一、The SHP-2 tyrosine phosphatase: Signaling mechanisms and biological functions（论文文献综述）
赵翌竹[1]（2021）在《ITIM/ITSM对酪氨酸磷酸酶SHP2激活作用的研究》文中指出含有Src同源结构域2的蛋白质酪氨酸磷酸酶2（SHP2）由PTPN11基因编码,是许多信号通路的关键变构磷酸酶。SHP2的激活突变可以导致AML、胃癌、乳腺癌等多种癌症,因此,PTPN11现已成为公认的原癌基因,也是蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTPs）家族中唯一的原癌基因。免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）是具有L/I/V/SXYXXL/V（其中X代表任意的一个氨基酸残基）结构的一段蛋白质序列,通常存在于发挥免疫抑制作用膜受体的胞内段。免疫受体酪氨酸开关基序（ITSM）,是含有TXYXXV/I结构的一段基序,经常与ITIM相邻,与ITIM共同调节磷酸酶的活性。研究表明,磷酸化的ITIM/ITSM可以激活SHP2,但是ITIM/ITSM是如何与SHP2的两个SH2结构域相互作用的科学问题仍然未知,探究ITIM/ITSM与SHP2的作用机制对于进一步了解SHP2的激活方式及SHP2抑制剂的开发都具有重要的意义。为了探究上述问题,我们进行了如下工作。（1）查阅文献得知,SHP2的C末端会对其活性造成影响,所以我们以实验室原有的p RC-CMV-SHP2质粒为模板,构建了人SHP2 C末端截短体重组质粒:p ET28a-SHP2T,通过亲和层析获得了目的蛋白SHP2T。（2）对SHP2T进行了酶学表征,研究了酶的最适反应温度、最适pH值和最适离子强度。（3）在不同条件下,我们使用PZR和PD-1的ITIM/ITSM单磷酸化肽段、双磷酸化肽段以及单磷酸化肽段的等摩尔混合物,探究了ITIM/ITSM体外激活SHP2的作用机制。（4）构建人SHP2T的3种突变体的重组质粒:SHP2T第32位精氨酸突变为赖氨酸的质粒（p ET28a-SHP2T＿R32K）、第138位精氨酸突变为赖氨酸的质粒（p ET28a-SHP2T＿R138K）及第32和第138位精氨酸同时突变为赖氨酸的质粒（p ET28a-SHP2T＿DRK）,分离纯化获得了SHP2T的3种突变体。（5）研究了ITIM/ITSM对3种突变体的激活作用,以及影响SHP2T活化的关键氨基酸残基。实验结果表明,（1）单磷酸化的ITIM/ITSM对SHP2T的激活作用很弱,二者等摩混合物对SHP2的激活作用也非常有限,与双磷酸化肽的激活作用相比均可忽略不计。（2）与pITIM（N）相比,PD-1的p ITSM（C）和PZR的pITIM（C）激活SHP2T的作用更强。此外,与PZR的pITIM（N）-pITIM（C）双磷酸化肽相比,PD-1的pITIM-p ITSM双磷酸化肽对SHP2T的激活作用更显着,说明p ITSM与SH2结构域的结合更有利于SHP2T的激活。（3）无论单磷酸化肽、ITIM/ITSM等摩混合物还是双磷酸化肽,它们对SHP2T＿R32K突变体几乎没有激活作用,而对SHP2T＿R138K突变体均有微弱的激活作用,说明N-SH2结构域中的精氨酸残基对SHP2构象变化起关键作用。综上所述,只有具备特定长度和结构的ITIM/ITSM双磷酸化肽段才能完全激活SHP2T,单磷酸化ITIM/ITSM或者二者等摩尔混合的肽段对SHP2T的激活作用十分微弱。SHP2的N-SH2结构域中的精氨酸残基是SHP2构象改变的关键。本文初步揭示了ITIM/ITSM激活SHP2的分子机制,为进一步研究SHP2的活化机理及SHP2小分子抑制剂的设计提供了重要的实验依据。
王泉[2]（2021）在《蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B和SHP2变构调节机制的分子动力学模拟研究》文中研究说明蛋白质酪氨酸的可逆磷酸化是真核生物调节多种生理活动的重要手段。蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）超家族可以与蛋白酪氨酸激酶（PTKs）超家族协同作用,共同维持细胞内酪氨酸磷酸化和去磷酸化的生理平衡。虽然科学家们很早就开始研究PTPs的调控机制,但是单纯利用实验手段来研究PTPs的调节机制仍然存着较大的局限性,科学家们很难得到生理状态下PTPs的动态结构。随着计算机技术和模拟算法的高速发展,分子动力学模拟已经成为研究蛋白质结构和功能的重要手段。分子动力学模拟不仅可以研究蛋白质构象的动态变化,还可以得到伴随蛋白质构象变化的能量信息。PTP1B是第一个被发现的蛋白酪氨酸磷酸酶,目前已经成为研究其他蛋白酪氨酸酶的重要参照酶。SHP2则是PTPs超家族中的一个特殊成员,拥有独特的SH2蛋白域和自抑制机制。PTP1B和SHP2是PTPs家族中极有代表性的两个成员,探究PTP1B和SHP2的变构调节机制可以帮助我们更全面了解PTPs超家族的变构调节机制,为变构抑制剂的开发提供理论依据。本文利用分子动力学模拟的方法对蛋白酪酸磷酸酶PTP1B和SHP2的变构调节机制进行了系统的理论研究。主要内容如下:1.蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）变构调节机制的分子动力学模拟研究蛋白质酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是治疗Ⅱ型糖尿病和肥胖的理想靶点。自从PTP1B在1988年被发现以来,科学家们在寻找其抑制剂的研究中投入了大量的时间与精力,但是直到现在,PTP1B抑制剂在临床治疗上的应用仍然十分有限。在本研究中,我们采用分子动力学模拟（MD）的方法来研究PTP1B与竞争性抑制剂（TCS401）和变构抑制剂（香豆酮化合物）的结合机制,并研究催化位点和变构位点之间的联系。研究结果表明催化位点和变构位点之间可以通过一条氢键网络（THR177-TYR152-ASN193-GLU297）相互作用。这条氢键网络是维持WPD loop开放或关闭的重要因素,并且可以在催化位点和变构位点之间传递结构变化信号。ASN193是重要的枢纽残基,它可以连接关键的Loop L11和螺旋α7。此外双解离状态的TCS401比其它解离状态有着更强的PTP1B亲和力。我们的研究揭示了PTP1B潜在的变构调节机制,为PTP1B变构抑制剂的设计提供了新的思路。2.蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2变构机制的分子动力学研究SHP2（由PTPN11编码）是一种变构磷酸酶,在细胞信号传导中发挥着重要作用。程序性死亡受体1（PD-1）上的免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）和免疫受体酪氨酸转换基序（ITSM）上的酪氨酸被磷酸化后,可以与SHP2结合并引发T细胞失活。尽管SHP2-PD-1相互作用对调节免疫进程十分重要,但是SHP2与PD-1的结合模式以及变构机制尚不清楚。在本研究中,我们采用分子动力学模拟的方法来研究SHP2和PD-1的结合细节,探究SHP2的变构调节机制。结果表明,ITIM会优先选择与N-SH2蛋白域结合,而ITSM对N-SH2和C-SH2蛋白域没有选择性。只有当ITIM与N-SH2蛋白域结合,ITSM与C-SH2蛋白域结合时,SHP2才会被完全激活。ITIM和ITSM的结合会通过改变SHP2的运动模式来变构激活SHP2,从而开启下游的信号通路。3.不同EPIYA多肽变构激活SHP2机制的分子动力学模拟研究CagA蛋白是幽门螺旋杆菌的主要毒力因子。CagA蛋白根据其含有EPIYAC还是EPIYA-D多肽可以在地理上分为东亚型CagA（EPIYA-D）和西方型CagA（EPIYA-C）,东亚型CagA的致病性（胃癌）要强于西方型CagA。在本研究中,我们采用分子动力学模拟来探究SHP2与不同EPIYA片段的结合细节,并探究它们对SHP2的变构激活机制。我们的研究表明EPIYA-D与SH2蛋白域（无论是N-SH2还是C-SH2蛋白域）的结合能力要强于EPIYA-C。此外,单独的EPIYAD结合到SHP2的N-SH2蛋白域上会导致关键螺旋B发生偏转,偏转的螺旋B会进一步挤压N-SH2和PTP蛋白域的接触面,打破SHP2自抑制口袋。然而单独的EPIYA-C结合到SHP2的N-SH2蛋白域上只会破坏螺旋B的二级结构,无法破坏自抑制口袋。但是当两个串联的EPIYA-C多肽同时结合到N-SH2和CSH2蛋白域上时,不仅可以增加EPIYA-C与N-SH2蛋白域的结合能力,还会保护螺旋B的二级结构,变构激活SHP2。我们的研究可以帮助研究者们更好的了解由胃幽门螺旋杆菌感染导致的胃癌的致病机制。PTP1B和SHP2既是PTPs超家族中极有代表性的两个成员,又是治疗糖尿病和肿瘤的有效靶点。但是由于它们催化位点的特殊性,其竞争性抑制剂在临床上的应用面临着许多困难。随着结构生物学的发展,开发PTP1B和SHP2的变构抑制剂已经成为治疗糖尿病和癌症的新方向。在本研究中,我们采用分子动力学模拟的方法来解释PTP1B和SHP2的变构调节机制,为PTP1B和SHP2变构抑制剂的开发提供了理论支持。
