一、化疗对急性白血病患者INF-γ、IL-12表达关系的影响（论文文献综述）
刘皎皎[1]（2021）在《“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究》文中研究表明目的:采用随机对照临床试验（RCT）方法观察“补肾生髓成肝”法治疗晚期肝癌的临床疗效,并探究其改善肝癌肝再生微环境的疗效机制,为临床推广应用提供较高级别的循证医学证据。方法:1.采用随机分组法将2017年1月至2020年6月就诊于陕西省中医医院肝病科的入选晚期肝癌患者共126例,基于随机数字表法简单随机分成3组,即西医对照组42例（以下简称西医组）,采用西医综合治疗方案;补肾生髓成肝单独治疗组42例（以下简称中医组）,采用地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减治疗方案;补肾生髓成肝综合治疗组42例（以下简称中西医组）,采用西医治疗组方案基础上加上地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减。入选后有10例患者脱落（中医组6例,3例因失访脱落,3例因不能坚持治疗脱落;西医组4例,2例因异地就医不便退出,2例因不能坚持治疗脱落）,最终纳入统计分析病例资料的共116例,西医对照组（西医组）38例、补肾生髓成肝综合治疗组（中西医组）42组、补肾生髓成肝单独治疗组（中医组）36例。该研究通过湖北省中医院伦理审查,在中国临床试验注册中心（世界卫生组织国际临床试验平台一级注册机构）完成临床试验注册,注册号:Chi CTR-IOR-17011439。参与研究的患者均自愿签署了知情同意书。对比三组治疗3个月及治疗6个月的生存率及生存期,对比治疗前、治疗后3个月血常规、粪常规加潜血、肝功、血糖、血脂、肾功等指标,对比三组治疗前后的中医证候评分、生存质量评分,并对患者生存期的独立影响因素进行分析。2.依据治疗方案治疗3个月后分别收集中医组、西医组、中西组每组20名患者血清,共60份,正常人群血清18份。收集的血清-80℃冻存于陕西省中医医院肝病实验室。通过悬液芯片系统检测患者血清肝再生相关细胞因子粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony Factor,G-CSF）、肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）、干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白介素-6/8/18（Interleukin-6,IL-6,Interleukin-8,IL-8,Interleukin-18,IL-18）、血小板源性生长因子（Platelet Derived Growth Factor,PDGF-BB）、干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Nnecrosis Factor-α,TNF-α）的含量,观察体现“补肾生髓成肝”的中药对这些细胞因子的影响。结果:（1）三组患者治疗前后生存率及生存期比较:治疗3个月及6个月后,中西医组、中医组和西医组生存率比较,有统计学差异（88.10%VS72.22%VS52.63%）、（71.43%VS58.33%VS34.21%）（P<0.05）。治疗后中西医组、中西组和西医组患者生存期比较,具有统计学差异（23.86±17.55VS20.08±19.86VS15.95±16.44）（P<0.05）。（2）三组患者治疗前后肿瘤大小比较:中西医组、中医组和西医组组间比较及前后测量时间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。（3）三组患者治疗前后肝功指标比较:中西医组患者治疗后直接胆红素水平、间接胆红素水平、谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶水平较治疗前显着降低（P<0.05）,组间比较无统计学差异（P>0.05）。中医组治疗后胆碱酯酶水平较治疗前显着升高,组间比较不具有统计学意义（P>0.05）。三组患者治疗前后白蛋白水平比较,具有统计学意义（P<0.05）;两两比较,中西医组及中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（4）三组患者治疗前后其他生化指标比较:三组患者治疗后血常规指标中白细胞水平、中性粒细胞/淋巴细胞比值、血小板水平,中西医组、中医组与西医组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后肌酐水平比较,中西医组、中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（5）三组患者治疗前后中医证候评分比较:三组患者治疗前后中医证候评分以时间因素为源的主体内差异及以组别为源的主体间效应,具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后的中医证候评分均显着低于治疗前,差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组显着低于西医组的中医证候评分,差异具有统计学意义（P<0.05）。（6）三组患者治疗前后生存量表积分比较:三组患者生理机能积分方面治疗后积分均显着高于治疗前,具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组与西医组的社会功能评分比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。三组患者在生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,有统计学意义（P<0.05）,且两两组间比较后中西医组与中医组、西医组的生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）HGF表达水平比较:西医组明显高于中西医组、中医组及正常人群组,差异具有统计学意（2255.17VS1097.76VS1072.39VS882.67）（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制HGF的过度表达。（8）IL-6表达水平比较:中医组、中西医组及西医组均低于正常人群组,且组间差异具有统计学意义（5638.03VS5166.45VS12842.5VS24559.34）（P<0.05）。中西医组、中医组IL-6表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制IL-6的过度表达。（9）IL-18表达水平比较:西医组、中西医组及中医组,比较差异不具有统计学意义（120.345VS82.61VS78.58）（P>0.05）,但均较正常人群组升高（75.165）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗同样可以促进IL-18的表达。（10）PDGF-BB表达水平比较:中医组相对中西医组、西医组降低,差异不具有统计学意义（4677.18VS6140.6VS5534.885）（P>0.05）。但中医组低于西医组及中西医组,且更接近正常人群组（4401.67）。提示单用“补肾生髓成肝”可以抑制PDGF-BB的过度表达。（11）TNF-α表达水平比较:西医组、中西医组、中医组及正常人群组比较差异具有统计学意义（735.955VS244.93VS573.46VS1037.25）（P>0.05）。中西医组TNF-α表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”可以更好的抑制TNF-α的过度表达。结论:“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌能够显着提高晚期肝癌患者3个月及6个月的生存率及生存期,改善晚期肝癌患者临床症状同时,改善患者各种生化指标。明显降低晚期肝癌患者的中医证候评分,提高患者的生存质量,为临床推广应用提供了较高级别的循证医学证据。“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌患者的疗效机制之一可能是通过抑制晚期肝癌患者HGF、PDGF-BB、TNF-α、IL-6的过度表达,同时升高晚期肝癌患者IL-18的表达,改善肝癌的肝再生微环境及其相关的炎症微环境、免疫微环境、血管新生微环境等。
李美蓉[2]（2020）在《减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究》文中研究说明急性白血病发病迅猛、耐药、易复发、复发后更难治、死亡率高,是白血病死亡最常见的疾病类型。随着近几十年药物研发和风险分类管理的不断改善,儿童急性白血病治疗得到了巨大进步,然而成年尤其是老年急性白血病患者的预后仍然较差,许多患者复发后治疗失败,最终死亡。目前,急性白血病的治疗仍以化疗为主。化疗失败或疾病复发时,才考虑进行骨髓移植或造血干细胞移植。然而,化疗副作用强,耐药易复发,经常导致治疗失败和死亡。骨髓或造血干细胞移植也存在供体难寻、手术费用高昂及手术过程痛苦难耐等问题,且仍存在一定复发风险。因此寻找副作用小、疗效可靠且经济的治疗新药具有重大意义。多例急性白血病患者发生严重细菌感染后获得自发缓解的临床报道,结合目前关注度非常高的肿瘤细菌疗法,提示细菌疗法可能是治疗急性白血病的一个新方向。在多种用于肿瘤治疗研究的细菌中,沙门氏菌因其具有良好的肿瘤靶向性和抗肿瘤效果,被广泛应用于各种实体肿瘤治疗。但是沙门氏菌对血液肿瘤的治疗未见报道。经基因工程改造的减毒沙门氏菌VNP20009产生的内毒素毒力减少了5万倍,且其耐受性和安全性已在一期临床试验中得到证实,是研究细菌治疗急性白血病的理想菌株。本课题首次分别以小鼠急性淋巴细胞白血病细胞（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）L1210、人源急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞HL-60皮下移植瘤模型,和人源AML融合蛋白MLL-AF9驱动的系统性AML小鼠模型,评估了VNP20009对急性白血病的治疗效果,并探究了其可能的作用机制,主要研究内容如下:1.体外细菌-细胞共培养实验结果表明,减毒沙门氏菌VNP20009呈剂量效应和时间效应抑制多种急性白血病细胞增殖,并诱导其凋亡。2.裸鼠皮下移植瘤模型治疗实验结果表明,VNP20009能抑制急性白血病皮下移植瘤的生长。肿瘤组织苏木素&伊红染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal deoxynucleotidyl transferase（Td T）d UTP Nick-End Labeling,TUNEL）免疫荧光结果表明VNP20009能显着诱导肿瘤细胞凋亡,导致肿瘤中心区域细胞核破碎、DNA降解、胞膜解体,肿瘤组织大面积坏死。Western Blot检测肿瘤组织蛋白表明,VNP20009能显着上调促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3及Cleaved-PARP的表达,诱导急性白血病细胞凋亡。3.MLL-AF9驱动的AML模型小鼠治疗实验结果表明,VNP20009显着抑制小鼠体内AML细胞的增殖;降低AML小鼠外周血白细胞计数及其五分类数值,使其恢复至近正常生理水平;延长了AML小鼠的生存期。4.血清细胞因子与趋化因子检测及流式细胞术检测结果表明,VNP20009一方面能上调抗肿瘤因子γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）的产生,并降低粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）水平来抑制、杀伤肿瘤细胞;另一方面,显着上调分泌趋化因子C-X-C基序配体-10（C-X-C motif ligand-10,CXCL-10）和CC趋化因子配体-2（C-C motif ligand-2,CCL-2）,招募并激活自然杀伤细胞和以CD4+为主的T淋巴细胞的增殖,杀伤、抑制白血病细胞增殖。VNP20009还能进一步刺激T淋巴细胞向CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+效应T淋巴细胞极化,释放IFN-γ,进一步维持、增强机体抗肿瘤免疫力抑制白血病细胞增殖。结论:减毒沙门氏菌VNP20009能显着抑制白血病细胞的增殖,并促进其凋亡,起到治疗和延缓白血病的作用。一方面VNP20009进入机体后,能够诱导多种细胞因子和趋化因子的分泌和多种免疫细胞的增殖,增强机体抗肿瘤免疫力,抑制和杀伤白血病细胞,延长AML小鼠生存期。另一方面移植瘤组织中线粒体促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达增加,提示VNP20009感染后可能通过线粒体凋亡途径诱导急性白血病细胞凋亡。该研究为急性白血病的治疗提供一种新的策略和理论基础。
