一、基因治疗在肝脏移植中的应用进展（论文文献综述）
尹文[1]（2021）在《组织器官移植对临床输血的挑战与思考》文中提出临床输血和输血相关免疫对移植物成活至关重要。随着移植技术的发展,实现了肝移植、肾移植、小肠移植、肺移植、子宫移植、造血干细胞移植,异种器官移植也在积极探索,研究者也逐步对移植相关输血有了新的认识。本文阐述了实体器官移植及造血干细胞移植相关血液免疫学、围术期移植输血管理和异种器官移植未来的关注方向三个方面的内容,以期为移植技术发展过程中临床输血提供新的思路。
叶书林[2]（2021）在《木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究》文中认为目的:同种异体器官移植是治疗终末器官衰竭的有效手段。为了维持移植物在受者体内的存活,往往需要长期服用免疫抑制剂。一方面,术后器官排斥反应因免疫抑制剂的使用得以降低;另一方面长期应用免疫抑制剂的不良反应严重影响移植物和移植患者的存活,是移植免疫学和临床医学研究亟待解决的一大难题。中药免疫调节相关的基础研究和临床研究取得许多新的进展,从中药中寻求高效、低毒的免疫抑制剂是当今移植免疫学领域的研究方向之一。木犀草素是一种黄酮类化合物,研究表明木犀草素具有许多药理作用,如抗炎、抗肿瘤、抗氧化和神经保护等。在免疫调节作用方面的研究中发现木犀草素可以抑制小鼠T细胞的增殖和活化,下调IFN-γ、IL-6、IL-5等细胞因子的表达,具有免疫抑制作用。此外,还可以通过诱导CD4+CD25T淋巴细胞向CD4+CD25+调节性T细胞分化来减轻气道炎症。然而,目前木犀草素对于同种异体器官移植排斥反应方面的作用研究仍为空白。由于皮肤上抗原呈递细胞很多,排斥反应比其他器官移植更强,若药物能抑制皮肤排斥反应,则更能抑制其他器官移植排斥。因此,本实验首先通过小鼠同种异体皮肤移植模型探讨木犀草素对移植排斥反应的作用,再以同种异体胰岛移植模型进行验证,研究木犀草素对小鼠同种异体器官排斥反应的作用,以及其免疫调节的作用机制。方法:1.木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究建立小鼠皮肤移植模型,以BALB/c小鼠为供体,C57BL/6小鼠为受体。造模成功后随机分为四组,分别为同种异体皮肤移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、雷帕霉素组（Rapa,腹腔注射,1mg/kg）、木犀草素低剂量组（Lut-low,灌胃,25mg/kg）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）,观察木犀草素对移植皮片生存时间的影响,用中位存活时间（Mediansurvival time,MST）表示;移植10天后,取移植皮片检测炎症细胞浸润、CD3、Foxp3及相关细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-17a、Foxp3基因的表达情况;同时取移植小鼠脾脏和外周引流淋巴结检测CD4+CD44high CD62Llow 和 CD8+CD44high CD62Llow 效应 T 细胞、CD4+Foxp3+调节性 T细胞、CD11c+CD86+和CD11c+CD80+成熟树突状细胞的比例。木犀草素联合应用Anti-CD25删除小鼠体内Treg对小鼠皮肤移植反应的实验研究,分为四组:同种异体皮肤移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）、木犀草素高剂量联合同型对照组（Lut-H+Isotype,木犀草素50mg/kg灌胃联合Isotype抗体第0、3、6天0.2mg腹腔注射）,以及木犀草素高剂量联合Anti-CD25抗体组（Lut-H+PC61,木犀草素50mg/kg灌胃联合PC61抗体第0、3、6天0.2mg腹腔注射）,观察移植皮片生存时间,同时检测移植10天后脾脏和淋巴结中CD11c+CD86+和CD11c+CD80+成熟DC的比例。2.木犀草素对小鼠同种异体胰岛移植排斥反应的研究以BALB/c小鼠胰岛细胞为供体,移植到STZ诱导的糖尿病C57BL/6小鼠肾包膜下,建立小鼠同种异体胰岛移植模型。造模成功后随机分为四组,分别为同种异体胰岛移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、雷帕霉素组（Rapa,腹腔注射,1mg/kg）、木犀草素低剂量组（Lut-low,灌胃,25mg/kg）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）,观察木犀草素对移植后血糖的影响,用中位存活时间（Median survival time,MST）表示;移植10天后,取胰岛移植物检测胰岛素、炎症细胞浸润及CD3+T的表达情况;同时取移植小鼠脾脏和引流淋巴结通过流式细胞术检测CD4+Foxp3+Treg的比例。3.木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验流式细胞术分选CD3+T淋巴细胞,采用CCK-8法检测木犀草素对体外CD3+T细胞的细胞毒性,CFSE法检测木犀草素对体外CD3+T淋巴细胞增殖的影响,ELISA检测CD3+T细胞上清液中细胞因子IFN-y、IL-10和IL-17a蛋白的表达水平,流式细胞术分选CD4+CD25-T,检测木犀草素干预后对CD4+CD25+Treg的分化情况,Western Blotting检测木犀草素干预后CD3+T细胞中AKT/mTOR信号通路的蛋白表达。结果:1.木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究（1）与对照组相比,木犀草素低剂量组和高剂量组均能延长移植皮片的存活时间[MST=23.50±5.34（Lut-low）VS.16.50±2.74（Control）,P<0.05;MST=33.00±5.04（Lut-high）VS.16.50±2.74（Control）,P<0.01]。此外,与雷帕霉素组比较,木犀草素高剂量组在延长皮肤移植物存活率的作用差异无统计学意义（MST=33.00±5.04（Lut-high）VS.35.00±6.70（Rapa）,P>0.05）。（2）在移植皮片中,与对照组相比,木犀草素低剂量和高剂量组均能改善炎症细胞浸润,抑制CD3+T淋巴细胞浸润,上调Foxp3的表达,同时抑制促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-17amRNA的表达,上调IL-10和Foxp3mRNA的表达。（3）在受体小鼠淋巴器官脾脏和淋巴结中,与对照组相比,木犀草素低剂量和高剂量组均可显着降低CD4+CD44highCD62Llow和CD8+CD44highCD62Llow 效应 T 细胞以及 CD11c+CD86+和 CD11c+CD80+成熟 DC 的比例,同时显着增加引流淋巴结中CD4+Foxp3+Treg的比例（P<0.05或P<0.01）。（4）在应用Anti-CD25抗体删除Treg后,可逆转木犀草素延长移植皮片生存时间的作用,同时逆转对成熟DC的抑制作用（P<0.05或P<0.01）。2.木犀草素对小鼠同种异体胰岛移植排斥反应的研究（1）与对照组相比,木犀草素可延长移植术后胰岛的存活时间。（2）在胰岛移植区域,与对照组相比,木犀草素可减轻炎症细胞浸润。（3）在受体小鼠周围淋巴器官中,与对照组相比,木犀草素可上调移植后引流淋巴结中CD4+Foxp3+Treg的比例。3.木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验（1）不同浓度的木犀草素（1.25、2.5、5、10和20μM）给药48h和96h后,仅20μM浓度木犀草素对T细胞有活力有明显抑制作用（P<0.01）。（2）在T细胞增殖实验中,与对照组相比,木犀草素低浓度（Lut-low,2.5μM）和木犀草素高浓度（Lut-high,5μM）组与雷帕霉素组（Rapa,0.1μM）一样,均能显着抑制T细胞的增殖（P<0.01）。（3）与对照组相比,木犀草素低浓度和高浓度组均能显着抑制CD3+T细胞上清液中IFN-y和IL-17a的蛋白水平（P<0.01）,并上调IL-10蛋白的表达水平（P<0.05或P<0.01）。（4）与对照组相比,木犀草素低浓度和高浓度组均能明显促使CD4+CD25-T细胞向CD4+Foxp3+Treg分化（P<0.01）。（5）木犀草素（无论低浓度还是高浓度）能有效抑制P-p70S6K、P-mTOR和P-AKT蛋白的表达（P<0.01）,而雷帕霉素组对P-AKT蛋白的表达无明显作用（P>0.05）。结论:我们实验结果揭示了不管是在小鼠同种异体皮肤移植模型中还是胰岛同种异体移植模型中,木犀草素均可显着延长移植物的存活时间,提示木犀草素可抑制同种异体器官移植排斥反应,其潜在的作用机制可能是通过抑制效应性T细胞的增殖、DCs的成熟,同时诱导CD4+Foxp3+Treg的分化,以及抑制AKT/mTOR信号通路的激活而实现的。因此,我们的研究填补了木犀草素在抑制移植反应作用方面的空白,木犀草素在自然界中来源广泛,无明显毒副作用,作为一种潜在的免疫抑制剂,具有进一步深入研究的价值。