母倩文[3]（2021）在《SHP2抑制剂的发现研究》文中研究指明磷酸化和去磷酸化是蛋白质翻译后修饰的重要组成部分,参与调节细胞生长、增殖、分化、转移及肿瘤发生发展等生理病理活动,主要由蛋白磷酸酶（Phosphatases）和激酶（Kinases）协同完成。SHP2（Src homology-2 domain-containing protein tyrosine phosphatase-2）是由PTPN11编码的重要酪氨酸磷酸酶,参与调控多种癌症及炎症相关信号通路。SHP2突变可引起造血系统恶性肿瘤、实体瘤、努南综合征和豹皮综合征等多种疾病发生,因而开发SHP2抑制剂对治疗SHP2相关疾病尤其是癌症具有重要意义。SHP2＿E76K突变是幼年型粒-单核细胞白血病中最常见的突变,而现有抑制剂对该突变型SHP2的抑制活性低于野生型;此外,SHP2与同源蛋白SHP1氨基酸序列高度保守;因此,抑制剂的选择性颇为关键。本论文中我们主要针对SHP2＿E76K突变体建立抑制剂筛选平台,并针对SHP1测试化合物的选择性,旨在为高活性、高选择性的SHP2抑制剂发现提供苗头化合物。为此,我们首先构建了SHP2和SHP1相关的多种蛋白质（野生型SHP2全长蛋白,SHP2＿WT;E76K突变型SHP2全长蛋白,SHP2＿E76K;SHP2催化结构域蛋白,SHP2＿PTP;野生型SHP1全长蛋白,SHP1＿WT;E74K突变型SHP1全长蛋白,SHP1＿E74K;SHP1催化结构域蛋白,SHP1＿PTP）的表达质粒并纯化得到后续实验所需的目标蛋白。随后,建立针对SHP2和SHP1的酶活测试方法,并靶向SHP2＿E76K对2560个老药进行抑制剂筛选,发现10个对SHP2＿E76K具有抑制活性的化合物,其中艾曲波帕乙醇胺和漆树酸的抑制活性最佳,对SHP2＿E76K的IC50值分别为4.5μM和6.5μM。在针对SHP1测试化合物的选择性实验中,漆树酸表现出一定的选择性,对SHP2＿WT和SHP1＿WT的IC50值分别为2.2μM和10.1μM。我们利用蛋白热迁移方法（Thermal shift assay,TSA）验证活性化合物与SHP2的结合,其中头孢曲松和硫辛酸有较为明显的热迁移现象,ΔTm值分别是2.0℃和1.5℃。接着,我们利用分子对接方法探究小分子与SHP2的可能结合模式,发现这些小分子可与底物结合口袋中的关键氨基酸K364、K366、C459、S460和R465等形成了氢键、盐桥等相互作用。最后,我们通过筛选960个晶体条件得到SHP2的晶体生长条件,并使用X-射线衍射法收集晶体数据,尝试解析小分子与蛋白的复合物晶体结构,但没有发现小分子抑制剂的电子云密度,目前仅解析得到SHP2＿PTP（1.7?）和SHP2＿WT（2.5?）的单晶结构。综上所述,我们建立了SHP2抑制剂的筛选平台,针对老药化合物筛选得到了多个抑制SHP2的活性化合物,解析得到了高分辨率的SHP2＿PTP和SHP2＿WT蛋白质自身的晶体结构,为后续SHP2抑制剂的优化和复合物结构解析奠定了重要基础。
李兰兰[4]（2021）在《ATPR通过抑制SHP2/Rho/ROCK1通路诱导急性早幼粒细胞白血病NB4细胞分化和增殖抑制的研究》文中研究说明急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）是急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）中的一种特异性生物学亚型,其主要特征是未成熟髓细胞过度产生且分化停滞于早幼粒细胞阶段。目前,以全反式维甲酸（ATRA）为主的分化疗法是APL临床治疗的首要选择,但是约20%的患者在治疗后出现复发、耐药和维甲酸综合征等不良后果。本课题组以ATRA为前导物,基于改善药物的稳定性和副作用的目的,进行了一系列的结构改造与体外药效学筛选,最终合成了一种新型活性衍生物—4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯（4-Amino-2-trifuoromethyl-phenyl retinate,ATPR）,并已成功获得中国、美国、欧洲发明专利。前期研究已证明ATPR对于白血病、淋巴瘤、骨髓异常综合征等多种类型血液系统恶性肿瘤均具有显着的治疗活性。对于ATPR在大鼠体内组织分布的研究发现,灌胃和静脉注射给药ATPR后,肝脏中的血药浓度可以长时间维持在较高水平。大量研究虽已证实ATPR在体外对多种AML细胞（NB4,U937,MOLM-13和THP-1）具有明显的抑制增殖、促进分化的作用,在移植性AML小鼠模型中也展现了显着的治疗效果,然而其在APL中发挥作用的分子机制尚未充分揭示。蛋白酪氨酸磷酸酶（Protein tyrosine phosphatases,PTPs）参与调控的蛋白质可逆磷酸化是一种常见的翻译后修饰,可通过调节蛋白质的活性和功能对细胞信号传导、物质跨膜运输、基因转录表达、免疫应答等多种生理生化过程产生重要影响。越来越多研究表明PTPs是维持生物体稳态的关键调控因子,PTPs的失调与多种肿瘤的发生发展息息相关。作为第一个被报道的蛋白磷酸酶促癌基因,含Src同源结构域酪氨酸磷酸酶-2（Src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase-2,SHP2）在多种白血病中存在高表达和功能获得性突变。多项研究表明SHP2的水平与白血病治疗后耐药性的发生呈现正相关,提示其在白血病发生、预后中具有潜在作用。前期预实验结果显示ATPR可以显着抑制APL细胞中SHP2的表达和磷酸化水平,因此本研究将进一步明确SHP2在ATPR诱导的APL细胞分化和增殖抑制中的作用并探讨潜在分子机制,为新药ATPR临床前研究提供理论依据和实验基础。目的:本研究旨在探究SHP2在ATPR诱导的APL细胞分化和增殖抑制中的作用及相关分子机制。方法:1.ATPR对于SHP2的表达和活性的影响采用Western blotting法检测APL初诊患者外周血以及不同细胞系中SHP2和p-SHP2与正常对照的表达差异。采用Western blotting和q RT-PCR分别检测梯度稀释的不同浓度(10-5,10-6,10-7M)ATPR处理NB4细胞72 h以及ATPR(10-6M)处理NB4细胞不同时间（0 h,24 h,48 h,72 h）后,SHP2和p-SHP2的表达水平。采用Western blotting检测ATPR对非APL的其他AML细胞（HL-60和THP-1）中SHP2和p-SHP2表达的影响。2.SHP2表达或活性的下调对于ATPR作用下NB4细胞分化和增殖的影响使用sh SHP2慢病毒干扰SHP2的基因表达或SHP2的抑制剂SHP099（10μM）降低SHP2的活性后,再加入ATPR(10-6M)处理细胞72 h。对于各处理组分别采用:Western blotting和流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）检测分化相关蛋白（CD11b和CD14）的表达;瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学改变。Western blotting检测增殖相关蛋白（PCNA）、周期相关蛋白（Cyclin D3,Cyclin A2和p-Rb）的表达;FCM检测细胞周期分布;免疫荧光检测增殖抗原标记物（Ki67）的表达水平。3.SHP2对于Rho/ROCK1通路的影响在NB4细胞中,采用Western blotting检测降低SHP2的表达和活性对Rho/ROCK1蛋白的影响。体内构建NCG异种移植瘤小鼠模型,首先观测SHP2表达的下调对体内肿瘤生长的影响,再通过Western blotting和免疫组化检测小鼠皮下肿瘤组织中Rho/ROCK1的表达。4.Rho/ROCK1通路在ATPR诱导的NB4细胞分化和增殖抑制中的作用采用Western blotting检测梯度稀释的不同浓度(10-5,10-6,10-7M)ATPR处理NB4细胞72 h以及ATPR(10-6M)处理NB4细胞不同时间（0 h,24 h,48 h,72 h）后Rho/ROCK1的表达水平。采用Western blotting检测ATPR对HL-60和THP-1细胞中Rho/ROCK1表达的影响。预先使用ROCK1的抑制剂Y-27632（10μM）孵育NB4细胞2 h,再加入ATPR处理细胞72 h。对于各处理组分别采用:Western blotting检测分化蛋白（CD11b和CD14）、增殖蛋白（PCNA）和周期蛋白（Cyclin D3,Cyclin A2和p-Rb）的表达;FCM检测分化蛋白（CD11b和CD14）的表达以及细胞周期分布;瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学改变;免疫荧光检测增殖抗原标记物（Ki67）的表达水平。结果:1.SHP2在APL患者以及细胞系中的表达和磷酸化水平均明显高于正常对照组。ATPR抑制APL细胞NB4中SHP2的表达和活性,呈现浓度和时间依赖性。在非APL的其他AML细胞HL-60和THP-1中,ATPR同样可以显着抑制SHP2的表达和活性。2.SHP2的表达或活性的下降可以增强ATPR诱导的NB4细胞分化成熟和增殖抑制。3.沉默或者抑制SHP2后,Rho和ROCK1的表达明显降低,且ATPR可以显着增强SHP2对于Rho/ROCK1通路的抑制作用。4.ATPR抑制NB4,HL-60和THP-1细胞中Rho和ROCK1的表达。使用ROCK1抑制剂Y-27632可以增强ATPR诱导的NB4细胞分化和增殖抑制。结论:ATPR通过降低SHP2的表达和活性,进而抑制Rho/ROCK1信号轴,最终促进NB4细胞的终末分化并抑制其增殖。
陈新[5]（2020）在《新型荧光素酶NanoLuc结构研究与改造及SHP2在结肠癌HCT116细胞中的功能研究》文中指出本论文分两部分,第一部分内容为新型荧光素酶NanoLuc的结构研究和改造。生物发光是指通过生物体产生和发射光,是化学发光的一种特殊形式,广泛存在于自然界中。近年来,由于其光检测灵敏、转化效率高、毒副作用小、易于使用等优点,受到了广大科研工作者的重视,越来越多的研究致力于开发新的生物发光系统并将其应用于基因工程和生物医学研究。生物发光的主要应用领域包括体内成像、细胞活力测定以及报告基因检测等,无论是在医疗检测还是实验室研究中均发挥着重要作用。目前,生物发光系统的研究主要集中于高稳定性荧光素酶的开发。NanoLuc（NLuc）是一种从深海虾Oplophorus gracilirostris中提取并经历三次诱变,经过筛选、优化而得到的荧光素酶,它的分子量为19.1 kDa,是目前已知最小的与光形成有关的蛋白质。NanoLuc通过氧化腔肠素的类似物furimazine产生荧光,不依赖于ATP,发光强度比萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶高大约150倍,信号半衰期大于2个小时,是当前最新的用于生物研究的荧光素酶。相较于生命科学领域目前常用的绿色荧光蛋白（GFP）系统,荧光素酶标记蛋白质不需要使用激发光以及考虑荧光猝灭、光漂白等在荧光蛋白系统中经常遇到的问题,有利于光敏感的生物系统研究;并且荧光素酶的分子量较小,对目的蛋白本身的结构影响较少,十分有利于生命科学领域的研究。本论文通过大肠杆菌表达系统过量表达带有His标签的NanoLuc蛋白,进而通过镍亲和层析和分子筛层析纯化蛋白质;纯化后的蛋白质进行结晶生长,得到的晶体由Argonne国家实验室Argonne Photon Synchrotron（APS,Chicago）LS-CAT光束源收集衍射数据;利用分子置换的方法得到了分辨率为2.36?的NanoLuc全长蛋白晶体结构。本研究显示NanoLuc结构是由11个反向平行的β折叠股形成的β桶状结构,其催化活性的中心即发色团位于β桶状结构的中心腔,在中心腔与底物furimazine结合并催化其氧化反应。