刘芹芹[3]（2020）在《树突状细胞NLRP3炎症小体及免疫失衡在急性髓系白血病作用和机制研究》文中提出急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是恶性的血液系统疾病,其特征是骨髓造血干祖细胞克隆性增生、分化异常及凋亡受阻,在外周血、骨髓内及其他组织内大量增殖及浸润。AML骨髓微环境以免疫抑制为特征,与AML的发生发展相关,可促进免疫耐受和白血病细胞免疫逃逸。近年来虽然AML的治疗方法不断改进,但是许多患者仍然出现耐药、难治及复发,长期生存及预后不容乐观。树突状细胞（dendritic cells,DCs）是机体重要的抗原提呈细胞,在机体免疫应答中发挥重要的核心作用。DCs是连接机体适应性免疫和先天性免疫重要的桥梁,具有强大的抗原提呈能力,可以“驾驭”B细胞和T细胞两种重要的免疫细胞,在机体对病原体和抗肿瘤的保护性免疫应答中发挥重要的作用。DCs可以刺激体内的T细胞产生免疫应答,并在对肿瘤细胞杀伤的免疫反应中起重要作用。DCs具有免疫调节特性可以克服骨髓的免疫耐受,增强骨髓微环境免疫并诱导抗白血病特异性T细胞的增殖。活化的T细胞能够识别AML细胞上表达的抗原,并随后介导AML细胞杀伤。可以通过DCs免疫刺激自体T细胞减少或消除残留的白血病细胞预防AML复发,因此基于DCs的免疫疗法可能在根除AML患者残留白血病细胞方面更加成功。炎症小体是参与固有免疫的主要成分之一,NLRP3炎症小体是目前为止研究最多、最透彻的。NLRP3炎症小体在感染性疾病和免疫性疾病中影响Th亚群分化,但在AML中的研究很少。NLRP3炎症小体活化后,释放IL-1β活性细胞因子,可以诱导T细胞产生并释放细胞因子IL-2,维持T细胞的存活和促进T细胞增殖。T细胞是机体抗肿瘤反应的重要免疫细胞,通过释放细胞因子和细胞毒性物质来清除白血病细胞,NLRP3炎症小体通过调节T细胞增殖和分化,最终达到调控肿瘤的作用。尽管多数AML化疗后病情会缓解,但长期生存率并不理想。免疫抑制的骨髓微环境有利于白血病细胞的生长和免疫逃逸,具有免疫调节特性的治疗可以克服免疫耐受,提高骨髓微环境的免疫力,增强肿瘤的免疫原性,改善AML的预后。因此探究AML骨髓DCs细胞NLRP3炎症小体对骨髓微环境免疫的作用,研究免疫相关基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）与AML的关系,探索骨髓微环境免疫在AML发生发展中的作用及其机制,从而进一步探索抗白血病细胞免疫治疗的方法,为AML的免疫治疗提供策略。第一部分树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病骨髓Th1亚群分化的作用及机制研究背景急性髓系白血病（AML）机体免疫功能异常在其发生发展和耐药中发挥重要作用,免疫紊乱的骨髓微环境促进了免疫耐受,有利于白血病细胞逃逸,其作用机制可能与骨髓Th亚群失衡有关。免疫细胞主要包括T细胞、B细胞和NK细胞,是骨髓微环境免疫的重要组成部分,其中T细胞中的Th细胞免疫失衡引起了研究者的高度关注。AML骨髓中T细胞增殖和产生细胞因子的能力明显降低,AML白血病细胞通过骨髓髓系来源的抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）对T细胞发挥抑制作用,或阻止T细胞进入细胞周期或分泌Th1相关细胞因子。Th1细胞参与机体细胞免疫,在细胞免疫中发挥重要作用。Th1细胞与AML发病及预后密切相关,但其分子机制尚未明确。NLRP3炎症小体是一种细胞内传感器,感受“危险”信号后将细胞因子IL-1β和IL-18前体转变成其活性形式,该信号可以是宿主或病原体。NLRP3炎症小体是参与机体免疫的多蛋白复合物,其作用机制可能与介导Th亚群分化有关。NLRP3炎症小体在肿瘤微环境中能诱导Th1、Th2、Th17细胞及CTL细胞的分化并能抑制肿瘤的免疫逃逸。AML骨髓微环境免疫失衡及功能失调可以导致白血病的发生,且与治疗后残留白血病细胞的免疫逃逸相关,免疫功能紊乱的骨髓微环境可导致AML的复发及难治。研究发现AML骨髓Th1/Th2及Th17/Treg免疫失衡参与了白血病细胞的免疫逃逸,在AML发生发展和耐药中发挥重要作用。但是,目前树突状细胞NLRP3炎症小体是否参与了 AML骨髓T细胞分化尚未明确,尤其是Th1亚群分化的机制尚待研究。研究目的本研究旨在研究Th1亚群在AML骨髓微环境中是否存在免疫失衡;探索树突状细胞NLPR3炎症小体对AML骨髓中Th1亚群分化的影响及机制;研究树突状细胞NLRP3炎症小体对Th1相关细胞因子IFN-γ水平及相关转录因子表达的影响,进而分析NLRP3炎症小体对骨髓Th1亚群分化影响的关键分子,通过对关键分子的干预观察对Th1亚群的影响,明确NLRP3炎症小体参与AML免疫失衡尤其是Th1亚群分化的作用机制。研究方法（1）临床标本收集:本研究收集来自山东大学齐鲁医院的37例AML患者、30例AML治疗完全缓解（CR）患者、23例难治复发AML患者及16例对照的骨髓液,分离骨髓单个核细胞和CD4+T细胞,留取骨髓上清。（2）Th1细胞与AML患者临床特征的关系:收集、整理AML患者白细胞计数、治疗疗效等临床资料,流式细胞术检测骨髓中Th1细胞比例,分析骨髓Th1细胞比例与临床资料的相关性。（3）IFN-γ细胞因子水平与AML患者关系:酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测骨髓上清中的IFN-γ细胞因子水平,分析与AML的临床相关性。（4）树突状细胞及CD4+T细胞培养:AML患者骨髓单个核细胞（BMMCs）用IL-4和GM-CSF诱导培养为树突状细胞,并用流式细胞术检测树突状细胞CD14、CD11c、CD80、CD83、CD86分子表达情况及诱导DCs转化率。MACS分选骨髓BMMCs中的CD4+T细胞并用流式细胞术检测分选率。（5）树突状细胞NLRP3炎症小体活化及抑制:将诱导培养的树突状细胞分成三组:①实验组（LPS+ATP,LA）:树突状细胞先用脂多糖LPS预处理6小时,然后加ATP激活45分钟;②NLRP3炎症小体抑制组:LPS处理前,LPS处理前先加入炎症小体抑制剂MCC950作用1小时（MLA）;③对照组:加入对应量的无菌PBS。检测树突状细胞NLRP3炎症小体相关分子NLRP3、ASC、IL-18、Caspase-1、IL-1β及 NF-κB 的表达情况。（6）树突状细胞NLRP3炎症对CD4+T细胞分化影响:将以上3组DCs与CD4+T细胞共培养,7天后流式细胞术检测Th1、Th2、Th17及Treg细胞比例。（7）细胞因子检测:用多细胞因子阵列检测树突状细胞培养上清液中IL-12p70、IL-10、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-2、IL-8等细胞因子水平,用ELISA方法再次检测相关细胞因子水平。（8）IL-1β对Th1细胞分化的影响:在BMDCs和CD4+T细胞共培养对照组和抑制组加入重组人IL-1β细胞因子,在实验组加入人IL-1β中和抗体,流式细胞术检测Th1细胞比例。（9）树突状细胞NLRP3炎症小体促进Th1细胞分化的方式:将树突状细胞与CD4+T细胞进行接触或用小室分离共培养,流式细胞术检测CD4+T细胞中Th1比例,ELISA方法检测DCs与CD4+T细胞共培养上清液中IFN-y及IL-1β细胞因子水平。（10）IL-1β影响Th1细胞分化的机制:将分离的CD4+T细胞分为3组:①单独加入IL-12;②IL-12联合重组人IL-1β细胞因子;③加入对应量无菌PBS,RT-PCR检测各组CD4+T细胞中IFN-γ、IFN-γ受体和STAT1的表达。（11）树突状细胞NLRP3炎症小体对体内Th1细胞分化的影响:体外培养野生型（WT）或Nlrp3-/-C57BL/6J小鼠的树突状细胞,将WT小鼠树突状细胞分为3组:①实验组:LPS和ATP处理;②抑制组:炎症小体抑制剂MCC950作用1小时后LPS和ATP处理;③对照组:加入对应量的无菌PBS。Nlrp3-/-小鼠的树突状细胞分为实验组和对照组,然后将各组DCs通过尾静脉注入WT小鼠体内,观察树突状细胞NLRP3炎症小体对小鼠Th1亚群的影响,流式细胞检测小鼠骨髓、脾脏中Th1细胞比例。（12）IL-1β对小鼠Th1细胞分化的影响:将鼠IL-1β中和抗体注射到实验组小鼠体内,观察IL-1β对小鼠体内Th1亚群影响,流式细胞检测小鼠骨髓和脾脏中Th1细胞比例。研究结果:（1）AML初诊患者骨髓中Th1细胞比例与对照组相比显着降低,治疗达CR后患者骨髓Th1细胞比例明显增高;骨髓中Th1细胞比例与AML初诊患者外周血白细胞计数呈负相关,Th1细胞比例≤10%的AML患者外周血白细胞计数明显高于Th1>10%AML患者。（2）AML初诊患者骨髓上清液中细胞因子IFN-γ水平明显低于对照组,患者治疗骨髓达CR后骨髓上清液中细胞因子IFN-γ水平升高。（3）树突状细胞培养及CD4+T细胞:流式细胞仪检测结果为树突状细胞表达CD11c,不表达CD80和CD14,少量表达CD83和CD86,DCs诱导转化率在>90%。利用CD4+MACS磁珠分选骨髓中CD4+T细胞的分离纯度>90%。（4）树突状细胞NLRP3炎症小体活化及抑制:RT-PCR检测实验组较对照组树突状细胞NLRP3炎症小体激活后caspase-1和IL-1β的表达增加,抑制组caspase-1和IL-1β的表达较实验组有降低趋势。ELISA检测实验组与对照组相比BMDCs上清液中的IL-1β水平升高,而MCC950抑制组IL-1β分泌明显较实验组降低。此外,western blot结果表明,IL-1β的活化形式IL-1β（p17）蛋白在实验组树突状细胞NLRP3炎症小体活化后表达增加。（5）树突状细胞NLRP3炎症小体对CD4+T细胞分化影响:流式细胞术检测结果显示:实验组NLRP3炎症小体激活的BMDCs促进CD4+T细胞向Th1细胞分化,而NLRP3炎症小体被MCC950抑制后促进Th1细胞分化的作用明显降低。Th2、Th17和Treg细胞比例无明显变化。（6）细胞因子检测:多细胞因子阵列检测树突状细胞培养上清液,发现实验组NLRP3炎症小体激活后上清液中的IL-1β显着升高,MCC950抑制组较实验组明显降低。用ELISA方法检测验证了 12例AML患者树突状细胞NLRP3炎症小体激活后上清中的IL-1β水平升高,而MCC950抑制后降低。（7）IL-1β对Th1细胞分化的影响:在对照组和抑制组加入重组人IL-1β细胞因子后Th1细胞比例升高,IL-1β可以促进CD4+T细胞向Th1细胞分化,并且IL-1β可逆转抑制组MCC950的抑制作用,在实验组加入人IL-1β中和抗体后Th1细胞比例降低,IL-1β中和抗体可抑制NLRP3炎症小体激活的DCs促进CD4+T细胞向Th1细胞分化的作用。（8）树突状细胞NLRP3炎症小体促进Th1细胞分化的方式:树突状细胞和CD4+T细胞无论是接触共培养还是小室分离共培养,DCs NLRP3炎症小体激活促进CD4+T细胞向Th1分化的作用是一样的,而且共培养上清液中细胞因子IFN-y和IL-1β的水平没有显着差异。（9）IL-1β影响Th1细胞分化的机制:RT-PCR检测CD4+T细胞IFN-γ、IFN-γ受体和STAT1表达在IL-1β和IL-12联合组明显升高,IL-12单独刺激或PBS组升高不明显。（10）树突状细胞NLRP3炎症小体在体内对Th1细胞分化的影响:WT小鼠树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进WT小鼠骨髓或脾脏中Th1细胞的分化,Th1细胞比例高于对照组,而抑制组MCC950可抑制这种作用。但是Nlrp3-/-小鼠树突状细胞无论在实验组还是对照组均不能促进WT小鼠中Th1细胞分化。（11）IL-1β对小鼠Th1细胞分化的影响:将鼠IL-1β中和抗体注射到实验组小鼠体内,与未注射IL-1β中和抗体的实验组小鼠相比Th1细胞比例明显降低。研究结论1.AML初诊患者骨髓Th1细胞比例及IFN-γ水平降低,且Th1细胞比例降低与白细胞计数呈负相关,提示AML骨髓微环境中存在免疫失衡。2.树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进的Th1细胞分化需要一个有功能的炎症小体,该结果为纠正AML骨髓微环境的免疫失衡提供新的研究方向。3.树突状细胞NLRP3炎症小体激活不依赖于细胞接触通过IL-1β分泌的方式促进Th1细胞分化,表明IL-1β是促进Th细胞分化的关键分子,可以通过干预IL-1β提高骨髓微环境的免疫。第二部分树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病抗白血病作用及机制的研究研究背景急性髓系白血病（AML）是一种侵袭性致命的血液系统恶性肿瘤,为成人急性白血病最常见的一种,占儿童白血病的20%。AML标准诱导化疗方案可使50%到75%的AML患者得到缓解,由于化疗耐药性克隆的出现,标准疗法通常不足以维持持久缓解,细胞遗传学不良的AML即使采用积极的化疗效果也较差,大多数患者会复发并死于自身疾病,其5年生存率约为25%。但是年龄大于65岁的患者其预后并没有得到改善,最新报道其生存率低于10%,因此,迫切需要新的治疗方案,正是在这种情况下,免疫疗法在近年来脱颖而出。近年来基于免疫的治疗方法已经使某些晚期癌症患者的生存率得到意想不到的提高。免疫疗法治疗的前提是肿瘤会抑制免疫系统,肿瘤微环境中的T细胞功能受到抑制,并且可能与AML发病有关,而且新诊断的AML患者骨髓微环境中的T细胞浸润与总生存期之间存在显着关联。使用AML/树突状细胞融合的疫苗接种可引起白血病特异性T细胞的扩增,预防疾病复发,因此新型的个性化树突状细胞疫苗是一种新的治疗方法,产生防止疾病复发的免疫记忆,具有治疗AML的潜力。通过DCs刺激可以使T细胞产生免疫应答,并在针对肿瘤杀伤的免疫应答反应中起重要作用。活化的T细胞能够识别AML细胞上表达的抗原,并随后介导对AML细胞杀伤作用。近年来,DCs作为AML免疫治疗的工具引起了人们的极大兴趣,通过DCs免疫刺激自体T细胞是一种创新策略,可减少或消除残留的白血病细胞来预防AML复发,因此基于DCs的免疫疗法可能在根除AML患者中残留白血病细胞方面更加成功。AML患者在接受相当数量的DCs治疗后,可以获得非特异性和抗原特异性的免疫效应。NLRP3炎症小体在癌症发生和发展中的作用具有争议性。NLRP3炎症小体及其成分促进了恶性肿瘤如黑素瘤、肺癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤的生长、增殖、侵袭和转移。但是,在NLRP3基因敲除动物模式中使用氧化偶氮甲烷（AOM）及葡聚糖硫酸钠（DSS）（AOM/DSS）诱发结肠癌的实验研究中,NLRP3炎症小体对癌变具有保护作用。NLRP3炎症小体在不同肿瘤中的功能也突出了炎症小体的治疗潜力。前期我们研究结果显示AML患者骨髓中Th1细胞比例降低,存在骨髓微环境免疫抑制,树突状细胞炎症小体激活可以促进CD4+T细胞向Th1细胞分化,Th1细胞效应细胞因子为IFN-γ,IFN-γ具有抗肿瘤免疫的作用,然而树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进AML骨髓Th1细胞分化对白血病细胞是否具有杀伤作用及其机制尚待研究。