一、急性炎症反应中真核细胞转录因子-κB的信号转导作用（论文文献综述）
高明春[1]（2021）在《IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制》文中指出牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza 3 virus,BPIV3）是引起犊牛呼吸道感染的重要病原体之一,世界各国的牛群感染BPIV3的抗体阳性率通常在50%到90%之间。BPIV3可感染肺上皮细胞与肺泡巨噬细胞,发生组织损伤和免疫抑制,随后继发细菌感染导致严重的支气管肺炎。IL10（Interleukin10,IL10）是极少数具有强大的负调节功能的抗炎性细胞因子,上皮细胞、单核巨噬细胞等都是IL10发挥抑制性作用的靶细胞。许多病毒感染后依靠多种途径诱导宿主IL10表达来负调控宿主免疫应答,IL10负调控免疫应答的相关机制在HIV（Human immunodeficiency virus）、FMDV（Foot-and-Mouth disease virus）、LCMV（Lymphocytic choroid meningitis virus）、PCV2（Porcine circovirus type 2）、PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）等病毒的致病机制中发挥重要作用,BPIV3感染中IL10是否及如何调控免疫应答尚未清楚。本研究分离BPIV3流行毒株并分析其致病特征,证实BPIV3流行株能够感染牛与鼠的上皮细胞与单核巨噬细胞。建立小鼠呼吸道感染模型与鼠原代巨噬细胞感染模型。以小鼠与原代巨噬细胞的高通量转录组数据证实BPIV3可能利用IL10及其重要的下游产物SOCS3（Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3）下调宿主的抗感染免疫应答。随后开展了牛IL10、IL10R1、SOCS3的生物学活性与作用机制研究,证实牛IL10与IL10受体结合转导信号,激活JAK-STAT3通路来迅速高表达SOCS3,在小鼠与牛细胞上都具有类似的生物学活性。最终探索了BPIV3主要依赖My D88、p38 MAPK以及NF-κB信号通路来表达IL10,负调控宿主抗病毒应答并提高BPIV3复制能力的相关机制。本研究为阐明IL10/STAT3/SOCS3信号轴在BPIV3感染中的致病作用和抑制IL10通路防制牛呼吸道传染病奠定了理论基础。首先对2017年黑龙江省、河北省等地的群发犊牛肺炎1793份血清进行了BPIV3的抗体调查,结果表明近70%的犊牛呼吸道疾病可部分归因于BPIV3所参与的感染。随后自病牛鼻拭子中分离到了一株BPIV3,其具有感染MDBK、BHK21、BBEC、BL、BTB、BT、ML、PBMC、BMDM等牛与小鼠多种上皮细胞与单核巨噬细胞的能力。分离株经呼吸道感染小鼠肺脏并对其进行了致病性的分析,感染鼠肺脏发生病理变化,并且肺内病毒在12 d内不能够被完全清除,感染肺脏发生了多种炎性因子的表达,检测到重要的调节性抑炎性因子IL10在感染后的12 d之内,大多数检测时间点的转录均显着高于对照。通过高通量转录组测序、差异表达分析与基因富集及蛋白质相互作用网络分析,在小鼠与原代巨噬细胞感染BPIV3前后重要宿主免疫与调控分子的变化模式。BPIV3感染小鼠与感染巨噬细胞后,在感染早期显着上调了IL10与SOCS3表达,SOCS3几乎在所有分组中都得到了显着的转录激活。大多数组别中Tyk2、STAT1、STAT2、IRF7、ISG15、Mx1、RSAD2、PML等关键抗感染免疫基因被显着下调,IL10与SOCS3参与了BPIV3感染后抑制宿主抗病毒应答。为进一步研究牛IL10的信号转导以及其是否能发挥免疫负调控作用,克隆了牛IL10、牛IL10R1与SOCS3基因并分析其生物信息与进化保守性。对IL10、IL10R1胞外区与SOCS3进行了蛋白表达与纯化,并制备了相应的高效价抗体。采用腺病毒系统表达了牛IL10、IL10R1胞外区,然后在牛与鼠细胞上证实重组IL10可快速并强烈诱导SOCS3的表达,这种作用可以被IL10R1胞外区所抑制。IL10与SOCS3都具有抑制Ⅰ型干扰素及其下游分子表达的功能,即牛IL10与SOCS3可用于牛与鼠细胞的负免疫调控研究,而IL10R1胞外区可作为IL10通路的阻断剂。进一步探讨BPIV3感染中IL10参与负调控的相关机制,研究表明BPIV3以时间与剂量依赖性的方式诱导原代巨噬细胞与肺上皮细胞在感染极早期迅速上调IL10的m RNA并大量分泌IL10蛋白,同时TNF-α与Ⅰ型干扰素及其下游蛋白Mx1的表达受到了显着的抑制。IL10在原代巨噬细胞中的产量远高于上皮细胞,外源与内源性的IL10都可提高BPIV3的滴度。IL10R1胞外区作为游离的受体竞争掉IL10或抑制剂阻断IL10产生的通路都能降低病毒的复制能力。在My D88（Myeloid differentiation factor,MYD88）缺失与My D88抑制剂处理的BMDM细胞上,IL10/SOCS3的表达大幅降低,表明依赖My D88分子转导信号的通路在BPIV3感染过程中诱导IL10的表达起到了重要作用。此外,应用通路抑制剂证实NF-κB和p38 MAPK在BPIV3诱导IL10表达中为关键通路。JAK-STAT通路中的多种JAK与STAT分子均参与IL10与BPIV3之间复杂的调控作用。综上所述,BPIV3是我国犊牛传染性肺炎的主要病原之一,感染后可显着上调IL10与SOCS3的表达并引起宿主免疫抑制,主要下调以Ⅰ型干扰素及其下游分子介导的抗病毒应答,这种由IL10介导的负调控依赖于My D88、NF-κB和p38 MAPK信号通路。本研究可为进一步阐明BPIV3的分子致病机制与开发以调控IL10为靶标的免疫防控提供理论基础。
刘俊峰[2]（2021）在《IFN-τ诱导miR-505靶向HMGB1抑制奶牛子宫内膜炎性损伤的分子机制》文中提出病原微生物入侵子宫组织的成败受到子宫内膜完整性的直接影响。以肠外致病性大肠杆菌为首的病原微生物入侵产后奶牛子宫内膜组织造成的炎性损伤是引起奶牛不孕的重要原因。奶牛子宫内膜炎性损伤（Endometrial Inflammatory Injury,EII）的修复及其重建过程受到多方面因素的干预。IFN-τ作为反刍动物特有的I型干扰素的一种,具有调节并维持子宫内免疫微环境稳态的功能。本实验室前期研究已经证实,IFN-τ对脂多糖诱导小鼠肺组织炎性损伤作用具有保护作用;可介导小鼠子宫内先天免疫反应改善局部炎症状态。然而,对奶牛子宫内膜组织的炎性损伤是否具有保护作用,与损伤相关模式分子是否有关联性没有明确的报道;尤其是IFN-τ通过对靶基因的转录后调控作用干预奶牛子宫内膜炎性损伤的分子机制研究较少。本研究通过构建离体奶牛子宫内膜组织和奶牛子宫内膜上皮细胞（BEND或b EECs）,以及小鼠子宫内膜炎性损伤模型。应用荧光定量等分子生物学方法揭示IFN-τ抑制HMGB1/NF-κB信号通路的活性,缓减b EECs炎性损伤的调节机制;另外,利用高通量测序技术筛选出IFN-τ干预下奶牛子宫内膜上皮细胞中特异性miRNAs的表达谱。探究IFN-τ通过miRNA对靶基因的转录后调控作用介导HMGB1/NF-κB信号通路对奶牛子宫内膜组织炎性损伤作用的保护机制。为开拓IFN-τ的临床应用价值及筛选治疗奶牛子宫内膜炎性损伤的分子靶标奠定科学的理论依据,本研究主要结果如下:1.体外培养奶牛子宫内膜组织,通过H&E染色观察组织结构形态完整,无明显腺体脱落现象,成功培养了奶牛子宫内膜组织,并应用5、10、20μg/m L的LPS刺激子宫内膜组织建立炎性损伤模型。实验结果显示,当LPS的刺激浓度为10μg/m L时,与对照组相比较,炎性因子m RNA表达水平明显增加,主要包括三种,分别为IL-6和TNF-α以及IL-1β。通过免疫组织化学分析得到,LPS刺激下的b EECs中TLR4和HMGB1蛋白表达量显着增加;同时TUNEL实验结果证明,奶牛子宫内膜组织细胞的调亡率增加。IFN-τ浓度在25、50和100 ng/m L时,以浓度依赖方式抑制模型组IL-1β、IL-6和TNF-α的表达;并筛选出IFN-τ的最佳干预浓度为50 ng/m L。另外,IFN-τ以浓度依赖性的方式显着抑制模型组TLR4和HMGB1蛋白的表达水平,同时显着增加ZO-1和Occludin蛋白表达水平。IFN-τ抑制HMGB1和TLR4的表达进而抑制NF-κB信号通路的活性,促使IKBα和p65蛋白磷酸化水平下降。此外,实验结果显示50 ng/m L的IFN-τ可显着减少Bax表达,相反,Bcl-2表达被提高;对于组织细胞调亡具有显着的抑制性。而IFN-τ浓度为100 ng/m L时,无显着抑制细胞凋亡作用。研究结果表明,IFN-τ对奶牛子宫内膜组织的炎性损伤的保护作用,主要通过抑制HMGB1的表达而实现。2.通过建立bEECs炎性损伤模型的研究证明,其中炎性因子表达被抑制。免疫印迹实验证明IFN-τ显着抑制HMGB1的表达和p-IKK和p-p65的表达水平;同时,免疫荧光研究发现NF-κB p65的核易位被抑制。另外,用si-HMGB1转染b EECs阐明了HMGB1在子宫内膜上皮细胞炎性损伤级联反应中的关键作用。实验结果也说明了IFN-τ对HMGB1/NF-κB信号通路的抑制作用,进而起到保护b EECs的炎性损伤过程。此外,通过构建BALB/c小鼠子宫内膜炎性损伤模型也获得了同样的研究结论。3.高通量测序结果证明,在IFN-τ的作用下,b EECs中保守的特异性miRNA表达谱发生显着性变化。其中,在LPS刺激下miRNA表达呈上调和下调两种趋势;与对照组相比模型组中显着下调的miRNA有bta-miR-182、bta-miR-505、bta-miR-488和bta-miR-31。但在IFN-τ的干预下,bta-miR-505表达量显着上调,而bta-miR-182、bta-miR-488和bta-miR-31上调不明显;同时使用R软件中的phyper函数对miRNA的靶基因功能进行富集分析发现其参与细胞内信号转导,并具有双向调节作用。KEGG注释揭示差异表达miRNA靶基因主要参与细胞生命进程,并介导先天免疫调节参与细胞复制和修复。4.临床表现为子宫内膜炎性损伤组织和小鼠子宫内膜炎性损伤组织以及LPS诱导的b EECs炎性损伤中miR-505表达量均显着下调;然而IFN-τ的干预使的miR-505的表达显着上调。过表达miR-505可显着抑制炎性损伤的b EECs中,炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达以及IκBα和p65蛋白磷酸化。同时双荧光酶基因报告系统与si-HMGB1基因沉默实验结果揭示在调控HMGB1的表达方面,miR-505负调控HMGB1,同时对IκBα磷酸化产生抑制作用,对p65核易位起到一定的阻滞。另外,过表达miR-505与靶基因的si RNA干扰显着缓解了LPS诱导的b EECs周期阻滞和凋亡反应;免疫印迹结果提示,Bcl-2/Bax比值增加;活化的caspase-3和caspase-9表达量下降。结论:IFN-τ上调miR-505表达靶向HMGB1,抑制NF-κB通路的活性,通过抑制b EECs炎性应答反应和细胞凋亡,遏制奶牛子宫内膜组织炎性损伤。
李藤藤[3]（2021）在《ICA通过调控miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路抑制ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应》文中研究说明随着生活水平提高和生活方式的改变,动脉粥样硬化（AS）等心血管疾病病发率呈现逐年上升的趋势。AS是一种涉及平滑肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞等多种细胞的慢性炎症性疾病,并伴随着一系列的并发症,给人们的生活带来诸多的困扰。淫羊藿是我国一种传统的药用植物,主要化学成分有黄酮、木脂素、苯酚苷、生物碱、多糖、挥发油、蒽醌、鞣质、甾醇、倍半萜等。淫羊藿苷（ICA）是淫羊藿的主要化学成分,是一种黄酮类的化合物,具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老、抗骨质疏松、抗心肌缺血缺氧、促进免疫调节及促进生殖内分泌功能等多种药理作用。ICA具有抗AS的作用,目前多集中于ICA对平滑肌细胞增殖迁移、内皮细胞损伤等的研究,对巨噬细胞炎症反应的相关研究比较少。微小RNA（microRNA,miRNA）是一种短链非编码RNA,miRNA在细胞的增殖、分化,生物体的生长、发育及疾病治疗中发挥着越来越重要的作用。研究表明,miRNAs能够成为心血管疾病的治疗靶点、诊断标志。因此为我们寻找治疗、诊断AS提供了新思路和方法。本课题组前期实验研究已证实ICA具有抗AS的作用,并且构建了 ApoE-/-小鼠胸主动脉miRNA表达谱,但是有关ICA发挥抗AS的具体分子机制尚需进一步探索和研究。本研究从miRNA芯片入手,利用生物信息学分析构建了miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路,并以该信号通路为切入点研究ICA对ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应及分子机制。本研究分为3部分:（1）ICA 抗 AS miRNAs 芯片生物信息学分析及 miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路构建首先比较ApoE-/-小鼠胸主动脉MOD组/CON组miRNA芯片结果,将差异基因的条件设定为p<0.05且|log2 fold change|>1.32,筛选出差异表达的miRNAs共16个。为了寻找RAW264.7中ICA发挥抗AS的关键miRNAs,随机挑选6个miRNAs,利用qPCR技术进行miRNAs表达的验证并确定miR-672-5p作为研究对象。通过TargetScan和DAVID数据库对其靶基因进行预测、GO分析及KEGG分析,我们发现miR-672-5p与细胞增殖、凋亡,蛋白质的转录与翻译等生物学过程密切相关,在miR-672-5p富集的信号通路中PI3K-AKT通路p值较小、富集到其中的靶基因较多,同时AKT3 mRNA的3’ UTR处与miR-672-5p存在结合位点且靶向性较好,因此我们构建出miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路。（2）ICA对ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应的作用及机制研究以ox-LDL诱导RAW264.7构建巨噬细胞源性泡沫细胞,同时加入ICA进行干预,通过 CCK-8、油红 O 染色、ELISA、qPCR 及 Western Blot 探讨 ICA 对 ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应的作用,结果发现,ox-LDL可以降低RAW264.7细胞活力,诱导RAW264.7的泡沫化,增加培养上清IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。