂量BCG入血感染致小鼠脾脏、肺脏和肝脏肿大 |
| 2.3.2.3 大剂量BCG滴鼻感染致脾脏CD4~+T细胞表面高表达PD-1 |
| 2.3.2.4 大剂量BCG入血感染致脾脏CD8~+T细胞表面高表达PD-1 |
| 2.3.2.5 大剂量BCG滴鼻感染致脾脏CD4~+T细胞增殖能力增强 |
| 2.3.2.6 大剂量BCG入血感染致脾脏CD8~+T细胞增殖能力降低 |
| 2.3.2.7 BCG感染对外周血血清中IFN-γ的影响 |
| 2.3.2.8 BCG感染对脾脏T细胞分泌细胞因子的影响 |
| 2.3.2.9 BCG感染对骨髓LK细胞增殖能力的影响 |
| 2.3.2.10 BCG感染对骨髓造血微环境中细胞因子水平的影响 |
| 2.3.2.11 BCG感染对骨髓LK细胞转录因子表达的影响 |
| 2.3.3 IL-2治疗大剂量BCG入血感染动物模型的效果评价 |
| 2.3.3.1 IL-2治疗可降低脾脏CD8~+T细胞PD-1的表达 |
| 2.3.3.2 IL-2治疗可增强脾脏T细胞的增殖能力 |
| 2.3.3.3 IL-2治疗可部分逆转骨髓LK细胞的增殖能力 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 临床粟粒性肺结核的血液学变化 |
| 2.4.2 BCG感染途径和剂量对T细胞及骨髓造血功能的影响 |
| 2.4.3 BCG感染模型与临床粟粒性肺结核感染 |
| 2.4.4 BCG感染后骨髓造血微环境细胞因子的变化与骨髓造血细胞增殖分化异常 |
| 2.4.5 BCG感染后骨髓造血细胞增殖能力改变 |
| 2.4.6 后续研究计划 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 糖酵解酶ENO1单克隆抗体制备及其作用初步研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.1.1 糖代谢 |
| 3.1.2 烯醇化酶1(ENO1)与糖代谢 |
| 3.1.3 ENO1与肿瘤 |
| 3.1.4 ENO1与宫颈癌 |
| 3.1.5 单克隆抗体的制备 |
| 3.1.6 腺相关病毒(AAV) |
| 3.1.7 选题思路 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料和仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 重组质粒pcDNA3.1-ENO1的构建 |
| 3.2.2.2 PcDNA3.1-ENO1在HEK-293T细胞中的表达和纯化 |
| 3.2.2.3 PcDNA3.1-ENO1转染CHO-K1细胞 |
| 3.2.2.4 PFastBac1-ENO1的构建 |
| 3.2.2.5 ENO1蛋白的表达和纯化 |
| 3.2.2.6 ENO单克隆抗体制备 |
| 3.2.2.7 ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移侵袭能力的抑制作用 |
| 3.2.2.8 杂交瘤细胞RNA提取 |
| 3.2.2.9 ENO1单克隆抗体可变区基因测序 |
| 3.2.2.10 腺相关病毒载体包装ENO1单抗可变区基因 |
| 3.2.3 统计学处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 重组质粒pcDNA3.1-ENO1的构建 |
| 3.3.2 PcDNA3.1-ENO1在HEK-293T细胞中的表达和纯化 |
| 3.3.3 PcDNA3.1-ENO1转染CHO-K1细胞 |
| 3.3.4 ENO1基因在杆状病毒表达载体中的克隆、表达和纯化 |
| 3.3.5 ENO1单克隆抗体的制备 |
| 3.3.6 ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移侵袭能力的抑制作用 |
| 3.3.7 ENO1单克隆抗体单克隆抗体可变区基因测序 |
| 3.3.8 腺相关病毒包装ENO1单克隆抗体可变区基因 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 真核表达系统的选择 |
| 3.4.2 单克隆抗体的制备及测序 |
| 3.4.3 ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移侵袭能力的抑制作用 |
| 3.4.4 腺相关病毒载体的应用 |
| 3.4.5 后续研究计划 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成果 |
| 致谢 |
（2）FGF2人源化单抗E12及其联合顺铂/紫杉醇体外抑制乳腺癌细胞增殖作用的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 细胞株 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 FGF2单抗人源化改造情况分析 |