研究目的本研究旨在探究树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进AML骨髓Th1细胞分化是否对白血病细胞增殖和凋亡有影响;研究影响AML白血病细胞增殖和凋亡的关键分子,通过干预关键分子分析其对白血病细胞增殖和凋亡影响的机制,从而明确NLRP3炎症小体参与AML骨髓免疫促进Th1亚群分化抗白血病的作用机制。研究方法（1）树突状细胞NLRP3炎症小体对白血病细胞增殖和凋亡的影响:将AML患者BMDCs分成三组:①NLRP3炎症小体激活实验组（LA）:DCs先用脂多糖LPS预处理6小时,再加ATP作用45分钟,激活NLRP3炎症小体;②抑制组（MLA）:LPS处理前,预先加入炎症小体抑制剂MCC950作用1小时,抑制NLRP3炎症小体活性;③对照组:加入对应量的无菌PBS。用小室将CD4+T细胞与三组BMDCs共培养,共培养后的CD4+T细胞再与THP-1或U937 AML细胞系共培养,流式细胞术检测THP-1及U937白血病细胞的凋亡,用CCK-8检测细胞增殖试剂盒检测白血病细胞的增殖。（2）影响白血病细胞增殖和凋亡的机制:ELISA方法检测共培养细胞上清液中的Th1细胞主要效应细胞因子IFN-γ水平。在实验组共培养体系中加入人IFN-γ中和抗体,流式细胞术检测THP-1及U937白血病细胞的凋亡,CCK-8检测细胞增殖试剂盒检测白血病细胞的增殖,探讨细胞因子IFN-γ对影响白血病细胞的凋亡和增殖的影响。（3）树突状细胞NLRP3炎症小体对AML白血病小鼠的影响:体外培养WT或Nlrp3-/-C57BL/6J小鼠的树突状细胞,将WT小鼠树突状细胞分为3组:①激活NLRP3炎症小体实验组:LPS和ATP处理;②抑制NLRP3炎症小体抑制组:先用NLRP3炎症小体抑制剂MCC950作用1小时后LPS和ATP处理;③对照组:加入对应量的无菌PBS。Nlrp3-/-小鼠的树突状细胞分为实验组和对照组。先通过WT小鼠尾静脉注射了 MLL-AF9-GFP白血病细胞,3天后将各组BMDCs通过尾静脉注入小鼠体内,7天后检测各组白血病小鼠脾脏和肝脏体积和重量,流式细胞术检测小鼠骨髓、脾脏及肝脏中MLL-AF9-GFP白血病细胞比例。（4）IFN-y对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:将MLL-AF9-GFP白血病细胞通过WT小鼠尾静脉注射入小鼠体内,3天后将对照组和实验组WT/BMDCs通过尾静脉注入小鼠体内,将鼠IFN-γ中和抗体在第4、6和8天注射入部分实验组小鼠体内,第10天检测各组白血病小鼠脾脏和肝脏体积和重量,流式细胞术检测小鼠脾脏、肝脏及骨髓中MLL-AF9-GFP白血病细胞比例。（5）IL-1β对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:将MLL-AF9-GFP白血病细胞通过WT小鼠尾静脉注射入小鼠体内,3天后将对照组和实验组WT/BMDCs通过尾静脉注入小鼠体内,将鼠IL-1β中和抗体连续4天注射入部分实验组小鼠体内,第10天检测各组白血病小鼠脾脏和肝脏体积和重量,流式细胞术检测小鼠脾脏、肝脏及骨髓中MLL-AF9-GFP白血病细胞比例。研究结果（1）树突状细胞NLRP3炎症小体对白血病细胞增殖和凋亡的影响:与对照组相比,实验组CD4+T细胞与THP-1或U937白血病细胞共培养后白血病细胞凋亡明显增加,而抑制组MCC950会降低这种促凋亡作用。与对照组或抑制组的BMDCs组共培养的CD4+T细胞相比,实验组CD4+T细胞使THP-1或U937白血病细胞的增殖明显降低。（2）影响白血病细胞增殖和凋亡的机制:ELISA检测实验组NLRP3炎症小体激活的BMDCs与CD4+T细胞共培养上清液中的细胞因子IFN-γ水平明显高于对照组,而抑制组IFN-γ的水平显着降低。在实验组共培养体系中加入人IFN-γ中和抗体后THP-1或U937白血病细胞的凋亡显着降低。同样,在实验组共培养体系中加入IFN-γ中和抗体后THP-1或U937白血病细胞的增殖较未加入IFN-γ的实验组明显增加。（3）树突状细胞NLRP3炎症小体对白血病小鼠肿瘤影响:与对照相比,注射NLRP3炎症小体激活WT/BMDCs的实验组白血病小鼠的脾脏和肝脏的体积和重量显着降低,且骨髓、脾脏和肝脏中的MLL-AF9-GFP白血病细胞比例低于对照组,而MCC950可逆转WT/BMDCs NLRP3炎症小体激活抑制白血病细胞增殖的这种作用。但是Nlrp3-/-小鼠的实验组BMDCs NLRP3炎症小体激活后注射入白血病小鼠体内后,未观察到对白血病小鼠白血病细胞的抑制作用。（4）IFN-γ对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:与未注射鼠IFN-γ中和抗体的实验组小鼠相比,注射鼠IFN-γ中和抗体的实验组小鼠的脾脏体积或肝脏重量和体积显着增加,小鼠中骨髓、脾脏或肝脏中的MLL-AF9-GFP白血病细胞比例显着增加。（5）IL-1β对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:实验组小鼠注射鼠IL-1β中和抗体后,与未注射鼠IL-1β中和抗体的实验组小鼠相比白血病小鼠的脾脏和肝脏的体积和重量显着增加,且骨髓、脾脏和肝脏中的MLL-AF9-GFP白血病细胞比例显着增加。研究结论1.NLRP3炎症小体激活的BMDCs促进Th1细胞分化有抗白血病的作用,为AML的免疫治疗提供新的研究方向。2.IFN-γ是BMDCs NLRP3炎症小体激活抗白血病作用重要的效应分子。3.NLRP3炎症小体通过IL-1β/Th1/IFN-γ参与抗白血病作用,调节树突状细胞NLRP3炎症小体和IL-1β有望成为AML治疗新的靶点。第三部分免疫相关基因单核苷酸多态性在急性髓系白血病中的研究研究背景急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是髓系原始幼稚细胞在骨髓内大量增殖导致正常造血功能受损,并伴有遗传学异常,是成人发病率最高的血液系统恶性肿瘤。恶性肿瘤存在免疫失衡,AML患者骨髓存在免疫系统损伤,免疫系统最重要的组成部分T细胞存在数量和功能上的缺陷。免疫T细胞是至关重要的抗肿瘤免疫细胞,通过释放细胞因子和细胞毒性物质消灭AML白血病细胞。同时,AML白血病细胞也会影响T细胞的分化和增殖,并通过释放抑制性细胞因子等方式发挥免疫抑制作用。T辅助（Th）细胞在T细胞免疫系统网络中起着举足轻重的作用,Th1/Th2及Th1 7/Treg失衡与实体瘤的发病机理以及血液系统恶性肿瘤有关,但是Th细胞在AML骨髓微环境中研究不多。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）是最常见的遗传变异类型,其功能在生物学的许多领域被发现,特别是在人类各种疾病方面的研究最多。炎症相关的SNPs在AML患者中的作用已已有相关研究,并且发现SNPs与化疗敏感性、疾病预后和生存时间相关的SNPs。例如IL-1β（rs16944）GA基因型与AML遗传学预后良好相关,而含有IL-18（rs1946518）GT基因型的AML患者生存率较差。Zhu等报道IL-17F的G单突变体和GG突变纯合子与AML易感性有关。TNF-α、IL-10、TGF-β1等功能性变异可能与AML的发病机制有显着相关性。我们在前期研究中发现AML骨髓中Th亚群失衡及其相关细胞因子分泌紊乱,并发现失衡的Th亚群与紊乱的细胞因子可能共同参与AML的发生和发展。因此,我们进一步研究免疫相关基因（包括促炎或抗炎细胞因子以及T细胞亚群的关键调节因子）的SNPs与AML的关系,探索SNPs在AML发病过程中涉及一些尚未发现的功能及病理机制,寻找新的治疗AML重要的免疫靶点。研究目的本研究旨在探索免疫相关基因的单核苷酸多态性与AML易感性、预后危险分层和生存分析之间的关系;分析免疫相关基因的单核苷酸多态性不同基因型与AML临床特征之间的关系;结合相关基因mRNA表达和功能分析,进一步确定了潜在的信号通路,寻找AML新的免疫治疗靶点。研究方法标本收集:本研究收集来自山东大学齐鲁医院的269例初诊AML患者及200例健康对照标本,分离单个核细胞并提取DNA及RNA。收集整理患者临床相关资料。（1）将AML患者及健康对照标本进行质谱SNPs分型信息采集及分析。Sequenom MassARRAY平台对21个候选SNPs进行了引物延伸质谱的基因分型,得出269例AML病例和200例健康对照的基因分型准确性结果。本研究利用Hardy-Weinberg平衡和微小等位基因频率（MAF）对21个候选SNPs的适用性进行了评价。（2）实时荧光定量PCR检测AML骨髓单个核细胞中IL-12 mRNA的表达。研究结果:（1）免疫相关基因SNPs与AML易感性的关系:IL4（rs2070874、rs2243250）和IL22 rs1179251在显性模式下基因型频率与AML易感性显着相关;单因素logistic回归分析显示,调整年龄和性别后,在显性模式下只有IL4（rs2243250）与AML的易感性显着相关,但是经过Bonferroni多重校正后,没有SNPs与AML的易感性相关。（2）免疫相关基因SNPs与骨髓原始幼稚细胞的关系:在隐性模式下IL2（rs2069762）基因型频率在骨髓高幼稚细胞（≥42%）和低幼稚细胞（<42%）组间差异有统计学意义。（3）免疫相关基因SNPs与外周血白细胞的关系:IL22（rs2227491）在显性、共显性和等位基因模式下的基因型频率与白细胞计数显着相关;另外IL4（rs2243250）等位基因频率也与白细胞计数显着相关;rs2227491在显性和等位模式下的基因型频率经Bonferroni多重校正后与白细胞计数也显着相关;在调整年龄和性别后,IL22（rs2227491）在显性模式下AML患者携带TT基因型发生高白细胞计数的风险是TC/CC基因型携带患者的4.2倍,IL22 rs2227491等位基因的分布也有统计学差异。（4）免疫相关基因SNPs与血红蛋白、血小板及乳酸脱氢酶的关系:在共显性和显性模式下STAT6（rs324011）和IL12A（rs2243115）的基因型频率在高血红蛋白（≥80g/L）和低血红蛋白（<80/L）间差异有统计学意义;在共显性和隐性模式下IFN-γ（rs2069718）等位基因频率和基因型频率与血红蛋白高低也显着相关;在调整年龄和性别后,IL6R（rs2228145）基因型频率仅在显性模式下与高乳酸脱氢酶（LDH）显着相关性,但是在Bonferroni多重校正后,SNPs与血红蛋白、LDH无显着相关性。未发现SNPs与血小板高低相关。（5）免疫相关基因SNPs与WHO分型重现性遗传学异常的关系:STAT5B（rs6503691）在共显性和隐性模式下与AML重现性遗传学异常（RGAs）显着相关,即使Bonferroni多重校正后,rs6503691与重现性遗传学异常之间的相关性也具有统计学意义;调整年龄和性别后进行单变量逻辑回归分析,rs6503691 CC基因型（共显性模式）或CC/CT基因型（隐性模式）被作为参考时,TT或CT基因型（共显性模式）和TT（隐性模式）与重现性遗传学异常显着相关。（6）免疫相关基因SNPs与AML危险度分层的关系:在共显性、显性和隐性模式下TGF-β1（rs1800469）与AML危险度分层显着相关,但是经多元回归调整年龄和性别因素后rs1800469在共显性、显性和隐性模式下差异无统计学意义。（7）AML缓解组和难治组总生存时间（OS）:对191名化疗诱导治疗患者的治疗效果进行OS的单因素分析,结果显示完全缓解（CR）组和难治组之间的结果有显着差异,中位OS分别为39个月和18个月。（8）免疫相关基因SNPs与AML非M3诱导化疗敏感性的关系:在共显性和隐性模式下STAT1（rs3771300）的等位基因频率和基因型频率在治疗敏感组、中等组和无效难治组间差异有统计学意义;在共显性模式下GATA3（rs3824662）等位基因频率和基因型频率在三组间均有显着相关性,但是经过Bonferroni多重校正后无SNPs与诱导化疗敏感性相关。（9）免疫相关基因SNPs与AML生存的关系:在显性和共显性模式下STAT3（rs744166）基因型频率与AML患者生存期显着相关;IL12A（rs6887695）在等位基因、隐性和共显性模式下的与AML患者的生存期显着相关;在Bonferroni多重校正后IL12A（rs6887695）只有在共显性和隐性模式下的与AML患者的生存显着相关;在IL12A（rs6887695）共显性模式下AML患者携带CC基因型的比GG基因型的携带患者OS降低22个月;IL12A（rs6887695）在GC/CC下的生存期（22.0个月）明显短于隐性模式下GG（33.0 个月）。（10）rs6887695与IL12 mRNA表达水平的关系:在共显性模式下,CC基因型患者IL12mRNA表达水平高于GG基因型患者;与GG基因型相比,CG杂合子患者的IL12水平也升高;在隐性模式下,与CG/GG基因型相比,GG基因型的样本中IL12表达显着降低;而在显性模式下,CC/CG基因型和GG基因型的IL12 mRNA表达无差异。研究结论1.IL22（rs2227491）与白细胞计数显着相关,提示IL22与AML预后有相关性。2.STAT5B（rs6503691）与AML患者重现性遗传学异常密切相关,提示STAT5B与AML预后关。3.IL12A（rs6887695）与 AML 患者的 IL12 mRNA 表达及 OS 相关,对 AML的预后有独立的负面影响。