论文进一步探究NanoLuc与底物共结晶的结构,以分析NanoLuc与底物的结合方式,为NanoLuc的应用提供了理论依据和科学思路;同时,由于NanoLuc的突变稳定性,通过突变三个甘基酸到丙氨酸获得的突变体NanoLuc具有较低的散发光背景,可以成为AlaRS引起的丙氨酸到甘氨酸错误翻译的检测工具。本文的第二部分对酪氨酸磷酸酶SHP2在结肠癌HCT-116细胞中的功能进行了研究。蛋白质酪氨酸磷酸化由蛋白质酪氨酸激酶（PTK）和磷酸酶（PTP）协同调控,酪氨酸磷酸化失调通常与癌症的发生发展密切相关。许多靶向PTK的抗癌药物在治疗各种癌症中已经发挥了重要的作用,目前,起负向调控作用的PTP也成为抗癌药物开发的潜在靶点。蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP2是PTP家族的成员之一,由原癌基因PTPN11编码。SHP2广泛表达于人体内,是生长因子、细胞因子和细胞粘附分子的受体,在多种细胞信号传导途径中均起到至关重要的作用,最具代表性的是Ras-Raf-MEK-ERK信号通路,它调节多种细胞生物学过程,包括生长、分化和增殖。SHP2是PTP家族唯一具有致癌作用的成员,它的功能获得性突变会导致多种癌症的发生,现已成为抗癌药物开发的热点。最近,科学家们筛选出了多种、高效专一的SHP2抑制剂,其中SHP099能够有效降低SHP2的异常活性,并且对PTK突变引起的癌症也有明显的抑制作用。不仅如此,SHP2在KRAS驱动的癌症中具有特殊的作用。我们以带有KRAS-G13D杂合突变的结直肠癌细胞系HCT-116为研究对象,结果发现,SHP2抑制剂并没有抑制HCT-116的生长,反而促进了细胞的生长和ERK1/2的活化。通过使用CRISPR技术建立SHP2基因敲除的HCT-116细胞系,进一步明确了SHP2的缺失对HCT-116细胞生长的促进作用。此外,将细胞植入免疫缺陷型小鼠时,SHP2基因敲除的HCT-116细胞肿瘤形成的能力显着增强。我们的研究表明,靶向SHP2会对某些特定癌症产生与预期相反的影响,说明SHP2在肿瘤生长中具有复杂的作用,这对靶向SHP2抗癌药物的深入开发和临床应用具有重要的指导意义。
李拓凡[6]（2020）在《Env蛋白对J亚群禽白血病病毒致病性的影响及其分子机制研究》文中指出J亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J）属于反转录病毒科（Retravirid）、α-反转录病毒属（alpharetrovirus）,它是一种引起鸡群患髓细胞性白血病、血管瘤为主要特征的免疫抑制性病毒。1989年,ALV-J首次分离鉴定于英国。我国首例ALV-J感染报道于1999年。与其他ALV亚群相比,ALV-J具有更强的致病性及传播能力,危害更大。目前ALV-J感染已呈世界范围流行,给养禽业带来了巨大的经济损失。然而对于ALV-J感染,目前尚无有效的抗病毒药物及疫苗可供使用,核心鸡群的检测与净化是目前防控ALV-J的主要策略。因此,开展ALV-J致病机理研究,发掘ALV-J感染抗宿主因子对开发抗ALV-J药物及抗病育种新策略具有重要意义。囊膜表面糖蛋白Env被认为与ALV-J感染及其致病性密切相关,然而关于其在ALV-J致病致瘤中的具体作用及分子基础知之甚少。本研究将从Env蛋白出发,探究其对ALV-J致病性的影响及分子机制。1、表达不同Gp37蛋白C端的ALV-J传染性克隆构建及病毒拯救env基因编码ALV-J的囊膜表面蛋白Env,根据Env蛋白在细胞膜上所处位置,又可将其分为膜外的Gp85和跨膜的Gp37两部分。在实验室前期工作中,依据Gp37的胞浆区（Cytoplasmic domain,CTD）所含酪氨酸基序的差异,将ALV-J Env蛋白分为三种类型:抑制型Env、激活型Env和双功能型Env蛋白。为了探究三种Env蛋白及CTD的酪氨酸基序对ALV-J致病性的影响,以J1（含双功能型Env）传染性克隆为骨架,通过同源重组技术构建了含三种Env的Gp37蛋白C端的变体及CTD中酪氨酸位点突变体共9个重组ALV-J传染性克隆。将这些传染性克隆分别命名为:EAV-HP（含抑制型Env）、NY-EAV-HP、YF-EAV-HP、4817（含激活型 Env）、YN-4817、2YF-4817、NFF-4817、YF-J1和YN-J1。将J1和上述传染性克隆分别转染DF-1细胞并盲传5代后,成功拯救出了所有重组ALV-J。这些重组病毒的获得,为进一步探究不同类型Env蛋白以及Gp37的CTD酪氨酸基序对ALV-J致病性的影响奠定了基础。2、Gp37蛋白C端调控ALV-J的致病性为了比较表达不同Gp37蛋白C端的ALV-J的体外复制动力学差异,将10种拯救病毒接种DF-1细胞并构建生长曲线。结果表明:在含三种类型Env蛋白的ALV-J中,含激活型Env的4817复制速率高于含双功能型Env的J1,而含抑制型Env的EAV-HP则复制最慢;同时Gp37的CTD中酪氨酸位点亦显着影响ALV-J的体外复制速率。进而将EAV-HP、4817和J1病毒分别接种1日龄SPF鸡,并定期监测鸡的病毒血症、泄殖腔排毒、脏器组织病毒载量、抗体产生和体重变化,以评估这三种病毒在鸡体内的致病性。结果表明,感染4817和J1病毒的鸡的病毒血症阳性率、泄殖腔拭子P27阳性率和脏器组织中的病毒载量均高于感染EAV-HP的鸡。同时,尽管感染EAV-HP病毒的鸡相较PBS对照组的鸡有减重现象,但感染4817和J1病毒的鸡减重更为严重。有趣的是,EAV-HP组的抗ALV抗体的总体阳性率及抗ALV P27抗体的滴度均高于4817和J1组。因此,Gp37蛋白C端调控ALV-J的致病性,含激活型和双功能型Env的ALV-J均比含抑制型Env的ALV-J的致病性强。3、ALV-J及其Env蛋白介导SHP-2的去磷酸化ALV-J Gp37的CTD中含有不同的酪氨酸基序,其中抑制型和双功能型Env蛋白均含能招募SHP-2的免疫抑制型基序ITIM,这提示ALV-J可能参与SHP-2介导的相关信号通路。为探究ALV-J对SHP-2的影响,将DF-1和HD11细胞感染ALV-J GY03,结果表明ALV-J感染可以下调SHP-2的Y542位点的磷酸化水平。进而在DF-1细胞和HD11细胞外源高表达ALV-J Env,结果表明Env蛋白亦可下调SHP-2的磷酸化水平。在体内试验中,ALV-J感染SPF鸡导致脾脏和外周血淋巴细胞中SHP-2磷酸化水平的下降,且外周血淋巴细胞中SHP-2的去磷酸化可能与激酶EphA2的低表达有关。值得注意的是,外源转染的EphA2的配体Ephrin A2在ALV-J感染的DF-1细胞中与Env蛋白存在相互作用。这提示ALV-J感染宿主时,其Env蛋白可能通过影响SHP-2的磷酸化来干扰宿主细胞相关信号通路的正常功能,进而介导致病致瘤。4、SHP-2可有效促进ALV-J的复制既然ALV-J感染及其Env能下调SHP-2磷酸化,为了深入解析ALV-J与SHP-2之间的互作关系,进一步探究了 SHP-2对ALV-J复制的影响。结果表明,外源高表达SHP-2促进ALV-J在LMH和DF-1细胞中的体外复制,且这种作用不依赖于其磷酸酶结构域。而敲除LMH细胞的SHP-2则显着抑制ALV-J的复制,同时发现在敲除SHP-2的LMH细胞中外源转染SHP-2也可以促进ALV-J复制。值得注意的是,在LMH和DF-1细胞中使用SHP-2的变构抑制剂SHP099,可有效抑制ALV-J的复制。因此,SHP-2能通过其非磷酸酶结构域有效支持ALV-J的体外复制,ALV-J的复制可能一定程度上依赖于SHP-2分子的存在。另外,在DF-1细胞与内源性SHP-2高表达的鸡肝癌细胞系LMH比较研究中发现,ALV-J在LMH细胞中扩增的速率更快、滴度更高,病毒拯救效率也更高。在对临床疑似ALV感染样品进行病毒分离鉴定时发现,LMH细胞比DF-1细胞对ALV感染更敏感,更容易分离到病毒。因此,内源性高表达SHP-2的LMH细胞系的发现为ALV-J的高效分离鉴定提供了有力工具。本研究首次发现Gp37蛋白C端影响ALV-J的致病性,明确了 ALV-J参与SHP-2相关信号通路以及SHP-2对ALV-J复制的影响,发现了内源性高表达SHP-2的LMH细胞可以高效分离ALV-J。故本研究为进一步探究ALV-J致病致瘤机理、抗ALV药物的研发以及提高ALV分离效率打下了坚实基础。
张昊楠[7]（2020）在《蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2抑制剂的设计、合成及生物活性研究》文中认为通过可逆的磷酸化修饰蛋白质被认为是细胞信号传导中最普遍的调节方式,蛋白质酪氨酸激酶（PTK）和蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP）掌控着该项调节。PTP在某些系统中起着抑癌作用,在细胞周期调节以及T细胞活化中同样也起着作用。一般情况下,PTP通常被认为是PTK的负面监管者。但是,在PTP中,蛋白质酪氨酸磷酸酶2（SHP-2）是较为独特的一种,它通过结合和去磷酸化大鼠肉瘤蛋白（RAS）,从而增加RAS-RAF结合并激活下游增殖性RAS/ERK/MAPK信号传导。然而在临床研究中很少关于SHP-2抑制剂的研究,且迄今为止尚没有SHP-2抑制剂成为注册药物,主要问题是该抑制剂缺乏细胞活性和选择性。本论文的研究工作是:通过总结分析已有的SHP-2选择性抑制剂,以及蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂,总结出现有SHP-2抑制剂的可能改进的方向,并设计出两类小分子化合物;运用化学合成手段,以原儿茶酸为原料,经酯化反应与乙醇合成出原儿茶酸乙酯,再经过肼解反应与水合肼合成反应得到原儿茶酸乙酰肼,之后经过环化,得到中间产物;将中间产物分别与酰氯和氯卞进行反应,得到两个系列的化合物。第一系列是12个与氯卞结合的小分子化合物,第二系列是12个与酰氯结合的小分子化合物,随后进行分子水平的体外活性筛选,发现以酰氯和氯卞为杂环的24个小分子对SHP-2抑制活性很低。究其原因,可能是因为酰氯以及氯卞残基,对于SHP-2活性位点的空间来说大,无法进入SHP-2的活性位点。因此针对SHP-2的结构,本研究又从四个方向提出改进办法,为以后的抑制剂开发提供了参考。