| 1.2.2 人源化单抗E12的纯度鉴定 |
| 1.2.3 间接ELISA检测E12与FGF2的结合活性 |
| 1.2.4 BCA法检测E12的蛋白浓度 |
| 1.2.5 CCK-8法检测E12对乳腺癌细胞株的细胞增殖抑制作用 |
| 1.2.6 CCK-8法检测E12联合化疗药物对乳腺癌细胞株的细胞增殖抑制作用 |
| 1.2.7 流式细胞术检测E12联合化疗药物诱导乳腺癌细胞株的凋亡 |
| 1.2.8 E12的生物信息学表位分析 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 FGF2单抗E12人源化改造情况统计 |
| 2.2 人源化单抗E12的纯度鉴定 |
| 2.3 间接ELISA检测FGF2人源化单抗E12与FGF2的结合活性 |
| 2.4 BCA法测定人源化FGF2单抗E12的蛋白浓度 |
| 2.5 CCK-8法检测E12对乳腺癌细胞株的细胞增殖抑制作用 |
| 2.6 CCK-8法检测FGF2单抗E12联合化疗药物对乳腺癌细胞株的细胞增殖抑制作用 |
| 2.7 流式细胞术检测FGF2单抗E12联合化疗药物诱导乳腺癌细胞株的凋亡 |
| 2.8 FGF2人源化单抗E12的生物信息学表位分析 |
| 3 讨论 |
（3）人源化FGF2单抗E12及其联合化疗药物体外抑制乳腺癌MCF7和MDA-MB453细胞增殖作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 FGF2,FGF2 受体与结合伴侣以及其信号通路 |
| 2 FGF2 在肿瘤发生与发展中的作用 |
| 3 FGF2 在实体和血液肿瘤中的作用及其临床预后价值 |
| 4 单克隆抗体与抗体药物 |
| 5 FGF2 单抗抑制肿瘤 |
| 6 FGF2 单抗联合化疗抗肿瘤研究进展 |
| 7 计算辅助治疗性抗体的人源化 |
| 8 分子对接技术与抗原抗体识别表位的预测 |
| 9 研究目的及意义 |
| 10 技术路线 |
| 第一部分 人源化抗人FGF2 单抗E12 的特性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂和材料 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 主要溶液的配置 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 鼠源FGF2 单抗E12 的人源化改造情况统计 |
| 2.2 SDS-PAGE和 HPLC对人源化FGF2 单抗E12 的纯度进行鉴定 |
| 2.3 ELISA检测FGF2 人源化抗体与鼠源抗体的效价 |
| 2.4 BCA法测定人源化FGF2 单抗的蛋白浓度 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 FGF2 人源化单抗E12 及其联合化疗药物体外抑制乳腺癌细胞的增殖作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂和材料 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 主要溶液的配置 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CCLE数据库查询MCF-7,MDA-MB453 细胞的FGF2,FGFR1 表达量 |
| 2.2 MCF-7,MDA-MB453 细胞对于FGF2 的敏感性 |
| 2.3 FGF2 单抗E12 单独抑制肿瘤细胞MCF-7,MDA-MB453 增殖 |
| 2.4 顺铂单独抑制肿瘤细胞MCF-7,MDA-MB453 增殖 |
| 2.5 紫杉醇单独抑制肿瘤细胞MCF-7,MDA-MB453 增殖 |
| 2.6 FGF2 单抗E12 与顺铂联合抑制肿瘤细胞MCF-7,MDA-MB453 增殖 |
| 2.7 FGF2 单抗E12 与紫杉醇联合抑制肿瘤细胞MCF-7,MDA-MB453 增殖 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 FGF2 人源化单抗E12 及其联合化疗药物诱导乳腺癌细胞的凋亡作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂和材料 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 主要溶液的配置 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 流式细胞仪检测FGF2 单抗联合顺铂诱导MCF-7 细胞株的凋亡 |
| 2.2 流式细胞仪检测FGF2 单抗联合紫杉醇诱导MCF-7 细胞株的凋亡 |
| 2.3 流式细胞仪检测FGF2 单抗联合顺铂诱导MDA-MB453 细胞株的凋亡 |
