一、人重症肌无力胸腺树突状细胞的分离和培养（论文文献综述）
张丽[1]（2021）在《小鼠胸腺和脾脏增龄性变化的转录组和蛋白组学研究》文中研究表明研究背景免疫衰老指随着年龄的增长,因免疫器官结构破坏和免疫反应功能障碍,造成先天性和适应性免疫受损,导致老年人免疫功能的改变,伴随以慢性炎症为特征的全身炎症状态,与感染、自身免疫性疾病以及肿瘤等的发生发展密切相关。目前免疫衰老的确切机制尚未完全明确。初级和次级淋巴器官结构和功能的破坏可导致免疫功能减退,因此免疫器官增龄性变化可能与免疫衰老的发生有关。胸腺和脾脏作为机体最大的中枢和外周免疫器官,随着年龄增加,结构和功能发生改变,正常微环境的破坏以及T淋巴细胞数目的减少引起机体免疫功能的减退,影响外周免疫的稳态,可能促进与年龄有关的机体炎症状态以及免疫衰老的发生。衰老引起的胸腺及脾脏结构和功能的变化可能与免疫衰老存在关联。目的胸腺和脾脏增龄性分子变化以及机制目前尚未明确。本实验通过基于整合转录组和蛋白质组学方法,揭示不同年龄组小鼠胸腺和脾脏组织在转录组和蛋白组水平上的增龄性分子变化,探讨胸腺、脾脏的增龄性变化在免疫衰老中潜在作用,为免疫衰老导致的相关疾病的诊治提供可能的候选靶标。方法本实验首先通过HE染色、免疫组化以及透射电镜超微观察等方法研究不同年龄组（6周龄,6月龄,20月龄）小鼠胸腺和脾脏免疫器官组织学变化。随后通过整合RNA-seq转录组学方法以及串联质谱标签（TMT）相对定量蛋白质组学技术,研究不同年龄组小鼠胸腺和脾脏组织在转录组和蛋白组水平上的表达差异变化,结合生物信息学方法分析其所富集的通路,筛选出增龄相关的差异基因和蛋白,并进一步验证筛选出的差异基因与蛋白。结果1.小鼠增龄性免疫器官重量及指数变化小鼠鼠体重随着年龄增长而增加。小鼠胸腺重量随年龄增加而减少,20月龄组和6月龄组小鼠胸腺重量均显着低于6周龄组,且具有统计学意义。小鼠脾脏重量随着年龄增加变化不显着,20月龄和6月龄组小鼠脾脏重量高于6周龄组,均无统计学差异。小鼠胸腺指数和脾脏指数均随年龄增加而显着减少。2.免疫器官组织学变化（1）胸腺HE染色:6周龄组小鼠胸腺皮髓质界限清晰,皮质着色深,淋巴细胞致密、染色较深;髓质着色较浅,结构稍疏松,淋巴细胞数目较皮质少,有大量TECs。6月龄组小鼠胸腺组织皮质成分变薄,皮髓质内胸腺细胞间隙增大,皮/髓比显着降低;髓质内TECs数目较少。20月龄组小鼠胸腺组织较6周龄、6月龄组明显萎缩、面积显着减少,周围可见结缔组织包绕、替代,皮髓质界限不清;胸腺细胞、TECs数量均较少,胸腺细胞深染、不规则,成纤维细胞数目增加。免疫组化:随着年龄增加,小鼠胸腺皮、髓质中CD3阳性T淋巴细胞、Ep CAM阳性TECs数目显着减少。20月龄组皮质TECs较6周龄与6月龄组显着减少,20月龄与6月龄组髓质TECs较6周龄组显着减少;20月龄与6月龄组皮质淋巴细胞较6周龄组显着减少,20月龄组髓质淋巴细胞较6周龄与6月龄组显着减少;20月龄与6月龄组巨噬细胞较6周龄组显着增加。超微结构:小鼠胸腺随年龄增长,细胞数目减少、结构疏松,淋巴细胞核趋于不规则,核质比小;可见坏死胸腺的上皮细胞。20月龄组可见凋亡现象增加,上皮细胞线粒体呈空泡变。（2）脾脏HE染色:6周龄组小鼠脾脏红、白髓、边缘区结构清晰,脾脏小体结构规则,淋巴滤泡深染,淋巴细胞致密。6月龄组小鼠脾脏红、白髓界限模糊,边缘区较6周龄组显着增宽,生发中心面积增大,淋巴细胞较6周龄组稍疏松。20月龄组小鼠皮髓质界限模糊,脾脏小体结构不规则,白髓萎缩、面积减少,红髓面积相应增大,红/白髓比显着升高;边缘区较6月龄组与6周龄组显着增宽,生发中心面积增大,实质内成纤维细胞、纤维结缔组织增生。免疫组化:随着年龄增加,小鼠脾脏白髓内淋巴细胞数目显着下降,白髓边缘区与生发中心内B淋巴细胞数目增加,边缘区巨噬细胞数目增龄性显着增加。超微结构:6周龄小鼠脾脏内淋巴细胞较致密,核规则呈圆形,核质比大,异染色质较多,胞浆线粒体、内质网、有力的核糖体较丰富;局部散在中性粒细胞、浆细胞、巨噬细胞等。6月龄小鼠脾脏内淋巴细胞部分核稍不规则,异染色质边聚,部分胞浆内可见线粒体空泡变;凋亡细胞增加。20月龄小鼠脾脏内淋巴细胞疏松,数目明显减少,核不规则,异染色质边聚,呈块状,凋亡细胞明显增加。