刘凌[8]（2020）在《Gab1、Gab2、Gab3基因多态性与原发性高血压的关联性研究》文中指出目的:原发性高血压发病机制复杂,危险因素众多,是一种受环境和遗传因素共同作用的慢性非传染性疾病。当前有多个研究表明,Gab家族蛋白中的Gab1、Gab2、Gab3基因可能通过调节信号通路参与了高血压的发生发展过程。本研究旨在从遗传易感性的角度分析Gab1/2/3的基因多态性与原发性高血压的关联,为高血压发病机制提供病因学线索并为疾病的预防和治疗提供新的靶点。方法:采用整群抽样的方法对江苏省宜兴市两个城镇地区的农村人口开展流行病学研究。共纳入研究对象4222例,其中高血压病例组2012例,健康对照组2210例,收集基线资料,并对健康对照进行了平均5.01年的随访研究。最终筛选出Gab1基因的rs300893、rs11936966,Gab2基因的rs2450135、rs7107174、rs3740677,以及Gab3基因的rs3813455、rs5987015共七个位点,采用Taqman探针技术进行基因分型。不同基因型的多态性与高血压风险关联采用二元Logistic回归分析,随访调查研究的资料采用Cox风险回归分析,同时分别根据年龄、性别、吸烟、饮酒进行分层分析,且分别对加性/显性/隐性三种模型进行分析,各组间血压水平的比较采用一般线性模型。统计软件采用SPSS 18.0。结果:Logistic回归结果表明,在总人群中校正相关协变量之后,除了Gab2基因上位点rs7107174 C>T突变（CC+CT vs.TT,OR=1.204,95%CI=1.019-1.423,P=0.029）与高血压患病风险相关外,其他SNPs与高血压易感性关联无统计学意义（P>0.05）。分层分析结果显示,在<55岁的亚组中,Gab3上的位点rs5987015 A>G突变（AA vs.AG vs.GG,OR=1.220,95%CI=1.028-1.448,P=0.023）与高血压患病风险升高明显相关;在≥55岁的分组中,Gab1上的位点rs300893T>C（TT vs.TC+CC,OR=1.182,95%CI=1.013-1.380,P=0.033）与高血压患病风险存在关联。在女性亚组中,Gab1上位点rs300893 T>C（TT vs.TC vs.CC,OR=1.155,95%CI=1.007-1.325,P=0.039）表明位点变异与高血压存在关联。在不吸烟组中,Gab1上位点rs300893 T>C（TT vs.TC vs.CC,OR=1.133,95%CI=1.004-1.279,P=0.042）以及Gab2上位点rs7107174 C>T（CC+CT vs.TT,OR=1.284,95%CI=1.059-1.556,P=0.011）均表明位点突变与高血压患病风险增加存在关联。在饮酒组中,Gab2上位点rs7107174 C>T（CC vs.CT vs.TT,OR=1.228,95%CI=1.006-1.499,P=0.044）提示位点变异会增加高血压患病风险,差异具有统计学意义。对对照人群的随访研究中发现,在<55岁分层中,Gab2基因上rs7107174位点（C>T）突变可以降低高血压的发病风险,其加性模型（CC vs.CT vs.TT）,HR=0.797（0.642-0.989）,P=0.039,且rs7107174的隐性模型（CC+CT vs.TT）,HR=0.488（0.302-0.789）,P=0.003和rs2450135的显性模型（GG vs.GA+AA）,HR=1.462（1.085-1.972）,P=0.013均提示位点突变与高血压发病存在明显关联。在≥55岁分层中,Gab3基因上rs3813455位点（C>G）突变也可以降低高血压发病风险,HR=0.691（0.512-0.932）,P=0.015。性别分组中,男女分层中均提示Gab2基因上rs7107174位点（C>T）突变在高血压发病风险中差异有统计学意义（P<0.05）,加性模型HR=1.210（1.011-1.447）（P=0.038）,隐性模型HR=1.419（1.047-1.924）（P=0.024）;女性组中加性模型HR=0.828（0.712-0.964）（P=0.015）,隐性模型HR=0.645（0.476-0.874）（P=0.005）。对基因多态性在治疗和未治疗组中对血压水平影响的研究结果显示,调整了相关变量后,未治疗组中,Gab3基因上rs3813455位点野生型携带者（CC）的舒张压水平（81.82±7.91）mm Hg、杂合型（CG）（81.16±8.40）mmHg和突变型（GG）（81.35±8.10）mmHg存在统计学差异（P=0.015）;其野生型（130.23±14.29）mmHg、杂合型（127.55±14.76）mm Hg和突变型（128.86±13.56）mmHg的收缩压水平也存在统计学差异（P=0.027）。Gab3基因上rs5987015位点AA和AG基因携带者的收缩压水平（130.45±14.40和127.94±13.93）mm Hg与GG基因携带者（130.55±14.15）mmHg存在差异（P=0.001）;而且rs5987015位点各型基因携带者（82.45±7.83）、（80.34±8.06）、（81.92±7.91）mmHg的舒张压水平也存在统计学差异（P<0.001）。结论:Gab2基因上rs7107174位点TT基因型可能是中国汉族人群高血压发病风险的危险因素;Gab1上rs300893位点在≥55岁人群和女性人群中均为高血压的危险因素,Gab3上的rs5987015位点在<55岁人群中是高血压危险因素;Gab1上rs300893位点在无吸烟行为人群中为高血压危险因素,Gab2上rs2450135在存在饮酒行为人群、rs7107174位点在无吸烟和饮酒行为人群中发现是高血压危险因素;Gab3上rs3813455和rs5987015位点突变型基因与抗高血压药物治疗的交互作用对人群的血压水平存在一定影响。
谢菁[9]（2019）在《鸡源Shp-2的克隆表达、单抗研制以及敲除Shp-2的鸡肝细胞系构建》文中研究说明Src同源区2（SH2）蛋白酪氨酸磷酸酶2（Shp-2）是一种非受体酪氨酸磷酸酶,在各种脊椎动物的细胞中普遍表达,参与细胞的分化等多种生物学功能的调控及信号转导过程。作为原癌基因PTPN11编码的酪氨酸磷酸酶,Shp-2的表达及其活性改变已被证明与造血细胞的恶性增生、儿童白血病及多种人的恶性肿瘤疾病有关。然Shp-2在禽类疾病中所起的作用研究鲜见报道。为探究鸡源Shp-2功能及其在相关疾病中作用,本研究在克隆、表达了鸡源Shp-2基因的基础上,研制出了针对鸡Shp-2的特异性单克隆抗体,且利用CRISPR-Cas9技术建立了稳定敲除Shp-2的鸡肝细胞系。1、鸡Shp-2基因克隆及表达为获得用于制备抗鸡Shp-2单克隆抗体的免疫原和筛选抗原,本研究将Shp-2基因克隆至线性化载体pGEX-6p-1和pcDNA3.1上,成功构建了 Shp-2原核表达载体pGEX-6P-1-Shp-2 及真核表达载体 pcDNA3.1-Shp-2。将获得的阳性重组子pGEX-6P-1-Shp-2转化至Rosetta感受态中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现GST-Shp-2蛋白可以以包涵体形式以及可溶性形式表达。Western blot分析证明重组蛋白GST-Shp-2具有良好的抗原反应性。利用GST琼脂糖凝胶柱纯化了可溶性形式表达的GST-Shp-2蛋白,为后续小鼠免疫及抗鸡Shp-2单克隆抗体的制备提供了生物材料,奠定了基础。2、抗鸡Shp-2单克隆抗体的制备及特性鉴定为获得抗鸡Shp-2单克隆抗体,本研究将纯化的GST-Shp-2免疫BALB/c小鼠,以转染pcDNA3.1-Shp-2的DF-1细胞为筛选抗原,通过IFA筛选出两株能够分泌出抗鸡Shp-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3A10和3G12,亚类均为IgG1,轻链均为κ链。3A10和3G12的IFA荧光效价测定均为1:12800,且Western blot试验表明这两株单抗与内源性和外源性表达的Shp-2均能发生特异性反应。通过对单抗3A10和3G12的初步表位鉴定表明,这两株单抗的表位均跨越了 NSH2和CSH2两个重要功能结构域。两株抗Shp-2单克隆抗体的获得为研究Shp-2的生物学功能提供了材料。3、敲除Shp-2的鸡肝细胞系的建立为探究Shp-2与禽类疾病的关系,本研究利用CRISPR/Cas9技术建立了敲除Shhp-2基因的LMH细胞系。首先将设计的针对Shp-2基因的5条sgRNA克隆至lentiCRISPRv2载体,将重组质粒转染LMH细胞,嘌呤霉素筛选。通过Western blot技术检测发现,sgRNA-3的敲除效果最好。通过将转染lentiCRISPRv2-sgRNA-3的LMH细胞单克隆化,Western blot检测单克隆细胞株的Shp-2的蛋白水平,最后获得稳定敲除Shp-2的LMH细胞系,命名为 LMH-KO-Shp-2-3、LMH-KO-Shp-2-6、LMH-KO-Shp-2-11,为研究 Shp-2 在禽类疾病中的作用提供有力工具。
宋洁[10]（2019）在《SHP2对体外活化肝星状细胞凋亡的影响》文中研究说明目的探讨含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2（src-homology domain 2-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2）对体外活化肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）凋亡的影响。方法通过反复感染AD293细胞,扩增携带野生型SHP2（PTPN11）基因并表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的重组腺病毒Ad-SHP2、携带靶向SHP2的RNA干扰序列[短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）]并表达GFP的重组腺病毒Ad-shRNA/SHP2及仅表达GFP的对照空病毒Ad-GFP;体外培养人肝星状细胞系LX-2,将重组腺病毒Ad-SHP2、Ad-shRNA/SHP2及对照空病毒Ad-GFP分别转染LX-2细胞;应用实时荧光定量PCR技术检测活化HSC的SHP2 mRNA表达;应用Western blot技术检测活化HSC的SHP2、Bax、Bcl-2蛋白表达;采用末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL）、膜联蛋白-V（Annexin-V）及碘化丙啶（propidium iodide,PI）双标记流式细胞术检测活化HSC的凋亡。应用SPSS22.