| 2.4 流式细胞仪检测FGF2 单抗联合紫杉醇诱导MDA-MB453 细胞株的凋亡 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 FGF2 单抗E12 生物信息学表位分析及生物学活性的机理解释 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器设备 |
| 1.2 分析方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 FGF2 同源建模同源性最高模板的搜索结果 |
| 2.2 FGF2 同源建模模型与模型合理性评价 |
| 2.3 FGF2 人源化单抗E12 可变区同源建模模型与模型合理性评价 |
| 2.4 抗原抗体分子对接结果 |
| 2.5 抗体表位的分析结果 |
| 2.6 FGF2 分子生物活性部位的鉴定 |
| 2.7 抗体生物学活性的机理解释 |
| 2.8 抗原抗体复合物丙氨酸扫描结果 |
| 2.9 抗原抗体复合物单点饱和突变结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 总结与展望 |
| 1 全文总结 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词 |
| 攻读硕士期间参加会议及发表论文 |
| 致谢 |
（4）猪口蹄疫O型复合表位蛋白疫苗生产工艺研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 口蹄疫基因工程疫苗研究进展 |
| 1 口蹄疫的历史及分布 |
| 2 口蹄疫的危害 |
| 3 口蹄疫基因工程疫苗研究进展 |
| 3.1 传统疫苗现状 |
| 3.2 口蹄疫基因工程疫苗研究进展 |
| 3.2.1 基因工程亚单位疫苗 |
| 3.2.2 病毒活载体疫苗 |
| 3.2.3 基因缺失疫苗 |
| 3.2.4 合成肽疫苗 |
| 3.2.5 核酸疫苗 |
| 3.2.6 病毒样颗粒疫苗 |
| 3.2.7 表位疫苗 |
| 3.2.8 标记疫苗 |
| 4 基因工程疫苗生产工艺 |
| 4.1 高密度发酵工艺 |
| 4.1.1 培养基 |
| 4.1.2 pH值 |
| 4.1.3 温度 |
| 4.1.4 溶解氧 |
| 4.1.5 诱导条件 |
| 4.1.6 接种量 |
| 4.1.7 补料 |
| 4.2 蛋白质纯化 |
| 4.2.1 细菌的收集 |
| 4.2.2 包涵体的分离 |
| 4.2.3 包涵体的溶解 |
| 4.2.4 纯化 |
| 4.2.5 复性 |
| 5 研究展望 |
| 第二章 猪口蹄疫O型复合表位蛋白菌种的鉴定及培养条件的优化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌种 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 仪器与设备 |
| 1.1.4 溶液的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 BL21-FMDV-B4的鉴定 |
| 1.2.2 细菌的培养 |
| 1.2.3 分析方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 BL21-FMDV-B4的鉴定 |
| 2.1.1 BL21-FMDV-B4形态鉴定 |
| 2.1.2 BL21-FMDV-B4酶切鉴定 |
| 2.1.3 BL21-FMDV-B4蛋白表达、Westernblot鉴定 |
| 2.2 BL21-FMDV-B4生长曲线 |
| 2.3 诱导条件的优化 |
| 2.3.1 IPTG诱导时机的优化 |
| 2.3.2 IPTG诱导时间的优化 |
| 2.3.3 IPTG诱导温度的优化 |
| 2.4 培养基的优化 |
| 2.4.1 起始培养基中磷酸盐浓度的优化 |
| 2.4.2 微量元素混合溶液用量的确定 |
| 2.5 发酵条件的优化 |
| 2.5.1 接种量的优化 |
| 2.5.2 培养基初始pH值的优化 |
| 2.5.3 装液量的优化 |
| 2.5.4 补料条件的优化 |
| 2.5.5 流加甘油对菌体生长的影响 |
| 3 讨论 |
| 第三章 猪口蹄疫O型复合表位蛋白的分离、纯化及检验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌种 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 仪器与设备 |
| 1.1.4 溶液的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 菌体的收集 |
| 1.2.2 菌体的洗涤 |
| 1.2.3 菌体的破碎 |
| 1.2.4 包涵体的清洗 |
| 1.2.5 包涵体的溶解 |
| 1.2.6 B4蛋白的亲和层析纯化 |
| 1.2.7 B4蛋白的复性 |
| 1.2.8 B4蛋白的除盐与浓缩 |
| 1.2.9 B4蛋白的无菌检验 |
| 1.2.10 B4蛋白的浓度检验 |
| 1.2.11 B4蛋白的纯度检验 |