邓磊[4]（2020）在《造血干细胞微嵌合及工程化树突状细胞促进受者T细胞活化的机制研究》文中指出背景:微嵌合是指个体内一小部分细胞或DNA来自于另一个体的现象。微嵌合与移植耐受、慢性GVHD、自身免疫病等免疫过程有关,研究造血干细胞微嵌合形成的过程及其对受者T细胞免疫功能的影响具有重要意义。树突状细胞（DCs）是最重要的抗原提呈细胞之一,是T细胞活化的桥梁。修饰后的工程化树突状细胞能够增强对T细胞的调节作用,Mo S2纳米薄片（MSNs）由于优异的物理和化学性质,已应用于生物成像探针、生物传感器、光热治疗剂、药物载体和组织工程支架等方面。利用其作为佐剂来修饰树突状细胞是一个非常吸引人的研究课题。机体内的抗肿瘤免疫反应主要通过激活T细胞来杀死肿瘤细胞。原发性皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）是最常见的皮肤淋巴瘤,晚期皮肤T细胞淋巴瘤的5年生存率仍不到25%。早期阻止皮肤T细胞淋巴瘤的进展,将避免疾病晚期的高死亡率。方法:1. 为了研究造血干细胞输注产生的微嵌合过程及其对受者免疫功能的影响,我们将G-CSF动员后的C57脾细胞输注给不接受预处理的CB6F1可形成微嵌合。通过多色流式技术标记小鼠不同细胞亚群及供受细胞H-2抗原的不同,我们可以比较不同细胞亚群微嵌合形成的异同。通过小动物活体成像系统及C57BL/6-Tg（Fluc+/-）小鼠我们可以在活体内完整观察供者细胞在受者体内分布及扩增形成微嵌合的过程。多色流式技术使我们进一步可以检测微嵌合形成过程中供受者T细胞活化的状态及骨髓干祖细胞扩增的情况。通过流式分选细胞然后进行RNA-Seq,我们可以掌握微嵌合前后受者T细胞RNA的表达情况。2.我们使用了分别为100-250纳米（S-MSNs）和400-500纳米（L-MSNs）的少层状Mo S2薄片（MSNs）来修饰DCs。骨髓培养的DCs暴露在不同剂量（0、8、16、32、64、128μg/ml）MSNs中48h后,检测其表面标志、细胞因子分泌。应用小动物活体成像系统体内追踪DCs的归巢,通过流式检测其对局部淋巴结T细胞的活化作用。3.我们在-2天于C57BL/6小鼠接种EG7-OVA小鼠T淋巴瘤细胞,于0天经尾静脉输注G-CSF动员后Balb/c小鼠脾细胞。分别在第0天和第7天将共孵育的DCs注入小鼠右侧脚垫中,并在第7天和第14天取小鼠尾静脉血通过多色流式技术检测嵌合。在第14天通过流式和细胞计数检测外周血及腘窝淋巴结T细胞的增殖活化。于第7天、10天、14天用游标卡尺测量并计算小鼠肿瘤体积。结果:1. DCI-6E7组在输细胞后+1天供者细胞植入为1.76±0.49%,+4天供者细胞嵌合到达最高2±0.54%,在7-14天其嵌合波动于1.2-1.9%,未见明显下降。但是14-21天其嵌合迅速降至0.18%,而后持续下降。DCI-6E7组小鼠细胞输注后体重逐渐上升,小鼠饮食、毛色、体态均未见明显异常,外周血白细胞仅仅是轻微下降而后恢复,但是血小板和血红蛋白却无明显变化。DCI-6E7组受鼠在1-14天时T、B细胞及其他亚群仅形成低比例供者嵌合（1.1%～4.5%）;+14天各细胞亚群嵌合均开始快速下降,至+28天,流式细胞术仅检测到极少量供者嵌合。6×107组CD3+,CD11b+,B220+细胞比例仅有轻度变化,分别波动于31.1-47.8%,25.6%-36%,8.6%-24.3%。CD4/CD8波动于1.5-3.2,持续>1。DCI-6E7组荧光强度在0-12小时上下波动,于+1天减弱,而1-5天无明显变化,并于第5-7天升高,随后持续下降,供者细胞荧光信号6×107组主要集中于淋巴结和脾脏。DCI-6E7组供者来源活化T细胞在输注后4-7天有不同程度扩增,而后逐渐下降。受者来源T细胞活化相关标志则在细胞输注后7-21天有剧烈扩增,而后逐渐下降。输细胞后+10天相对于输细胞前受者CD4+细胞差异基因明显上调的基因数目多余下调的基因数目,受者CD8+细胞差异基因明显下调的基因数目多余上调的基因数目。他们参与多种生物学过程和细胞组分以及分子学功能,涉及调节多种信号通路（包括免疫与炎症反应、自身免疫性疾病、感染性疾病等）。其中有许多基因参与免疫与炎症反应,他们通过调节TH1/TH2、TH17细胞的分化或直接通过细胞间的粘附通路调节炎症反应。2. 所有剂量（0-128μg/ml）不同大小的MSNs均不影响DCs的活性。128μg/ml的S-MSNs和L-MSNs处理的DCs其CD40、CD80、CD86和CCR7的表达显着升高。IL-12p70的分泌保持不变,而IL-1β减少分泌,TNF-α的分泌在某种程度上与MSNs治疗的剂量有关。只有128μg/ml的L-MSNs处理的DCs显着观察到增加的IL-6。MSNs处理显着促进了个体局部淋巴结和血液循环中DCs的体内外运动和体内归巢能力。DCs归巢能力增强的原因细胞是因为受ROS升高调节的细胞骨架的重排。经MSNs修饰的DCs接种到小鼠中,CD4+和CD8+T细胞的增殖和活化更为明显（以CD107a、CD69和ICOS的高表达为特征）。MSNs的处理并没有影响LPS诱导的DC激活、归巢和T细胞启动。3. OVA和MSNs的细胞毒性并不高,OVA单独不能促进DCs的成熟,而和MSNs共培养可以促进DC成熟,其特征是CD40,CD80和CD86的升高,增强IL-6的分泌。外周血造血干细胞输注可以在肿瘤小鼠体内产生供者细胞微嵌合,随着时间的延长有下降的趋势。外周血造血干细胞输注可以刺激肿瘤小鼠外周血B细胞和T细胞的扩增。特别是刺激了CD4+细胞、CD8+细胞中CD107a、CD69、ICOS活化标志细胞的大量扩增。DCs免疫可以刺激小鼠局部淋巴结中B细胞和T细胞的扩增,Mo S2修饰后可以进一步放大这种效果。特别是刺激了CD4+细胞,CD8+细胞中CD107a、CD69、ICOS活化标志细胞的大量扩增。对小鼠进行OVA-DCs免疫治疗可以抑制小鼠肿瘤的生长,而加上Mo S2修饰的DCs可以进一步抑制小鼠肿瘤生长。单独输注外周血造血干细胞也可以抑制肿瘤的生长。联合外周血造血干细胞输注和Mo S2-OVA-DCs免疫对肿瘤细胞的抑制效果最好。结论:1.通过活体成像,我们观察到供者细胞在受者体内形成微嵌合的过程。造血干细胞输注形成微嵌合与传统大嵌合相比仅轻度降低血象、无GVHD,激活了受者T细胞,并且可以刺激受者骨髓造血干祖细胞的扩增,调节受者免疫功能与炎症反应。这些结果为研究微嵌合的形成及其在抗肿瘤、自身免疫性疾病及促造血中的作用提供了基础。2.在DC的工程化修饰中,在相对高剂量（128μg/ml）时,MSNs可以提高DCs的体外成熟和淋巴结归巢,并大幅度提高DCs的活化能力,引起更强的CD4+和CD8+T细胞免疫反应。此外,ROS诱导的细胞骨架排列参与了MSNs修饰的DCs运动能力的提高。作为第一个系统研究MSNs对DC修饰的工作,我们的发现为修饰DC提供了新的方法,同时为MSNs作为免疫调节佐剂提供了支持证据。3. 造血干细胞微嵌合和二硫化钼纳米薄片修饰的DCs均具有一定抑制肿瘤的作用,联合二者可以发挥更强的抑制肿瘤生长的作用。发挥这一作用的途径可能是通过激活受者外周血及局部淋巴结T细胞的活化和扩增。
杨阿丽[5]（2020）在《TLR-8激动剂刺激的DC对CD4+CD25+调节性T细胞的体外增殖及杀伤功能的影响》文中研究表明目的本实验研究Toll样受体8（TLR-8）激动剂对急性髓细胞白血病患者CD4+CD25+调节性T细胞的增殖和功能的影响,用TLR-8激动剂（VTX-2337）刺激负载CD34+白血病细胞的DC,与CD4+CD25+调节性T细胞共培养,观察其对CD4+CD25+调节性T细胞的增殖活性的影响;用TLR-8激动剂（VTX-2337）处理后的CD4+CD25+调节性T细胞,与CD34+白血病细胞及CTL共培养,观察其对CTL杀伤CD34+白血病细胞功能的影响。从CD4+CD25+调节性T细胞的增殖和功能两个方面更深层次挖掘体外白血病细胞免疫治疗的新途径,为杀灭体内白血病细胞提供新的方法。方法与患者本人或授权人充分沟通该研究的研究内容和目的后签署知情同意书,在患者住院期间采集初发急性髓细胞白血病患者（根据WHO分型,除急性早幼粒细胞型）的骨髓抗凝血5ml,离心后得到单个核细胞,然后使用MACS方法分选出CD34+白血病细胞,进一步冻存用作后续研究;待患者达完全缓解期时再次采集自体外周抗凝血20ml进行离心后同样用MACS方法分选获得CD14+单个核细胞、CD4+CD25+调节性T细胞,其中向CD14+单个核细胞中加入粒-巨细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素（IL）-4、肿瘤坏死因子（TNF）-α制备得成熟DC,冻存用作后续研究。将成熟的DC与去甲氧柔红霉素和硼替佐米诱导凋亡的CD34+白血病细胞融合共培养2小时制备负载CD34+白血病细胞的DC,留作后续研究。采集完全缓解期患者的外周抗凝血,离心得单个核细胞,用负载CD34+白血病细胞的DC和IL-2（20 IU/ml）进行诱导生成CTL,用MACS方法分选出CTL,留作后续实验。将TLR-8激动剂（VTX-2337）与负载CD34+白血病细胞的DC、CD4+CD25+调节性T细胞共培养,观察CD4+CD25+调节性T细胞增殖活性;用TLR-8激动剂（VTX-2337）对CD4+CD25+调节性T细胞进行处理后,将其与CTL细胞、CD34+白血病细胞共培养观察CTL杀伤率。结果（1）对照组CD4+CD25+调节性T细胞增殖活性为23.73%±3.36%,TLR-8激动剂组CD4+CD25+调节性T细胞增殖活性为2.95%±1.23%,P＜0.01,差异具有统计学意义,TLR-8激动剂组CD4+CD25+调节性T细胞增殖活性明显下降,提示经过TLR-8刺激的负载CD34+白血病细胞的DC明显抑制了CD4+CD25+调节性T细胞增殖活性;（2）效靶比12.5:1组对照组杀伤率为13.81%±1.77%,TLR-8激动剂组杀伤率为46.98%±7.98%,P＜0.01,差异具有统计学意义,效靶比25:1组对照组杀伤率为27.15%±5.99%,TLR-8激动剂组杀伤率为50.88%±8.83%,P＜0.01,差异具有统计学意义。TLR-8激动剂组杀伤率明显增加,提示TLR-8激动剂抑制了 CD4+CD25+调节性T细胞的免疫抑制能力进而增强了 CTL杀伤能力。结论TLR-8激动剂刺激的负载CD34+白血病细胞的DC能抑制CD4+CD25+调节性T细胞的增殖活性,且TLR-8激动剂能够抑制CD4+CD25+调节性T细胞发挥免疫抑制功能,增强CTL的抗肿瘤免疫功能,提示TLR-8激动剂可以通过以上两种机制增强抗肿瘤效应。
郑义[6]（2019）在《东方栓孔菌多糖的分离纯化、结构解析与生物活性研究》文中认为多糖为大型真菌的主要活性成分,因具有免疫调节、抗肿瘤和抗氧化等生物活性而被广泛关注。东方栓孔菌作为传统中药材,主治肺炎、咳嗽痰喘、肺结核、支气管炎等多种肺部疾病,目前有关东方栓孔菌多糖的研究鲜有报道。本论文从提取工艺、分离纯化、理化性质、结构表征、抗氧化、免疫调节、抗炎和抗肿瘤活性等方面,深入研究了东方栓孔菌多糖。通过响应面法优化了东方栓孔菌多糖的超声辅助提取工艺和超声-微波辅助提取工艺。超声辅助提取东方栓孔菌多糖的最佳工艺参数为30 mL/g,超声功率110 W,提取温度40℃,提取时间42 min,在此条件下多糖得为7.49±0.14%（n=3）。超声-微波辅助提取东方栓孔菌多糖的最佳工艺参数为液料比28 mL/g,超声功率114 W,提取时间11 min,在此条件下多糖得率为7.52±0.12%（n=3）。与其他提取方法相比,超声-微波辅助提取法用时最短,得率最高,更适用于东方栓孔菌多糖的提取。通过DEAE-纤维素和Sephadex G-100色谱纯化东方栓孔菌粗多糖,得到了一个主要的纯化组分,命名为TOP-2。理化性质与红外光谱分析表明TOP-2为含有硫酸基的酸性多糖;高效凝胶渗透色谱测得TOP-2相对分子质量为6.3×104;GC-MS法测得TOP-2由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,摩尔比为1:3.45:5.77:5.79;刚果红试验及透射电子显微镜分析表明TOP-2具有三股螺旋构象。理化性质及结构分析提示TOP-2可能具有良好的生物活性。以清除1,1-二苯基-2-苦基肼基（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基能力、还原力、清除超氧阴离子能力和螯合铁离子能力为指标,评价了TOP-2的体外抗氧化活性;采用急性酒精性肝损伤小鼠模型评价了TOP-2的保肝作用。结果表明,TOP-2具有较好的体外抗氧化活性。TOP-2能降低酒精性肝损伤小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase,ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase,AST）活性,拮抗酒精所致小鼠肝脏超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）活性的下降,降低丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量,抑制肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）水平。结果提示TOP-2可能是通过提高体内抗氧化酶活性、抑制TNF-α和IL-1β等促炎因子表达、直接清除自由基和螯合金属离子等途径发挥其对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用。构建环磷酰胺致免疫抑制小鼠模型评价了TOP-2对环磷酰胺致免疫抑制小鼠的保护作用。结果表明,TOP-2能够恢复环磷酰胺致免疫抑制小鼠的脾脏、胸腺、心脏、肝脏和肾脏等脏器系数,改善免疫抑制小鼠巨噬细胞的吞噬能力,激活巨噬细胞NO的释放,增加T、B淋巴细胞增殖,增强自然杀伤（natural killer,NK）细胞和细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）的毒性作用,恢复血清细胞因子白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）、γ-干扰素（interferon-γ,IFN-γ）、免疫球蛋白A（immunoglobulin A,IgA）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）和免疫球蛋白M（immunoglobulin M,IgM）水平,提高总抗氧化能力（total antioxidant capacity,T-AOC）、SOD、CAT和GSH-Px活性,降低MDA含量。TOP-2通过免疫调节和抗氧化活性发挥其对环磷酰胺致免疫抑制小鼠的保护作用。评价了TOP-2对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抗肿瘤与免疫调节活性。