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差（x±s）表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,两组间均数比较采用LSD检验,以P<0.05为差异有统计学意义。实验分组:（1）Control组:腺病毒转染时,以DMEM代替病毒液;（2）Ad-GFP组:转染仅表达GFP的空病毒Ad-GFP;（3）Ad-shRNA/SHP2组:转染携带靶向SHP2的shRNA并表达GFP的重组腺病毒Ad-shRNA/SHP2;（4）Ad-SHP2组:转染携带野生型SHP2（PTPN11）基因并表达GFP的重组腺病毒Ad-SHP2。结果1通过反复感染AD293细胞获得实验所需滴度的腺病毒,三种腺病毒Ad-GFP、Ad-shRNA/SHP2及Ad-SHP2的滴度分别为:1.6×108 pfu/ml、1.4×108pfu/ml及1.2×108 pfu/ml。2腺病毒Ad-GFP和Ad-shRNA/SHP2以感染倍数100、Ad-SHP2以感染倍数300转染LX-2细胞,48小时后通过倒置荧光显微镜计算其转染效率均大于80%。3腺病毒感染肝星状细胞48小时,实时荧光定量PCR检测各组HSC的SHP2 mRNA表达,以Control组HSC的SHP2 mRNA表达量为1,则Ad-GFP组、Ad-shRNA/SHP2组、Ad-SHP2组HSC的SHP2 mRNA表达量相对于Control组的倍数分别为1.109倍、0.256倍、7.554倍。Ad-SHP2组HSC的SHP2 mRNA表达量明显高于Control组、Ad-GFP组及Ad-shRNA/SHP2组（P<0.05）;而Ad-shRNA/SHP2组HSC的SHP2 mRNA表达量则明显低于Control组、Ad-GFP组及Ad-SHP2组（P<0.05）;但Ad-GFP组与Control组HSC的SHP2mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。进一步应用Western blot分析各组HSC的SHP2蛋白表达,Ad-SHP2组HSC的SHP2蛋白表达（1.852±0.138）明显高于Ad-shRNA/SHP2组（0.759±0.120）、Control组（1.271±0.206）及Ad-GFP组（1.336±0.197）,P<0.05;而Ad-shRNA/SHP2组HSC的SHP2蛋白表达明显低于Ad-SHP2组、Control组及Ad-GFP组（P<0.05）,但Ad-GFP组与Control组HSC的SHP2蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。4 TUNEL法检测各组HSC凋亡显示:Ad-shRNA/SHP2组HSC凋亡率（12.755±1.606）%明显高于Ad-SHP2组（1.520±0.259）%、Control组（3.077±0.731）%及Ad-GFP组（3.250±0.851）%,P<0.05;Ad-SHP2组HSC凋亡率明显低于Control组、Ad-GFP组、Ad-shRNA/SHP2组（P<0.05）;而Ad-GFP组与Control组HSC凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。5 Annexin-V/PI双标记流式细胞术检测各组HSC凋亡显示:Ad-shRNA/SHP2组HSC凋亡率（19.340±2.505）%明显高于Ad-SHP2组（2.442±0.931）%、Control组（9.438±0.804）%及Ad-GFP组（8.893±1.982）%,P<0.05;Ad-SHP2组HSC凋亡率明显低于Control组、Ad-GFP组及Ad-shRNA/SHP2组（P<0.05）;而Ad-GFP组与Control组HSC凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。6腺病毒感染HSC 48小时,应用Western blot技术分析各组HSC的Bax蛋白表达,Ad-shRNA/SHP2组HSC的Bax蛋白表达（2.493±0.203）显着高于Ad-SHP2组（1.545±0.208）、Control组（1.989±0.147）及Ad-GFP组（1.999±0.162）,P<0.05;Ad-SHP2组HSC的Bax蛋白表达明显低于Control组、Ad-GFP组、Ad-shRNA/SHP2组（P<0.05）,但Ad-GFP组与Control组HSC的Bax蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。7腺病毒感染HSC 48小时,应用Western blot技术分析各组HSC的Bcl-2蛋白表达,Ad-shRNA/SHP2组HSC的Bcl-2蛋白表达（1.042±0.148）明显低于Ad-SHP2组（2.134±0.247）、Control组（1.707±0.146）及Ad-GFP组（1.521±0.142）,P<0.05;而Ad-SHP2组HSC的Bcl-2蛋白表达明显高于Control组、Ad-GFP组及Ad-shRNA/SHP2组（P<0.05）,但Ad-GFP组与Control组HSC的Bcl-2蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论1 SHP2表达变化对体外活化肝星状细胞的凋亡有明显影响,其表达变化与活化肝星状细胞的凋亡呈负相关,即SHP2表达下调可诱导活化肝星状细胞凋亡,而SHP2表达上调则可抑制活化肝星状细胞凋亡。2 Bcl-2/Bax机制参与了SHP2对体外活化肝星状细胞凋亡的调控,即SHP2表达下调使活化肝星状细胞的Bax表达增加、Bcl-2表达下降,而SHP2表达上调则使活化肝星状细胞的Bax表达下降、Bcl-2表达增加。图6幅;表6个;参75篇。
二、The SHP-2 tyrosine phosphatase: Signaling mechanisms and biological functions（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、The SHP-2 tyrosine phosphatase: Signaling mechanisms and biological functions（论文提纲范文）
（1）ITIM/ITSM对酪氨酸磷酸酶SHP2激活作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛋白质酪氨酸磷酸化概述 |
| 1.2 蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP2 |
| 1.2.1 SHP2 简介 |
| 1.2.2 SHP2T及其突变体 |
| 1.3 免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)与开关基序(ITSM) |
| 1.4 PD-1 概述 |
| 1.5 PZR概述 |
| 1.6 立题依据 |
| 第2章 SHP2T及其突变体重组质粒的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 感受态细胞DH5α和BL21(DE3)的制备 |
| 2.2.2 SHP2T及其突变体重组质粒的构建 |
| 2.2.2.1 引物的设计 |
| 2.2.2.2 SHP2T重组质粒的构建 |
| 2.2.2.3 SHP2T_R32K重组质粒的构建 |
| 2.2.2.4 SHP2T_R138K重组质粒的构建 |
| 2.2.2.5 SHP2T_DRK重组质粒的构建 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 pEt28a-SHP2T重组质粒构建的实验结果 |
| 2.3.2 pEt28a-SHP2T_R32K重组质粒构建的实验结果 |
| 2.3.3 pEt28a-SHP2T_R138K重组质粒构建的实验结果 |
| 2.3.4 pEt28a-SHP2T_DRK重组质粒构建的实验结果 |
| 2.3.5 讨论 |
| 第3章 SHP2T及其突变体的分离、纯化和表征 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 pEt28a-SHP2T表达及分离纯化 |
| 3.2.2 pEt28a-SHP2T_R32K表达及分离纯化 |
| 3.2.3 pEt28a-SHP2T_R138K表达及分离纯化 |
| 3.2.4 pEt28a-SHP2T_DRK表达及分离纯化 |
| 3.2.5 酶活力的表征 |
| 3.2.6 酶性质研究 |
| 3.2.6.1 反应时间对酶活力的影响 |
| 3.2.6.2 pH对酶活力的影响 |
| 3.2.6.3 温度对酶活力的影响 |
| 3.2.6.4 离子强度对酶活力的影响 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 蛋白SHP2T表达及分离纯化实验结果 |
| 3.3.2 蛋白SHP2T_R32K表达及分离纯化实验结果 |
| 3.3.3 蛋白SHP2T_R138K表达及分离纯化实验结果 |
| 3.3.4 蛋白SHP2T_DRK表达及分离纯化实验结果 |
| 3.3.5 酶性质研究结果 |
| 3.3.5.1 反应时间实验结果 |
| 3.3.5.2 最适反应温度实验结果 |
| 3.3.5.3 最适pH实验结果 |
| 3.3.5.4 最适离子强度实验结果 |
| 3.3.6 讨论 |
| 第4章 ITIM/ITSM激活SHP2T的分子机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 SHP2T浓度的确定 |
| 4.2.2 SHP2T与磷酸化肽段反应体系的确定 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 PZR的ITIM激活SHP2T及其突变体的实验结果 |
| 4.3.2 PD-1的ITIM/ITSM激活SHP2T及其突变体的实验结果 |
| 4.3.3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B和SHP2变构调节机制的分子动力学模拟研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| §1.1 生物信息学简介 |