| 1.2.12 B4蛋白的内毒素检验 |
| 1.2.13 B4蛋白的活性检测 |
| 1.2.14 B4蛋白的Westernblot检验 |
| 2 结果 |
| 2.1 菌体的破碎结果 |
| 2.2 不同浓度咪唑洗涤结果 |
| 2.3 不同条件复性结果 |
| 2.4 B4蛋白无菌、浓度检验结果 |
| 2.5 B4蛋白的纯度检验 |
| 2.6 B4蛋白内毒素检验 |
| 2.7 B4蛋白活性检验 |
| 2.8 B4蛋白的WesternBlot检验 |
| 3 讨论 |
| 第四章 BL21-FMDV-B4抗原不同佐剂乳化配比及效力试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒种及抗原 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.1.4 仪器与设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 水相和油相配制比例 |
| 1.2.2 疫苗乳化 |
| 1.2.3 物理性状检验 |
| 1.2.4 不同油佐剂乳化效力对比 |
| 1.2.5 疫苗乳化 |
| 1.2.6 效力检验 |
| 1.2.7 血清抗体的制备 |
| 1.2.8 O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 水相和油相不同配比物理性状检验结果 |
| 2.1.1 外观 |
| 2.1.2 剂型 |
| 2.1.3 稳定性 |
| 2.1.4 黏度 |
| 2.2 不同油佐剂效力对比 |
| 2.2.1 疫苗攻毒结果 |
| 2.2.2 抗体检测结果 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 导师简介 |
（5）人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 汉坦病毒概述 |
| 2 汉坦病毒人工制备抗体研究进展 |
| 3 病毒感染与内质网应激 |
| 第一部分 HFRS疫苗接种者和患者BLCLs的建立、筛选和克隆化 |
| 实验一 国产与进口人HFRS IgG抗体ELISA检测试剂盒的性能比较 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 利用EBV转化技术建立HFRS疫苗接种者BLCLs |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 中国西部地区人群HFRS疫苗接种后的抗体反应 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 具有潜在中和活性的HTNV噬菌体抗体库的构建及筛选 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 人源性抗HTNV Fab抗体的可溶性表达及中和活性的检测 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 HTNV感染巨噬样人急性单核白血病细胞（dTHP-1）诱导内质网应激（ER stress）反应的初步探讨 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（6）鸡柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原AMA1蛋白亲和肽筛选及其抗球虫作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 鸡球虫病简介 |
| 1.1.1 鸡球虫的分类 |
| 1.1.2 鸡球虫病的临床表现及危害 |
| 1.1.3 鸡球虫的生活史 |
| 1.2 顶复门原虫顶体膜抗原1（AMA1）研究进展 |
| 1.2.1 弓形虫、疟原虫AMA1的研究进展 |
| 1.2.2 鸡柔嫩艾美耳球虫AMA1研究进展 |
| 1.3 噬菌体展示技术研究进展 |
| 1.3.1 噬菌体展示技术的原理 |
| 1.3.2 噬菌体展示技术的应用 |
| 1.4 分子模拟方法简介 |
| 1.4.1 同源建模 |
| 1.4.2 分子对接 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物和虫种 |
| 2.1.2 菌种与细胞株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 标准参照物 |
| 2.1.5 主要仪器与设备 |
| 2.1.6 主要溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 EctoAMA1重组蛋白的纯化与复性 |
| 2.2.2 利用噬菌体随机十二肽库筛选EctoAMA1蛋白亲和配体 |
| 2.2.3 结合克隆的特征鉴定 |
| 2.2.4 亲和噬菌体氨基酸序列推导与合成 |
| 2.2.5 ELISA检测亲和噬菌体与重组EctoAMA1蛋白及虫体EtAMA1蛋白结合情况 |