ICA可以逆转上述反应的变化。说明ICA可以抑制ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应。进一步通过qPCR和Western Blot检测miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路相关基因及蛋白表达,结果表明,ox-LDL可以降低RAW264.7中miR-672-5p的表达,提高AKT3 mRNA及蛋白的表达,并且上调IKK、IκBα及p65的磷酸化水平,而ICA可以逆转上述基因和蛋白表达的改变。说明ICA可能通过调控miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路,从而抑制ox-LDL诱导RAW264.7的炎症反应。（3）miR-672-5p在ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应中的作用构建过表达/沉默miR-672-5p的RAW264.7,利用油红O染色、ELISA、qPCR及Western Blot技术探讨miR-672-5p在ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应的作用。结果发现,ox-LDL可以诱导RAW264.7的泡沫化,增加RAW264.7培养上清IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的含量,降低 RAW264.7 miR-672-5p 的表达,提高 AKT3 mRNA及蛋白的表达,并且上调IKK、IκBα和p65的磷酸化水平。过表达miR-672-5p可以逆转ox-LDL的作用,而沉默miR-672-5p则增强ox-LDL的作用。说明miR-672-5p通过调控AKT3,介导NF-κB信号通路,从而抑制ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应。综上所述,本实验证明ICA可能通过调控miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路,抑制ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应,进而治疗AS。miR-672-5p是ICA治疗AS的分子靶点。
唐俊纯[4]（2021）在《大黄鱼MAVS、TRAF5及其异构体的克隆与免疫功能初步研究》文中提出线粒体抗病毒信号蛋白（mitochondrial antiviral signaling adaptor,MAVS）是模式识别受体RIG样受体（retinoic acid inducible gene I（RIG-I）-like receptors,RLRs）的接头蛋白,在脊椎动物的抗病毒免疫相关信号通路中发挥重要作用。值得注意的是,近年来还在硬骨鱼类中发现了MAVS异构体的存在,有关硬骨鱼类MAVS及其异构体在宿主免疫反应中的作用越来越受到人们的广泛关注。肿瘤坏死因子受体相关因子5（TNF receptor-associated factor 5,TRAF5）能与MAVS相互作用并参与细胞信号转导,在MAVS介导的抗病毒免疫信号通路中发挥重要功能。本研究以大黄鱼为研究对象,克隆鉴定了MAVS、TRAF5及其异构体,通过荧光定量PCR检测了MAVS、TRAF5及其异构体在健康大黄鱼各组织以及不同病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）刺激下的表达模式,利用荧光示踪质粒揭示了它们的亚细胞定位,并通过双荧光素酶报告基因检测技术初步解析了MAVS、TRAF5及其异构体的免疫功能以及在介导宿主细胞信号转导通路中的作用。本研究克隆鉴定了大黄鱼MAVS及其异构体,分别命名为Lc-MAVS＿tv1和LcMAVS＿tv2。Lc-MAVS＿tv1蛋白分子由caspase激活与募集域（caspase activation and recruitment domains,CARD）、富含脯氨酸结构域（roline-rich region,PRR）以及跨膜结构域（trans-membrane domain,TM）组成,而Lc-MAVS＿tv2缺失了TM结构域。在健康大黄鱼中,Lc-MAVS＿tv1表达水平远高于Lc-MAVS＿tv2,且在大黄鱼鳃、脾脏和头肾中Lc-MAVS＿tv1及Lc-MAVS＿tv2的表达水平在poly I:C、LPS、PGN刺激和变形假单胞菌感染刺激下均显着上调,提示Lc-MAVS＿tv1及Lc-MAVS＿tv2均能参与宿主的免疫反应。亚细胞定位分析结果表明Lc-MAVS＿tv1主要定位于线粒体,而Lc-MAVS＿tv2则在胞浆中均匀分布。此外,Lc-MAVS＿tv1与Lc-MAVS＿tv2过表达均能诱导核转录因子κB（nuclear transcription factor-κB,NF-κB）启动子活化,且Lc-MAVS＿tv2的诱导活性显着高于Lc-MAVS＿tv1;Lc-MAVS＿tv1过表达能诱导干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3,IRF3）启动子活化,但LcMAVS＿tv2的过表达则无法诱导IRF3启动子的激活;值得注意的是Lc-MAVS＿tv1与LcMAVS＿tv2共表达对NF-κB和IRF3启动子的诱导活性显着高于两者单转的诱导活性。此外,Lc-MAVS＿tv1、Lc-MAVS＿tv2与TRAF3/5/6在对NF-κB启动子的诱导激活中均有协同作用,且Lc-MAVS＿tv2与TRAF3/5/6共表达的诱导活性显着高于Lc-MAVS＿tv1;但LcMAVS＿tv2会显着的抑制TRAF3/5/6对IRF3启动子的诱导活性,说明Lc-MAVS＿tv2可能对大黄鱼TRAF3/5/6介导的IRF3信号通路的激活具有负调控作用。本研究还克隆鉴定了大黄鱼TRAF5及其异构体,分别命名为Lc-TRAF5＿tv1和LcTRAF5＿tv2。Lc-TRAF5＿tv1蛋白分子包含环指蛋白结构域（RING Finger domain）、锌指蛋白结构域（Zinc Finger domain）、卷曲螺旋结构域（coiled coil domain）和MATH结构域（Meprin and TRAF-homology domain）,而Lc-TRAF5＿tv2仅包含RING Finger结构域。在健康大黄鱼中,Lc-TRAF5＿tv1表达水平远高于Lc-TRAF5＿tv2,且在大黄鱼鳃、肠道和头肾中Lc-TRAF5＿tv1及Lc-TRAF5＿tv2的表达水平在poly I:C、LPS、PGN刺激和变形假单胞菌感染刺激下均显着上调,提示Lc-TRAF5＿tv1及Lc-TRAF5＿tv2均能参与宿主的免疫反应。亚细胞定位分析结果表明Lc-TRAF5＿tv1与Lc-TRAF5＿tv2均为胞浆蛋白,不同的是LcTRAF5＿tv1在胞浆中均匀分布,而Lc-TRAF5＿tv2在细胞核周围有明显的聚集状斑点。此外,Lc-TRAF5＿tv1和Lc-TRAF5＿tv2的过表达均能显着诱导NF-κB和IRF3启动子的激活,且Lc-TRAF5＿tv1对NF-κB启动子的诱导活性显着高于Lc-TRAF5＿tv2;值得注意的是,Lc-TRAF5＿tv2与Lc-TRAF5＿tv1的共表达会显着抑制Lc-TRAF5＿tv1对NF-κB启动子的诱导活性,说明Lc-TRAF5＿tv2可能对大黄鱼TRAF5介导的NF-κB信号通路的激活具有负调控作用。
陈晨[5]（2021）在《溃疡性结肠炎“以痈论治”策略的临床疗效及机制研究》文中认为目 的:首先,通过理论研究,总结姜树民教授“以痈论治”UC的学术思想及经验。然后,通过临床试验,观察消痈止痢汤治疗活动期大肠湿热型UC患者的有效性及安全性。最后,通过动物实验,分析消痈止痢汤疗效的可能作用机制。为“以痈论治”UC提供新的治疗思路和科学依据。资料与方法:首先,通过理论研究,梳理姜树民教授“以痈论治”UC学术思想的师脉传承,总结姜师对UC祖国传统医学病因、病机的认识,挖掘其对本病的治疗特色及经验,并对消痈止痢汤的配伍特点、组方原则、方药功效进行分析。其次,通过临床研究,对符合纳入标准的48例UC患者,随机分为对照组和治疗组,对照组予美沙拉嗪缓释颗粒治疗,治疗组在此基础上联合消痈止痢汤颗粒剂治疗,疗程为2个月,疗程结束后对两组患者的临床疗效、中医证候疗效、中医主要证候总积分、改良Mayo评分、Baron内镜评分、IBDQ评分及血常规、肝肾功等安全性指标进行评价。最后,通过动物实验研究,先将51只SD大鼠随机分为空白组和造模组,对造模大鼠通过自由饮用4%DSS溶液,7天建立UC大鼠模型。造模成功后,再将造模大鼠随机分为模型组、消痈止痢汤低、中、高剂量组和柳氮磺吡啶组,并将全部大鼠连续7天灌胃治疗,空白组与模型组灌等量的生理盐水,中药组及西药组分别灌不同浓度的消痈止痢汤水煎液和柳氮磺吡啶混悬液。实验期间,每天观察大鼠的一般状态、体质量、便潜血等情况。疗程后,对大鼠麻醉、取材,腹主动脉取血,分离结肠组织。最后,观察各组大鼠的一般状态、体质量、结肠长度、DAI评分的变化情况;观察病理下组织形态,并对组织学评分;ELISA法对血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO含量进行检测;免疫组化法对结肠组织中磷酸化的ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65蛋白进行检测,并测定平均光密度值;Western blot法对结肠组织中ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65蛋白及磷酸化蛋白检测,并测定灰度值。结果:一 理论研究姜树民教授认为UC“脾虚为发病之本”,“湿热、毒、瘀”为关键病理因素,“毒热致痈”为发病特点,认为UC的病机为:湿热壅滞,凝滞气血,热极成毒,浊毒相互胶结,下结肠腑,脂络受损,血肉腐败,酿化成痈。临证善用托法,采用“消痈去腐”的治疗原则,创立“消痈止痢汤”。二 临床研究1.临床疗效比较:治疗组总有效率90.9%,对照组78.3%,治疗组高于对照组,但无统计学差异（P>0.05）。2.中医证候疗效比较:治疗组总有效率高于对照组（P<0.05）。3.中医主要证候总积分比较:两组中医证候积分较治疗前比较,均下降（P<0.05）;且治疗组积分低于对照组（P<0.05）。4.改良Mayo评分比较:两组较治疗前比较,Mayo评分均下降（P<0.05）;且治疗组评分低于对照组（P<0.05）。5.Baron内镜评分比较:两组较治疗前比较,Baron内镜评分均下降（P<0.05）;且治疗组评分低于对照组（P<0.05）。6.IBDQ评分比较:经过治疗,两组较治疗前比较,IBDQ评分均升高（P<0.05）;且治疗组评分高于对照组（P<0.05）。7.安全性指标检测:两组患者在疗程后,血常规、肝肾功检测均正常,全部病例未出现不良反应。三 实验研究1.UC模型成功的复制①大鼠在造模期间,从第3天便隐血试验开始呈现阳性（+）;从第4-5天逐渐出现体质量下降、大便变稀,便隐血试验呈强阳性（+++）;从第6-7天开始,大便中混有鲜血。②结肠组织肉眼和病理学观察结果:肉眼可见结肠黏膜表面充血、糜烂,距肛门口4-6cm处最为明显;病理下可见黏膜上皮破坏明显、隐窝结构消失、杯状细胞大量减少、黏膜层及下层大量炎性细胞浸润。2.消痈止痢汤对UC大鼠一般状态变化的影响疗程后,空白组大鼠状态活跃、皮毛光泽、进食正常、大便正常。与空白组相比,模型组大鼠皮毛缺乏光泽,食量下降,活动量减少,精神萎靡,大便中混有鲜血。与模型组比较,各剂量中药组及西药组对大鼠的一般状态均有不同程度的改善。3.消痈止痢汤对UC大鼠体质量变化的影响实验期间内,空白组大鼠体质量逐渐增加,并在实验第14天达到最大值;而模型组大鼠从第3天开始,体质量逐渐下降,在实验第14天下降到最低值,与空白组比较有统计学差异（P<0.01）;各剂量中药组及西药组,在第1周时间内,体质量下降程度同模型组相同（P>0.05）;实验结束后,各中药剂量组及西药组大鼠的体质量同模型组比较均增加（均P<0.01）。4.消痈止痢汤对UC大鼠DAI评分变化的影响与空白组比较,模型组DAI评分显着增高（P<0.01）;与模型组比较,各剂量中药组和西药组评分均降低（P<0.05,P<0.01）。5.消痈止痢汤对UC大鼠结肠长度变化的影响与空白组比较,模型组结肠显着缩短（P<0.01）,与模型组比较,各剂量中药组及西药组显着变长（P<0.01）。6.消痈止痢汤对UC大鼠组织病理学变化的影响①显微镜下:空白组,大鼠结肠黏膜表面组织完整,隐窝结构正常,排列规整,可见大量杯状细胞,无炎性细胞浸润;模型组,黏膜上皮损伤严重,隐窝结构消失,杯状细胞大量减少,组织中大量炎性细胞浸润;与模型组比较,高剂量组和西药组黏膜上皮完整,隐窝结构排列规则,杯状细胞明显增多,少量炎性细胞浸润;中剂量组黏膜上皮较完整,隐窝结构排列欠规则,可见隐窝萎缩、分支,炎症细胞浸润减轻;低剂量组,黏膜上皮完整性略有改善,炎性细胞浸润略有减轻,隐窝结构仍破损明显。②病理组织学评分:与空白组比较,模型组评分明显增加（P<0.01）;与模型组比较,各剂量中药组和西药组均明显降低（P<0.05,P<0.01）。7.消痈止痢汤对大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO含量的影响与空白组比较,模型组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO含量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,各剂量中药组及西药组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO含量明显降低（P<0.05,P<0.01）。8.免疫组化法对组织中磷酸化的ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65蛋白含量进行检测①光镜下结果:p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK、p-NF-κ Bp65蛋白主要表达于细胞浆,在结肠黏膜层和黏膜下层均有不用程度的表达,均呈棕色或棕黄色。②p-ERK含量:与空白组比较,模型组显着升高（P<0.01）;与模型组比较,各剂量中药组及西药组显着降低（P<0.05,P<0.01）。③p-JNK含量:与空白组比较,模型组显着升高（P<0.01）;与模型组比较,中剂量、高剂量组、西药组显着降低（P<0.01）,低剂量组无差异（P>0.05）。④p-p38含量:与空白组比较,模型组显着升高（P<0.01）;与模型组比较,中剂量、高剂量组、西药组显着降低（P<0.01）,低剂量组无差异（P>0.05）。⑤p-NF-κ Bp65含量:与空白组比较,模型组显着升高（P<0.01）;与模型组相比,各剂量中药组及西药组显着降低（均P<0.01）。9.Western blot对大鼠结肠组织中ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65及磷酸化蛋白检测与空白组比较,模型组大鼠结肠组织中ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65及其磷酸化的蛋白水平显着升高（P<0.01）。与模型组比较,除了低剂量组在p-JNK蛋白含量上与模型组无明显差异外（P>0.05）,各不同剂量中药组及西药组大鼠结肠组织中ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65及其磷酸化蛋白水平显着降低（P<0.05,P<0.01）。结 论:1.姜树民教授“以痈论治”UC理论渊源明确、学术特色鲜明,创立“消痈止痢汤”,为临床治疗本病提供新的治疗思路。2.消痈止痢汤联合西药,与单纯西药对比,可明显提高活动期大肠湿热型轻中度UC患者的中医证候疗效、降低中医主要证候总积分、改善主要临床症状、降低内镜下黏膜评分、促进肠道黏膜溃疡的愈合以及提高患者的生存质量。3.在临床试验中,患者各安全性指标未出现变化、未出现不良反应,消痈止痢汤安全有效,无毒副作用,可在临床上推广。4.消痈止痢汤对DSS诱导的UC模型大鼠的一般状态有明显改善作用,并可抑制结肠黏膜组织病理学损伤。5.UC模型大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α炎性细胞因子和MPO的含量明显增高,且其含量水平与疾病严重程度呈正相关。6.消痈止痢汤能通过抑制UC模型大鼠血清中L-1 β、IL-6、TNF-α炎性细胞因子和MPO的含量,来改善肠道炎症反应、降低黏膜组织损伤。7.消痈止痢汤治疗UC模型大鼠的作用机制,可能是通过抑制MAPK信号通路的活化,下调NF-κB转录因子的表达,阻止NF-κB的核移位,降低促炎性细胞因子的转录和释放,从而发挥抗炎疗效。