潘慧[3]（2020）在《肝移植术后患者他克莫司的血药浓度分布，凝血功能及肝肾功能的探讨》文中指出目的:探讨应用他克莫司抗排异方案治疗的肝移植受者术后他克莫司血药浓度的分布,凝血功能,肝肾功能变化趋势及影响因素,为他克莫司的治疗药物监测,以及血药浓度范围提供参考,为可能出现的肝肾不良反应提供依据,确保他克莫司安全有效。方法:回顾性研究2015.9～2019.10在上海市第一人民医院行肝移植的85例,经筛选,搜集71例患者肝移植术前及术后1～5d凝血功能指标:凝血酶原时间（PT）,活化部分凝血酶原时间（APTT）,凝血酶时间（TT）,血小板计数（PLT）以及纤维蛋白原（FBG）,进行统计分析;经筛选,搜集66例患者术后30 d内,90 d和180 d他克莫司血药浓度,和谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肌酐（Scr）指标,观察他克莫司血药浓度分布,探讨术后肝肾功能骤升的原因,及肝肾功能长期变化的趋势。符合正态的数据分布采用t检验,反之采用Wilcoxon秩和检验。结果:71例患者术后PT,APTT,TT及FBGd1～d 5内逐步恢复,但PLT在术后d1～d 5内持续下降,d2～d 5的PLT与术前相比,差异有统计学意义（P<0.05）。66例患者30 d内他克莫司平均血药浓度7.39±3.18ng/m L,39%的浓度在6～10ng/m L;90d为6.32±3.09ng/m L,58%的浓度在4～8ng/m L;180d为6.43±3.03ng/m L,55%的浓度在4～8ng/m L。66例患者的ALT、AST及Scr在术后1 d出现峰值,ALT及AST术后30天内恢复正常,术后180天基本保持在正常范围内,与术前相比无统计学差异;Scr术后7天内恢复,180天Scr明显高于术前（P<0.05）,且具有统计学差异。联合西罗莫司治疗组,180天Scr与术前无差异;单用他克莫司治疗组,180天Scr与术前相比,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:长期应用他克莫司,不能忽视可能造成的血小板减少,治疗量即可能引起血小板聚集而导致血小板计数减少。诱导免疫治疗,或联用西罗莫司,可延迟或减少他克莫司的暴露,维持他克莫司最低有效浓度,既有抗排异作用,也可减少肾毒性。他克莫司对肾脏的损伤是慢慢积累的,联合西罗莫司可改善他克莫司引起的肾功能损伤。
李婷[4]（2020）在《肝脏异种移植后CD47-SIRPα不兼容介导血细胞吞噬作用的研究》文中提出背景:临床肝移植的成功开展,为肝脏疾病的外科治疗开启了新的篇章。目前肝移植已经成为公认的治疗终末期肝病的唯一有效手段,同时也是急性爆发性肝衰竭、肝细胞癌、肝门部胆管癌和一些代谢性疾病的最佳选择。随着手术技术和免疫抑制剂的不断进步,肝移植的手术适应证不断扩大,可能的受益人群也在不断的增加,伴随而来的便是日益凸显的供体短缺问题。虽然活体肝移植、心脏死亡后器官捐献和其他一些边缘供肝的应用可以一定程度上缓解供体短缺带来的压力,然而由于数量有限并且会增加潜在的并发症无法从根本上解决问题。从长远的角度来讲,最实用和有效的解决方法便是异种移植。猪由于其器官大小及生理特点与人类类似并且具有良好的繁殖特性,基因修饰的可行性等优势成为了理想的异种供器官来源。然而相比于非灵长类哺乳动物而言,显然猪与人的亲缘性更远,因此需要更大程度的基因修饰。识别可能获益的遗传表位靶点并辨别其可能的作用对于转基因猪遗传修饰表位的筛选显得至关重要。随着各种转基因猪的不断问世,猪器官异种移植取得了重大进展,异位猪心脏异种移植和肾异种移植分别达到了 945天和435天的生存记录。然而,异种的猪肝脏移植存活时间却仍然无法突破一个月。原因虽然尚不十分明确,但是与凝血功能失调特别是严重的血小板丢失导致的致命出血密切相关。此外,贫血的发生被认为也与肝脏异种移植相关。目前认为异种肝移植后血小板减少的主要原因包含以下两点:（1）猪内皮细胞与灵长类动物的血小板之间的细胞表面受体-配体相互作用不协调;（2）猪肝内皮抗原天然抗体的存在,导致内皮细胞活化。其中,脱唾液酸蛋白受体-1（asialoglycoprotein receptor-1,ASGR1）和 CD11b/CD18（MAC-1）的作用较为明确。同样,猪肝脏的吞噬细胞可以参与人红细胞的吞噬作用。学界普遍认为CD47-信号调节蛋白α（signal regulatory protein-α,SIRPα）信号通路通过识别自我与非我调节吞噬反应,在体外的吞噬实验和体内的细胞移植实验中可介导排斥反应,可能参与了异种肝移植后的血小板减少和贫血的发生,但一直缺乏有力的器官水平的证据。研究目的:通过小鼠肝移植模型及大鼠-小鼠异种肝移植模型,探索CD47-SIRPα不兼容在肝脏移植器官水平对血细胞吞噬作用的影响,从而为转基因猪遗传修饰的表位筛选提供可靠的依据。实验方法:（1）通过完善技术细节和优化非技术细节构建出成熟稳定可靠的小鼠肝移植模型。（2）利用小鼠肝移植模型,探究在同种同基因肝移植后,CD47-SIRPα不兼容对外周血红细胞和血小板计数的影响。并通过免疫荧光染色观察CD41荧光信号的变化以及与F4/80的共定位现象。（3）构建大鼠-小鼠异种肝脏移植模型,通过组织学检查、ALT检测及流式细胞技术,确定其存在排斥反应及产生的排斥反应类型。（4）使用大鼠-小鼠肝脏异种移植模型,探究在异种肝移植后,排斥反应环境下,CD47-SIRPα不兼容对外周血红细胞和血小板计数的影响。并通过流式细胞技术检测血小板活化的情况。结果:（1）通过优化选择小鼠品系及胆道支架,小鼠原位肝移植的远期预后可以达到2周、1个月及3个月100%、80%及80%的生存率。（2）同种同基因肝移植模型后,野生型（wild-type,WT）肝脏移植后,与WT受体小鼠相比,CD47KO小鼠的红细胞计数无明显下降,血小板计数术后第1天（Postoperative day 1,POD1）和POD5有轻度下降。免疫荧光染色共聚焦显微镜观察,CD41荧光信号无明显增加,且与F4/80无共定位现象。（3）选用未脱乳与受体小鼠体重相仿的F344大鼠构建大鼠-小鼠异种肝移植模型,组织学检查和ALT检测证实存在严重的排斥反应。流式检测证实主要的浸润细胞为CD8+T细胞,且T细胞的免疫表型从幼稚的和中枢记忆T细胞向效应型记忆T细胞大量转化。（4）利用大鼠-小鼠异种肝移植模型,F344肝脏移植后,与WT受体小鼠相比,CD47KO小鼠外周血红细胞和血小板的变化并没有显着差异。两组的红细胞、血小板计数均随着时间的推移而不断下降,并且活化的血小板比例无明显变化。结论:（1）小鼠品系和胆道支架的选择制约至小鼠原位肝移植的远期预后。（2）同基因小鼠肝脏移植后,CD47-SIRPα不兼容不能介导肝脏对血细胞的吞噬作用。（3）大鼠-小鼠异种肝移植后产生的排斥反应主要是由CD8+T细胞介导的排斥反应。（4）大鼠-小鼠异种肝移植后,CD47-SIRPα不兼容亦不能介导肝脏对血细胞的吞噬作用。