| 2.2.6 体外检测两多肽抑制E. tenella子孢子入侵细胞的作用 |
| 2.2.7 体内检测两多肽阳性噬菌体抗球虫保护作用 |
| 2.2.8 利用同源模建和分子对接分析Et AMA1与L肽、C肽的结合 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组EctoAMA1蛋白的纯化与复性 |
| 3.2 噬菌体十二肽库对EctoAMA1重组蛋白亲和配体的生物淘选 |
| 3.2.1 噬菌体十二肽库对Ecto AMAl重组蛋白的四轮淘洗 |
| 3.3 多肽的亲和力检测 |
| 3.3.1 亲和噬菌体与EctoAMA1结合情况的ELISA检测 |
| 3.3.2 EctoAMA1多抗竞争抑制亲和噬菌体与EctoAMA1重组蛋白结合 |
| 3.3.3 虫体EtAMA1蛋白与亲和噬菌体结合的ELISA检测 |
| 3.4 L、C两多肽对E.tenella子孢子入侵的体外抑制作用 |
| 3.4.1 E.tenella子孢子的纯化 |
| 3.4.2 多肽浓度的选择 |
| 3.4.3 EctoAMA1多克隆抗体抑制E.tenella子孢子入侵MDBK细胞 |
| 3.4.4 多肽对E.tenella子孢子入侵MDBK细胞的抑制 |
| 3.5 L、C两多肽体内抑制E.tenella子孢子入侵分析 |
| 3.5.1 体重增重变化 |
| 3.5.2 感染球虫后盲肠病变计分 |
| 3.5.3 卵囊排出减少率 |
| 3.5.4 抗球虫指数ACI |
| 3.5.5 盲肠病理组织学变化 |
| 3.6 同源建模与分子对接分析L、C两多肽与EtAMA1的结合情况 |
| 3.6.1 同源建模 |
| 3.6.2 分子对接 |
| 4 讨论 |
| 4.1 EctoAMA1亲和肽的筛选与鉴定 |
| 4.2 体外评价两个亲和肽抑制E.tenella子孢子入侵细胞的能力 |
| 4.3 体内评价亲和噬菌体抑制E.tenella子孢子入侵细胞的能力 |
| 4.4 利用同源建模和分子对接分析L、C两多肽与EtAMA1的结合 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（7）我国重组药物质量控制技术体系的建立和应用研究（论文提纲范文）
| 1 质量标准研究依据及法规要求 |
| 2 质量标准及其检定方法研究建立 |
| 3 标准品研究及对照品鉴定 |
| 4 重组药物历年检验结果分析 |
| 5 问题与展望 |
（8）新型融合蛋白Pro-SIRPα的构建及生物学活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 一、新型融合蛋白pro-SIRPα的设计 |
| （一）酶联免疫吸附法筛选噬菌体表面展示肽库 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| （二）竞争性ELISA法筛选具有竞争性结合能力的12肽 |
| 1、实验材料 |
| 2、试验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 二、新型融合蛋白pro-SIRPα的构建表达 |
| （一）重组表达载体的构建、酶切鉴定和测序 |
| 1、实验材料 |
| 2、试验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| （二）重组蛋白的表达，酶切与纯化 |
| 1、实验材料 |
| 2、试验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 三、新型融合蛋白pro-SIRPα的体外活性研究 |
| （一）竞争性ELISA验证与CD47的亲和性 |
| 1、实验材料 |
| 2、试验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| （二）pro-SIRPα联用抗EGFR-IgG1单抗的肿瘤细胞吞噬实验 |
| 1、实验材料 |
| 2、试验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 CD47-SIRPα信号通路在吞噬功能及免疫系统领域的研究进展 |
| 一、SIRPα与CD47的简介 |
| （一）SIRPα简介 |
| （二）CD47简介 |
| 二、CD47-SIRPα信号通路的功能 |
| （一）调节巨噬细胞的吞噬作用 |
| 1、对成熟红细胞的吞噬作用 |
| 2、对移植造血干细胞的吞噬作用 |
| 3、对肿瘤细胞的吞噬作用 |
| （二）调节免疫系统的作用 |
| 1、调节树突状细胞及T细胞在次级淋巴器官中的平衡 |
| 2、调节自身免疫性疾病的进展 |
| 三、结语 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（9）抗COX-2人源单链抗体的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 COX-2的基本特性 |