李建德[6]（2021）在《小鼠角膜碱烧伤及雷帕霉素对其修复的机制研究》文中研究表明眼角膜暴露于外部环境,极有可能受到各种损伤。角膜化学损伤占眼科急诊的11.5%至22.1%,其中,碱烧伤通常比其他类型的损伤更严重,这是由于碱试剂亲脂性的特征使其能迅速穿透组织,造成更为严重的创伤。即使采取及时的临床治疗,大多也会由于伤口愈合过程中形成角膜瘢痕和新生血管而造成永久性失明。因此,角膜的碱烧伤修复不仅是基础科学研究的热点,也是一个急需解决的重要医学问题。然而,大量的研究多集中在药物对角膜碱烧伤的影响上,对损伤引起的系统性应答机制研究较少,不利于靶点药物的筛选。角膜碱烧伤引发的应答是一个复杂的级联反应,涉及细胞因子介导下的角膜上皮细胞、基质细胞和免疫细胞之间的相互作用,其中最为重要的是损伤引起的角膜血管新生、纤维化和严重的炎症反应。近年来,雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）被发现具有抗角膜损伤引起的纤维化和血管生成作用,但其介导哺乳动物雷帕霉素靶点（Mammalian target of Rapa,m TOR）调节角膜血管新生的机制研究甚少。本研究通过建立小鼠角膜碱烧伤模型,采用Hematoxylin&Eosin（H&E）染色、免疫荧光染色、实时定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）、亚硫酸氢钠测序PCR（Bisulfite sequencing PCR,BSP）、电泳迁移率实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）、蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）、流式细胞术（Flow cytometry,FCM）和酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）技术,从形态、组织和分子水平,确定小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下血管生成的DNA甲基化调控机制、转录因子调控机制、MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路调控机制、以及角膜碱烧伤引起的机体免疫应答与药物干预下的修复机制,得到以下结论:Ⅰ.碱烧伤引起的小鼠角膜浑浊化及Rapa干预下血管生成的DNA甲基化调控、转录因子调控、及MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路调控:1.碱烧伤引发血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）介导的血管新生,并诱导静止的角质细胞分化为成纤维细胞,成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）转化为肌成纤维细胞导致角膜纤维化。Rapa通过降低VEGF和α-SMA介导的血管生成和角膜纤维化,减轻角膜碱烧伤引起的损伤。2.碱烧伤诱导的角膜细胞增殖主要来自于基质细胞,而Rapa诱导的损伤角膜细胞增殖主要来自于上皮细胞。此结果显示出Rapa作为治疗角膜碱烧伤备选药物的可行性:能有效促进损伤角膜上皮细胞的增殖以达到修复创伤面的目的,并可能抑制因损伤引起的基质细胞增殖,保证了角膜基质的均一性和良好的光线折射性。3.小鼠角膜碱烧伤可诱导DNA甲基转移酶3b（DNA methyltransferases 3b,Dnmt3b）表达升高并介导m TOR基因启动子发生从头DNA甲基化修饰,而Rapa通过抑制Dnmt3b的表达降低碱烧伤诱导的甲基化。这种调控机制在如碱烧伤类的损伤中主要借助于基因启动子区一些关键的Cp Gs位点实现其对转录水平的影响。4.转录因子ETS变体5（The transcription factor ETS-variant 5,ETV5）结合在Rapa诱导的m TOR基因去甲基化位点并负调控基因表达,在角膜碱烧伤后的Rapa修复中发挥重要作用。5.小鼠角膜碱烧伤模型中,损伤诱导PI3K/AKT/m TOR信号通路活化和低氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-1α）高调,引起VEGF高表达。因此得到一条角膜碱烧伤引起的血管生成调控轴:PI3K/AKT/m TOR/HIF-1/VEGF。6.MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路通过m TOR分子调控VEGF的表达,因此,对以上通路的联合抑制,有利于血管生成疾病的治疗。Ⅱ.小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下的免疫应答:1.角膜碱烧伤引起包括巨噬细胞和中性粒细胞在内的白细胞浸润,它们通过角膜缘迁移进入基质,释放白介素1α（Interleukin-1α,IL-1α）和肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）,启动Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）和NOD样受体家族3（Nucleotide binding oligomerization domain-like receptors,NLRP3）炎症信号通路,招募基质金属蛋白酶-2（Matrix metalloproteinases-2,MMP-2）,发展了损伤角膜的急性炎症反应和与之相关的血管生成。Rapa通过抑制白细胞的浸润和炎症因子的表达降低了碱烧伤引起的角膜炎症反应和炎症相关的血管生成。2.Rapa促进角膜中碱烧伤诱导的CD4+T细胞向CD4+CD25high Treg细胞转化。
王玉天[7]（2021）在《从数据挖掘和网络药理学探讨“湿瘀”理论与清热利湿方治疗痛风性关节炎作用机制》文中认为研究一:数据挖掘研究目的:通过数据挖掘分析痛风性关节炎证候特点及朱跃兰教授治疗痛风性关节炎的遣方用药规律,梳理痛风“湿瘀”理论,总结核心处方及导师学术思想。方法:收集2012年1月至2019年12月于北京中医药大学东方医院风湿病科门诊或住院治疗且经朱跃兰教授开具中药处方的痛风性关节炎患者病历资料;病历信息经规范化处理后,录入中医传承辅助平台V2.5和EXCEL进行频次统计、规则分析、熵聚类分析及复杂网络分析。结果:（1）本研究共纳入612例病历资料,男性患者580例,女性患者32例,平均年龄51岁,共出现41个合并疾病,以“高血压”最多。（2）整体数据挖掘结果:发病诱因以“饮酒”最为多见;共出现126种症状和舌脉,症状以“局部皮肤灼热感,关节红肿热痛”最多,舌脉以“舌暗红,苔黄腻,脉弦滑”为多;共出现5种证型,“湿热蕴结证”占绝大多数;612首中药处方中,共出现207味中药,“虎杖、土茯苓、甘草”等中药出现频次最高,功效分类显示,“清热药”使用频次最高,药性以“平、寒”居多,药味以“甘、苦、辛”居多,归经以“肝经、脾经、胃经”等居多。（3）分层数据挖掘结果:①湿热蕴结证:共出现106种症状和舌脉,以“关节红肿热痛,局部皮肤灼热感”为核心症状,舌脉以“舌暗红,苔黄腻,脉弦滑”为多;共出现166味中药,以“虎杖、土茯苓、川牛膝”等12味中药为核心,共演化出11首新处方。②瘀热阻滞证:共出现72种症状和舌脉,以“关节肿胀疼痛,皮色紫暗”为主症,舌脉以“舌暗红,苔腻,脉弦滑”为多见;共出现112味中药,以“土茯苓、虎杖、川牛膝”等9味中药为核心,共演化出13首新处方。③脾虚湿盛证:共出现61种症状和舌脉,以“高尿酸血症”为主症,舌脉以“舌暗红,苔白腻,脉滑”多见;共出现107味中药,以“六君子汤”加减为核心,共演化出5首新处方。④肝肾亏虚证:共出现74种症状和舌脉,以“关节畸形、反复发作”为核心症状,舌脉以“舌黯淡,苔薄黄,脉弦细”为主;共出现136味中药,以“川牛膝、熟地黄”等12味中药为核心,共演化出8首新处方。⑤痰浊阻滞证:共出现50种症状和舌脉,以“关节酸痛,关节肿胀疼痛”为核心症状,舌脉以“舌黯淡胖大,苔白腻,脉弦”为主;共出现88味中药,以“甘草、砂仁、茯苓”等10味中药为核心,共演化出2首新处方。结论:（1）痛风临床以“湿热蕴结证”最为多见,“瘀热阻滞证”次之,“湿”“瘀”“热”可能是痛风的主要特征性因素。（2）朱跃兰教授以“湿瘀”理论为辨治思想,认为痛风以“湿热瘀阻”为核心病机,治疗以清热利湿、活血止痛为法,“清热利湿方”为其核心代表方剂。研究二:网络药理学研究目的:利用网络药理学方法探究清热利湿方治疗痛风性关节炎的主要成分、靶点以及通路,预测其治疗痛风性关节炎的作用机制,为后续实验研究提供思路及理论基础。方法:通过TCMSP中药数据库收集清热利湿方主要活性成分及作用靶点,采用Swiss Target Prediction数据库预测主要活性成分靶点;通过OMIM数据库、TTD数据库、DisGeNET数据库以及CTD数据库收集痛风性关节炎疾病相关靶点;通过韦恩图,得到疾病与药物的共同靶点;利用Cytoscape3.7.2软件构建“药物-化合物-靶点”网络;将共同靶点上传至String数据库构建蛋白相互作用网络图,分析后获得关键靶点;对关键靶点进行基因本体（gene ontology,GO）功能富集分析以及京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析。结果:收集并筛选出清热利湿方140个活性成分、358个靶点,痛风性关节炎疾病相关靶点1494个,清热利湿方与痛风性关节炎的共同靶点93个,关键靶点38个。GO富集分析得到1504条富集结果,KEGG富集分析得到126条相关信号通路,主要涉及白细胞介素（interleukin,IL）-17信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）信号通路、辅助性T细胞17分化、Toll样受体（toll-likereceptors,TLRs）信号通路、核苷酸结合寡聚结构域样受体（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs）信号通路等。结论:清热利湿方含有多种有效成分及靶点,作用机制较为复杂,本研究预测了清热利湿方治疗痛风性关节炎的作用机制,可能通过TLRs信号通路、NLRs信号通路及TNF信号通路等发挥作用,体现了中药多成分、多靶点、多途径的作用特点,为进一步研究提供了理论基础和研究方向。研究三:动物实验研究目的:基于TLRs信号通路及Nod样受体蛋白3（nod-like receptor protein 3,NLRP3）炎性小体探讨清热利湿方治疗急性痛风性关节炎大鼠疗效及作用机制。方法:将48只健康雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、双氯芬酸钠组和中药组,每组12只。除空白组外,余3组大鼠均复制急性痛风性关节炎模型,空白组大鼠相同部位注射等量生理盐水。造模后2h对所有大鼠开始灌胃,空白组、模型组大鼠灌胃蒸馏水,其余各组均灌胃给药,每天一次,连续灌胃5天。观察大鼠一般情况,并于不同时间节点对所有大鼠进行踝关节肿胀度、功能障碍指数以及关节炎症指数测定。末次给药2h后,测定各组大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平,踝关节滑膜组织病理学观察,并分别检测 TLR2、TLR4、核转录因子-κB（nuclearfactor-kappaB,NF-κB）、NLRP3蛋白及mRNA水平。结果:（1）造模6h后,中药组关节功能障碍指数评分逐渐减低,造模48h后,与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;与双氯芬酸钠组比较,各时间节点均无明显差异（P>0.05）。（2）造模12 h后,中药组关节炎症指数评分逐渐减低,造模72 h后,与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）;与双氯芬酸钠组比较,各时间节点均无明显差异（P>0.05）。（3）造模6 h后,中药组踝关节肿胀度逐渐减低,造模12 h后,与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;与双氯芬酸钠组比较,各时间节点均无明显差异（P>0.05）。（4）与模型组比较,中药组血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均显着下降（P<0.01）;与双氯芬酸钠组比较,中药组血清IL-8水平显着升高（P<0.01）,IL-1β、IL-6、TNF-α水平虽呈升高趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。（5）与模型组比较,中药组大鼠踝关节滑膜组织病理可见少量炎性细胞浸润,部分细胞轻度水肿增生,偶见细胞坏死变性;与双氯芬酸钠组比较未见明显差异。（6）与模型组比较,中药组大鼠踝关节滑膜组织TLR2、NF-κB、NLRP3蛋白表达水平显着下降（P<0.05）,TLR4蛋白表达水平呈下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;与双氯芬酸钠组比较,TLR2、TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达水平呈升高趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;（7）与模型组比较,中药组大鼠踝关节滑膜组织TLR2、TLR4、NF-κB、NLRP3 mRNA表达水平均显着下降（P<0.05,P<0.01）;与双氯芬酸钠组比较,TLR2、TLR4、NF-κB mRNA表达水平显着升高（P<0.05,P<0.01）,NLRP3 mRNA表达水平虽呈升高趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。结论:（1）清热利湿方可有效缓解急性痛风大鼠关节炎性症状,改善大鼠踝关节肿胀、炎性浸润等,并可显着降低急性痛风大鼠血清炎症因子水平;（2）清热利湿方可能通过抑制TLR2/NF-κB信号通路及NLRP3炎性小体发挥抗炎作用。