TOP-2对Lewis肺癌有较好的抑制作用,能够恢复Lewis肺癌小鼠体重、脾脏系数和胸腺系数,活化Lewis肺癌荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞,刺激脾淋巴细胞增殖,提高细胞因子IL-2、白细胞介素-12（interleukin-12,IL-12）和TNF-α表达水平,通过与Toll样受体4（toll like receptor 4,TLR4）结合,激活核因子κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）信号通路。TOP-2通过免疫调节活性发挥其对Lewis肺癌小鼠的抗肿瘤作用。构建大气细颗粒物(fine particulate matter,PM2.5)致肺损伤小鼠模型,采用细胞学、分子生物学和生化分析方法,评价了TOP-2对PM2.5致肺损伤小鼠的保护作用。TOP-2能够减轻PM2.5致肺损伤小鼠的肺水肿程度,缓解肺损伤小鼠炎性损伤,减少中性粒细胞募集,缓解PM2.5对巨噬细胞的毒效应,维持肺泡毛细血管膜完整性,减少支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中总蛋白（total protein,TP）、白蛋白（albumin,ALB）、C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）和酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase,ASM）渗漏,抑制TNF-α、IL-1β和白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）的释放,缓解PM2.5致肺损伤小鼠的氧化应激,提高肺组织SOD、CAT和GSH-Px活性,降低MDA、蛋白质羰基（protein carbonyl group,PCG）和8-羟基-2’-脱氧鸟苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG）含量,增加肺组织核因子NF-E2相关因子（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2）和血红素氧合酶1（heme oxygenase-1,HO-1）蛋白的表达,抑制NLR家族蛋白3（NLR family pyrin domain-containing 3,NLRP3）炎症小体活化。TOP-2通过抗氧化和抗炎活性发挥其对PM2.5致肺损伤小鼠的保护作用,其保护机制与激活Nrf2/HO-1通路和抑制NLRP3炎症小体活化相关。该论文有图60幅,表29个,参考文献398篇。
陈婷[7]（2019）在《移植物抗宿主病的特异性生物标志物的研究》文中进行了进一步梳理目的:异基因造血干细胞移植（Hematopoietic stem cell transplant,HSCT）是治疗血液肿瘤的最佳手段之一,移植物抗宿主病（Graft-Versus-Host Disease,GVHD）是移植术后的主要并发症,严重影响了移植的成功率和患者安全。移植物抗宿主病分为急性和慢性,急性移植物抗宿主病（Acute Graft-Versus-Host Disease,aGVHD）进展快,病情危重,导致移植后患者的早期死亡。慢性移植物抗宿主病（Chronic Graft-Versus-Host Disease,cGVHD）迁延不愈,病程甚至长达数年,病程长,严重影响患者的生存质量。目前GVHD的诊断主要依据临床症状及病理活检,但临床症状缺乏特异性,病理活检的有创性,严重影响了GVHD的早期诊疗。血清生物标志物的筛查简单快速易行,具有无创性,而且生物标志物的表达水平变化可以反映机体的病理免疫状态,有利于对GVHD发病的预警以及对机制的研究,因此,进行GVHD血清特异性生物标志物检测对早期诊断和治疗具有重要的临床参考价值。方法:1.建立GVHD小鼠模型:选用SPF级雄性C57BL/6（H-2b）小鼠作为供体鼠,取股骨、胫骨骨髓和脾脏;SPF级雌性BALB/C（H-2d）小鼠作为受体鼠。经650 cGy 60Coγ线行全身辐照。然后分为对照组及aGVHD组（实验组）两组。对照组小鼠在尾静脉注射供体鼠骨髓细胞5x10^6/只,aGVHD组小鼠（实验组）另外加入供体鼠脾脏细胞1x10^6/只。2.在aGVHD动物模型中检测10种生物标志物的表达水平动态变化,筛选出与急性GVHD相关的特异性生物标志物。选取我中心发生急性GVHD和没有发生急性GVHD的患者各20例,运用蛋白质芯片技术检测及验证10种生物标志物在GVHD患者中的临床意义,探索生物标志物在急性GVHD发病中的价值。3.选取我中心发生慢性GVHD的30例患者,没有发生慢性GVHD的60例患者,运用液相悬浮芯片技术检测患者的12种生物标志物的表达水平变化。筛选出与慢性GVHD相关的特异性生物标志物,并且评价生物标志物在GVHD的发生发展,疾病严重程度,不同靶器官中的意义。结果:1.经650 cGy 60Coγ线全身辐照,实验组的受体鼠中加用供体鼠骨髓细胞+脾脏细胞后,移植后第14天,FISH技术检测小鼠的供体干细胞成功植入,实验组小鼠出现脱毛,体重下降,弓背,腹泻等GVHD表现。2.通过10种特异性生物标志物的检测,与对照组相比较,aGVHD小鼠模型和急性GVHD患者中均发现IL-2,TLR4表达水平显着增高（P<0.05）,TGF-β同时在急性GVHD小鼠和患者中表达水平明显下降（P<0.05）。3.通过对12种生物标志物的检测,与对照组相比较,慢性GVHD患者中观察到CXCL9,CXCL13,CCL11,CCL17,MPIF-1/CCL23表达水平显着增高（P<0.05）,CXCL13,CCL17在重度cGVHD的患者中表达水平显着高于对照组（P<0.05）,CXCL9在皮肤、CCL17在肝脏中的表达明显增高且具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.受体鼠经650 cGy 60Coγ线全身辐照,用供体鼠骨髓细胞+脾脏细胞输注的方法可以成功构建aGVHD小鼠模型。2.IL-2,TLR4,TGF-β这三种生物标志物可作为早期预测、诊断急性GVHD发生的特异性生物标志物,对临床应用有参考价值。3.CXCL9,CXCL13,CCL11,CCL17,MPIF-1/CCL23五种生物标志物联合可以作为早期诊断、评估慢性GVHD发生的特异性生物标志物;其中CXCL13,CCL17可以作为预测重度cGVHD发生的特异性生物标志物;CXCL9,CCL17可以为不同靶器官损害提供辅助参考。
杨阳[8]（2019）在《Wnt/β-catenin信号途径对肿瘤相关巨噬细胞的调控及其在肝癌进展中的作用和机制研究》文中进行了进一步梳理【背景】我国是肝癌发病的重灾区,其患病率和死亡率占亚洲近70%,居亚洲之首。原发性肝癌也是我国发病率位居第四位,死亡率位居第三位的恶性肿瘤,其中肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是其最常见的类型,约占90%以上。由于起病隐匿,确诊时多已到中晚期,治疗效果差,预后恶劣,是对我国人民生命健康构成严重威胁的疾病之一。我国肝癌的病因与乙型、丙型肝炎病毒感染密切相关,这类慢性炎症性疾病后期所导致的肝纤维化、肝硬化是诱发肝细胞癌变的罪魁祸首。目前,全世界对肝癌的治疗并不理想,对于早期患者,手术是首选治疗方式,而中晚期患者只能依靠一些姑息治疗。由于肝脏本身是一种具有解毒及代谢功能的消化器官,因而对化疗也很不敏感。近年来,小分子抑制剂类药物的开发及使用也未能改变肝癌治疗的困窘,还给患者带来很大的经济负担。因此,为了减轻肝癌对人类健康的危害,对其复杂发病机理的全面深入研究,将任重而道远。近年来肿瘤相关的慢性炎症已被认为是肿瘤的第七大标志,肿瘤微环境中多种免疫细胞与肿瘤细胞相互影响以形成统一的适宜肿瘤生长的炎性微环境。其中,肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）是肿瘤微环境中最主要的一类天然免疫细胞,许多研究已证明TAMs可通过分泌多种细胞因子及介导T细胞免疫反应对肿瘤的生长、侵袭转移、血管生成等方面产生重要影响。因而,在肿瘤中晚期,其内部TAMs的浸润将加速肿瘤进展,大大阻碍治疗效果。鉴于巨噬细胞具有强大的起源及功能异质性,它们可根据微环境中的信号转变自身功能及角色。肿瘤中的巨噬细胞可被肿瘤细胞驯化,进而成为肿瘤进展的帮凶,因而研究肿瘤细胞与其周围浸润TAMs之间crosstalk的调控机制将有望阻断肿瘤对巨噬细胞功能及极化的影响,并有助于将促进肿瘤的巨噬细胞改造为抑制肿瘤进展的巨噬细胞。Wnt配体是一类以旁分泌形式传递细胞与细胞间信息的糖蛋白,可参与胚胎发育或成体发育阶段的细胞生长、迁移等生命活动。其异常表达也可导致多种疾病,例如肿瘤的发生。Wnt配体可由Wntless（WLS）这一细胞表面的跨膜转运体分泌至胞外,进而与FZDs及LRP5/6受体结合从而激活自身或邻近细胞内的Wnt/b-catenin信号。许多研究也表明肿瘤细胞,例如人乳腺癌、宫颈癌及非小细胞型肺癌细胞等均可高分泌Wnt配体。而肿瘤细胞是否可通过Wnt配体驯化巨噬细胞向TAMs转变至今还未见相关报道。【目的】已有研究报道Wnt信号可以影响造血细胞的分化过程,尤其对T细胞及树突细胞这类免疫细胞的发育有重要作用。提示Wnt信号可能还有进一步调控免疫反应的作用。我们的前期实验结果表明:Wnt/β-catenin信号在不同极化状态巨噬细胞中的表达存在显着差异性。接着,我们试图通过改变巨噬细胞中Wnt/β-catenin信号活化状态来研究其对巨噬细胞功能及极化的影响,并进一步探索这些改变将对肿瘤细胞的生物学行为产生何种作用。初步寻找肿瘤细胞与巨噬细胞之间crosstalk的可能方式。最后,计划在临床肝癌的手术标本中进一步验证,以期为临床肝癌的治疗提供一定基础研究依据。【方法】1.首先分选C57BL/6小鼠骨髓细胞中的CD11b+细胞,同时利用巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor,MCSF）体外诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞,采用QRT-PCR方法分别检测CD11b+单核前体和CD11b+F4/80+巨噬细胞中Wnt/β-catenin通路下游基因表达差异,以观察Wnt/β-catenin信号对单核巨噬细胞分化的影响。其次,利用LPS+IFN-r与IL-4分别诱导M1及M2极化巨噬细胞,采用QRT-PCR方法对不同极化的巨噬细胞中Wnt配体、受体及下游基因的表达进行检测,根据检测结果进一步利用Western-Blot技术及免疫荧光细胞爬片进行反复验证。另外,通过构建小鼠原位肝癌模型,分选肿瘤内TAMs,进行极化相关分子表达以及Wnt/β-catenin通路下游基因表达情况的检测。2.选取C57BL/6小鼠体外MCSF诱导成功的骨髓来源巨噬细胞作为研究对象,对β-catenin低表达的M1型极化巨噬细胞进行Wnt3a激活Wnt/β-catenin通路的处理,观察对极化因子表达的影响。相反,对β-catenin高表达的M2型极化巨噬细胞进行ICG001抑制Wnt/β-catenin通路的处理,观察对极化因子表达的影响。在此部分实验中,采用QRT-PCR、免疫荧光细胞爬片、Western-blot以及流式细胞术胞内染色等多种技术方法反复验证。最后借助小干扰RNA技术通过沉默巨噬细胞Wnt/β-catenin通路下游靶分子c-Myc的表达,来研究Wnt/β-catenin信号对巨噬细胞极化的下游调控机制。3.采用小干扰RNA技术干涉巨噬细胞中β-catenin的表达,然后收集其经过IL-4极化刺激后的细胞培养上清,孵育肿瘤细胞或进行共培养实验观察巨噬细胞中β-catenin的表达降低后可对肿瘤细胞平板克隆形成能力、划痕愈合能力、侵袭转移能力有何影响。并进行混合淋巴细胞共培养实验检测巨噬细胞沉默β-catenin后对T淋巴细胞增殖能力的影响。4.为寻找肿瘤细胞对巨噬细胞驯化的可能机制。首先收取肿瘤细胞培养上清来孵育巨噬细胞,采用Western-Blot技术检测处理后巨噬细胞中Wnt/β-catenin通路下游分子β-catenin,c-Myc以及M2型极化相关分子的表达变化。另一方面,我们使用ICG001抑制剂与肿瘤上清同时孵育巨噬细胞,采用Western-Blot同样观察上述相关分子的表达变化。然后,利用慢病毒介导的sh RNA沉默技术,下调小鼠肝癌细胞hepa1-6中分泌Wnt配体的重要分子Wntless（WLS）后再次重复上述共孵育实验,以验证肿瘤细胞是否可通过分泌Wnt配体以激活巨噬细胞Wnt/β-catenin信号进而对其极化进行调控的猜想。最后,使用两种不同处理的hepa1-6细胞系（对照组:NC-hepa1-6及沉默组:sh-WLS-hepa1-6）构建小鼠原位肝癌模型,一方面观察肿瘤大小;另一方面利用免疫荧光,流式细胞术来分析肿瘤组织中的免疫细胞的变化情况,确认肿瘤细胞是否是通过分泌Wnt配体来调控巨噬细胞的极化。5.收集临床25例肝癌患者的手术切除标本,进行巨噬细胞（CD68）,Wnt信号（β-catenin）和极化相关分子（MR/Arg-1）的免疫荧光染色,共聚焦显微镜拍照后对巨噬细胞中Wnt信号活化与极化相关分子表达进行定量和相关性分析。【结果】1.磁珠分选的骨髓CD11b+细胞纯度可达97%,体外诱导巨噬细胞成熟后纯度也达到95%以上。QRT-PCR结果显示单核向巨噬分化过程中Wnt/β-catenin信号下游分子表达水平是增加的。在不同极化状态的巨噬细胞中,M1、M2巨噬细胞均可表达一系列Wnt配体,但M2型巨噬细胞表达较高的受体FZD4,7,9,而受体在M1中表达均低于M0与M2。此外,QRT-PCR、Western-Blot和IF结果均显示Wnt/β-catenin信号下游分子Axin2,β-catenin,c-Myc在M2中表达最高,M1中表达最低。小鼠原位肝癌模型TAMs的QRT-PCR结果显示TAMs为M2-like表型,并且与正常肝脏枯否细胞（kuffer,KCs）相比Axin2,β-catenin,c-Myc表达显着增加。2.QRT-PCR结果显示使用Wnt3a处理后的M1型巨噬细胞,TNF-α、IL-12表达水平显着降低但同时IL-10、MR、Arg-1表达则增加;同样Wnt3a处理M2型巨噬细胞后,MR、Arg-1等表达也增加。