曾宪鹏[5]（2019）在《小鼠肝脏低温携氧机械灌注系统的建立及保护机制研究》文中提出目的:由于器官来源不足,心脏死亡（donation after circulatory death,DCD）供肝等质量不佳的肝脏被应用于临床,为弥补冷保存（cold storage,CS）不能修复供肝质量的缺陷,肝脏低温携氧机械灌注（hypothermic oxygenated machine perfusion,HOPE）技术逐渐被使用。然而鉴于缺乏合适的研究模型,HOPE作用的分子机制尚不明晰。为此,我们拟建立小鼠肝脏HOPE模型,在探究合适灌注参数的基础上,应用该模型阐明HOPE对DCD供肝的保护作用机制。方法:对比应用不同流量HOPE灌注正常肝脏及热缺血30分钟肝脏的效果,验证小鼠肝脏HOPE系统的稳定性与有效性,并探寻适合的灌注流量。应用体外常温非载血复灌系统,阐明自噬在HOPE对DCD供肝中的作用。通过体外常温载血复灌系统与基因工具鼠,分析P选择素是否参与HOPE对DCD供肝的保护作用。结果:当HOPE流量不小于0.3 ml/min·g时,该系统能在正常小鼠肝脏中达到完全灌注。在流量为0.1-0.5 ml/min·g条件下,HOPE能发挥明显优于CS的DCD供肝保护作用。与CS相比,经历了HOPE的DCD供肝能够激活自噬体的生成,自噬蛋白表达与自噬体数量明显增加,然而应用自噬抑制剂后,HOPE的保护作用被消除。在炎症反应方面,P选择素敲除能够减轻DCD供肝损伤程度,其与野生型小鼠HOPE的作用机制类似。此外,比较P选择素敲除小鼠HOPE与CS对DCD供肝效果发现,P选择素敲除小鼠HOPE在拥有抗炎作用的基础上还能减轻DNA与氧化应激损伤。结论:我们成功建立了稳定的小鼠肝脏HOPE系统,阐明了HOPE可通过激活自噬及P选择素依赖与非依赖途径发挥对DCD供肝的保护作用。
刘巧玉[6]（2018）在《鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G（i）α2依赖MLK3信号通路介导小鼠肝脏缺血再灌注损伤》文中认为目的:肝脏缺血再灌注（I/R）损伤是肝切除和移植手术中的主要挑战。以前的研究表明,鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G（i）α2（GNAI2）参与心肌和大脑I/R损伤的进展,但在肝脏I/R中的作用尚未阐明。方法:在肝细胞特异性GNAI2敲除小鼠（GNAI2-LKO）和对照组（GNAI2-FLOX）中建立肝I/R模型;将从GNAI2-LKO和GNAI2-FLOX小鼠中分离的原代肝细胞培养并进行缺氧-再氧合（H/R）损伤。通过免疫组化染色（IH）,RT-PCR,免疫印迹（WB）和免疫共沉淀（Co-IP）等方法探讨GNAI2是I/R引发的肝损伤中具有特殊功能及其潜在的分子机制。结果:与假手术组（Sham）的小鼠相比,在肝I/R期间和之后野生型小鼠的肝组织中GNAI2mRNA和蛋白质的水平显着上调。肝细胞特异性GNAI2缺陷在体内减弱I/R诱导的肝损伤,炎症细胞因子表达,巨噬细胞/嗜中性粒细胞浸润和凋亡。GNAI2的缺失可通过上调MAPK和NF-κB途径激活加剧肝I/R损伤,并且阻断MLK3可减轻GNAI2介导的肝I/R损伤。结论:GNAI2通过JNK和NF-κB信号通路的依赖MLK3激活加重肝I/R损伤和炎症。我们的研究有望能通过抑制肝细胞中的GNAI2表达或阻断MLK3活性为预防肝I/R引发的损伤提供了潜在的治疗方法。
张丽娜[7]（2017）在《IL-10和FASL基因共转染的树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的研究》文中研究指明目的:通过基因工程修饰树突状细胞（Dendritic cells,DCs）,构建hIL-10和hFasl重组质粒,探讨hIL-10和hFasl单个和联合修饰DCs在体外抑制免疫排斥反应的效果。同时通过构建大鼠肝移植急性排斥动物模型,进一步研究单个和联合修饰后的DCs对大鼠肝脏移植后的排斥反应和存活时间的影响,探讨其在诱导免疫耐受的机制,为今后临床肝脏移植免疫耐受治疗提供新的策略。方法:1、大鼠骨髓来源的DCs的培养及鉴定:用低剂量的细胞因子（集落刺激因子以及IL-4）诱导培养大鼠骨髓来源的造血前体细胞分化为成熟树突状细胞（mature dendritic cells,mDCs）和未成熟的树突状细胞（immature dendritic cells,imDCs）,利用倒置显微镜等对细胞进行形态学观察,并用流式细胞法以及免疫荧光法对其进行表型鉴定,利用混合淋巴细胞法对其进行功能学鉴定。2、构建PCDH-CMV-EGFP-hIL-10以及PCDH-CMV-EGFP-hFasl慢病毒表达载体:（1）PCR扩增hIL-10以及hFasl基因后并用1%琼脂糖凝胶分离、回收PCR扩增产物后与PCDH-CMV-EGFP空载体一起用EcoR1以及BamH1进行双酶切,T4DNA连接酶连接过夜,将产物转入DH5α感受态细胞内;（2）挑取单克隆菌落扩增后进行菌落PCR以及质粒抽提,将提取的质粒进行酶切验证,验证阳性的质粒送公司测序;（3）选取细胞状态良好的293T细胞按照慢病毒包装体系进行慢病毒的包装、浓缩,浓缩后的病毒颗粒于-80℃保存。3、慢病毒介导的PCDH-CMV-EGFP-hIL-10、PCDH-CMV-EGFP-hFasl单个以及联合感染imDCs,检测感染后imDCs的分子表型以及其免疫学功能的变化:（1）ELISA、Western-blot检测感染后细胞的IL-10及Fasl的表达情况;（2）流式细胞术检测感染后的imDCs表面CD80、CD86以及MHC-II分子的表达情况;（3）混合淋巴细胞反应法检测感染后的imDCs对T细胞的增殖作用;（4）ELISA检测混合淋巴细胞后上清里面TGF-β1以及TNF-α的变化。4、大鼠肝脏移植急性排斥动物模型的建立:采用改良二袖套法用Lewis作为供鼠,BN作为受鼠建立大鼠肝脏移植急性排斥模型。5、PCDH-CMV-EGFP-hIL-10以及PCDH-CMV-EGFP-hFasl单基因以及联合基因感染后的DCs输注对于诱导肝移植后免疫耐受的研究:（1）移植后肝脏苏木精-伊红染色（HE）以及急性免疫排斥反应的病理评分（RAI）;（2）观察各组大鼠术后的生存时间。结果:1、DCs的培养及鉴定:（1）倒置显微镜观察细胞形态显示DCs形态不规则,胞核空亮,周围有突起;（2）流式细胞法及免疫荧光实验显示mDCs较imDCs高表达CD80、CD86以及MHC-II分子;（3）混合淋巴细胞实验证实mDCs对淋巴细胞有明显的促增殖作用,而imDCs的促增殖作用较弱。2、PCDH-CMV-EGFP-hIL-10以及PCDH-CMV-EGFP-hFasl真核表达质粒的构建、筛选、鉴定、扩增以及抽提:（1）琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物大小与目的基因大小一致;（2）菌落PCR显示连接后的质粒成功导入目的基因片段;（3）重组质粒经双酶切验证后都有两条条带,大小也与目的基因大小一致;（4）双酶切阳性的重组质粒测序后的结果经Genbank比对后基因序列完全正确。3、慢病毒介导的PCDH-CMV-EGFP-hIL-10、PCDH-CMV-EGFP-hFasl单个以及联合感染imDCs,检测感染后imDCs的分子表型以及其免疫学功能的变化:（1）ELISA检测转染后各组上清目的蛋白的表达,发现IL-10组以及联合感染组细胞上清里IL-10的表达均高于其它组,而FasL组以及联合感染组细胞上清里sFasl的表达与其它组差异无统计学意义;（2）Western-blot显示单基因以及双基因联合感染组均有相应的目的蛋白的高表达,空载体组能够低表达IL-10蛋白,未见明显的Fasl蛋白的表达;（3）流式细胞法证实基因感染后并未明显影响imDCs表面CD80、CD86以及MHC-II分子的表达;（4）混合淋巴细胞实验证实单基因感染组对淋巴细胞的增殖反应均弱于imDCs组以及mDCs组,双基因联合感染组对淋巴细胞的增殖反应弱于单基因感染组;（5）感染后DCs与淋巴细胞混合后上清中TGF-β1显示双基因转染组上清中TGF-β1的含量较单基因组略高,IL-10组上清液中TGF-β1含量较Fasl组略高,而Fasl组上清液中TGF-β1含量较mDCs组略高,与imDCs组以及空载体组差异无统计学意义;TNF-α的ELISA检测结果显示双基因感染组上清液中TNF-α含量较Fasl组、空载体组、imDCs组以及mDCs组略低,而与IL-10组差异无统计学意义,Fasl组mDCs组略低,与imDCs组、空载体组差异无统计学意义。