许知礼[8]（2021）在《白色念珠菌通过激活炎症信号途径在小鼠模型中诱导急性肺损伤的研究》文中指出研究背景白色念珠菌是一种常见于健康成人胃肠道、泌尿生殖道、口腔、皮肤和呼吸道的共生微生物,也是人类和其他哺乳动物的一种机会性真菌病原体。在多种条件下,如HIV/AIDS感染、广谱抗生素的过度使用、先天性免疫缺陷疾病、化疗和免疫抑制治疗,它可以从良性共生生物转变为致病病原体。据统计分析1997年至2016年期间侵入性念珠菌病仍主要由白色念珠菌感染引起。大约?的肺部念珠菌病患者需要入住重症监护病房或机械通气,与非白色念珠菌感染相比,总体住院死亡率显着升高。而且下呼吸道念珠菌定植会增加医院获得性肺炎发生率、增加耐药细菌感染风险,免疫受损患者合并念珠菌定植预后更差。支气管肺念珠菌病是侵入性念珠菌病的重要组成部分,但组织学证明的肺炎很少。因此,白色念珠菌导致肺损伤的机制有待于动物实验的进一步研究。目前研究发现,白色念珠菌感染会增加宿主促炎细胞因子和趋化因子的表达,抑制炎症信号通路可显着保护啮齿动物免受炎症诱导的急性肺损伤。核因子-κB（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）、信号转导和转录激活因子（STATS）通路是重要的炎症信号通路。然而,这些炎症信号通路是否参与小鼠白色念珠菌感染所致的急性肺损伤以及免疫抑制是否加重小鼠肺损伤仍需进一步探讨。研究目的1、探讨腹腔内注入地塞米松联合环磷酰胺是否可成功建立免疫抑制动物模型。2、探讨气道注入白色念珠菌是否可成功建立感染动物模型。3、探讨白色念珠菌感染是否诱导正常和免疫抑制小鼠急性肺损伤。4、探讨白色念珠菌感染导致正常和免疫抑制小鼠急性肺损伤的可能炎症机制。实验方法（1）白色念珠菌混悬液的制备取白色念珠菌标准菌株（ATCC SC5314）在YPD培养基30℃中培养过夜,使用倍比稀释涂布平板法将白色念珠菌混合配制成混悬液,调整菌量约为106～107CFU/ml。（2）免疫抑制动物模型建立地塞米松（Dexa,10mg/kg）i.p每天1次×10d,环磷酰胺（Cy,150 mg/kg）i.p每天1次×1d,成功制成免疫抑制模型;对照组于相同时间给予同等剂量生理盐水腹腔内注射。（3）感染动物模型建立免疫抑制模型建立次日,CA组和Dex A+Cy+CA组小鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3m L/100g）后气管内注入50μl白色念珠菌混悬液。Control组和Dexa+Cy组小鼠麻醉后气管内注入50μl生理盐水。（4）流式细胞术Control组和Dexa+Cy组小鼠麻醉后利用眼球采血留取外周血行流式细胞术检查评估免疫抑制情况。（5）组织学白色念珠菌感染后6h处死所有小鼠,右肺上叶组织行组织培养,部分肺组织10%福尔马林浸泡,脱水石蜡包埋,切片HE染色和PAS染色。（6）ELISA法检测血清炎性因子IL-17、IL-6、IL-1β水平。RT-PCR法检测肺组织中IL-6、TGF-β、Kc和Mcp-1 m RNA水平。Western-blotting检测NF-κB、MAPK、PI3K/AKT和STAT3信号通路的蛋白表达。采用免疫组织化学方法检测NF-κBp65、NF-κBp50和p-STAT3的阳性核定位。（7）生存分析Control组、Dexa+Cy组、CA组和Dex A+Cy+CA组小鼠每组10只,动物死亡观察至白念珠菌感染后7d。研究结果1、腹腔内注射Dexa+Cy成功建立小鼠免疫抑制模型。雄性BALB/c小鼠腹腔内注射Dexa+Cy后表现为精神倦怠、萎靡,不喜活动,不嗜食水,毛发蓬乱,体重下降。小鼠外周血流式细胞术显示淋巴细胞比例下降,CD4+T和CD8+T细胞下降、CD4+T/CD8+T比值下降,免疫抑制模型构建成功。2、气管内注入白色念珠菌混悬液成功建立小鼠白色念珠菌感染模型。肺组织石蜡切片PAS染色显示肺组织内可见白色念珠菌孢子,肺组织培养可见白色念珠菌生长,白色念珠菌感染动物模型构建成功。3、白色念珠菌气管注入6小时后导致急性肺损伤,免疫抑制加重肺损伤。肺组织病理学Dexa+Cy组肺系数较Control组无统计学差异。CA组肺系数较Control组相比略有增加（P<0.05）。Dexa+Cy+CA组肺系数较Dexa+Cy组明显增加（P<0.01）。HE染色观察Control组和Dexa+Cy组显微镜下见肺泡结构完整,无炎症细胞浸润。CA组HE染色显微镜下见肺泡腔及间质可见大量炎症细胞浸润,伴有肺泡壁增厚。Dexa+Cy+CA组显着加重了小鼠肺中白色念珠菌诱导的炎症细胞浸润和肺泡壁增厚。4、白色念珠菌感染上调正常和免疫抑制小鼠肺部炎症因子和趋化因子的表达。正常和免疫抑制组小鼠白色念珠菌感染后,肺组织中炎症因子IL-6和TGF-βm RNA和趋化因子Kc和Mcp-1 m RNA显着增加。进一步测定血清IL-17、IL-6和IL-1β水平,CA组和Dexa+Cy+CA组三者水平显着升高,其中Dexa+Cy+CA组中IL-17和IL-1β水平较CA组进一步增高。5、白色念珠菌感染激活小鼠肺中NF-κB信号。核因子抑制蛋白IκBα在四组中表达水平无差异,但p-IκBα水平在白色念珠菌感染后显着升高。CA组肺NF-κB p50和p65的水平显着增加,免疫抑制后NF-κB p50和p65水平进一步增加。进一步分析肺NF-κB p50和p65的核移位发现NF-κB p50和p65的核移位主要在正常和免疫抑制小鼠的肺上皮细胞和间质细胞中,免疫抑制增加了白色念珠菌感染后κB p50和p65细胞核阳性的数量。研究结果显示白色念珠菌感染激活小鼠肺中NF-κB信号诱导急性肺损伤。6、白色念珠菌感染激活小鼠肺中MAPKs信号通路。研究显示四组之间肺p38、ERK1/2和JNK表达水平无差异。白色念珠菌感染对p-ERK1/2和p-JNK蛋白表达没有影响,但可显着诱导肺p38磷酸化,提示白色念珠菌感染可能通过MAPK-p38通路介导急性肺损伤。7、白色念珠菌感染激活小鼠肺中PI3K/Akt信号通路。研究发现正常和免疫抑制组小鼠肺中的p-Akt水平在白色念珠菌感染后明显上调的,提示白色念珠菌感染可以激活肺中的PI3K/Akt信号通路。8、白色念珠菌感染激活小鼠的肺STAT3信号通路。本课题分析了肺组织中的STAT3信号。结果发现白色念珠菌感染显着诱导肺STAT3磷酸化,免疫抑制小鼠的肺p-STAT3水平进一步升高。白色念珠菌感染后肺组织中ROR-γt和ROR-α水平显着升高。免疫抑制小鼠中p-STAT3细胞核阳性的数量增加。结果显示白色念珠菌感染可能活化小鼠的肺STAT3信号通路。研究结论（1）腹腔内注射Dexa+Cy成功建立小鼠免疫抑制模型。（2）气管内注入白色念珠菌混悬液成功建立小鼠白色念珠菌感染模型。（3）白色念珠菌感染上调正常和免疫抑制小鼠肺部炎症因子和趋化因子的表达。（4）白色念珠菌气道内注入可能通过激活NF-κB,MAPKs,PI3K/Akt和STAT3信号通路诱导急性肺损伤。免疫抑制可能通过激活部分炎症信号通路（NF-κB、STAT3）加重急性肺损伤。
何泳龙[9]（2020）在《miR-150与白藜芦醇在痛风炎症中的作用机制研究》文中研究指明背景与目的:痛风（gout）是尿酸或尿酸盐（monosodium urate,MSU）晶体沉积于全身关节及其关节周围组织或器官而引起以高尿酸血症、急慢性痛风性关节炎、痛风石、尿酸性尿路结石以及尿酸性肾病为主要表现的一组临床综合征。近年来,在全球范围内痛风的发病率和患病率呈逐年升高趋势,且有年轻化趋势。流行病学资料显示,欧洲痛风患病率达1.4%,而我国痛风患病率1%3%。高尿酸血症是痛风发生的生化基础和最直接原因。研究证实,MSU可作为DAMPs激活TLRs介导的免疫炎症信号通路,释放IL-1β、TNF-α、IL-6等致炎因子。痛风区别于其它自身炎症性疾病或自身免疫性疾病的显着特征之一是急性发作后710天后可自行缓解,痛风这一特征的具体分子机制尚不清楚,是目前痛风发病机制中急需解决的问题之一。micro RNAs是一类长度约为18-25nt的内源性高度保守的非编码小RNA,它通过与靶基因的3’-UTR结合,形成RNA诱导的沉默复合体,来降解m RNA和/或抑制靶m RNA转录后翻译。mi RNAs在炎症反应的调节作用受到广泛的关注。近年来,越来越多的研究发现,mi RNAs在痛风发病过程中发挥重要作用。本课题组前期研究发现,mi R-150在MSU刺激的野生型小鼠骨髓诱导的巨噬细胞中呈高表达,提示mi R-150可能参与MSU诱导的炎症反应。中医认为痛风属于“痹症”范畴,是因脾胃运化功能失常所致。湿热瘀阻型和痰瘀互结证是痛风急性发作期最常见的证型,其治疗以清热利湿为主,而虎杖具有清热利湿的效果。近年来,发现虎杖提取物白藜芦醇具有通过调节细胞信号通路和mi RNAs来发挥抗炎作用而被广泛关注。有研究显示,白藜芦醇可能通过抑制NF-κB的活化来调控TLR4信号通路来抑制巨噬细胞分泌细胞因子发挥抗炎作用,但具体机制还有待进一步研究。本课题拟通过研究痛风患者mi R-150的变化情况、mi R-150调控痛风炎症机制以及白藜芦醇调控痛风炎症的机制探讨mi R-150在痛风炎症中的作用。材料与方法:1.收集痛风（其中,急性期60例（acute gout,AG）、间歇期60例（intercritical gout,IG）患者）和同期体检的48例健康体检者（health control,HC）外周静脉血标本以及临床和实验室资料,其中。采用RT-q PCR检测痛风患者外周血单个核细胞中mi R-150、SOCS1、STAT3、NF-κB P65 m RNA表达水平,Western blot检测痛风患者PBMCs中SOCS1、p-STAT3和p-NF-κB P65蛋白水平,并通过相关性分析mi R-150与实验室资料的相关关系。2.利用生物信息学分析并鉴定THP-1细胞中mi R-150的靶分子（1）结合文献查阅及利用生物信息学软件Target Scan、mi Rbase、RNAhybrid 2.2预测,筛选出与痛风炎症相关的mi R-150靶分子;（2）构建作用靶点双荧光素酶报告载体,与mi R-150 mimic（过表达）共转染至293T细胞中,观察mi R-150是否能与靶基因3’-UTR区中预测位点结合;（3）mi R-150 mimic（过表达mi R-150）和mi R-150 inhibitor（抑制mi R-150表达）共转染THP-1细胞,采用RT-q PCR法检测mi R-150和SOCS1 m RNA的表达,运用Western blot法检测SOCS1蛋白的水平。3.mi R-150 mimic/inhibitor对MSU刺激THP-1巨噬细胞炎症的影响（1）mi R-150 mimic/inhibitor转染THP-1细胞48h后予以100ng/ml PMA诱导分化24h,再予以100μg/ml的MSU刺激6h后收集细胞和上清液;（2）采用流式细胞术检测经（1）中处理后细胞凋亡情况;RT-q PCR法检测mi R-150、SOCS1 m RNA水平;Western blot法检测SOCS1、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白水平;采用ELISA法检测上清液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平;4.白藜芦醇及SOCS1 si RNA对MSU刺激THP-1巨噬细胞炎症的影响（1）白藜芦醇单独或联合SOCS1 si RNA干预100μg/ml MSU刺激经100ng/ml PMA诱导分化的THP-1细胞,收集细胞和上清液;（2）采用流式细胞术检测经（1）中处理后的细胞凋亡情况;RT-q PCR检测SOCS1 m RNA水平;Western blot法检测SOCS1、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白水平;采用ELISA法检测上清液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平;5.采用SPSS13.0统计软件包及Graph Pad Prism 5对所有数据进行分析统计,基因表达以2^（-??CT）表示,结果以均数±标准差（x±s）表示,多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）,进一步组间两两比较采用t检验（Bonferroni法）,相关性分析采用Spearman。P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.与健康对照组比较,痛风患者除炎症指标如WBC、GR、ESR和CRP外,与代谢相关的多个指标如血尿酸、BMI、血脂、血糖、血压均显着增高（P<0.01或P<0.05）;2.AG组患者外周血单个核细胞中mi R-150显着低于IG组和HC组（P均<0.05）,而IG与HC组之间差异无统计学意义（P>0.05）;3.利用生物信息学在线软件预测到SOCS1为mi R-150的靶基因;通过构建含有mi R-150作用靶点的双荧光素酶报告载体,证实了mi R-150能与SOCS1 m RNA上预测的结合位点结合;通过转染mi R-150 mimic/inhibitor至THP-1细胞后,结果发现,与Blank组比较,mi R-150 mimic组mi R-150显着上调（P<0.01）,而mi R-150inhibitor组mi R-150显着降低（P<0.01）;与Blank组比较,mi R-150mimic组SOCS1 m RNA和蛋白的表达水平显着下降（P<0.01）,而mi R-150 inhibitor组SOCS1 m RNA和蛋白的表达水平显着升高（P<0.01）。