而使用ICG001处理M2型巨噬细胞,IL-10、MR、Arg-1表达显着受到抑制。M2型巨噬细胞使用Wnt3a与ICG001处理后的免疫荧光结果与QRT-PCR结果一致。另一方面,QRT-PCR结果显示干扰c-Myc表达再进行IL-4极化,IL-10、MR、Arg-1等M2极化分子的表达相对于对照组降低,并且可抵消Wnt3a对其表达的促进作用。3.采用巨噬细胞条件性培养基孵育肿瘤细胞的平板克隆结果显示巨噬细胞沉默β-catenin组与对照组相比可抑制肿瘤细胞克隆形成能力。划痕实验结果也与其一致。在迁移侵袭的共培养实验中,沉默组较对照组均表现为对肿瘤侵袭能力有抑制作用。而混合T淋巴细胞培养实验中,结果显示巨噬细胞中沉默β-catenin后在M0及M2极化状态时均对T淋巴细胞的增殖有明显促进。4.利用肿瘤上清孵育巨噬细胞后可表现为促进M2型极化及激活Wnt/β-catenin信号的作用。而同时加入ICG001后,该作用被抑制。利用WLS沉默的肿瘤细胞上清孵育同样可减弱上述表型。sh-WLS-hepa1-6细胞接种小鼠肝癌模型中,免疫荧光显示肿瘤细胞Ki67染色与对照组相比减少;F4/80+MR/Arg-1的共染现象减少。肿瘤免疫微环境中TAMs的募集有一定减少,TAMs分泌IL-12增加,IL-10的分泌减少。并且T淋巴细胞的浸润在沉默组是增加的,而Treg浸润比例则减少。5.临床肝癌患者手术病理标本免疫荧光染色结果为CD68+β-catenin+MR/Arg-1有一定比例的共染现象。并且平均荧光强度的统计结果提示CD68+细胞中β-catenin与MR或Arg-1的平均荧光强度呈正相关关系。【结论】1.Wnt/β-catenin不仅参与单核巨噬分化成熟的过程而且还可参与巨噬细胞极化的调控,表现为促进M2型极化而抑制M1型极化。Wnt/β-catenin可通过下游效应分子c-Myc促进巨噬细胞M2型极化。本研究初步揭示了一种调控巨噬细胞分化及极化的新机制。2.抑制巨噬细胞中Wnt/β-catenin信号通路会影响肿瘤细胞克隆形成,划痕愈合及侵袭转移的恶性生物学能力。并且抑制巨噬细胞中Wnt/β-catenin表达可提高巨噬细胞刺激T淋巴细胞增殖的能力,有利于形成抑制肿瘤发展的免疫微环境。为临床寻找肝癌生物免疫治疗的新靶点提供了理论基础及实验依据。3.肿瘤细胞可能通过分泌Wnt配体来激活巨噬细胞中的Wnt/β-catenin信号通路,进而促进其向M2型极化转变并可减少T淋巴细胞的浸润和招募Treg细胞等免疫抑制细胞促进肿瘤恶性生长。本研究提出肿瘤细胞通过分泌Wnt配体激活肿瘤相关巨噬细胞中Wnt/?-cateninh信号途径进而调控M2型巨噬细胞极化的新机制。
金春卉[9]（2018）在《急性B淋巴细胞白血病人源化小鼠的T淋巴细胞免疫治疗研究》文中进行了进一步梳理背景及目的:ALL是淋巴细胞系前体细胞的克隆性增殖性疾病。尽管应用目前的治疗手段,B-ALL缓解率逐渐提高,但患者耐药及复发后的二次缓解比例较低,整体预后不良。抗CD19 CAR T细胞治疗B-ALL可以靶向杀伤白血病细胞,提高难治复发患者的缓解率,并为造血干细胞移植争取机会。但由于白血病细胞免疫逃逸、骨髓中微小残存病灶的存在及肿瘤微环境中的保护机制,使患者不能达到长期缓解。同时抗CD19 CAR T细胞治疗临床试验的患者会出现一系列治疗相关的不良反应,严重的不良反应将威胁患者生命。目前尚缺乏模拟B-ALL患者接受同源CAR T细胞治疗的动物模型。另外,增强T细胞清除残存白血病病灶的治疗方法尚需进一步探索。本研究以人源化小鼠为基础,通过建立MLL-AF9融合基因诱导的人B-ALL人源化小鼠模型为受者,应用同基因人源化小鼠T细胞制备的抗CD19 CAR T细胞进行治疗。建立模拟临床患者的患病及CAR T细胞治疗过程的小鼠模型。白血病小鼠模型中的人B-ALL细胞表达CXCR4,其与白血病细胞的归巢、治疗抵抗及疾病复发相关,通过阻断基质细胞衍生因子1（stromal cell derived factor 1,SDF-1/CXCL12）/CXCR4通路,探索增强T细胞免疫杀伤B-ALL细胞的方法。方法:在实验一,构建人B-ALL人源化小鼠模型,应用同基因抗CD19 CAR T细胞进行治疗。1.建立MLL-AF9诱导的人B-ALL人源化小鼠模型。分离人源化小鼠T细胞,制备抗CD19 CAR T细胞。应用抗CD19 CAR T细胞治疗B-ALL人源化小鼠模型。2.流式分析仪对小鼠模型的白血病细胞、抗CD19 CAR T细胞及其他免疫细胞进行分析,检测抗CD19 CAR T细胞在小鼠体内增殖及存活情况、白血病细胞增殖及被杀伤情况。3.监测小鼠血清细胞因子及生存情况,观察小鼠CAR T细胞治疗后细胞因子释放与抗白血病效应的相关性及CAR T细胞治疗效果。在实验二,以人B-ALL NSG小鼠为模型,应用异基因T细胞杀伤白血病细胞。探索能否应用CXCR4拮抗剂阻断SDF-1/CXCR4通路,使白血病细胞进入外周,从而增强T细胞杀伤白血病细胞效果。1.建立B-ALL NSG小鼠模型,应用异基因T细胞在体内杀伤白血病细胞。2.注射CXCR4拮抗剂AMD3100。3.检测小鼠外周血各种细胞的比例及数量,观察白血病细胞被杀伤情况及异基因移植后移植物抗宿主反应。4.监测小鼠生存期、检测小鼠组织器官中白血病细胞数量及比例,观察残存白血病细胞被清除的情况。5.过继移植治疗后小鼠骨髓细胞到NSG小鼠体内,监测疾病长期缓解情况。结果:实验一:1.通过人类胚胎胸腺及胚胎肝脏CD34+细胞移植建立人源化小鼠模型。在移植后第7周人源化小鼠人类细胞嵌合率达49%以上。构建人B-ALL人源化小鼠模型。2.CAR T细胞制备及体外扩增。分离人源化小鼠脾脏中T细胞,制备抗CD19 CAR T细胞及对照组CAR T细胞,并在体外扩增。转染率分别为73%和45.3%。3.B-ALL人源化小鼠接受CAR T细胞输注治疗,发挥抗CD19阳性细胞作用。CAR T细胞输注后第1、2和第4周,抗CD19 CAR T细胞治疗组小鼠B淋巴细胞明显少于对照CAR T细胞治疗组,P值分别为0.0144,0.0047和0.0059。第6和第8周,抗CD19 CAR T细胞治疗组小鼠白血病细胞明显少于对照CAR T细胞治疗组,P值分别为<0.0001和0.0048。4.B-ALL人源化小鼠抗CD19 CAR T细胞治疗后血清中细胞因子释放。治疗后第1周抗CD19 CAR T治疗组小鼠血清中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）及白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）显着性高于对照CAR T治疗组,P值分别为0.0095和0.0422;治疗后第4周抗CD19 CAR T治疗组小鼠血清中γ干扰素（interferon-γ,INF-γ）显着性高于对照CAR T治疗组,P值为0.0161。5.抗CD19 CAR T细胞治疗延长B-ALL人源化小鼠生存时间。对照CAR T细胞治疗组小鼠生存时间为5182天（中位生存时间为72天）,抗CD19 CAR T治疗组小鼠生存时间为CAR T细胞治疗后86>120天（中位生存时间为99天）,生存期明显长于对照CAR T治疗组小鼠,P值为0.003。实验二:1.小鼠骨髓中白血病细胞较外周组织抵抗T细胞治疗。白血病NSG小鼠接受异基因T细胞治疗,小鼠骨髓中的白血病细胞比例明显高于外周血、脾脏、肝脏、肺及肾脏（P<0.001）。2.B-ALL NSG小鼠白血病细胞表达CXCR4。3.CXCR4拮抗剂使ALL NSG小鼠白血病细胞进入外周血。给予B-ALL NSG小鼠注射AMD3100（以下简称AMD）或PBS。第一次及最后一次给药后3、6和12 h AMD组小鼠外周血白血病细胞的比例和细胞计数明显高于PBS组。第1次给药后第7天AMD组小鼠外周血细胞比例及计数均显着性低于PBS组,P值分别为0.0359和<0.001,而第21天及28天两组小鼠外周血白血病细胞无统计学意义。两组小鼠组织器官中白血病细胞数无统计学意义。4.CXCR4拮抗剂协助供体淋巴细胞输注（donor lymphocyte injection,DLI）增强移植物抗白血病（graft-versus-leukemia,GVL）效应。DLI联合AMD治疗组在第15天,外周血白血病细胞水平明显低于DLI联合PBS对照组,P值为<0.0001。DLI后第25天,DLI联合AMD组小鼠骨髓白血病细胞的比例明显低于DLI联合PBS组,P值为0.0075。5.CXCR4拮抗剂联合DLI在更具侵袭性的B-ALL NSG模型中也可以达到清除白血病作用。在白血病细胞增殖较快的B-ALL NSG小鼠模型中,给予两轮DLI联合AMD/PBS治疗。首次治疗后第31天AMD组小鼠（2/5小鼠未检测到GFP+细胞）外周血白血病百分比和计数明显低于PBS组,P值分别为0.0098和0.007;AMD组小鼠骨髓中白血病细胞计数明显低于PBS组,P值为0.0174。DLI联合AMD/PBS小鼠骨髓作为1代小鼠,骨髓细胞移植给2代NSG小鼠。AMD组2代小鼠外周血白血病细胞明显低于PBS组2代小鼠,第5、6、7及第8周P值分别为0.033、0.0077、0.0133和0.0829。AMD组1只2代小鼠23周均未检测出白血病细胞。结论:1.用人源化小鼠脾脏T淋巴细胞构建的CD19 CAR T细胞可以在体外扩增。2.用人源化小鼠脾脏T细胞构建的CD19 CAR T细胞可在B-ALL人源化小鼠体内杀伤普通的人B淋巴细胞及白血病细胞。3.应用CD19 CAR T细胞治疗的B-ALL人源化小鼠血清中细胞因子升高。4.CD19 CAR T细胞存活和扩增程度与治疗效果呈正相关。5.CD19 CAR T细胞治疗B-ALL人源化小鼠模型能够模拟临床情况,为CAR T细胞抗肿瘤作用评价及改善治疗方法提供良好的模型。6.B-ALL对骨髓中异基因T细胞的杀伤作用不如在外周敏感。7.CXCR4拮抗剂AMD3100可以使骨髓中白血病细胞进入外周。8.在B-ALL NSG小鼠模型中,单纯应用AMD3100不能有效清除白血病细胞。9.应用AMD3100不增加DLI的移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD）效应。10.CXCR4拮抗剂增强异基因T细胞抗白血病效应。
万江波[10]（2017）在《IL-10基因修饰的树突状细胞诱导1型调节T细胞在防治GVHD和保存GVL中的研究》文中进行了进一步梳理背景和目的:Allo-HSCT是有望治愈血液系统恶性肿瘤的根本手段,但是对于allo-HSCT患者来说,GVHD是主要的移植相关死因。然而,来自异基因供体T淋巴细胞还可以产生GVL效应,从而减少移植后白血病的复发。因此,如何在防治GVHD的同时保留GVL效应是目前改善allo-HSCT治疗效果的关键。Tregs在针对自身和外来抗原产生的外周免疫耐受中发挥重要作用。它分为两大类,即nTregs和iTregs,后者主要为Tr1细胞。nTregs在机体内含量极少,体外大量扩增难度大,难以大规模生产而满足临床需求。本研究拟用IL-10基因修饰的DCs诱导产生Tr1细胞,并对其在体外对T细胞增殖,混合淋巴细胞反应以及小鼠骨髓移植模型中对GVHD以及移植动物的生存进行了观察。研究方法:构建携带IL-10基因的慢病毒载体转染受体DCs,应用DCLV-IL-10与供体CD4+T细胞共培养后免疫磁珠分选,获得纯化的Tr1细胞,并应用流式细胞和ELISA方法分析Tr1细胞生物特性;同时利用体外淋巴细胞增殖实验和混合淋巴细胞反应观察其特异性免疫抑制效应,在白血病小鼠骨髓移植模型中,观察其对GVHD的发生和GVL效应的影响。结果:1.携带IL-10的慢病毒载体的构建并转染DCs,DCLV-IL-10保留成熟DCs的表型,并分泌高水平的IL-10。2.受体DCLV-IL-10与供体幼稚CD4+T细胞共培养,能诱导产生大量的表达特征性CD49b、LAG-3、CD4和CD25免疫表型,同时表达IL-10和IFN-γ,而不表达Foxp3的T细胞,符合Tr1细胞的免疫特征。3.诱导产生的Tr1细胞分泌高水平的IL-10、IFN-γ以及低水平的IL-4、IL-2,对于其发挥免疫调节功能具有重要的作用;4.体外试验显示诱导产生的Tr1细胞抑制CD4+和CD8+T细胞增殖以及混合淋巴细胞反应,并呈剂量依赖趋势,此效应能被抗IL-10抗体所中和,提示其免疫抑制作用主要依靠IL-10;5.在C57BL/6→BALB/c小鼠骨髓移植模型中,输注Tr1细胞能显着减轻受体小鼠临床和病理GVHD的程度,延长生存期;6.在C57BL/6→BALB/c小鼠白血病骨髓移植模型中,输注Tr1细胞受体小鼠T细胞维持对A20淋巴瘤细胞的杀伤效应,出现Th1向Th2细胞转化,同时其生存期也明显延长,提示Tr1细胞在抑制GVHD的同时也保留了异基因供体T细胞的GVL效应。结论:1.应用IL-10基因修饰的受体DCs与供体CD4+T细胞共培养,体外大规模诱导符合临床应用的Tr1细胞是可行的,同时受体DCLV-IL-10诱导产生的Tr1细胞,在体外具有特异性的免疫抑制功能。2.受体DCLV-IL-10诱导产生的Tr1细胞,在小鼠白血病异基因骨髓移植模型中,输注Tr1细胞明显延长无病生存期,提示Tr1细胞在明显减轻GVHD程度的同时能够保留GVL效应。
二、化疗对急性白血病患者INF-γ、IL-12表达关系的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、化疗对急性白血病患者INF-γ、IL-12表达关系的影响（论文提纲范文）
（1）“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文名称缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察 |
| 1 一般资料 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 纳入标准 |
| 2.2 排除标准 |
| 2.3 剔除标准 |
| 2.4 退出标准 |
| 2.5 中止标准 |
| 2.6 观察指标:包括安全性观察指标和疗效性观察指标 |
| 2.7 疗效判断 |
| 3 治疗方法 |