| §1.2 蛋白质结构预测 |
| §1.3 计算机模拟概述 |
| §1.4 蛋白质酪氨酸磷酸酶简介 |
| §1.4.1 PTP1B蛋白的结构与功能 |
| §1.4.2 PTP1B抑制剂 |
| §1.4.3 SHP2蛋白的结构与功能 |
| §1.4.4 SHP2蛋白与疾病相关 |
| §1.5 选题依据 |
| §1.6 技术路线 |
| §1.7 研究目的和研究内容 |
| 第2章 理论基础和计算方法 |
| §2.1 分子力场 |
| §2.1.1 分子力场函数简介 |
| §2.1.2 常用分子力场 |
| §2.2 分子力学 |
| §2.2.1 一次导数求极值法 |
| §2.2.2 二次导数求极值法 |
| §2.3 分子动力学 |
| §2.3.1 基本理论 |
| §2.3.2 积分算法 |
| §2.3.3 积分步长的选取 |
| §2.3.4 周期性边界条件与长程静电力 |
| §2.3.5 平衡系统分子动力学模拟的系综 |
| §2.3.6 常规分子动力学计算流程 |
| §2.3.7 分子动力学模拟的初始条件 |
| §2.4 分子对接 |
| §2.5 结合自由能计算 |
| §2.5.1 自由能微扰和热力学积分方法的基本原理 |
| §2.5.2MM-PB/GBSA方法的基本原理 |
| 第3章 PTP1B变构调节机制的分子动力学模拟研究 |
| §3.1 引言 |
| §3.2 计算细节 |
| §3.2.1 分子动力学模拟 |
| §3.2.2 聚类分析 |
| §3.2.3 结合自由能及分解能分析 |
| §3.3 结果与讨论 |
| §3.3.1 不同体系的整体结构分析 |
| §3.3.2 聚类分析 |
| §3.3.3WPD loop在自然状态下会保持一种动态的构象 |
| §3.3.4 氢键网络分析 |
| §3.3.5不同的解离状态影响TCS401对PTP1B的结合能力 |
| §3.4 本章小结 |
| 第4章 SHP2变构调节机制的分子动力学模拟研究 |
| §4.1 引言 |
| §4.2 计算细节 |
| §4.2.1 模型准备 |
| §4.2.2 分子动力学模拟 |
| §4.2.3 结合自由能及分解能分析 |
| §4.2.4 主成分分析及FEL |
| §4.3 结果与讨论 |
| §4.3.1 整体结构分析 |
| §4.3.2 结合自由能及分解能分析 |
| §4.3.3 氢键网络分析 |
| §4.3.4 主成分分析及主成分投影图 |
| §4.3.5 相关性分析 |
| §4.3.6 ITIM和ITSM的结合改变了SHP2蛋白的FEL |
| §4.4 本章小结 |
| 第5章 不同EPIYA多肽变构激活SHP2机制的分子动力学模拟 |
| §5.1 引言 |
| §5.2 计算细节 |
| §5.2.1 模型准备 |
| §5.2.2 分子动力学模拟 |
| §5.2.3 结合自由能计算 |
| §5.2.4 主成分分析及FEL |
| §5.3 结果与讨论 |
| §5.3.1 整体结构分析 |
| §5.3.2 结合自由能及分解能分析 |
| §5.3.3 氢键分析 |
| §5.3.4 主成分分析及FEL |
| §5.3.5 主成分投影图 |
| §5.3.6 相关性分析 |
| §5.4 本章小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介及攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）SHP2抑制剂的发现研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛋白酪氨酸磷酸酶家族 |
| 1.2 SHP2 的结构与功能 |
| 1.3 SHP2 突变引发的疾病与抑制剂研究进展 |
| 1.4 SHP1 结构、功能和抑制剂研究进展 |
| 第2章 SHP2和SHP1 蛋白表达与纯化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒和菌株 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 主要实验仪器和耗材 |
| 2.2.4 载体构建 |
| 2.2.5 目的蛋白的表达 |
| 2.2.6 目的蛋白的纯化 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 SHP2 蛋白的纯化及鉴定 |
| 2.3.2 SHP1 蛋白的纯化及鉴定 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第3章 靶向SHP2 抑制剂的筛选与作用机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验仪器与试剂 |
| 3.2.2 高通量抑制剂筛选方法 |
| 3.2.3 蛋白热迁移实验(Thermal shift assay,TSA) |
| 3.2.4 分子对接(Docking) |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 针对老药库的抑制剂筛选结果 |
| 3.3.2 化合物的选择性测试 |
| 3.3.3 化合物与SHP2 的结合验证 |
| 3.3.4 化合物与蛋白结合模式探究 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第4章 SHP2 蛋白晶体的结构解析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验仪器与试剂 |
| 4.2.2 蛋白晶体培养 |
| 4.2.3 蛋白晶体数据收集和结构解析 |
| 4.3 蛋白晶体条件筛选与结构解析 |
| 4.3.1 蛋白晶体条件筛选 |
| 4.3.2 SHP2 晶体结构解析 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第5章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 酪氨酸磷酸酶相关疾病及抑制剂研究进展 |
| 参考文献 |
（4）ATPR通过抑制SHP2/Rho/ROCK1通路诱导急性早幼粒细胞白血病NB4细胞分化和增殖抑制的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 血液样本的收集 |
| 2.2 实验细胞 |
| 2.3 实验动物 |
| 2.4 实验仪器与设备 |
| 2.5 实验试剂 |
| 2.6 主要溶液的配制 |
| 2.7 10%RPMI-1640细胞培养液的配制 |
| 2.8 Western blotting所需试剂配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 样本外周血单个核细胞的提取 |
| 3.2 细胞操作 |
| 3.3 慢病毒转染 |
| 3.4 皮下移植瘤小鼠模型瘤组织和细胞总蛋白的提取与定量 |
| 3.5 蛋白免疫印记实验 |
| 3.6 实时荧光定量 PCR(q RT-PCR) |
| 3.7 细胞周期的检测 |
| 3.8 流式细胞术检测分化 |
| 3.9 瑞氏-吉姆萨染色法 |
| 3.10 Ki67 染色 |
| 3.11 皮下移植瘤小鼠模型的建立 |
| 3.12 免疫组织化学 |
| 3.13 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 SHP2在APL患者及细胞系中高表达 |
| 4.2 ATPR抑制SHP2的表达和活性 |
| 4.3 SHP2参与调控ATPR诱导的NB4细胞分化成熟 |
| 4.4 SHP2参与调控ATPR诱导的NB4细胞增殖抑制 |
| 4.5 SHP2抑制Rho/ROCK1通路的激活 |
| 4.6 ATPR对Rho/ROCK1通路的影响 |
| 4.7 ROCK1参与调控ATPR诱导的NB4细胞分化成熟和增殖抑制 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 蛋白酪氨酸磷酸酶在白血病中的研究进展 |
| 参考文献 |
（5）新型荧光素酶NanoLuc结构研究与改造及SHP2在结肠癌HCT116细胞中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一篇 NanoLuc的结构研究与应用 |
| 第一章 背景综述 |
| 1.1 生物发光概述 |
| 1.2 NanoLuc的研究进展和意义 |
| 1.3 氨基酸错误翻译的监测 |
| 1.4 立题依据及研究意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 实验结果与讨论 |
| 3.1 NanoLuc的晶体结构研究 |
| 3.2 NanoLuc与底物的共结晶研究 |
| 3.3 NanoLuc的改造-氨基酸错误翻译监测工具 |
| 本篇小结 |
| 参考文献 |
| 第二篇 酪氨酸磷酸酶SHP2 活性的缺失促进结肠癌HCT-116 细胞的增殖 |
| 第一章 背景综述 |
| 4.1 结直肠癌概述 |
| 4.2 蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP2 概述 |
| 4.3 SHP2在肿瘤生物学中的作用 |
| 4.4 KRAS突变 |
| 4.5 CRISPR/Cas技术 |
| 4.6 立题依据及研究意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 第三章 实验结果与讨论 |
| 6.1 KRAS-G13D突变验证 |
| 6.2 HCT-116 细胞中SHP099 的作用 |
| 6.3 HCT-116 SHP2 敲除细胞株的构建与表征 |
| 6.4 SHP2 敲除对HCT-116 细胞增殖的影响 |
| 6.5 SHP2对肿瘤形成及生长的体内验证 |
| 本篇小结 |
| 参考文献 |
| 作者简介及博士期间获得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）Env蛋白对J亚群禽白血病病毒致病性的影响及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 禽白血病病毒研究进展 |
| 1.1 病毒粒子与基因组结构 |