4.mi R-150对MSU刺激THP-1巨噬细胞炎症的影响:（1）RT-q PCR结果显示mi R-150在MSU刺激的THP-1巨噬细胞中表达显着增加（P<0.01）;RT-q PCR和Western blot结果显示SOCS1 m RNA和蛋白水平在MSU刺激的THP-1巨噬细胞中显着降低（P<0.05）;上清液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平显着增加（P均<0.01）（2）mi R-150过表达时,RT-q PCR及Western blot结果显示SOCS1m RNA和蛋白表达水平均显着下调（P均<0.01）,Western blot结果显示p-NF-κB和p-STAT3蛋白表达显着升高（P均<0.05）;ELISA结果显示细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平显着增加（P均<0.01）;而mi R-150表达抑制时,结果显示SOCS1m RNA和蛋白表达水平均显着增加（P均<0.01）,而p-NF-κB和p-STAT3蛋白表达显着下降（P均<0.05）;上清液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平显着降低（P均<0.01）;（3）AG组和IG组PBMCs中SOCS1 m RNA和蛋白均显着低于HC组（P<0.01,P<0.05）,且AG组显着低于IG组（P<0.05）。AG组STAT3和NF-κB p65 m RNA水平显着高于IG组和HC组（P<0.05,P<0.01）,AG组p-STAT3和p-NF-κB p65蛋白水平显着高于IG组和HC组（P均<0.01）5.流式细胞术结果显示不同浓度的白藜芦醇、白藜芦醇单独或联合SOCS1 si RNA组细胞活性均大于96%,凋亡率小于5%,说明白藜芦醇联合MSU和SOCS1 si RNA以及不同浓度白藜芦醇联合MSU刺激THP-1细胞对细胞活性无显着影响（P均>0.05）。6.不同浓度（0,25,50,100μM）Res联合MSU刺激THP-1细胞后,结果发现mi R-150在各组间差异无统计学差异（P>0.05）。Res50μmol/L、100μmol/L联合MSU组SOCS1 m RNA和蛋白表达水平较MSU组显着增加（P均<0.05）,且SOCS1的表达水平呈现浓度依赖性;同时我们发现Res 50μmol/L、100μmol/L联合MSU组NF-κB p65 m RNA和p-NF-κB p65蛋白水平较MSU组显着下降,且随着Res浓度增加下降越明显（P<0.05,P<0.01）;7.不同浓度（0,25,50,100μM）Res联合MSU刺激THP-1细胞后,结果发现Res 50μmol/L、100μmol/L联合MSU组IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平较MSU组显着下降（P均<0.01）,且随着Res浓度增加而下降;8.SOCS1 si RNA联合MSU刺激THP-1细胞后,与MSU组比较,SOCS1 m RNA和蛋白水平显着下降（P均<0.01）,而p-NF-κB p65和p-STAT3蛋白表达水平显着增加（P均<0.01）;9.与Res100+MSU组比较,SOCS1 si RNA组中SOCS1的m RNA和蛋白表达水平显着下降（P均<0.05）,而p-NF-κB p65和p-STAT3蛋白表达水平明显增加（P均<0.05）;上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平显着增加（P均<0.01）。与SOCS1 si RNA联合MSU组比较,SOCS1 si RNA+Res100+MSU组SOCS1 m RNA和蛋白表达水平增加（P均<0.01）,而p-NF-κB p65和p-STAT3蛋白表达水平明显下调（P均<0.01）;上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平显着降低（P均<0.01）。小结:1.除炎症指标如WBC、GR、ESR、CRP外,痛风患者代谢指标如BMI、血压、血糖、血脂等多项实验室指标均高于健康对照者,说明痛风患者容易伴发代谢相关性疾病。2.mi R-150在痛风患者PBMCs中和MSU诱导的巨噬细胞炎症反应中表达异常,提示mi R-150可能参与了痛风的发病。3.预测并验证了SOCS1为mi R-150靶分子;并通过转染实验发现SOCS1 m RNA和蛋白水平能够被mi R-150抑制,提示mi R-150可能通过降解SOCS1 m RNA而发挥抑制作用。4.SOCS1在痛风患者和MSU诱导的炎症反应中表达显着降低,而STAT3、NF-κB p65 m RNA和p-STAT3和p-NF-κB p65蛋白水平在痛风患者和MSU诱导的炎症反应中显着增加,提示SOCS1、NF-κB和STAT3信号通路可能参与痛风发病过程。5.mi R-150可能通过下调SOCS1的表达,进而促进NF-κB信号通路和STAT3的活化,使炎症因子分泌增多,进而加重炎症反应。6.白藜芦醇通过上调MSU诱导的THP-1巨噬细胞炎症反应中SOCS1的水平,降低p-NF-κB p65和p-STAT3以及炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6水平的降低,SOCS1 si RNA抑制SOCS1的表达后能逆转白藜芦醇的这种抑制效应,提示白藜芦醇调控NF-κB和STAT3的活化来抑制MSU诱导的痛风炎症反应可能是通过上调SOCS1的表达实现的。
汪志文[10]（2020）在《罗非鱼CD6分子及其相关配体的鉴定与功能研究》文中认为哺乳动物中,CD6分子作为来自清道夫受体家族的一种淋巴细胞特异性表面受体,在抗炎症反应以及T细胞激活中具有重要作用,兼顾先天性免疫和适应性免疫调控。但是,CD6分子在以硬骨鱼类为代表的低等脊椎动物中的特性和功能尚不清楚。为探究鱼类CD6分子功能,本论文以尼罗罗非鱼为对象克隆鉴定了CD6分子（On CD6）及其配体CD166、Syntenin-1、LCP2和TARF6。由此展开了以下4个方面的工作:（1）通过原核表达获取了On CD6胞外段蛋白,制备单克隆抗体,探究了On CD6分子富含半胱氨酸结构域胞外段蛋白的生物学功能;（2）以罗非鱼头肾淋巴细胞和动物实验探究了On CD6分子参与炎症反应的作用机制;（3）通过GST Pull-Down确定了On CD6分子与其配体的互作及互作结构域（4）初步探究了On CD6分子及其配体参与的信号通路。取得的研究结果如下:1、On CD6分子作为清道夫受体具备模式识别受体的功能本研究成功克隆鉴定了罗非鱼CD6基因,该分子定位于淋巴细胞膜上。体外实验表明On CD6分子胞外段重组蛋白On CD6-ECD在Ca2+作用下能够广泛识别各种水产病原菌以及病原体相关分子模式（PAMPs）,具有体外抑菌功能并能够诱导细菌凝集,能够促进头肾淋巴细胞的呼吸爆发作用和吞噬反应,并促进HKLs促炎因子IL-1β和TNF-α和抑炎因子IL-10和TGF-β的表达。而其配体CD166则不需要在Ca2+的存在下就能够广泛识别病原体相关分子模式。这些结果表明CD6分子作为清道夫受体的功能保守存在从而具有模式识别受体分子（PRRs）的功能。2、On CD6分子参与无乳链球菌引起的罗非鱼急性炎症反应的作用机制On CD6-ECD重组蛋白联合无乳链球菌攻毒以及On CD6在体内过表达后攻毒实验都能有效提高罗非鱼对无乳链球菌感染的免疫保护率。进一步探究发现On CD6能够有效降低无乳链球菌在罗非鱼体内的定植,并增强鱼体总抗氧化能力、抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的表达、促进抑炎因子IL-10和TGF-β的表达。通过细胞信号通路抑制剂刺激HKLs,发现On CD6分子可能通过NF-κB、MAPK通路调节炎症因子的表达。结合体外研究结果,发现On CD6参与炎症反应的可能机制:广泛识别各种病原体相关分子模式从而结合各种病原引起细菌凝集,增大外源病菌颗粒大小,提高抗氧化物酶活性增强呼吸爆发作用,促进对细菌的清除作用（吞噬作用）。与此同时下调促炎因子IL-1β和TNF-α表达,促进抑炎因子IL-10和TGF-β的表达,降低由无乳链球菌感染造成的损伤等炎性反应症状,从而有效保护机体。3、On CD6分子胞内胞外相关配体表达特征及互作确定成功克隆获取CD6胞内胞外相关配体CD166、Syntenin-1、LCP2和TRAF6。相关定量实验结果表明On CD6分子及其配体组织表达特征具有一致性,都在免疫相关组织中高水平表达,且在LPS、LTA和无乳链球菌刺激下快速上调表达,表明On CD6分子及其配体参与了罗非鱼对无乳链球菌免疫应答;KLH刺激结果表明On CD6在KLH刺激之后,逐渐增加,并且在二次免疫后呈现表达更快,强度更高和持续时间更长的时序表达模式,我们推测On CD6可能参与了宿主对T细胞依赖性病原体感染的防御。GST Pull-Down和ELISA实验结果表明,On CD6与胞外配体On CD166能够结合,并且相互作用结构域为On CD6-SR2和On CD166-IG1;GST Pull-Down体外验证了罗非鱼CD6胞内段CD6-ICD与On Syntenin-1、On LCP2能够结合,而On CD6与On TRAF6的结合可能是通过On Syntenin-1间接作用。4、On CD6、On CD166和On TRAF6参与的信号通路本研究中On CD6和On CD166抑制NF-κB通路激活,On TRAF6显着激活该通路。将On CD6/On CD166和On TRAF6共转染后发现,On CD6/On CD166下调TRAF6引起的NF-κB激活,表明On CD6可能通过与TARF6的结合参与NF-κB的负调节;此外,On CD6/On CD166有效激活了STAT1和ISRE干扰素激活反应元件,并最终激活了IFN3的表达,对IFN1的影响没有显着性变化。我们推测On CD6与其配体的相互作用,可能在IFN3的激活过程中具有重要作用,从而在抗病毒反应中也具有一定作用。
二、急性炎症反应中真核细胞转录因子-κB的信号转导作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、急性炎症反应中真核细胞转录因子-κB的信号转导作用（论文提纲范文）
（1）IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 牛呼吸道疾病病原及其固有免疫应答 |
| 1.1 牛呼吸道病原识别病原的分子基础 |
| 1.2 气道和肺上皮细胞对牛呼吸系统疾病的抵抗能力 |
| 1.3 固有免疫系统的效应细胞 |
| 第二章 牛副流感病毒3 型感染及其逃避宿主免疫的研究进展 |
| 2.1 宿主范围与传播特点 |
| 2.2 流行病学与基因型 |
| 2.3 BPIV3 编码基因与蛋白特征 |
| 2.4 牛副流感的临床症状与病理变化 |
| 2.5 病原分离与鉴定 |
| 2.6 BPIV3 造成的经济损失 |
| 2.7 BPIV3 的治疗与预防 |
| 2.8 副黏病毒拮抗Ⅰ型干扰素的研究概况 |
| 第三章 IL10 的信号转导与其在病毒致病中的作用 |
| 3.1 白细胞介素-10 的来源细胞与基本作用 |
| 3.2 IL10 的受体与信号转导 |
| 3.3 IL10 的相关家族与病毒编码的IL10 |
| 3.4 IL10 在病毒致病中的作用 |
| 3.5 IL10 重要产物SOCS3 在病毒感染中的作用 |
| 3.6 病毒诱导IL10 产生的信号通路 |
| 3.7 阻断IL10 清除病毒感染的新策略 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 犊牛BPIV3 血清抗体调查与BPIV3 A的分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、菌株与质粒 |
| 1.2 血清与病料采集 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 呼吸道症状的犊牛BPIV3 抗体调查 |
| 2.2 鼻棉拭子中的BPIV3 鉴定与分离培养 |
| 2.3 病毒的鉴定与纯化 |
| 3 结果 |
| 3.1 呼吸道症状的犊牛BPIV3 抗体调查 |
| 3.2 BPIV3 分离培养 |
| 3.3 BPIV3 的特性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 BPIV3 感染C57BL/6 小鼠与巨噬细胞的转录组分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要动物、细胞与毒株 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3对C57BL/6 鼠的致病性 |
| 2.2 转录样本的制备 |
| 2.3 转录组测序 |
| 2.4 qPCR验证转录组测序结果 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3对C57BL/6 鼠的致病性 |
| 3.2 BPIV3 感染鼠巨噬细胞后细胞因子的变化 |
| 3.3 BPIV3 感染C57 小鼠后肺组织的转录组分析 |
| 3.4 BPIV3 感染原代巨噬细胞转录组测序与分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的重组表达及特性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、菌株与质粒 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的克隆与生物信息学分析 |
| 2.2 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的原核表达与多抗制备 |
| 2.3 牛IL10、SOCS3 的真核表达 |
| 2.4 牛IL10、IL10R1 腺病毒制备及蛋白表达 |
| 2.5 牛IL10 启动子双荧光素酶载体的构建 |
| 2.6 构建牛IL10、IL10R1、SOCS3 干扰载体 |
| 2.7 牛IL10 的生物学活性及信号通路研究 |
| 2.8 牛SOCS3 对I型干扰素表达的负调控 |
| 3 结果 |
| 3.1 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的克隆 |
| 3.2 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的原核表达与多抗制备 |
| 3.3 牛IL10、SOCS3 的真核表达 |
| 3.4 牛IL10、IL10R1 胞外区的腺病毒感染细胞与表达蛋白鉴定 |
| 3.5 牛IL10 启动子双荧光素酶载体的构建与活性分析 |
| 3.6 牛IL10、IL10R1、SOCS3 干扰载体的构建 |
| 3.7 牛IL10 和IL10R的生物学活性 |
| 3.8 牛IL10 的信号通路 |
| 3.9 牛SOCS3 对I型干扰素表达的负调控 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 IL10 在牛副流感病毒3 型感染中的作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与质粒 |