4、大鼠肝脏移植急性排斥模型的建立:利用改良二袖套法成功构建了Lewis-BN大鼠肝脏移植急性排斥模型。5、PCDH-CMV-EGFP-hIL-10以及PCDH-CMV-EGFP-hFasl单基因、联合基因感染后的DCs输注对于同种异体肝移植后免疫耐受的研究:移植术后大鼠肝脏病理示双基因修饰组以及IL-10修饰组仅有少量淋巴细胞浸润,RAI评分约为2-4分,属于非确定型急性排斥反应到轻度排斥反应之间;Fasl组汇管区大部扩张,中量淋巴细胞浸润,RAI评分约为4-5分,属于轻-中度排斥反应;imDCs组及空载体组汇管区见中量淋巴细胞浸润,大部分胆管上皮破坏,RAI评分约为5-6分,属于中度排斥反应;mDCs组及未加DCs干预组表现为重度汇管区炎,大部分胆管上皮破坏、变性,RAI评分约为9分,属于重度排斥反应。结论:1、本实验利用大鼠骨髓造血干细胞在体外成功诱导和培养出足够数量的mDCs以及imDCs。2、成功构建了PCDH-CMV-EGFP-hIL-10以及PCDH-CMV-EGFP-hFasl慢病毒表达载体,并成功感染imDCs,获得较好的感染效率。同时,转入的基因可在imDC细胞中稳定表达。3、本实验通过hIL-10与hFasl双基因共修饰imDCs后,在体外诱导免疫耐受的能力明显高于单基因感染以及未感染组,说明联合应用hIL-10与hFasl在诱导移植免疫耐受的研究有很好的前景。4、本实验利用二袖套法以Lewis大鼠作为供体,BN大鼠作为受体成功构建大鼠肝脏移植排斥反应模型。5、单基因修饰以及双基因共修饰后的imDCs在体内均能抑制急性排斥反应,并且双基因修饰组优于单基因修饰组。
李来邦[8]（2009）在《重组腺病毒载体Ad5-galectin-9对大鼠肝移植抗排斥反应的实验研究》文中认为第一部分大鼠原位肝移植急性排斥反应模型的建立目的：建立稳定的大鼠原位肝移植的急性排斥反应模型并观察其急性排斥反应的特点。为进一步的实验研究搭建坚实的技术平台。方法：1采用改良“二袖套管法”,利用封闭群SD大鼠进行大鼠肝移植模型技能训练。2对照研究DA-Lewis, Lewis-Lewis配对组合的肝移植后排斥反应,分别观察术后第4d、7d、10d天症状、体征、肝功能变化、移植肝病理特征等的变化,并对肝移植急性排斥反应模型制备作出客观评价,每组另5只观察生存时间。结果：1技能练习阶段受体大鼠的存活时间大多不超过72小时。此时段主要为手术操作技能的训练、围手术期管理积累经验。2正式实验中两组术后血清ALT同期比较Lewis-Lewis组明显低于DA-Lewis组（P<0.01）差异有显着性,DA-Lewis组随着术后时间延长ALT呈进行性的升高（P<0.01）,而Lewis-Lewis组ALT逐渐下降,组内比较差异无显着性。3正式实验中两组术后血清TBIL第7d、10d两组比较Lewis-Lewis组明显低于DA-Lewis组（P<0.01）差异有显着性：随着术后时间延长DA-Lewis组TBIL呈进行性的升高（P<0.01）,而Lewis-Lewis组TBIL无明显升高,组内比较差异无显着性。4正式实验中术后7d、10d, DA-Lewis组移植肝脏病理可见汇管区三体（肝动脉、门静脉和胆管汇管）炎细胞浸润大量淋巴细胞浸润,肝小叶结构破坏明显,肝细胞呈灶块状坏死,肝实质内散在一些淋巴、单核、中性粒细胞浸润。少数汇管区内有小胆管破坏。Banff评分Ⅱ-Ⅲ级。而Lewis-Lewis组,肝脏病理可见汇管区三体（肝动脉、门静脉和胆管汇管）少量淋巴细胞浸润,浸润程度未达到急性排斥的诊断标准,Banff评分0级。结论：1大鼠原位肝移植模型制作难度较大,影响因素众多。熟练的显微外科技术,完善的围手术期处理及耐心细致熟练的操作是决定大鼠原位肝移植模型制作成功的关键。2 DA-Lewis组大鼠肝移植出现明显、稳定的排斥反应的特征,可作为ROLT急性排斥模型进行相关的研究。第二部分大鼠galectin-9基因的克隆及重组腺病毒载Ad5-galectin-9的构建和包装目的：克隆大鼠galectin-9基因全长cDNA,构建含大鼠galectin-9基因的重组腺病毒载体,并予以鉴定方法：从大鼠的肝脏组织中用RT-PCR的方法克隆扩增大鼠galectin-9基因,再定向插入到NotⅠ和Hind III酶切的pDC316穿梭质粒中,获得穿梭质粒pDC316-galectin-9,经PCR、NotⅠ和HindⅢ酶切及测序等鉴定后,用脂质体将穿梭质粒pDC316-galectin-9与腺病毒骨架质粒PBHGloxΔE1.3Cre共转染293细胞,经位点特异性重组获得含目的基因的重组腺病毒Ad5-galectin-9,行PCR鉴定,经293细胞扩增、纯化制备高滴度病毒液,TCID50法测定病毒滴度。结果：PCR、酶切及测序证实穿梭质粒构建正确,PCR鉴定证实大鼠galectin-9基因重组腺病毒载体构建正确,病毒的感染滴度为1.4×109IU/ml。结论：成功构建了含大鼠galectin-9基因的重组腺病毒载体,为进一步研究大鼠galectin-9基因的功能奠定了基础。第三部分Ad5-galectin-9对大鼠肝移植抗急性排斥发应的实验研究目的：研究重组腺病毒载体Ad5-galectin-9对肝移植后急性排斥反应的抑制作用及探讨其相关机制。方法：供体选用雄性DA大鼠,受体选用Lewis大鼠。采用改良Kamada’S"二袖套法”建立肝移植模型。实验动物随机分成5个组：A组为对照组（n=24）；B组为空载体组（n=24）,夹闭移植肝肝上及肝下下腔静脉,经门静脉灌注2ml、肝动脉灌注lml空载体,保存60min; C组为环抱素组（n=24）,术后2d开始给予环孢素A处理,10mg/kg,每天一次；D组为Ad5-galectin-9组（n=24）,夹闭移植肝肝上及肝下下腔静脉,经门静脉灌注2ml、肝动脉灌注1ml 1.0×109IU/ml的Ad5-galectin-9载体,保存60min; E组为Ad5-galectin-9+CsA组（n=24）,同D组,术后2d开始给予环孢素A处理,5mg/kg,每天一次。各组分成4个亚组（n=6）,留1个亚组观察大鼠移植后生存期,另外3个亚组分别于移植后4d、7d和10d处死大鼠,检测血清ALT, AST, TBIL水平；ELISA法测定IL-2 IL-4 IL-10和IFN-y水平；用流式细胞仪检测肝细胞和Thl细胞凋亡；肝组织行HE染色,进行病理组织学检查并进行评分（根据Banff分级评分方案）；Werstern blotting测定Galectin-9蛋白的表达。结果：和A、B组比较, C、D、E组生存期明显延长（P<0.05）;移植术后各组大鼠血清生化检查：在移植术后4、7、10d肝功能C、D和E组逐渐恢复,A、B组ALT AST TBIL急剧上升,与存活时间表现一致。A、B组IL-2 IFN-γ明显高于C、D和E组（P<0.01）,且与C组比较,D、E组下降更明显（P<0.05）；IL-4、IL-10值A、B组明显低于C、D和E组（P<0.01）。A、B组的排斥发应活动指数（RAI）明显高于C、D和E组（P<0.05）,差异有显着性。C、D和E组的肝细胞凋亡率明显低于A、B组（P<0.01）,差异有显着性。结论：（1） Ad5-galectin-9可以改善肝功能、降低移植肝排斥反应病理学评分（RAI）,延长其生存期。（2）CsA延长了所转导基因Ad5-galectin-9在移植肝的表达,对Ad5-galectin-9抑制肝移植后急性排斥反应起协同作用。（3） Ad5-galectin-9通过特异性诱导Th1细胞凋亡,抑制肝移植后的急性排斥反应。（4） Ad5-galectin-9可以抑制移植肝细胞调亡,保护肝功能。（5） Galectin-9有可能成为抑制或治疗急性排斥反应的新型药物。