| 4 统计学分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 三组患者基线资料比较 |
| 5.2 三组患者治疗前后生存率及生存期比较 |
| 5.3 三组患者治疗前后肿瘤大小比较 |
| 5.4 三组患者治疗前后生化指标水平比较 |
| 5.5 三组患者中医证候评分比较 |
| 5.6 三组患者生存质量评分比较 |
| 5.7 观察指标对患者疗效及预后的影响 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”对晚期肝癌患者生存率及生存期的影响 |
| 2 肝癌肝再生微环境及“补肾生髓成肝”的改善作用 |
| 3 “补肾生髓成肝”对患者中医证候评分及生存质量的影响 |
| 4 “补肾生髓成肝”对患者并发症及预后的影响 |
| 参考文献 |
| 第二部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的疗效机制研究 |
| 1 研究样本及方法 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验操作流程 |
| 2 统计学处理方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 肝再生相关细胞因子正态性检验结果 |
| 3.2 肝再生相关细胞因子在各组人群中表达的差异性 |
| 3.3 肝再生相关细胞因子表达水平之间的相关性分析 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”疗法相关研究进展 |
| 2 “补肾生髓成肝”改善肝再生微环境防治肝癌的疗效机制 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述一 肝癌微环境的研究现状 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 中医药影响肝癌微环境的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中医证候评分量表 |
| SF-36 |
| 在校期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（2）减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白血病概述 |
| 1.1.1 白血病的定义及常见症状 |
| 1.1.2 白血病的发现及分类 |
| 1.1.3 白血病发病机制研究进展 |
| 1.1.4 白血病流行病学 |
| 1.1.5 白血病的治疗 |
| 1.2 白血病自发性缓解与细菌感染 |
| 1.3 细菌抗肿瘤研究 |
| 1.3.1 细菌抗肿瘤研究历程 |
| 1.3.2 细菌抗肿瘤的优势 |
| 1.3.3 细菌抗肿瘤的应用前景 |
| 1.4 沙门氏菌抗肿瘤研究 |
| 1.4.1 沙门氏菌有效靶向肿瘤 |
| 1.4.2 沙门氏菌介导肿瘤细胞自我死亡 |
| 1.4.3 沙门氏菌减少肿瘤转移 |
| 1.4.4 沙门氏菌诱发宿主抗肿瘤免疫反应 |
| 1.4.5 沙门氏菌增强肿瘤化疗敏感性 |
| 1.4.6 沙门氏菌联合治疗进一步促进了肿瘤的消退 |
| 1.4.7 沙门氏菌的遗传学改造 |
| 1.4.8 沙门氏菌可作为递呈肿瘤治疗分子载体 |
| 1.5 减毒沙门氏菌VNP20009的研究 |
| 1.5.1 减毒沙门氏菌VNP20009的构建及遗传特点 |
| 1.5.2 减毒沙门氏菌VNP20009的生物分布特性 |
| 1.5.3 减毒沙门氏菌VNP20009的毒理学评价 |
| 1.5.4 减毒沙门氏菌VNP20009的抗肿瘤研究 |
| 1.6 课题研究思路、目的、意义及内容 |
| 1.6.1 研究思路 |
| 1.6.2 研究目的和意义 |
| 1.6.3 研究内容 |
| 第二章 VNP20009对急性淋巴细胞白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株及细胞株 |
| 2.2.2 实验动物及饲养 |
| 2.2.3 试剂与耗材 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.2.5 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 2.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.5 L1210皮下瘤模型建立 |
| 2.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 2.3.7 石蜡切片的制备 |
| 2.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 2.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 2.3.10 总蛋白的提取 |
| 2.3.11 蛋白浓度测定 |
| 2.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 2.3.13 统计学分析 |
| 2.4 研究结果 |
| 2.4.1 VNP20009 体外抑制L1210/Jurkat细胞增殖 |
| 2.4.2 VNP20009 体外诱导L1210/Jurkat细胞凋亡 |
| 2.4.3 VNP20009治疗L1210细胞荷瘤小鼠体重和活动未见异常 |
| 2.4.4 VNP20009抑制L1210皮下移植瘤生长 |
| 2.4.5 VNP20009引起L1210皮下移植瘤组织坏死 |
| 2.4.6 VNP20009诱导L1210皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 2.4.7 VNP20009治疗L1210皮下移植瘤凋亡蛋白表达量升高 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 VNP20009对急性髓系白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株及细胞株 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 主要试剂与耗材 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.2.5 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 3.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.3.5 HL-60皮下瘤模型建立 |
| 3.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 3.3.7 石蜡切片的制备 |
| 3.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 3.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 3.3.10 总蛋白的提取 |
| 3.3.11 蛋白浓度测定 |
| 3.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 3.3.13 统计学分析 |
| 3.4 研究结果 |
| 3.4.1 VNP20009体外抑制HL-60细胞增殖 |
| 3.4.2 VNP20009体外诱导HL-60细胞凋亡 |
| 3.4.3 VNP20009治疗HL-60细胞荷瘤小鼠体重和活动情况无异常 |
| 3.4.4 VNP20009抑制HL-60皮下移植瘤生长 |
| 3.4.5 VNP20009引起HL-60皮下移植瘤组织坏死 |
| 3.4.6 VNP20009诱导HL-60皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 3.4.7 VNP20009治疗HL-60皮下移植瘤组织凋亡蛋白表达量增加 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 VNP20009 对系统性MLL-AF9 驱动型AML小鼠的治疗作用及免疫激活研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株及细胞 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 主要试剂与耗材 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.2.5 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 4.3.2 沙门氏菌VNP20009的组织分布 |
| 4.3.3 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞的复苏 |
| 4.3.4 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞小鼠尾静脉注射造模 |
| 4.3.5 抗凝全血样本的采集 |
| 4.3.6 血清样本的采集 |
| 4.3.7 MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞(GFP+)检测 |
| 4.3.8 血涂片瑞氏-吉姆萨染色 |
| 4.3.9 小鼠外周血细胞分类计数 |
| 4.3.10 原代脾脏单细胞悬液的制备 |
| 4.3.11 原代骨髓单细胞悬液的制备 |
| 4.3.12 原代白血病细胞红细胞裂解处理 |
| 4.3.13 原代白血病细胞的冻存 |
| 4.3.14 MLL-AF9 驱动型AML小鼠分组与给药治疗 |
| 4.3.15 细胞因子与趋化因子的测定 |
| 4.3.16 流式细胞术检测细胞表面分子 |
| 4.3.17 流式细胞术检测胞内细胞因子的表达 |
| 4.3.18 统计学分析 |
| 4.4 研究结果 |
| 4.4.1 VNP20009小鼠组织分布情况 |
| 4.4.2 MLL-AF9 驱动型AML小鼠模型的构建 |
| 4.4.3 VNP20009 治疗MLL-AF9 驱动型AML小鼠体重未见明显异常 |
| 4.4.4 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.5 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠脾脏中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.6 VNP20009 影响MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血细胞的分布 |
| 4.4.7 NP20009对MLL-AF9驱动型AML主要器官重量的影响 |
| 4.4.8 VNVNP20009 延长MLL-AF9驱动型 AML小鼠生存期 |
| 4.4.9 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.10 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.11 VNP20009 激活 MLL-AF9驱动型 AML 小鼠外周血中T淋巴细胞的增殖 |
| 4.4.12 VNP20009 促进 MLL-AF9 驱动型 AML 小鼠脾脏中 IFN-γ+效应T淋巴细胞的极化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）树突状细胞NLRP3炎症小体及免疫失衡在急性髓系白血病作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病骨黼Thl亚群分化的作用及机制 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病抗白血病作用及机制的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 免疫相关基因单核苷黢多态性在急性醢系白血病中的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学位论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章 |
（4）造血干细胞微嵌合及工程化树突状细胞促进受者T细胞活化的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 异体造血干细胞输注形成微嵌合并刺激受者外周血T细胞的活化 |
| (一)材料和方法 |
| (二)实验结果 |
| (三)实验讨论 |
| 第二章 工程化DCs促进受者局部淋巴结T细胞活化 |
| (一)材料和方法 |
| (二)实验结果 |
| (三)实验讨论 |
| 第三章 外周血造血干细胞联合工程化DC抑制肿瘤生长 |
| (一)材料和方法 |
| (二)实验结果 |
| (三)实验讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述:米托蒽醌和柔红霉素在AML诱导化疗中的系统性综述和meta分析 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（5）TLR-8激动剂刺激的DC对CD4+CD25+调节性T细胞的体外增殖及杀伤功能的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 6. 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 TLR-8信号通路与CD4~+CD25~+调节性T细胞在肿瘤发生发展过程中的关系 |
| 参考文献 |