| 1.2 抗体和抑制剂 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3 感染细胞表达IL10 并发挥其活性 |
| 2.2 IL10/IL10R1对BPIV3 感染与细胞因子表达的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3 感染细胞诱导IL10 的转录与表达 |
| 3.2 BPIV3 感染对STAT3 表达的影响 |
| 3.3 BPIV3 感染对SOCS3 转录的影响 |
| 3.4 BPIV3 感染对其他细胞因子表达的影响 |
| 3.5 IL10对BPIV3 感染与细胞因子表达的影响 |
| 3.6 IL10 受体阻断对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 IL10 与牛副流感病毒3 型感染的相互调控 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与质粒 |
| 1.2 抗体和抑制剂 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3 感染诱导IL10 产生的信号通路 |
| 2.2 调控IL10 相关通路对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3 诱导IL10 产生所依赖的信号通路 |
| 3.2 调控IL10 相关通路对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）IFN-τ诱导miR-505靶向HMGB1抑制奶牛子宫内膜炎性损伤的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 前言 |
| 1 奶牛子宫内膜炎性损伤 |
| 1.1 奶牛子宫内膜的主要生理功能 |
| 1.2 奶牛子宫内膜炎性损伤的发生原因 |
| 1.3 奶牛子宫内膜炎性损伤的病理机制 |
| 2 IFN-τ的生物学特性 |
| 2.1 IFN-τ |
| 2.2 IFN-τ与妊娠 |
| 2.3 IFN-τ抗病毒作用 |
| 2.4 IFN-τ对炎性损伤的影响 |
| 2.5 IFN-τ对信号转导的干预 |
| 3 miRNA及其生物学作用 |
| 3.1 miRNA |
| 3.2 miRNA及其生物学作用 |
| 3.3 miRNA的调控机制 |
| 3.4 miRNA与免疫应答 |
| 3.5 miRNA对组织损伤修复的干预作用 |
| 4 HMGB1与TLR4/NF-κB信号通路 |
| 4.1 HMGB1生物学特性 |
| 4.2 HMGB1与TLR4/NF-κB信号通路的关联性分析 |
| 5 研究目的及意义 |
| 第二章 IFN-τ对奶牛子宫内膜组织炎性损伤的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 组织样品采集 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 生物信息学分析及数据分析软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 奶牛子宫内膜组织离体培养 |
| 2.2.2 离体奶牛子宫内膜组织炎性损伤模型的建立 |
| 2.2.3 实验分组与处理 |
| 2.2.4 组织切片制备 |
| 2.2.5 奶牛子宫内膜组织免疫组织化学检测 |
| 2.2.6 奶牛子宫内膜组织免疫荧光检测 |
| 2.2.7 TUNEL法检测 |
| 2.2.8 RT-qPCR |
| 2.2.9 子宫内膜组织蛋白提取及定量检测 |
| 2.3 数据统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 奶牛子宫内膜组织学分析 |
| 3.2 奶牛子宫内膜组织培养及炎性损伤模型的建立 |
| 3.3 IFN-τ对子宫内膜炎性损伤的影响及浓度筛选 |
| 3.4 IFN-τ抑制奶牛子宫内膜损伤组织中炎性因子的表达 |
| 3.5 IFN-τ对奶牛子宫内膜组织炎性损伤相关蛋白表达的影响 |
| 3.6 IFN-τ对奶牛子宫内膜组织炎性损伤中细胞凋亡的干预作用 |
| 4 讨论 |
| 第三章 IFN-τ介导HMGB1抑制bEECs炎性损伤作用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物实验 |
| 2.2.2 奶牛子宫内膜上皮细胞培养 |
| 2.2.3 奶牛子宫内膜上皮细胞传代培养 |
| 2.2.4 奶牛子宫内膜上皮细胞鉴定 |
| 2.2.5 奶牛子宫内膜上皮细胞分组处理 |
| 2.2.6 CCK-8检测 |
| 2.2.7 ELISA测定 |
| 2.2.8 qPCR检测 |
| 2.2.9 siRNA转染 |
| 2.2.10 Western blotting |
| 2.2.11 小鼠子宫组织免疫荧光检测 |
| 2.2.12 数据统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 bEECs分离培养与鉴定 |
| 3.2 bEECs炎性损伤模型确证 |
| 3.3 IFN-τ对bEECs活力的影响 |
| 3.4 IFN-τ抑制炎性细胞因子的表达 |
| 3.5 IFN-τ抑制HMGB1-IKK-NF-κB通路的活性 |
| 3.6 si-HMGB1沉默HMGB1抑制炎性损伤中相关蛋白表达 |
| 3.7 IFN-τ抑制HMGB1表达对p65蛋白核易位的影响 |
| 3.8 IFN-τ抑制HMGB1表达对小鼠子宫内膜炎性损伤的保护作用 |
| 4 讨论 |
| 第四章 IFN-τ对炎性损伤bEECs中miRNAs表达的干预 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 奶牛子宫内膜上皮细胞培养 |
| 2.2.2 实验分组与处理 |
| 2.2.3 总RNA提取 |
| 2.2.4 总RNA纯度检测 |
| 2.2.5 Small RNA文库构建及高通量测序 |
| 2.2.6 测序结果分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 IFN-τ对bEECs炎性损伤中miRNAs表达的干预 |
| 3.2 差异miRNA聚类分析 |
| 3.3 预测miRNA的靶基因 |
| 3.4 差异miRNA靶基因的KEGG注释 |
| 4 讨论 |
| 第五章 IFN-τ通过miR-505阻遏bEECs炎性损伤作用研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 生物信息学分析工具 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 奶牛子宫内膜组织采集与处理 |
| 2.2.2 小鼠子宫内膜炎性损伤模型的构建 |
| 2.2.3 子宫内膜组织病理学检测 |
| 2.2.4 小鼠子宫组织干湿(W/D)比重测定 |
| 2.2.5 髓过氧化物酶(MPO)检测 |
| 2.2.6 细胞培养 |
| 2.2.7 bEECs转染 |
| 2.2.8 CCK-8检测细胞增殖 |
| 2.2.9 ELISA检测 |
| 2.2.10 总RNA提取和RT-qPCR分析 |
| 2.2.11 Western blotting |
| 2.2.12 miR-505靶基因验证 |
| 2.2.13 流式细胞术检测 |
| 2.2.14 免疫荧光检测 |
| 2.3 数据统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 IFN-τ对miR-505表达的干预作用 |
| 3.2 LPS诱导bEECs中miR-505的表达 |
| 3.3 过表达miR-505抑制bEECs炎性因子的分泌 |
| 3.4 miR-505抑制LPS介导的NF-κB通路的激活 |
| 3.5 miR-505靶向HMGB1-3'UTR调节其转录后翻译过程 |
| 3.6 敲低HMGB1抑制LPS诱导的bEECs炎性损伤作用 |
| 3.7 过表达miR-505抑制bEECs细胞周期阻滞以及凋亡 |
| 4 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 1 本研究主要结论 |
| 2 本研究的不足之处与展望 |
| 参考文献 |
| 附录:作者简历 |
| 致谢 |
（3）ICA通过调控miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路抑制ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 淫羊藿苷的药理学作用 |
| 1.1.1 对心血管系统的作用 |
| 1.1.2 对免疫调节的作用 |
| 1.1.3 抗肿瘤的作用 |
| 1.1.4 对骨代谢的作用 |
| 1.1.5 对神经系统的作用 |
| 1.1.6 对生殖系统的作用 |
| 1.2 miRNAs与动脉粥样硬化 |
| 1.2.1 miRNAs对内皮细胞的影响 |
| 1.2.2 miRNAs对平滑肌细胞的影响 |
| 1.2.3 miRNAs对巨噬细胞的影响 |
| 1.3 常见信号通路与动脉粥样硬化的关系研究 |
| 1.3.1 NF-κB信号通路 |
| 1.3.2 MAPK信号通路 |
| 1.3.3 Toll样受体通路 |
| 1.3.4 Janus激酶/信号转导及转录激活因子信号通路 |
| 1.3.5 PI3K/AKT信号通路 |
| 第2章 ICA抗AS miRNAs芯片生物信息学分析及miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 药品及试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 差异miRNAs的筛选 |
| 2.2.3 差异miRNAs在RAW264.7中表达的验证及目的miRNA的确定 |
| 2.2.4 miR-672-5p的靶基因预测以及GO分析 |
| 2.2.5 KEGG通路分析、靶基因确定及信号通路构建 |
| 2.2.6 ApoE~(-/-)小鼠胸主动脉组织中miR-672-5p、AKT3 mRNA及蛋白的表达 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 差异miRNAs的筛选 |
| 2.3.2 差异miRNAs在RAW264.7中表达的验证及目的miRNA的确定 |
| 2.3.3 miR-672-5p靶基因预测和功能富集结果 |
| 2.3.4 miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路构建 |
| 2.3.5 miR-672-5p、AKT3基因及蛋白在ApoE-/-小鼠胸主动脉组织中的表达 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 ICA对ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应的作用及机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 药品及试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 CCK-8检测RAW264.7细胞的增殖情况 |
| 3.2.3 油红O染色检测RAW264.7泡沫化的形成 |
| 3.2.4 ELISA检测RAW264.7培养上清IL-1β IL-6及TNF-α的含量 |
| 3.2.5 qPCR检测RAW264.7中miR-672-5p及AKT3 mRNA的表达 |
| 3.2.6 Western Blot检测RAW264.7中AKT3及相关信号通路蛋白的表达情况 |
| 3.2.7 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 ox-LDL诱导巨噬细胞源性泡沫细胞模型最佳浓度、时间确定 |
| 3.3.2 ICA对ox-LDL诱导RAW264.7细胞活力影响的浓度确定 |
| 3.3.3 ICA对ox-LDL诱导RAW264.7泡沫化的影响 |
| 3.3.4 ICA对ox-LDL诱导RAW264.7培养上清IL-1β、IL-6及TNF-α含量的影响 |
| 3.3.5 ICA对ox-LDL诱导RAW264.7 miR-672-5p及AKTmRNA表达的影响 |
| 3.3.6 ICA对ox-LDL诱导RAW264.7中AKT3以及信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 miR-672-5p在ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应中的作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 药品及试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 miR-672-5p对AKT3靶向调控作用的验证 |
| 4.2.2 miR-672-5p对ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应的影响 |
| 4.2.3 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 miR-672-5p与AKT3靶向调控的验证 |
| 4.3.2 miR-672-5p对ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 ICA治疗ApoE~(-/-)小鼠AS的miRNA芯片的生物信息学分析及miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路的构建 |
| 5.2 巨噬细胞源性泡沫细胞的构建 |
| 5.3 ICA改善ox-LDL诱导RAW264.7的炎症反应 |
| 5.3.1 ICA抑制ox-LDL诱导RAW264.7的泡沫化 |
| 5.3.2 ICA减少ox-LDL诱导RAW264.7培养上清IL-1β、IL-6及TNF-α的含量 |
| 5.4 ICA通过miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路抑制ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应 |
| 5.4.1 miR-672-5p/AKT3的生物学作用 |
| 5.4.2 ICA通过miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路抑制ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应 |