哈肖别克·卡斯木[9]（2008）在《主要组织相容性复合体Ⅰ类分子相关A基因（MICA）抗体与临床肝移植排斥的相关性实验研究》文中研究指明目的:本研究旨在通过对主要组织相容性复合体I类分子相关A基因（MICA）的多态性检测,探讨MICA抗体在肝移植排斥反应过程中的作用机制。本研究包括:1)通过对主要组织相容性复合体I类分子相关A基因（MICA）转染的细胞系检测肝移植病人的血清,运用流式细胞仪检测是否产生针对MICA的抗体来探讨MICA抗体在肝移植免疫排斥反应中的影响机制。2)运用PCR方法检测22例发生肝移植排斥反应供、受体病人血清中的MICA的等位基因型,确定MICA*008等位基因在肝移植排斥反应中的作用机制。3)运用免疫组织化学方法进一步证实MICA抗原与肝移植排斥反应的关系。方法:课题第一部分:1)转染MICA的人类B淋巴母细胞细胞系（721.221）通过细胞培养后,同84例接受肝移植手术的病人的血清进行流式细胞仪检测,实验分为五组,第一组:MICA转染细胞（5×105个）+羊抗鼠抗体2微升（二抗,荧光抗体）;第二组:MICA转染细胞（5×105个）+抗MICA抗体（一抗,荧光抗体）+羊抗鼠抗体2微升（二抗,荧光抗体）;第三组:MICA转染细胞（5×105个）+AB血清（阴性对照）+羊抗人（IgG+IgM）10微升（二抗）;第四组:MICA转染细胞（5×105个）+阳性对照病人血清+羊抗人（IgG+IgM）10微升（二抗）;第五组:MICA转染细胞（5×105个）+抗MICA抗体（一抗,荧光抗体）+产生排斥反应的病人的血清+羊抗人（IgG+IgM）10微升（二抗）。各组再用抗MICA单克隆抗体封闭,以检测血清中的抗体是否是MICA特异性抗体。2)MICA转染细胞、胆管上皮细胞（BEC）、肝窦内皮细胞（LSEC）和肝细胞与5μl的抗MICA抗体结合,加入萤光抗体羊抗鼠IgG,分别行流式细胞仪检测,MICA的未转染细胞和MICA转染细胞分别作为阴性和阳性对照。课题第二部分:1)将22例发生肝移植排斥反应病人供体、受体的血清分别提取DNA并以分光光度计进行检测,采用PCR方法和标有MICA等位基因序列的引物进行电泳检测,分析记录电泳图,并与MICA等位基因图谱相对照得出各自的MICA等位基因型。2)从健康肝脏中分别提取胆管上皮细胞（BEC）、肝窦内皮细胞（LSEC）和肝细胞,细胞经过培养后,提取RNA及cDNA合成,以葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶（G6PD）被当作内生的正常对照,MICA的第一代细胞系和MICA转染细胞分别作为阴性和阳性对照组,分别行RT-PCR检测和免疫印记检测。课题第三部分:将已经病理检查确诊的13例肝移植并发生排斥反应病人的肝穿刺标本、15例没有发生排斥反应的肝移植病人的肝穿刺标本和11例患有结肠癌病人的结肠标本行免疫组织化学检查。其中没有发生排斥反应病人的标本设为阳性对照,患有结肠癌病人的结肠标本作为阴性对照。结果:1)总共22例（22/84）（26%）术前或/和术后病人产生MICA抗体,其中8例（8/84）（9.5%）为术前病人,14例（14/84）（17%）为术后病人,84例病人中,共有43例（43/84）发生排斥反应,在有MICA抗体组中,排斥发生率为63%（14/22）,在没有MICA抗体组中,排斥发生率为47%（29/62）,二者相比没有统计学差异。在非转染细胞组（721.221）没有发现MICA表达,而在转染组提示有高表达;用抗MICA单克隆抗体封闭后,血清与MICA转染的细胞系的结合被抑制,提示在这些病人血清中检测到的抗体是MICA特异性抗体。在MICA抗体阳性组和阴性组中,无论发生排斥反应及病人的存活与否,两组之间都没有临床联系。2)流式细胞仪分析显示,MICA的表达在MICA转染细胞的表面上;而做为阴性对照,胆管上皮细胞、肝窦内皮细胞或肝细胞并没有发生任何变化,提示MICA的表达并不在这些细胞表面上。3)在肝移植供、受体中出现频率最高的MICA等位基因是MICA*008,在9例病人供体和受体的抗体当中检测到了MICA*008,其中,4例病人的供体和受体检测出MICA*008完全相配;发现在4例病人中,供体不匹配的MICA等位基因是MICA*008;5例病人中,供体不匹配的MICA等位基因不是MICA*002就是MICA*010。在14/22（63%）例发生排斥反应的病人中可以检测到MICA*008细胞系抗体,而在29/62（47%）例病人中没有检测到MICA*008细胞系抗体,二者之间没有显着性差异（P>0.05）。4)提取的新鲜肝脏细胞和抗MICA单克隆抗体经过免疫印迹法检测显示,62kDa条带与MICA多肽的相一致,这一结果仅见于MICA转染细胞而不是胆管上皮细胞、肝窦内皮细胞和肝细胞。5)在那些发生排斥反应和没有发生排斥反应的肝移植病人标本中仅发现轻度的MICA抗原染色,而那些患有结肠癌并当作阴性对照组的病人,免疫组化显色后显示在上皮细胞有很强和散在的细胞质染色。结论:1)MICA的表达仅在MICA转染细胞的表面上,而在胆管上皮细胞、肝窦内皮细胞或肝细胞并没有发生表达,提示MICA的表达并不在这些细胞表面上。2)MICA抗原仅在肝移植病人及发生排斥反应的肝移植病人的肝组织中发生微弱的表达,但却在结肠癌病人的结肠上皮组织中发生强烈表达。3)统计结果显示,在肝移植预留抗体中没有发现MICA等位基因的表达,与肾移植相比较,MICA抗原不是引起肝移植排斥反应的目标抗原
李杰群[10]（2008）在《重组腺病毒载体Ad-hIL-10的构建及其对大鼠移植肝的保护作用》文中指出第一部分大鼠原位肝移植模型及肝移植急性排斥反应模型的建立目的:建立大鼠原位肝移植模型及稳定的近交系大鼠肝移植急性排斥反应模型。方法:采用改良Kamada’s“二袖套法”建立大鼠肝移植模型。预实验采用封闭群SD大鼠,共实施大鼠肝移植120例,其中定型手术80例。在此基础上,建立30例DA到Lewis近交系大鼠肝移植急性排斥反应模型,根据Banff分级评分方案来评价排斥反应的强度。结果:后期40例定型手术中:无肝期为17.98±3.03 min,手术成功率为87.50%,1W存活率为82.5%,手术效果较前期40例明显改善（P<0.05）,差异均有统计学意义。急性排斥反应出现于术后第3d,以术后第7d最为典型。结论:采用改良Kamada’s“二袖套法”,改进肝上下腔静脉重建及肝脏灌注方法,成功建立大鼠原位肝移植模型。近交系大鼠DA→Lewis之间的原位肝移植是稳定的肝移植急性排斥反应模型。第二部分重组腺病毒载体Ad-hIL-10的构建及包装目的:制备携带人白细胞介素10基因的腺病毒载体Ad-hIL-10。方法:设计及合成适当的引物,从pCDNA3.1-hIL-10质粒上PCR扩增得到hIL-10基因,并将其重组到质粒pShuttle-CMV。将重组质粒pShuttle-CMV-hIL-10与pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183细胞,产生重组腺病毒质粒Ad-hIL-10。再将重组腺病毒病毒质粒转染AD-293细胞后包装出腺病毒颗粒,并进行病毒感染滴度的测定。结果:从pCDNA3.1-hIL-10质粒中成功扩增得到hIL-10基因片段,再把hIL-10基因重组到pShuttle-CMV载体中,酶切电泳鉴定及测序鉴定pShuttle-CMV-hIL-10质粒正确;重组腺病毒质粒酶切鉴定为阳性克隆;并获得了高滴度(2×1010IU/ml)、高纯度的腺病毒颗粒。结论:成功构建了含携带有人白细胞介素10基因高纯度、高滴度的重组腺病毒Ad-hIL-10。第三部分Ad-hIL-10对移植肝缺血再灌注损伤的保护作用目的:研究重组腺病毒载体Ad-hIL-10对大鼠移植肝IRI的保护作用及其机制。方法:供受体均选用雄性SD大鼠。供体在0～4℃的乳酸林格氏液中保存12h,采用改良的Kamada’s“二袖套法”建立肝移植模型。实验动物随机分成4个组,各组6对。A组为假手术组,B,C及D组在获取供肝前48h供体分别经肠系膜静脉推注2ml生理盐水、空载体或1.0×1010IU/ml的Ad-hIL-10载体。