| 1.1.1 COX-2基因的结构组成及表达调控 |
| 1.1.1.1 COX-2基因的结构组成 |
| 1.1.1.2 COX-2的转录水平调节 |
| 1.1.1.3 COX-2的转录后调节 |
| 1.1.1.4 COX-2的翻译后调节 |
| 1.1.2 COX-2的蛋白结构 |
| 1.1.3 COX-2的催化机制 |
| 1.2 COX-2的生理作用 |
| 1.2.1 COX-2与炎症 |
| 1.2.2 COX-2与肿瘤 |
| 1.2.3 COX-2与血管生成 |
| 1.3 COX-2抑制剂 |
| 1.3.1 COX-2抑制剂的发展 |
| 1.3.2 COX抑制剂的研究现状 |
| 1.4 单链抗体的研究进展 |
| 1.4.1 单链抗体的制备 |
| 1.4.2 单链抗体的修饰 |
| 1.4.3 单链抗体的应用前景 |
| 1.5 抗原-抗体相互作用分析 |
| 1.5.1 抗原表位 |
| 1.5.2 噬菌体展示技术预测抗原表位 |
| 1.5.3 计算机模拟在抗原表位预测中的应用 |
| 1.5.3.1 同源建模 |
| 1.5.3.2 分子对接 |
| 1.6 本论文的立题目的及意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 各种试剂的配置 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 生物学软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组人COX-2蛋白的表达纯化与活性分析 |
| 2.2.1.1 粗制包涵体的制备 |
| 2.2.1.2 粗制包涵体的洗涤与变性 |
| 2.2.1.3 目的蛋白的亲和纯化与复性 |
| 2.2.1.4 ELISA法检测重组人COX-2蛋白的活性 |
| 2.2.2 抗COX-2单链抗体的可溶性表达、纯化与活性分析 |
| 2.2.2.1 抗COX-2单链抗体的表达纯化 |
| 2.2.2.2 ELISA法检测纯化的单链抗体与COX-2的结合活性 |
| 2.2.3 温度梯度ELISA验证COX-2的表位类型 |
| 2.2.4 噬菌体随机环七肽库筛选与抗COX-2单链抗体结合的小肽 |
| 2.2.4.1 环七肽库的筛选 |
| 2.2.4.2 阳性噬菌体克隆的结合活性鉴定 |
| 2.2.4.3 环七肽序列的确定 |
| 2.2.5 计算机模拟与分子对接 |
| 2.2.5.1 抗COX-2单链抗体三维结构的同源建模 |
| 2.2.5.2 小肽构象的优化 |
| 2.2.5.3 抗COX-2单链抗体与环七肽的分子对接 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 成功制备重组人COX-2抗原蛋白 |
| 3.1.1 成功纯化了原核表达的重组人COX-2抗原蛋白 |
| 3.1.2 纯化的重组人COX-2抗原蛋白的鉴定 |
| 3.2 成功制备抗COX-2人源单链抗体 |
| 3.2.1 抗COX-2人源单链抗体的纯化 |
| 3.2.2 抗COX-2人源单链抗体的鉴定 |
| 3.3 温度梯度ELISA分析COX-2的表位类型 |
| 3.4 噬菌体随机环七肽库筛选与抗COX-2单链抗体结合的小肽 |
| 3.4.1 特异性结合单链抗体OX-1的噬菌体环七肽的筛选和富集 |
| 3.4.2 噬菌体阳性克隆的鉴定 |
| 3.4.3 噬菌体阳性克隆的序列测定 |
| 3.5 抗COX-2单链抗体特异性结合噬菌体小肽的序列分析 |
| 3.6 同源建模与分子对接 |
| 3.6.1 OX-1的同源建模 |
| 3.6.2 小肽构象的获得 |
| 3.6.3 OX-1与小肽的分子对接 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 抗COX-2单链抗体与抗原相互作用的表位预测 |
| 4.2 抗COX-2单链抗体的分子作用机制 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）抗Cyclin D1胞内抗体的抑瘤效应及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝癌的研究现状 |
| 1.2 细胞周期与Cyclin D1 |
| 1.2.1 细胞周期 |
| 1.2.2 Cyclin D1的发现及其结构特征 |
| 1.2.3 Cyclin D1的分子调控机制 |
| 1.2.4 Cyclin D1的生物学作用 |
| 1.2.5 Cyclin D1的降解 |
| 1.2.6 Cyclin D1与肿瘤 |
| 1.2.7 Cyclin D1为靶点的肝癌治疗 |
| 1.3 胞内抗体技术 |
| 1.3.1 胞内抗体技术的发展 |
| 1.3.2 胞内抗体技术的优势及应用 |
| 1.4 抗原抗体的相互作用分析 |
| 1.4.1 噬菌体展示技术与表位预测 |
| 1.4.2 计算机模拟 |
| 1.5 本论文的立题目的及意义 |