| 5.5 miR-672-5p作为ICA抑制RAW264.7炎症反应作用靶点的探讨 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）大黄鱼MAVS、TRAF5及其异构体的克隆与免疫功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 大黄鱼简介 |
| 1.2 MAVS的研究概述 |
| 1.2.1 MAVS的鉴定与分子特征 |
| 1.2.2 MAVS的亚细胞定位 |
| 1.2.3 MAVS的分子功能 |
| 1.2.4 MAVS介导的免疫相关信号通路 |
| 1.2.5 MAVS介导的免疫相关信号通路的负调控 |
| 1.2.6 MAVS异构体的研究进展 |
| 1.3 TRAF5的研究概述 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 1.5 主要研究内容与技术路线 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及细胞 |
| 2.1.2 载体及菌株 |
| 2.1.3 主要仪器设备、试剂及耗材 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大黄鱼各组织样品采集 |
| 2.2.2 总RNA提取 |
| 2.2.3 cDNA的合成 |
| 2.2.4 荧光定量PCR |
| 2.2.5 真核表达质粒的构建与提取 |
| 2.2.6 生物信息学分析 |
| 2.2.7 细胞培养 |
| 2.2.8 细胞的脂质体转染 |
| 2.2.9 Western blotting分析 |
| 2.2.10 亚细胞定位实验 |
| 2.2.11 荧光素酶实验 |
| 第3章 大黄鱼MAVS及其异构体的克隆和免疫功能的初步研究 |
| 3.1 大黄鱼MAVS及其异构体的克隆与序列分析 |
| 3.2 大黄鱼MAVS及其异构体的亚细胞定位分析 |
| 3.3 大黄鱼MAVS及其异构体的表达分析 |
| 3.4 大黄鱼MAVS及其异构体对NF-κB、IRF3启动子的激活作用分析 |
| 3.5 大黄鱼MAVS及其异构体与TRAF3/5/6之间的相互作用分析 |
| 3.6 讨论 |
| 第4章 大黄鱼TRAF5及其异构体的克隆和免疫功能的初步研究 |
| 4.1 大黄鱼TRAF5及其异构体的克隆与序列分析 |
| 4.2 大黄鱼TRAF5及其异构体的亚细胞定位分析 |
| 4.3 大黄鱼TRAF5及其异构体的表达分析 |
| 4.4 大黄鱼TRAF5及其异构体对NF-κB、IRF3启动子的激活作用分析 |
| 4.5 大黄鱼TRAF5及其异构体与MAVS及其异构体之间的相互作用分析 |
| 4.6 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成果情况 |
（5）溃疡性结肠炎“以痈论治”策略的临床疗效及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 姜树民教授“以痈论治”溃疡性结肠炎的学术思想及经验 |
| 1 “以痈论治”学术特色的师脉传承 |
| 2 “以痈论治”UC及“毒热致痈”的源流考析 |
| 3 UC的病因和病机 |
| 4 姜师治疗UC特色及经验 |
| 5 姜师治疗UC用药特色 |
| 6 消痈止痢汤的组方解析 |
| 第二部分 临床研究 “消痈止痢汤”治疗活动期大肠湿热型轻中度溃疡性结肠炎的临床疗效观察 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 消痈止痢汤对溃疡性结肠炎大鼠的一般状态和黏膜组织形态的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 消痈止痢汤对溃疡性结肠炎大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO含量的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验三 消痈止痢汤对溃疡性结肠炎大鼠MAPK信号通路和NF-κB蛋白表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 中医药治疗溃疡性结肠炎分子机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（6）小鼠角膜碱烧伤及雷帕霉素对其修复的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 哺乳动物眼球及角膜结构 |
| 1.1.1 眼球的结构 |
| 1.1.2 角膜的结构 |
| 1.2 角膜碱烧伤引起的主要不良病变 |
| 1.3 小鼠角膜碱烧伤引起的血管新生和纤维化病变研究 |
| 1.3.1 哺乳动物角膜碱烧伤引起的血管新生 |
| 1.3.2 哺乳动物角膜碱烧伤引起的角质细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化 |
| 1.4 角膜碱烧伤的甲基化调控研究 |
| 1.4.1 表观调控及甲基化调控简介 |
| 1.4.2 角膜疾病中的甲基化调控研究及研究意义 |
| 1.5 角膜碱烧伤引起的炎症反应和免疫应答 |
| 1.6 Rapamycin(Rapa)对角膜碱烧伤治疗的研究 |
| 1.6.1 Rapa及mTOR简介 |
| 1.6.2 Rapa在碱烧伤治疗中的应用和研究意义 |
| 1.7 PI3K/AKT/mTOR、MAPK信号通路和HIF-1 对角膜碱烧伤影响的研究 |
| 1.7.1 PI3K/AKT/m TOR信号通路对血管生成的调控 |
| 1.7.2 HIF-1/VEGF通路对血管生成的调控 |
| 1.7.3 MAPK信号通路对血管生成的调控 |
| 1.8 选题依据、意义及研究内容 |
| 1.9 本研究的创新 |
| 第二章mTOR因子介导的小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下血管生成的甲基化调控、转录因子调控及信号通路PI3K/AKT和 MAPK/ERK调控 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要药物和试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.2.3 实验动物及模型建立 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 碱烧伤引起的角膜新生血管形态学数据采集 |
| 2.3.2 石蜡切片和Hematoxylin and Eosin(H&E)染色 |
| 2.3.3 冰冻切片及CD31、HIF-1α和VEGF免疫荧光染色 |
| 2.3.4 石蜡切片和Brd U免疫荧光染色 |
| 2.3.5 RNA提取及实时定量聚合酶链式反应(Quantitativereal-time polymerase chain reaction,q RT-PCR) |
| 2.3.6 DNA亚硫酸氢钠测序PCR(Bisulfite sequencing PCR,BSP) |
| 2.3.7 电泳迁移率实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA) |
| 2.3.8 蛋白提取及Western blot |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 时间梯度的筛选和建立 |
| 2.4.2 碱烧伤引起的角膜血管新生和Rapa处理对其形态的影响 |
| 2.4.3 碱烧伤及Rapa处理对角膜上皮层和基质层结构的影响 |
| 2.4.4 碱烧伤及Rapa处理对角膜细胞增殖的影响(Brd U+细胞染色) |
| 2.4.5 碱烧伤及Rapa处理对角膜血管生成的影响(CD31 染色) |
| 2.4.6 碱烧伤及Rapa处理对角膜VEGF和 α-SMA表达的影响 |
| 2.4.7mTOR因子介导的小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下血管生成的甲基化调控(DNA水平调控) |
| 2.4.8 转录因子ETV对去甲基化位点的负调控(转录水平调控) |
| 2.4.9 Rapa通过抑制碱烧伤诱导的PI3K/AKT/mTOR、HIF-1和MAPK信号通路活化,降低了VEGF的表达(蛋白水平调控) |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 碱烧伤诱导VEGF和 α-SMA表达与Rapa对角膜血管生成和纤维化的抑制作用 |
| 2.5.2 碱烧伤引起的角膜组织损伤和Rapa对其的修复 |
| 2.5.3 角膜碱烧伤及Rapa对其修复的分子机制 |
| 2.6 本章主要结论 |
| 第三章 小鼠角膜碱烧伤及Rapa治疗过程中的免疫应答 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要药物和试剂 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.2.3 实验动物及模型建立 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 小鼠血清的采集 |
| 3.3.2 石蜡切片和H&E染色 |
| 3.3.3 CD45、F4/80和MPO冰冻切片的免疫荧光染色 |
| 3.3.4 RNA提取及qRT-PCR |
| 3.3.5 血清中TGF-β和 Foxp3的ELISA测定 |
| 3.3.6 流式细胞术对脾脏淋巴细胞的测定 |
| 3.3.7 角膜中TNF-α、MMP-2、p-mTOR和VEGF蛋白的检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CD45+、F4/80+、MPO+细胞通过角膜缘浸润进入基质 |
| 3.4.2 Rapa抑制碱烧伤诱导的炎症因子高表达 |
| 3.4.3 脾脏T细胞对小鼠角膜碱烧伤及Rapa处理的响应 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 碱烧伤引起的炎症细胞浸润和Rapa对其过程的抑制 |
| 3.5.2 Rapa在多重细胞因子调控的炎症和血管生成中发挥作用 |
| 3.5.3 MMP-2对碱烧伤引起的血管重构发挥炎症因子作用 |
| 3.5.4 Rapa通过诱导CD4+CD25highTreg细胞生成调控角膜的损伤修复 |
| 3.6 本章主要结论 |
| Rapa在角膜碱烧伤诱导的损伤应答中的主要作用 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）从数据挖掘和网络药理学探讨“湿瘀”理论与清热利湿方治疗痛风性关节炎作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医学对痛风的认识 |
| 1 中医学对痛风病名的认识 |
| 2 中医学对痛风病因病机的认识 |
| 3 痛风的中医药治疗进展 |
| 4 网络药理学在中医药领域的应用 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 痛风性关节炎现代医学研究进展 |
| 1 流行病学 |
| 2 病因及诱因 |
| 3 痛风性关节炎炎性机制 |
| 4 痛风性关节炎治疗 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于数据挖掘分析痛风证候特点及朱跃兰教授治疗痛风性关节炎用药规律 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 1 临床资料 |
| 2 研究方法 |
| 研究结果 |
| 1 一般情况 |
| 2 整体数据挖掘结果 |
| 3 分层数据挖掘结果 |
| 讨论 |
| 1 痛风性关节炎患者一般情况分析 |
| 2 痛风证候特点分析 |
| 3 朱跃兰教授遣方用药规律分析 |
| 4 “湿瘀”理论梳理与清热利湿方 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于网络药理学探讨清热利湿方治疗痛风性关节炎的作用机制 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 1 清热利湿方活性成分的筛选 |
| 2 活性成分潜在靶点收集与筛选 |
| 3 痛风性关节炎相关靶点的获取及筛选 |
| 4 清热利湿方主要活性成分与痛风性关节炎共同靶点的获取 |
| 5 核心靶点蛋白相互作用网络构建 |
| 6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 |
| 结果 |
| 1 清热利湿方药效成分筛选 |
| 2 清热利湿方药效成分靶点预测及筛选 |
| 3 痛风性关节炎相关靶点及中药与疾病共同靶点的筛选 |
| 4 核心靶点蛋白相互作用(PPI)网络的构建分析及关键蛋白的筛选 |
| 5 GO富集分析 |
| 6 KEGG通路富集分析 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 清热利湿方对急性痛风性关节炎大鼠治疗效果及作用机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 1 大鼠一般情况 |
| 2 清热利湿方对痛风性关节炎大鼠关节功能障碍指数的影响 |
| 3 清热利湿方对痛风性关节炎大鼠关节炎症指数的影响 |
| 4 清热利湿方对痛风性关节炎大鼠踝关节肿胀度的影响 |
| 5 清热利湿方对痛风性关节炎大鼠血清炎症因子水平的影响 |
| 6 清热利湿方对痛风性关节炎大鼠踝关节滑膜组织病理学的影响 |
| 7 清热利湿方对痛风性关节炎大鼠踝关节组织TLR2、TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达的影响 |
| 8 清热利湿方对痛风性关节炎大鼠踝关节组织TLR2、TLR4、NF-κB、NLRP3mRNA表达的影响 |
| 讨论 |
| 1 痛风性关节炎动物模型选择 |
| 2 清热利湿方治疗急性痛风性关节炎大鼠的抗炎作用 |
| 3 清热利湿方治疗急性痛风性关节炎大鼠的作用机制 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（8）白色念珠菌通过激活炎症信号途径在小鼠模型中诱导急性肺损伤的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 支气管肺白色念珠菌小鼠感染模型和免疫抑制小鼠模型的建立和评价 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 主要试剂来源 |