移植术后24h检测血清ALT,AST水平;肝组织行HE染色,观察病理组织学改变及进行评分（根据Suzuki’s标准）;TUNEL法检测肝细胞凋亡;RT-PCR检测肝组织TNF-α,MIP-2,ICAM-1及hIL-10 mRNA的水平;Werstern blotting测定Bcl-2,Bcl-xl,HO-1及NF-κB蛋白的表达。结果:大鼠移植肝冷保存12h,恢复血流再灌注24h后,与D组比较,B和C组血清ALT,AST升高（P<0.05）;病理学半定量评分（根据Suzuki’s标准）升高（P<0.05）;细胞调亡指数升高（P<0.05）;移植肝中TNF-α,IFN-γ及MIP-2 mRNA显着增高（P<0.05）,差异均有显着性。A、B及C组移植肝不表达hIL-10 mRNA,而D组表达明确。Western blotting检测结果A组大鼠肝脏仅表达少量Bcl-2,Bcl-xl,HO-1及NF-κB蛋白;与D组比较,B组及C组Bcl-2,Bcl-xl及HO-1蛋白表达弱（P<0.05）,而NF-κB蛋白表达明显增强（P<0.05）,差异均有显着性。结论:（1）Ad-hIL-10通过下调前炎性因子TNF-α,MIP-2及ICAM-1mRNA的水平及抗细胞凋亡作用,减轻了移植肝IRI。（2）Ad-hIL-10对前炎性因子TNF-α,MIP-2及ICAM-1 mRNA的下调作用,至少部分是通过大量表达hIL-10抑制NF-κB这一途径来实现的。（3）Ad-hIL-10可以抑制移植肝IRI中细胞调亡,可能与其上调抗调亡基因Bcl-2及Bcl-xl的表达有关。（4）在Ad-hIL-10对移植肝细胞保护及抗凋亡作用中,HO-1为其所转导的hIL-10下游的效应器之一。第四部分Ad-hIL-10对大鼠肝移植后急性排斥发应的影响目的:研究重组腺病毒载体Ad-hIL-10对肝移植后急性排斥反应的抑制作用及探讨其相关机制。方法:供体选用雄性DA大鼠,受体选用Lewis大鼠。采用改良Kamada’s“二袖套法”建立肝移植模型。实验动物随机分成6个组:A组为假手术组（n=6）;B组为对照组（n=12）;C组为空载体组（n=12）,夹闭移植肝肝上及肝下下腔静脉,经门静脉灌注2ml、肝动脉灌注1ml空载体,保存60min;D组为环孢素组（n=12）,手术当天肌注CSA10mg/kg;E组为Ad-hIL-10组（n=12）,夹闭移植肝肝上及肝下下腔静脉,经门静脉灌注2ml、肝动脉灌注1ml 1.0×1010IU/ml的Ad-hIL-10载体,保存60min;F组为Ad-hIL-10+CSA组（n=12）,同E组,同时手术当天肌注CSA 10mg/kg。B,C,D,E及F组分成2个亚组（n=6）,一个亚组观察大鼠移植后生存期,另一亚组分别于移植后7d处死大鼠,检测血清ALT,AST,TBIL水平;肝组织行HE染色,进行病理组织学检查并进行评分（根据Banff分级评分方案）;ELISA法测定E组和F组血清hIL-10的水平,TUNEL法检测肝细胞凋亡;RT-PCR检测肝组织中IL-2,IL-4,IFN-γ,hIL-10 mRNA及肝实质细胞FasL mRNA的水平;Werstern blotting测定Bcl-2及Bcl-xl蛋白的表达。结果:和E组比较:B、C及D组生存期缩短（P<0.05）,而F组明显延长（P<0.05）;移植术后7d,B、C及D组血清ALT,AST,TBIL水平升高（P<0.05）,F组降低（P<0.05）;B、C及D组排斥发应活动指数（RAI）明显升高（P<0.05）,而F组降低（P<0.05）,差异均有显着性。移植术后3d和7d,F组血清hIL-10的水平较E组升高（P<0.05）,差异均有显着性。与B、C及D组比较,移植肝IL-4mRNA及肝实质细胞FasL mRNA在E组及F组增高（P<0.05）,差异有显着性;IL-2 mRNA和IFN-γmRNA在B,C,D,E及F组比较无统计学意义,A,B,C及D移植肝不表达hIL-10 mRNA,F组hIL-10 mRNA水平较E组升高（P<0.05）。与E组及F组比较,B,C及D组Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达弱（P<0.05）,差异均有显着性。结论:（1）Ad-hIL-10可以改善肝功能、降低移植肝RAI,延长其生存期,但并不能逆转移植肝排斥反应。CSA延长了转导基因hIL-10在移植肝的表达时间,对Ad-hIL-10抑制肝移植后急性排斥反应起协同作用。（2）Ad-hIL-10通过上调Th2细胞因子对移植肝急性排斥反应产生抑制作用。（3）Ad-hIL-10可以抑制移植肝急性排斥发应中肝细胞调亡,可能与其上调抗调亡基因Bcl-2及Bcl-xl的表达有关。（4）Ad-hIL-10对移植肝排斥反应的保护作用可能是通过FasFasL这一途径介导GICs调亡实现的。
二、基因治疗在肝脏移植中的应用进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因治疗在肝脏移植中的应用进展（论文提纲范文）
（1）组织器官移植对临床输血的挑战与思考（论文提纲范文）
| 1 实体器官及造血干细胞移植相关血液免疫学 |
| 1.1 ABO非同型移植的血型与输血问题： |
| 1.2 移植过程中产生的同种抗体： |
| 1.3 移植术后发生的“过客淋巴细胞综合征”： |
| 2 围术期移植相关输血管理 |
| 2.1 肝移植围术期输血： |
| 2.2 肾移植的围术期输血： |
| 2.3 小肠移植围术期输血： |
| 2.4 子宫移植的围术期输血： |
| 2.5 造血干细胞移植过程中的输血问题： |
| 3 异种器官移植带来的挑战与思考 |
| 3.1 异种器官移植的应用前景： |
| 3.2 异种器官移植对输血相关因素的影响： |
| 4 结语 |
（2）木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究（论文提纲范文）
| 答辩委员会名单及评定意见 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 移植免疫概述 |
| 一、器官移植排斥反应概述 |
| 二、调节性T细胞在移植免疫中的作用 |
| 三、DC细胞在移植免疫中的作用 |
| 第二节 免疫抑制剂在器官移植中的作用 |
| 一、免疫抑制剂分类 |
| 二、雷帕霉素 |
| 第三节 中医药在器官移植中的研究进展 |
| 一、中医药对移植前后的病因病机认识 |
| 二、中医药对移植前后的辨证认识 |
| 三、中药对器官移植的治疗 |
| 第四节 木犀草素的研究进展 |
| 一、木犀草素药代动力学及生物利用度的研究进展 |
| 二、木犀草素药理作用的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 木犀草素对小鼠皮肤移植排斥反应的实验研究 |
| 一、小鼠同种异体皮肤移植模型的建立 |
| 二、木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的作用 |
| 三、木犀草素联合应用Anti-CD25抗体删除Treg对小鼠皮肤移植反应的影响 |
| 四、讨论 |
| 第二节 木犀草素对小鼠胰岛移植排斥反应的实验研究 |
| 一、小鼠同种异体胰岛移植模型的建立 |
| 二、木犀草素对小鼠胰岛移植的作用 |
| 三、讨论 |
| 第三节 木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验 |
| 一、实验内容 |
| 二、讨论 |
| 第三章 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、创新性 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（3）肝移植术后患者他克莫司的血药浓度分布，凝血功能及肝肾功能的探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 肝移植术后早期应用他克莫司对凝血功能的影响 |