| 第二章 抗人Cyclin D1胞内抗体在体内外抑制肝癌细胞的生长和增殖 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株及质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 主要药品及试剂 |
| 2.1.4 常用试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 去内毒素质粒的提取 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 脂质体介导的瞬时转染 |
| 2.2.4 瞬时转染细胞的相关分析 |
| 2.2.5 稳定转染细胞系建立与鉴定 |
| 2.2.6 肝癌裸鼠动物模型治疗分析 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HepG2细胞中Cyclin D1的表达 |
| 2.3.2 细胞瞬时转染实验鉴定ER-ADκ在HepG2细胞中的表达 |
| 2.3.3 稳定转染细胞系的建立及ER-ADκ的体外抑瘤效应分析 |
| 2.3.4 ER-ADκ体内抑瘤效应分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 治疗肝癌的新策略 |
| 2.4.2 靶向Cydin D1的胞内抗体是肝癌治疗的潜在手段 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 抗Cyclin D1胞内抗体ER-ADK的抗肿瘤分子机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种及质粒 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 常用试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 相关蛋白质的原核表达与纯化 |
| 3.2.2 Cyclin D1与AD9相互作用的表位分析 |
| 3.2.3 Cyclin D1截短突变体的构建和验证 |
| 3.2.4 计算机模拟 |
| 3.2.5 Cyclin D1定点突变体的构建及鉴定 |
| 3.2.6 胞内抗体在肿瘤细胞内对Cyclin D1下游信号的影响 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Cyclin D1与AD9的纯化 |
| 3.3.2 ELISA分析Cyclin D1与AD9作用的表位类型 |
| 3.3.3 噬菌体随机环七肽库筛选结合单链抗体的小肽 |
| 3.3.4 Cyclin D1截短突变体验证AD9识别的模拟表位区间 |
| 3.3.5 计算机模拟 |
| 3.3.6 Cyclin D1定点突变实验回复验证抗体-抗原相互作用关键氨基酸 |
| 3.3.7 抗Cyclin D1胞内抗体抑瘤效应的可能分子机制 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 Cyclin D1与抗Cyclin D1单链抗体相互作用的分子基础 |
| 3.4.2 ER-ADκ的抑瘤机制研究 |
| 3.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、重组人纽表位肽12生物学活性测定方法的研究（论文参考文献）
- [1]结核分枝杆菌抗原致骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究暨烯醇化酶-1单克隆抗体制备与作用初步研究[D]. 李菲. 兰州大学, 2019
- [2]FGF2人源化单抗E12及其联合顺铂/紫杉醇体外抑制乳腺癌细胞增殖作用的研究[J]. 张宇,黄建芳,徐萌,王宏,向军俭. 中国免疫学杂志, 2018(08)
- [3]人源化FGF2单抗E12及其联合化疗药物体外抑制乳腺癌MCF7和MDA-MB453细胞增殖作用的研究[D]. 张宇. 暨南大学, 2018(02)
- [4]猪口蹄疫O型复合表位蛋白疫苗生产工艺研究[D]. 刘斌. 甘肃农业大学, 2018(10)
- [5]人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定[D]. 李卓. 第四军医大学, 2017(05)
- [6]鸡柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原AMA1蛋白亲和肽筛选及其抗球虫作用研究[D]. 黄宇晨. 东北农业大学, 2017(04)
- [7]我国重组药物质量控制技术体系的建立和应用研究[J]. 饶春明. 中国药学杂志, 2016(13)
- [8]新型融合蛋白Pro-SIRPα的构建及生物学活性研究[D]. 赵一蓉. 第二军医大学, 2016(05)
- [9]抗COX-2人源单链抗体的作用机制研究[D]. 杨宁. 吉林大学, 2016(01)
- [10]抗Cyclin D1胞内抗体的抑瘤效应及其分子机制研究[D]. 武艳. 吉林大学, 2015(01)