| 1.2 ALV的分群及新亚群的出现 |
| 1.3 内源性和外源性ALV |
| 1.4 ALV-J独特的env基因与其致病性的关系 |
| 1.5 ALV-J的细胞受体 |
| 1.6 ALV的常用实验室宿主体系 |
| 1.7 ALV的检测与诊断 |
| 1.8 国内ALV-J流行新状况 |
| 第二章 SHP-2研究进展 |
| 2.1 SHP-2的结构和功能域 |
| 2.2 SHP-2的酶活性调控 |
| 2.3 SHP-2与不同类型癌症 |
| 2.4 SHP-2突变体与人类疾病 |
| 2.5 SHP-2在癌症中的作用 |
| 2.6 SHP-2在造血干细胞中的功能 |
| 2.7 SHP-2的抑制剂 |
| 2.8 SHP-2与病毒感染 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 表达不同Gp37蛋白C端的ALV-J传染性克隆构建及病毒拯救 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 细胞与质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要试验仪器 |
| 1.1.4 主要试剂的配方 |
| 1.1.5 引物序列 |
| 1.1.6 PCR反应体系及程序 |
| 1.1.7 重组连接、转化及阳性克隆的鉴定 |
| 1.1.8 病毒的拯救 |
| 1.1.9 IFA |
| 1.1.10 TCID_(50)的测定 |
| 1.2 试验结果 |
| 1.2.1 含不同Gp37的ALV-J传染性克隆的构建策略 |
| 1.2.2 含抑制型Env和含激活型Env的ALV-J传染性克隆的构建 |
| 1.2.3 Gp37的CTD酪氨酸基序突变体的构建 |
| 1.2.4 表达不同Gp37蛋白的ALV-J病毒的拯救及鉴定 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 Gp37蛋白C端调控ALV-J的致病性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞和动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试验仪器 |
| 2.1.4 主要试剂的配方 |
| 2.1.5 IFA |
| 2.1.6 TCID_(50)的测定 |
| 2.1.7 病毒生长曲线的测定 |
| 2.1.8 动物感染试验 |
| 2.1.9 病毒血症的检测 |
| 2.1.10 双夹心ELISA检测泄殖腔排毒 |
| 2.1.11 感染鸡脏器的病毒载量测定 |
| 2.1.12 抗ALV抗体的检测 |
| 2.1.13 抗ALV P27抗体的检测 |
| 2.1.14 统计学分析 |
| 2.2 试验结果 |
| 2.2.1 含激活型Env比双功能型或抑制型Env的ALV-J复制能力强 |
| 2.2.2 4817和J1组的泄殖腔排毒量和组织病毒载量高于EAV-HP组 |
| 2.2.3 4817和J1感染导致的体重减少和病毒血症均比EAV-HP严重 |
| 2.2.4 感染EAV-HP的鸡体内抗体水平高于感染4817和J1的鸡 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 ALV-J及其Env蛋白介导SHP-2的去磷酸化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞、质粒与病毒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 抗体 |
| 3.1.4 主要试验仪器 |
| 3.1.5 主要试剂的配方 |
| 3.1.6 病毒感染 |
| 3.1.7 质粒转染 |
| 3.1.8 细胞裂解及煮样变性 |
| 3.1.9 SDS PAGE电泳及Western blot |
| 3.1.10 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP) |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 ALV-J感染介导DF-1细胞内源性SHP-2的去磷酸化 |
| 3.2.2 不同ALV-J毒株感染均介导SHP-2的去磷酸化 |
| 3.2.3 ALV-J感染介导HD11细胞内源性SHP-2的去磷酸化 |
| 3.2.4 ALV-J Env蛋白介导内源性SHP-2的去磷酸化 |
| 3.2.5 ALV-J感染导致鸡脾脏中SHP-2的磷酸化水平下调 |
| 3.2.6 ALV-J感染导致鸡外周血淋巴细胞中SHP-2的磷酸化水平下调 |
| 3.2.7 ALV-J Env蛋白与Ephrin A2相互作用 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 SHP-2对ALV-J复制的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞、质粒与病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 抗体 |
| 4.1.4 主要试验仪器 |
| 4.1.5 主要试剂的配方 |
| 4.1.6 病毒感染 |
| 4.1.7 质粒转染 |
| 4.1.8 细胞裂解及煮样变性 |
| 4.1.9 SDS PAGE电泳及Western blot |
| 4.1.10 TCID_(50)测定 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 过表达SHP-2促进ALV-J的体外复制 |
| 4.2.2 SHP-2促进ALV-J的复制不依赖于PTP结构域 |
| 4.2.3 敲除SHP-2显着抑制ALV-J的复制 |
| 4.2.4 SHP-2敲除细胞系中外源高表达SHP-2促进ALV-J的复制 |
| 4.2.5 SHP099抑制ALV-J的体外复制 |
| 4.2.6 SHP099抑制ALV-J的复制呈剂量依赖性 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 一种高效扩增ALV-J培养体系的建立 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞、质粒与病毒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 抗体 |
| 5.1.4 主要试验仪器 |
| 5.1.5 qRT-PCR引物 |
| 5.1.6 病毒感染 |
| 5.1.7 病毒生长曲线的测定 |
| 5.1.8 IFA |
| 5.1.9 TCID_(50)的测定 |
| 5.1.10 质粒转染 |
| 5.1.11 病毒的拯救 |
| 5.1.12 双夹心ELISA检测ALV P27 |
| 5.1.13 细胞裂解及煮样变性 |
| 5.1.14 SDS PAGE及Western blot |
| 5.1.15 qRT-PCR |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 LMH细胞高表达内源性SHP-2 |
| 5.2.2 ALV-J在LMH细胞中复制效率高于DF-1细胞 |
| 5.2.3 LMH缩短ALV-J分离鉴定的时间 |
| 5.2.4 LMH细胞高表达ALV-J的受体NHE-1 |
| 5.2.5 LMH细胞具有高效的外源基因表达系统 |
| 5.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（7）蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2抑制剂的设计、合成及生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2 |
| 1.2.1 蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2概述 |
| 1.2.2 蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2的结构特征 |
| 1.2.3 蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2的生理功能 |
| 1.3 SHP-2抑制剂和结合模式 |
| 1.4 SHP-2抑制剂分类及研究近况 |
| 1.4.1 不可逆抑制剂 |
| 1.4.2 竞争性抑制剂 |
| 1.4.3 非竞争性抑制剂 |
| 1.4.4 混合类型抑制剂 |
| 1.5 选题意义 |
| 第二章 苄基化合物的合成 |
| 2.1 化合物的合成研究 |
| 2.1.1 中间产物合成分析 |
| 2.1.2 苄基化合物合成分析 |
| 2.2 实验操作与波普解析 |
| 2.2.1 实验仪器与试剂 |
| 2.2.2 中间体化合物合成 |
| 2.2.3 抑制剂合成 |
| 2.3 合成讨论 |
| 第三章 苯甲酰基化合物的合成 |
| 3.1 化合物的合成研究 |
| 3.1.1 苯甲酰基化合物合成分析 |
| 3.2 实验操作与波谱解析 |
| 3.2.1 实验仪器与试剂 |
| 3.2.2 抑制剂合成 |
| 3.3 合成讨论 |
| 第四章 SHP-2的活性测定 |
| 4.1 主要仪器及试剂 |
| 4.2 样品准备 |
| 4.3 抑制效率测定结果 |
| 4.4 结果讨论 |
| 4.4.1 与Tyr279产生氢键的选择性可逆抑制剂 |
| 4.4.2 与Arg362,Lys364 产生氢键的选择性可逆抑制剂 |
| 4.4.3 与活性位点外围结合的变构抑制剂 |
| 4.4.4 与Arg465结合的复合型可逆抑制剂 |
| 第五章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 在读期间公开发表的论文 |
| 附录 |
（8）Gab1、Gab2、Gab3基因多态性与原发性高血压的关联性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1 研究对象的筛选 |
| 2 流行病学基线调查 |
| 3 随访调查 |
| 4 样本含量及把握度的计算 |
| 5 SNP位点的筛选 |
| 6 实验方法 |
| 6.1 基因组DNA提取 |