| 前言 |
| 1.研究对象及方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肝移植术后他克莫司谷血药浓度分布 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 免疫抑制方案 |
| 1.3 血样的采集 |
| 1.4 血样的检测 |
| 1.5 研究方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 肝移植受者情况 |
| 2.2 他克莫司血药谷浓度分布 |
| 3.讨论 |
| 3.1 肝移植受者基本情况分析 |
| 3.2 他克莫司血药浓度检测方式 |
| 3.3 他克莫司与免疫诱导治疗 |
| 3.4 他克莫司联合西罗莫司 |
| 参考文献 |
| 第三部分 肝移植术后他克莫司与肝肾功能的关系及其影响因素 |
| 前言 |
| 1.研究对象与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 免疫抑制方案 |
| 1.3 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 肝移植术后应用他克莫司肝功能情况 |
| 2.2 肝移植术后应用他克莫司肾功能情况 |
| 3.讨论 |
| 3.1 肝功能评价指标的选择 |
| 3.2 他克莫司与肝移植术后肝功能的关系 |
| 3.3 他克莫司联合西罗莫司治疗对肝功能的影响 |
| 3.4 肾功能评价指标的选择 |
| 3.5 他克莫司与肝移植术后肾功能的关系 |
| 3.6 他克莫司联合西罗莫司治疗对肾功能的影响 |
| 3.7 他克莫司的药学监护 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 综述 肝移植患者他克莫司血药浓度影响因素 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 科研成果 |
（4）肝脏异种移植后CD47-SIRPα不兼容介导血细胞吞噬作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝脏移植 |
| 1.1.1 肝脏移植的概况 |
| 1.1.2 肝脏移植发展面临的难题 |
| 1.2 肝脏异种移植 |
| 1.2.1 肝脏异种移植供体选择 |
| 1.2.2 转基因猪与肝脏异种移植 |
| 1.2.3 肝脏异种移植的瓶颈 |
| 1.3 肝脏异种移植血小板减少的作用机制研究进展 |
| 1.3.1 体内移植模型 |
| 1.3.2 体外灌注模型 |
| 1.3.3 体外实验 |
| 1.4 CD47-SIRPA信号通路与异种移植 |
| 1.4.1 CD47-SIRPα信号通路 |
| 1.4.2 CD47-SIRP α信号通路维持血细胞稳态 |
| 1.4.3 CD47-SIRP α信号通路参与肿瘤发生发展 |
| 1.4.4 CD47-SIRP α信号通路介导异种细胞移植排斥 |
| 1.4.5 CD47-SIRP α信号通路与异种器官移植 |
| 1.5 本课题的立题依据 |
| 第2章 小鼠原位肝移植模型的建立与优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要实验设备 |
| 2.2.3 主要手术器械和材料 |
| 2.2.4 主要实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 手术前准备 |
| 2.3.2 供体手术(图2.1) |
| 2.3.3 供肝修整(图2.2) |
| 2.3.4 受体手术 |
| 2.3.5 术后管理 |
| 2.3.6 苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,H&E)染色 |
| 2.3.7 统计方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 无肝期时间是手术成功的先决条件 |
| 2.4.2 手术后死亡原因分析 |
| 2.4.3 小鼠品系及胆道支架是小鼠肝移植术后远期生存的主要制约因素 |
| 2.4.4 通过优化供体品系及胆道支架达到满意的远期预后 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 肝脏器官移植后CD47-SIRPA不兼容介导血细胞吞噬的作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要实验设备 |
| 3.2.3 主要实验试剂和材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 小鼠血小板及红细胞CD47表达检测 |
| 3.3.2 小鼠原位肝移植 |
| 3.3.3 红细胞计数 |
| 3.3.4 血小板计数 |
| 3.3.5 肝脏组织获取及固定 |
| 3.3.6 免疫荧光 |
| 3.3.7 HE染色 |
| 3.3.8 统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 肝脏移植后,CD47-SIRP α不兼容不能诱发贫血及严重的血小板减少 |
| 3.4.2 肝脏移植后,CD47-SIRP α不兼容产生的血小板减低不影响小鼠的存活 |
| 3.4.3 肝脏移植后,CD47-SIRP α不兼容不能诱发肝脏吞噬血小板 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 异种肝脏移植后CD47-SIRP A不兼容介导血细胞吞噬的作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 主要实验设备 |
| 4.2.3 主要实验试剂和材料 |
| 4.2.4 主要的流式检测抗体 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 小鼠血小板及红细胞CD47表达检测 |
| 4.3.2 大鼠-小鼠异种原位肝移植 |
| 4.3.3 红细胞计数 |
| 4.3.4 血小板计数 |
| 4.3.5 密度梯度离心法分离小鼠外周血单个核细胞(PBMC) |
| 4.3.6 小鼠血清分离 |
| 4.3.7 移植肝非实质细胞分离 |
| 4.3.8 小鼠脾脏单细胞悬液的制备 |
| 4.3.9 血小板流式检测 |
| 4.3.10 PBMC、脾脏单细胞悬液、肝非实质细胞流式细胞检测 |
| 4.3.11 HE染色 |
| 4.3.12 小鼠谷丙转氨酶(ALT)检测 |
| 4.3.13 统计方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 大鼠-小鼠异种原位肝移植可作为异种肝移植的小动物模型 |
| 4.4.2 大鼠-小鼠异种原位肝移植术后产生强烈的排斥反应 |
| 4.4.3 大鼠-小鼠异种肝移植后排斥反应主要为T细胞介导的排斥反应 |
| 4.4.4 大鼠-小鼠异种肝移植后CD47-SIRP α不兼容对血细胞的吞噬作用 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 本研究主要创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得成绩 |
| 致谢 |
（5）小鼠肝脏低温携氧机械灌注系统的建立及保护机制研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 我国肝移植发展现状和瓶颈 |
| 1.2 供肝保存技术 |
| 1.3 低温机械灌注技术研究进展 |
| 1.4 HOPE机制的研究现状 |
| 1.5 自噬可能参与HOPE对 DCD肝脏的保护作用 |
| 1.6 HOPE可能通过P选择素依赖和非依赖途径发挥对DCD肝脏的保护作用 |