| 2.2 主要试剂配制 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 主要实验方法和技术 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 实验小鼠的一般情况 |
| 3.2 小鼠的脾脏重量指数 |
| 3.3 小鼠外周血流式细胞术结果 |
| 3.4 白色念珠菌感染模型小鼠肺部病理PAS染色及肺组织培养 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 白色念珠菌诱导小鼠急性肺损伤的炎症信号机制的探讨 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 主要试剂来源 |
| 2.2 主要试剂配制 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 主要实验方法和技术 |
| 3.结果 |
| 3.1 白色念珠菌感染致正常和免疫抑制小鼠急性肺损伤 |
| 3.2 白色念珠菌感染上调正常和免疫抑制小鼠肺部炎症因子和趋化因子的表达 |
| 3.3 白色念珠菌感染激活小鼠肺中NF-κB信号 |
| 3.4 白色念珠菌感染激活小鼠肺中MAPKs信号 |
| 3.5 白色念珠菌感染激活小鼠肺中PI3K/Akt信号 |
| 3.6 白色念珠菌感染激活小鼠的肺STAT3 信号 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 白色念珠菌相关毒力因子的研究进展 |
| 参考文献 |
（9）miR-150与白藜芦醇在痛风炎症中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 前言 |
| 第一部分 miR-150在痛风患者外周血单个核细胞中的变化特点 |
| 1.材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分 miR-150及其靶基因和相关分子的变化特点 |
| 1 材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 mi R-150对MSU刺激THP-1 巨噬细胞炎症的影响及机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 白藜芦醇通过影响SOCS1的表达调控痛风炎症反应 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文附图 |
| 综述 两个世界的相互联系:microRNA和NLRP3炎性体 |
| Reference |
| 致谢 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（10）罗非鱼CD6分子及其相关配体的鉴定与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 免疫应答机制概述 |
| 1.1.1 先天性免疫 |
| 1.1.2 适应性免疫 |
| 1.1.3 T细胞激活机制 |
| 1.2 清道夫受体概述 |
| 1.2.1 清道夫受体家族分类 |
| 1.2.2 清道夫受体家族功能 |
| 1.3 CD6的研究进展 |
| 1.3.1 CD6分子结构特征 |
| 1.3.2 CD6分子生理功能 |
| 1.3.3 CD6分子配体概述 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2 OnCD6分子的克隆和表达特征分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验用鱼 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 实验引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验用鱼及预处理 |
| 2.3.2 总RNA提取和c DNA合成 |
| 2.3.3 OnCD6基因克隆 |
| 2.3.4 OnCD6生物信息学分析 |
| 2.3.5 OnCD6实时荧光定量 |
| 2.3.6 OnCD6胞外段原核表达 |
| 2.3.7 OnCD6单克隆抗体制备方法 |
| 2.3.8 OnCD6亚细胞定位实验 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 OnCD6的基因克隆和生物信息学分析 |
| 2.4.2 OnCD6的组织分布 |
| 2.4.3 OnCD6在无乳链球菌刺激后的表达模式 |
| 2.4.4 OnCD6 在不同刺激物刺激HKLs后的表达模式 |
| 2.4.5 OnCD6在KLH刺激后的表达模式 |
| 2.4.6 OnCD6胞外段的原核表达及纯化 |
| 2.4.7 OnCD6的单克隆抗体制备 |
| 2.4.8 OnCD6的亚细胞定位 |
| 2.5 实验讨论 |
| 3 OnCD6体外功能验证 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验细菌 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 实验引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 OnCD6-ECD与细菌结合检测 |
| 3.3.2 OnCD6-ECD与 PAMPs结合检测 |
| 3.3.3 OnCD6-ECD诱导细菌凝集检测 |
| 3.3.4 OnCD6-ECD体外抑菌实验 |
| 3.3.5 OnCD6-ECD参与吞噬反应检测 |
| 3.3.6 OnCD6-ECD对 HKLs呼吸爆发影响的实验 |
| 3.3.7 OnCD6-ECD对 HKLs炎症因子表达影响的实验 |
| 3.3.8 OnCD6-ECD及其单克隆抗体对HKLs增殖影响的实验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 OnCD6-ECD参与结合细菌 |
| 3.4.2 OnCD6-ECD与 PAMPs结合 |
| 3.4.3 OnCD6-ECD诱导细菌凝集反应 |
| 3.4.4 OnCD6-ECD具有体外抑菌活性 |
| 3.4.5 OnCD6-ECD促进HKLs对细菌吞噬 |
| 3.4.6 OnCD6-ECD对 HKLs呼吸爆发的影响 |
| 3.4.7 OnCD6-ECD对 HKLs炎症因子表达的影响 |
| 3.4.8 OnCD6-ECD及其单克隆抗体对HKLs增殖的影响 |
| 3.5 实验讨论 |
| 4 OnCD6体内功能探究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验用鱼 |
| 4.2.2 实验病菌 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 实验设备 |
| 4.2.5 实验引物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 OnCD6-ECD重组蛋白对感染无乳链球菌的罗非鱼存活率影响实验 |
| 4.3.2 OnCD6-ECD重组蛋白对感染无乳链球菌的罗非鱼载菌量的检测 |
| 4.3.3 OnCD6-ECD重组蛋白对感染无乳链球菌的罗非鱼病理生化指标的影响实验 |
| 4.3.4 CD6体内过表达的生物学效应探究实验 |
| 4.3.5 HE染色 |
| 4.3.6 生化指标检测 |
| 4.3.7 通路抑制剂孵育HKLs检测信号通路 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼生存率的影响 |
| 4.4.2 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼载菌量影响 |
| 4.4.3 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼病理变化的影响 |
| 4.4.4 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼外周血生化指标的影响 |
| 4.4.5 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼炎症因子表达的影响 |
| 4.4.6 OnCD6体内过表达验证结果 |
| 4.4.7 OnCD6体内过表达对无乳链球菌感染罗非鱼存活率的影响 |
| 4.4.8 OnCD6体内过表达对炎症因子表达的影响 |
| 4.4.9 OnCD6在HKLs中信号通路检测 |
| 4.5 实验讨论 |
| 5 CD6与胞外配体CD166的相互作用探究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验用鱼 |
| 5.2.2 实验细菌 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.2.4 实验仪器 |
| 5.2.5 实验引物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 实验用鱼及预处理 |
| 5.3.2 总RNA提取和c DNA合成 |
| 5.3.3 OnCD166基因克隆和生信分析 |
| 5.3.4 OnCD166荧光定量 |
| 5.3.5 OnCD166胞外段原核表达 |
| 5.3.6 OnCD166多克隆抗体的制备实验 |
| 5.3.7 OnCD166-ECD与细菌结合检测 |
| 5.3.8 OnCD166-ECD与 PAMPs结合检测 |
| 5.3.9 OnCD166-ECD诱导细菌凝集反应检测 |
| 5.3.10 GST Pull-Down验证OnCD166和OnCD6 相互作用 |
| 5.3.11 OnCD166亚细胞定位及共定位实验 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 OnCD166基因克隆与生信分析 |
| 5.4.2 OnCD166 m RNA表达特征 |
| 5.4.3 OnCD166-ECD原核表达 |
| 5.4.4 OnCD166-ECD多克隆抗体制备 |
| 5.4.5 OnCD166-ECD参与细菌结合 |
| 5.4.6 OnCD166-ECD与 PAMPs结合 |
| 5.4.7 OnCD166-ECD诱导细菌凝集反应 |
| 5.4.8 OnCD166-OnCD6 互作及相互作用结构域确定 |
| 5.4.9 OnCD166 亚细胞定位及与OnCD6 共定位 |
| 5.5 实验讨论 |
| 6 CD6与胞内配体的互作及信号通路初探 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 实验用鱼 |
| 6.2.2 实验试剂 |
| 6.2.3 实验仪器 |
| 6.2.4 实验引物 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 罗非鱼Syntenin-1、LCP2和TRAF6 基因克隆及生信分析 |
| 6.3.2 罗非鱼Syntenin-1、LCP2和TRAF6 荧光定量 |
| 6.3.3 罗非鱼Syntenin-1、LCP2和TRAF6 原核表达 |
| 6.3.4 抗体封闭实验 |
| 6.3.5 GSTPull-Down验证OnCD6与Syntenin-1、LCP2和TRAF6 互作 |
| 6.3.6 双荧光素酶报告基因检测实验 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 罗非鱼Syntenin-1 基因克隆及生信分析 |
| 6.4.2 罗非鱼LCP2基因克隆和生信分析 |
| 6.4.3 罗非鱼TRAF6基因克隆和生信分析 |
| 6.4.4 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6 m RNA表达特征 |
| 6.4.5 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6原核表达及纯化 |
| 6.4.6 抗体封闭实验结果 |
| 6.4.7 OnCD6-ICD与 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6 互作 |
| 6.4.8 OnCD6、OnCD166和On TRAF6 参与的信号通路 |
| 6.5 实验讨论 |
| 7 全文总结与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 后续展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ GST标签包涵体蛋白变性条件下表达、纯化和复性 |
| 附录Ⅱ His标签包涵体蛋白变性条件下表达、纯化和复性 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
四、急性炎症反应中真核细胞转录因子-κB的信号转导作用（论文参考文献）
- [1]IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制[D]. 高明春. 吉林大学, 2021
- [2]IFN-τ诱导miR-505靶向HMGB1抑制奶牛子宫内膜炎性损伤的分子机制[D]. 刘俊峰. 华中农业大学, 2021(02)
- [3]ICA通过调控miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路抑制ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应[D]. 李藤藤. 吉林大学, 2021(01)
- [4]大黄鱼MAVS、TRAF5及其异构体的克隆与免疫功能初步研究[D]. 唐俊纯. 集美大学, 2021
- [5]溃疡性结肠炎“以痈论治”策略的临床疗效及机制研究[D]. 陈晨. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [6]小鼠角膜碱烧伤及雷帕霉素对其修复的机制研究[D]. 李建德. 兰州大学, 2021(09)
- [7]从数据挖掘和网络药理学探讨“湿瘀”理论与清热利湿方治疗痛风性关节炎作用机制[D]. 王玉天. 北京中医药大学, 2021(01)
- [8]白色念珠菌通过激活炎症信号途径在小鼠模型中诱导急性肺损伤的研究[D]. 许知礼. 安徽医科大学, 2021(01)
- [9]miR-150与白藜芦醇在痛风炎症中的作用机制研究[D]. 何泳龙. 成都中医药大学, 2020(02)
- [10]罗非鱼CD6分子及其相关配体的鉴定与功能研究[D]. 汪志文. 广东海洋大学, 2020(02)