（6）东方栓孔菌多糖的分离纯化、结构解析与生物活性研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语注释表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题研究背景 |
| 1.2 多孔菌多糖的研究进展 |
| 1.3 东方栓孔菌的研究概况 |
| 1.4 研究意义及内容 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 仪器与设备 |
| 2.3 东方栓孔菌多糖提取工艺优化的方法 |
| 2.4 多糖分离纯化、理化性质与初步结构表征的方法 |
| 2.5 TOP-2 的体外抗氧化活性及对酒精性肝损伤小鼠的保护作用的研究方法 |
| 2.6 TOP-2 对环磷酰胺致免疫抑制小鼠的保护作用的研究方法 |
| 2.7 TOP-2对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抗肿瘤与免疫调节活性的研究方法 |
| 2.8 TOP-2对PM2.5 致肺损伤小鼠的保护作用的研究方法 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 东方栓孔菌多糖的提取工艺优化 |
| 3.1 葡萄糖标准曲线的制作 |
| 3.2 超声辅助提取工艺优化 |
| 3.3 超声-微波辅助提取工艺优化 |
| 3.4 不同提取方法的比较 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 东方栓孔菌多糖的分离纯化、理化性质与初步结构表征 |
| 4.1 东方栓孔菌多糖的分离纯化 |
| 4.2 TOP-2 的理化性质 |
| 4.3 TOP-2 的初步结构表征 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 TOP-2 的体外抗氧化活性及对酒精性肝损伤小鼠的保护作用 |
| 5.1 TOP-2 的体外抗氧化活性 |
| 5.2 TOP-2 对酒精性肝损伤小鼠的保护作用 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 6 TOP-2 对环磷酰胺致免疫抑制小鼠的保护作用 |
| 6.1 TOP-2 对小鼠脏器系数的影响 |
| 6.2 TOP-2 对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响 |
| 6.3 TOP-2 对小鼠巨噬细胞NO生成的影响 |
| 6.4 TOP-2 对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 |
| 6.5 TOP-2 对小鼠NK细胞和CTL细胞毒性作用的影响 |
| 6.6 TOP-2 对小鼠血清细胞因子和免疫球蛋白的影响 |
| 6.7 TOP-2 对小鼠抗氧化能力的影响 |
| 6.8 讨论 |
| 6.9 小结 |
| 7 TOP-2对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抗肿瘤与免疫调节活性 |
| 7.1 TOP-2 对小鼠瘤重和抑瘤率的影响 |
| 7.2 TOP-2 对小鼠体重和免疫器官系数的影响 |
| 7.3 TOP-2 对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响 |
| 7.4 TOP-2 对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响 |
| 7.5 TOP-2 对小鼠血清细胞因子的影响 |
| 7.6 TOP-2对TLR4 介导的NF-κB信号通路的影响 |
| 7.7 讨论 |
| 7.8 小结 |
| 8 TOP-2对PM2.5致肺损伤小鼠的保护作用 |
| 8.1 TOP-2 对小鼠肺组织湿重/干重比 |
| 8.2 TOP-2 对小鼠BALF中炎性细胞的影响 |
| 8.3 TOP-2 对小鼠BALF中 TP、ALB和 CRP含量的影响 |
| 8.4 TOP-对小鼠BALF中 MPO、LDH、AKP和 ASM活性的影响 |
| 8.5 TOP-2 对促炎因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量的影响 |
| 8.6 TOP-2 对SOD、CAT和GSH-Px活性的影响 |
| 8.7 TOP-2 对MDA、PCG和 8-Ohd G含量的影响 |
| 8.8 TOP-2 对Nrf2 和HO-1 表达的影响 |
| 8.9 TOP-2 对NLRP3 炎症小体活化的影响 |
| 8.10 讨论 |
| 8.11 小结 |
| 9 结论与创新点 |
| 9.1 结论 |
| 9.2 创新点 |
| 9.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 学位论文数据集 |
（7）移植物抗宿主病的特异性生物标志物的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 小鼠急性移植物抗宿主病模型的建立 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 急性移植物抗宿主病的血清生物标志物的研究 |
| 2.1 引言 |
| 第一部分 急性移植物抗宿主病小鼠的特异性生物标志物的研究 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 第二部分 急性移植物抗宿主病患者的特异性生物标志物的研究 |
| 2.4 材料与方法 |
| 2.5 结果 |
| 2.6 讨论 |
| 第三章 慢性移植物抗宿主病血清特异性生物标志物的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 自身免疫性疾病的生物标志物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表和撰写的论文 |
| 学位论文自评表 |
| 致谢 |
（8）Wnt/β-catenin信号途径对肿瘤相关巨噬细胞的调控及其在肝癌进展中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 Wnt信号对巨噬细胞发育及极化的影响研究 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 巨噬细胞中Wnt信号对肿瘤恶性生物学行为影响的体外研究 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 肿瘤细胞分泌的Wnt配体对巨噬细胞极化调控的体内和体外研究 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（9）急性B淋巴细胞白血病人源化小鼠的T淋巴细胞免疫治疗研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 CAR T细胞演化进程 |
| 1.1.1 第一代CAR T细胞 |
| 1.1.2 第二代CAR T细胞 |
| 1.1.3 第三代CAR T细胞 |
| 1.1.4 第四代CAR T细胞 |
| 1.2 抗CD19 CAR T细胞治疗复发难治的B-ALL |
| 1.2.1 靶点选择 |
| 1.2.2 临床试验疗效 |
| 1.2.3 临床试验中的不良反应 |
| 1.3 B-ALL经抗CD19 CAR T治疗后复发仍是亟待解决的难题 |
| 1.4 白血病耐药、复发及治疗与SDF-1/CXCR4轴相关 |
| 1.4.1 白血病细胞在骨髓中存活及归巢依赖于SDF-1/CXCR4轴 |
| 1.4.2 阻断SDF-1/CXCR4轴利于白血病细胞脱离骨髓环境 |
| 第2章 实验一 抗CD19 CAR T治疗人B-ALL人源化小鼠模型 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器与器材 |
| 2.1.3 实验动物与组织 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人源化小鼠的构建及检测 |
| 2.2.2 人B-ALL人源化小鼠制备 |
| 2.2.3 人源化小鼠脾脏T淋巴细胞分离 |
| 2.2.4 CAR T转染T淋巴细胞及体外扩增 |
| 2.2.5 CAR T细胞治疗人B-ALL人源化小鼠 |
| 2.2.6 小鼠外周血单个核细胞及组织中细胞分离 |
| 2.2.7 用于流式细胞检测的细胞染色 |
| 2.2.8 数据统计和分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 人源化小鼠及白血病人源化小鼠建立 |
| 2.3.2 CAR T转染并在体外扩增 |
| 2.3.3 CAR T细胞体内杀伤B淋巴细胞及白血病细胞 |
| 2.3.4 B-ALL人源化小鼠抗CD19 CAR T细胞治疗后血清中细胞因子升高 |
| 2.3.5 抗CD19CART细胞治疗延长B-ALL人源化小鼠生存时间 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 实验二 CXCR4拮抗剂协助异基因淋巴细胞抗白血病作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器与器材 |
| 3.1.3 实验动物与组织 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 B-ALL NSG小鼠制备 |
| 3.2.2 人外周血密度梯度离心法制备PBMC |
| 3.2.3 异基因淋巴细胞输注 |
| 3.2.4 小鼠外周血中细胞检测 |
| 3.2.5 小鼠外周血单个核细胞及组织中细胞分离 |
| 3.2.6 AMD3100注射 |
| 3.2.7 小鼠胫骨骨髓穿刺术 |
| 3.2.8 用于流式细胞检测的细胞染色 |
| 3.2.9 数据统计和分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 BM中白血病细胞对DLI的抗白血病作用有抵抗性 |
| 3.3.2 B-ALL NSG小鼠白血病细胞表达人CXCR4 |
| 3.3.3 CXCR4拮抗剂使ALL-NSG小鼠白血病细胞动员到外周血 |
| 3.3.4 CXCR4拮抗剂协助DLI增强GVL效应 |
| 3.3.5 CXCR4拮抗剂联合DLI在更具侵袭性的B-ALL NSG模型中也可以达到清除白血病作用 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间科研成果 |
| 致谢 |
（10）IL-10基因修饰的树突状细胞诱导1型调节T细胞在防治GVHD和保存GVL中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 绪论 |
| 第一部分 :IL-10慢病毒载体的构建及转染DCs |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 主要材料和仪器 |
| 1.2 主要方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第二部分 :IL-10 基因修饰的DCs诱导Tr1 细胞 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 主要试剂和仪器 |
| 1.2 主要方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第三部分 :IL-10 基因修饰的DCs诱导Tr1 细胞对移植动物GVHD的发生以及生存的影响 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 主要材料和仪器 |
| 1.2 主要方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 :博士期间发表的学术论文 |
| 异基因造血干细胞移植中防治移植物抗宿主病并保留移植物抗白血病效应的研究进展 |
| 参考文献 |
四、化疗对急性白血病患者INF-γ、IL-12表达关系的影响（论文参考文献）
- [1]“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究[D]. 刘皎皎. 湖北中医药大学, 2021
- [2]减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究[D]. 李美蓉. 华南理工大学, 2020
- [3]树突状细胞NLRP3炎症小体及免疫失衡在急性髓系白血病作用和机制研究[D]. 刘芹芹. 山东大学, 2020(04)
- [4]造血干细胞微嵌合及工程化树突状细胞促进受者T细胞活化的机制研究[D]. 邓磊. 军事科学院, 2020(01)
- [5]TLR-8激动剂刺激的DC对CD4+CD25+调节性T细胞的体外增殖及杀伤功能的影响[D]. 杨阿丽. 安徽医科大学, 2020(02)
- [6]东方栓孔菌多糖的分离纯化、结构解析与生物活性研究[D]. 郑义. 中国矿业大学, 2019(04)
- [7]移植物抗宿主病的特异性生物标志物的研究[D]. 陈婷. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [8]Wnt/β-catenin信号途径对肿瘤相关巨噬细胞的调控及其在肝癌进展中的作用和机制研究[D]. 杨阳. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [9]急性B淋巴细胞白血病人源化小鼠的T淋巴细胞免疫治疗研究[D]. 金春卉. 吉林大学, 2018(04)
- [10]IL-10基因修饰的树突状细胞诱导1型调节T细胞在防治GVHD和保存GVL中的研究[D]. 万江波. 上海交通大学, 2017(05)
标签：白血病论文; 巨噬细胞论文; 急性淋巴细胞性白血病论文; 树突状细胞论文; 急性髓性白血病论文;