| 2 小鼠肝脏低温机械灌注系统的建立与参数探究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 3 HOPE通过上调自噬的表达发挥DCD肝脏损伤的保护作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 4 HOPE通过P选择素依赖和非依赖途径发挥对DCD肝脏的保护作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 综述三 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文目录 |
| 致谢 |
（6）鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G（i）α2依赖MLK3信号通路介导小鼠肝脏缺血再灌注损伤（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 :GNAI2通过影响肝细胞凋亡和炎症参与肝脏缺血再灌注损伤 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 :GNAI2依赖于MLK3信号通路介导小鼠肝脏缺血再灌注损伤 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（7）IL-10和FASL基因共转染的树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略名词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠骨髓来源的树突状细胞的培养及鉴定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 hIL-10 以及hFasl真核表达质粒的构建、慢病毒包装与浓缩及imDCs的感染 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 慢病毒介导的hIL-10 以及hFasl重组质粒感染imDCs后对其诱导免疫耐受的影响 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）重组腺病毒载体Ad5-galectin-9对大鼠肝移植抗排斥反应的实验研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 大鼠原位肝移植急性排斥反应模型的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 大鼠Galectin-9基因的克隆及重组腺病毒载体Ad5-Galectin-9的构建和包装 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 重组腺病毒载体Ad5-Gal-9对大鼠移植肝抗排斥反应的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:肝脏移植的基因治疗 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（9）主要组织相容性复合体Ⅰ类分子相关A基因（MICA）抗体与临床肝移植排斥的相关性实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 MICA 抗体在肝移植免疫排斥反应中的作用机制 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验设备 |
| 1.4 方法 |
| 1.5 间断性变性琼脂电泳（SDS-PAGE），免疫印迹和流式细胞仪检查 |
| 1.6 统计学方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 MICA008?008 等位基因对肝移植排斥反应的作用机制 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 溶液与试剂 |
| 1.3 主要实验器械和器皿 |
| 1.4 病人血清或全血中DNA 的提取 |
| 1.5 测定样本中的DNA 含量 |
| 1.6 MICA 等位基因型的确定 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 MICA 抗体在肝移植免疫排斥反应中的作用机制 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验溶液与试剂 |
| 1.3 实验设备 |
| 1.4 石蜡组织切片的HE 染色 |
| 1.5 石蜡组织切片的免疫组化染色 |
| 1.6 染色结果的判定 |
| 1.7 统计分析 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
（10）重组腺病毒载体Ad-hIL-10的构建及其对大鼠移植肝的保护作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 目录 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠原位肝移植模型及肝移植急性排斥反应模型的建立 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.附图 |
| 第二部分 重组腺病毒载体Ad-hIL-10的构建及包装 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.附图 |
| 第三部分 Ad-hIL-10对大鼠移植肝缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.附图 |
| 第四部分 Ad-hIL-10对大鼠肝移植后急性排斥反应的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.附图 |
| 参考文献 |
| 研究总结 |
| 文献综述 基因治疗与肝脏移植 |
| 攻读博士学位期间的主要研究成果 |
| 致谢 |
四、基因治疗在肝脏移植中的应用进展（论文参考文献）
- [1]组织器官移植对临床输血的挑战与思考[J]. 尹文. 临床输血与检验, 2021(05)
- [2]木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究[D]. 叶书林. 广州中医药大学, 2021(02)
- [3]肝移植术后患者他克莫司的血药浓度分布，凝血功能及肝肾功能的探讨[D]. 潘慧. 上海交通大学, 2020(01)
- [4]肝脏异种移植后CD47-SIRPα不兼容介导血细胞吞噬作用的研究[D]. 李婷. 吉林大学, 2020(01)
- [5]小鼠肝脏低温携氧机械灌注系统的建立及保护机制研究[D]. 曾宪鹏. 武汉大学, 2019(06)
- [6]鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G（i）α2依赖MLK3信号通路介导小鼠肝脏缺血再灌注损伤[D]. 刘巧玉. 南京医科大学, 2018(01)
- [7]IL-10和FASL基因共转染的树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的研究[D]. 张丽娜. 福建医科大学, 2017(04)
- [8]重组腺病毒载体Ad5-galectin-9对大鼠肝移植抗排斥反应的实验研究[D]. 李来邦. 昆明医学院, 2009(02)
- [9]主要组织相容性复合体Ⅰ类分子相关A基因（MICA）抗体与临床肝移植排斥的相关性实验研究[D]. 哈肖别克·卡斯木. 新疆医科大学, 2008(03)
- [10]重组腺病毒载体Ad-hIL-10的构建及其对大鼠移植肝的保护作用[D]. 李杰群. 中南大学, 2008(12)