| 6.2 基因分型 |
| 6.3 主要试剂 |
| 6.4 主要设备与仪器 |
| 7 质量控制 |
| 8 统计分析 |
| 结果 |
| 1 研究对象一般人口学特征 |
| 1.1 研究对象的基线资料 |
| 1.2 对照组的高血压随访信息 |
| 2 不同基因的单位点关联性分析 |
| 2.1 总人群的单位点关联性分析 |
| 2.2 Gab基因与高血压发病风险的分层分析 |
| 2.3 Gab家族基因变异与高血压发病风险的队列研究 |
| 2.4 Gab家族基因突变与高血压发病的队列研究分层分析 |
| 2.5 血压数量性状分析 |
| 2.6 单倍型分析 |
| 讨论 |
| 1.前期研究基础与信号传导机制 |
| 2.Gab基因参与高血压发病与分层分析 |
| 3.行为因素与基因的交互作用 |
| 4.基因突变对血压性状的影响 |
| 5.研究的创新点与局限性 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介及读研期间主要科研成果 |
| 致谢 |
（9）鸡源Shp-2的克隆表达、单抗研制以及敲除Shp-2的鸡肝细胞系构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 1 Shp-2研究进展 |
| 1.1 Shp-2的分子结构 |
| 1.2 Shp-2的生物学作用 |
| 1.2.1 Shp-2调节细胞分化、迁移、黏附 |
| 1.2.2 Shp-2与DNA损伤 |
| 1.2.3 Shp-2相关信号转导通路 |
| 1.3 Shp-2与人类疾病 |
| 1.3.1 Noonan综合征 |
| 1.3.2 Shp-2与乳腺癌 |
| 1.3.3 Shp-2与肝癌 |
| 1.3.4 Shp-2与神经系统肿瘤 |
| 1.3.5 Shp-2与病毒感染及致病 |
| 1.4 Shp-2作为肿瘤治疗靶点及其应用 |
| 2 研究目的及意义 |
| 研究内容一: 鸡源Shp-2基因克隆及表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 DF-1细胞RNA的提取 |
| 2.2 cDNA的制备 |
| 2.3 Shp-2基因片段和线性化载体的获取 |
| 2.3.1 引物的设计与合成 |
| 2.3.2 目的片段的扩增 |
| 2.4 重组质粒的构建 |
| 2.4.1 重组质粒构建原理 |
| 2.4.2 重组反应方法 |
| 2.4.3 重组反应产物转化涂板 |
| 2.5 重组质粒的鉴定 |
| 2.6 重组蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 2.6.1 阳性质粒的转化与涂板 |
| 2.6.2 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.6.3 SDS-PAGE验证蛋白表达 |
| 2.6.4 Western blot验证蛋白表达 |
| 2.7 重组蛋白的纯化与鉴定 |
| 2.7.1 重组蛋白的纯化 |
| 2.7.2 SDS-PAGE验证纯化蛋白 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Shp-2基因片段和线性化载体的扩增 |
| 3.2 重组子的菌落PCR鉴定 |
| 3.3 SDS-PAGE分析重组蛋白GST-Shp-2表达及纯化效果 |
| 3.4 Western blot鉴定重组蛋白GST-Shp-2的表达 |
| 4 小结与讨论 |
| 研究内容二: 抗鸡Shp-2单克隆抗体的制备及其特性鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 免疫动物 |
| 2.2 小鼠多抗血清的鉴定 |
| 2.2.1 IFA验证抗Shp-2多抗的反应性 |
| 2.2.2 Western blot验证抗Shp-2多抗的反应性 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.5 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 2.6 腹水的制备 |
| 2.7 腹水效价的测定 |
| 2.8 Shp-2在不同细胞中内源性表达的检测 |
| 2.9 抗鸡Shp-2单抗的初步抗原表位鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠多抗血清的鉴定结果 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 单克隆亚类鉴定及效价测定结果 |
| 3.4 Western blot检测Shp-2在不同细胞中表达的结果 |
| 3.5 抗鸡Shp-2单抗的初步抗原表位鉴定结果 |
| 4 小结与讨论 |
| 研究内容三: 敲除Shp-2的鸡肝细胞系的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株、质粒、菌种 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 sgRNA的设计和寡核苷酸链的合成 |
| 2.2 敲除载体的构建 |
| 2.2.1 lentiCRISPRv2质粒酶切 |
| 2.2.2 sgRNA Oligo退火形成双链DNA |
| 2.2.3 连接重组、转化 |
| 2.2.4 重组质粒的鉴定 |
| 2.3 重组质粒敲除效果的验证 |
| 2.4 稳定敲除Shp-2的LMH细胞系的筛选 |
| 2.5 Western blot检测单克隆细胞株的Shp-2蛋白表达水平 |
| 3 结果 |
| 3.1 lentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒的构建 |
| 3.2 重组质粒敲除效果的验证 |
| 3.3 单克隆细胞株表达Shp-2蛋白的Western blot检测结果 |
| 4 小结与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的科研成果 |
（10）SHP2对体外活化肝星状细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 重组腺病毒 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要试剂配制 |
| 1.1.5 主要实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 腺病毒扩增及滴度测定 |
| 1.2.3 腺病毒转染体外活化HSC |
| 1.2.4 Westernblot实验检测体外活化HSC的 SHP2、Bax、Bcl-2 蛋白表达 |
| 1.2.5 实时荧光定量PCR技术检测体外活化HSC的 SHP2表达 |
| 1.2.6 TUNEL法检测体外活化HSC凋亡 |
| 1.2.7 膜联蛋白-V及碘化丙啶双标记流式细胞术检测体外活化HSC凋亡 |
| 1.2.8 统计学方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 腺病毒扩增 |
| 1.3.2 腺病毒滴度 |
| 1.3.3 腺病毒转染HSC的转染效率 |
| 1.3.4 体外活化肝星状细胞的SHP2过表达及低表达模型成功构建 |
| 1.3.5 TUNEL法检测体外活化HSC凋亡 |
| 1.3.6 膜联蛋白-V及碘化丙啶双标记流式细胞术检测HSC凋亡 |
| 1.3.7 SHP2表达变化对体外活化HSCBax表达的影响 |
| 1.3.8 SHP2表达变化对体外活化HSCBcl-2 表达的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 SHP2对肿瘤细胞凋亡的影响 |
| 1.4.2 SHP2表达变化对体外活化肝星状细胞凋亡的影响 |
| 1.4.3 SHP2影响体外活化肝星状细胞凋亡的可能机制 |
| 1.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第2章 综述 SHP2与肝脏疾病研究进展 |
| 2.1 SHP2的结构及活性调节 |
| 2.2 SHP2的生物学功能及参与的信号传导通路 |
| 2.2.1 SHP2的生物学功能 |
| 2.2.2 SHP2参与的信号传导通路 |
| 2.3 SHP2与肝细胞癌 |
| 2.4 SHP2与非肿瘤性肝脏疾病 |
| 2.5 结语 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位论文数据集 |
四、The SHP-2 tyrosine phosphatase: Signaling mechanisms and biological functions（论文参考文献）
- [1]ITIM/ITSM对酪氨酸磷酸酶SHP2激活作用的研究[D]. 赵翌竹. 吉林大学, 2021(01)
- [2]蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B和SHP2变构调节机制的分子动力学模拟研究[D]. 王泉. 吉林大学, 2021(01)
- [3]SHP2抑制剂的发现研究[D]. 母倩文. 南昌大学, 2021(01)
- [4]ATPR通过抑制SHP2/Rho/ROCK1通路诱导急性早幼粒细胞白血病NB4细胞分化和增殖抑制的研究[D]. 李兰兰. 安徽医科大学, 2021(01)
- [5]新型荧光素酶NanoLuc结构研究与改造及SHP2在结肠癌HCT116细胞中的功能研究[D]. 陈新. 吉林大学, 2020(08)
- [6]Env蛋白对J亚群禽白血病病毒致病性的影响及其分子机制研究[D]. 李拓凡. 扬州大学, 2020
- [7]蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2抑制剂的设计、合成及生物活性研究[D]. 张昊楠. 山东理工大学, 2020(02)
- [8]Gab1、Gab2、Gab3基因多态性与原发性高血压的关联性研究[D]. 刘凌. 皖南医学院, 2020
- [9]鸡源Shp-2的克隆表达、单抗研制以及敲除Shp-2的鸡肝细胞系构建[D]. 谢菁. 扬州大学, 2019
- [10]SHP2对体外活化肝星状细胞凋亡的影响[D]. 宋洁. 华北理工大学, 2019(01)