3.ELISA检测细胞因子结果显示,小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-10、TNF-α和IL-6等有增龄性升高趋势,20月龄组中IL-10、TNF-α和IL-6水平高于6周龄组、6月龄组,20月龄、6月龄组中IFN-γ水平高于6周龄组,均无显着性统计学差异。4.胸腺转录组和蛋白组学结果分析RNA-Seq方法筛选出524个胸腺增龄相关差异表达基因,主要参与信号转导过程（PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路、Ras信号通路）、信号分子和相互作用过程（ECM-受体相互作用）、免疫系统（B细胞受体信号通路、补体和凝血级联、趋化因子信号通路）等信号通路;TMT技术确定113个胸腺增龄相关差异表达蛋白,主要参与能量代谢过程如柠檬酸盐循环（TCA循环）、细胞生长与死亡过程（细胞周期、凋亡过程）、遗传信息处理过程（剪接体）、内分泌系统（脂肪细胞因子信号通路）、免疫系统等通路。通过蛋白网络互作分析,筛选出与胸腺增龄相关的Fgf2、Flt1、BMP4、v WF、Lamc1、CD19、Cxcr5等重要差异基因以及CKS1、SRSF2、CASP-3、FGF2、CPT1B、PTMA、NASP等重要差异蛋白。5.脾脏转录组和蛋白组学结果分析基于RNA-Seq方法筛选出28个脾脏增龄相关差异表达基因,主要参与炎症反应、免疫相关通路,包括趋化因子信号转导途径,MAPK信号通路、Rap1信号通路等信号通路。TMT技术确定133个组织脾脏增龄相关差异表达蛋白,参与细胞生长与死亡过程（细胞周期）、遗传信息处理过程（翻译、核糖体）、细胞运动性过程（肌动蛋白细胞骨架调节）、免疫系统等通路。通过蛋白网络互作分析,筛选出与脾脏增龄相关的、vsig4、cfh、c7、cx3cl1、penk、ccl8、prkcz等重要差异基因以及CCNA2、ATOX1、CCR6、CXCL5、EIF3L、GZMA、RABL3、SLAMF1、RSL24D1等重要差异蛋白。结论随着年龄增长,小鼠免疫器官胸腺和脾脏在组织结构和免疫细胞分布上发生了变化,主要表现为微环境破坏、T淋巴细胞减少。衰老个体中炎症因子水平高于幼年组。不同年龄段小鼠胸腺和脾脏组织在基因和蛋白水平上表达存在明显差异性。增龄过程中,胸腺在基因水平上的变化表现为胸腺微环境受影响,脂肪生成活动增强,胸腺上皮细胞分化、生成以及胸腺细胞迁移、增殖或分化受影响,促炎作用增强等;在蛋白水平上表现为能量代谢增加,细胞生长、遗传物质传递相关过程受损,细胞凋亡活动增强、凋亡抑制作用减弱,脂质代谢增强,胸腺微环境受影响、促炎细胞因子分泌增加等。增龄过程中,脾脏在基因水平上的变化表现为T细胞增殖的抑制活动增强,促进细胞死亡活动增加,细胞凋亡的信号转导途径激活,促炎活动增强等。在蛋白水平上表现为细胞周期、蛋白质合成受损,细胞增殖活性减退、迁移过程受影响,抗氧化作用增强,T、B细胞激活作用增强、促炎反应增强等。衰老对胸腺和脾脏的影响主要包括影响其组织正常结构及其正常的生长、发育过程,此外促炎反应的增强可能与免疫衰老的炎症状态相关。本研究结果为阐明胸腺、脾脏增龄性分子变化以及探讨其在免疫衰老中可能存在的作用提供理论依据。
李婷婷[2]（2021）在《调节性B细胞亚群在胸腺瘤患者中的表达及其临床意义》文中研究说明背景:胸腺瘤是最为常见的发生于前纵隔的一类胸腺上皮性肿瘤,其发病率约占所有胸腺肿瘤的90%,占全身所有恶性肿瘤的0.2%-1.5%。据统计,胸腺瘤在亚洲人的发病率相对较其他人群高,发病高峰年龄为40-50岁。胸腺瘤组织病理学及生物学行为体现出多样性,故在分类上存在多种标准及方式。WHO对胸腺瘤进行分类时,依据上皮细胞的形态和上皮细胞与淋巴细胞的比例将其划分为A型、AB型、B1型、B2型和B3型五种亚型,不同类型的胸腺瘤具有不同的生物学特征。调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）作为B淋巴细胞的一个亚群,最早在小鼠模型中被证实具有负向免疫调节作用。越来越多的证据表明,调节性B细胞参与抑制抗肿瘤免疫反应,从而促进肿瘤发生和发展,如胃癌、肺癌、肝癌、甲状腺癌、食管癌和乳腺癌等。然而,调节性B细胞是否参与胸腺瘤患者发病及相关机制尚不清楚。目的:调节性B细胞是B淋巴细胞的一个亚群,分泌白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）,在抑制性免疫应答中具有重要作用,但其在胸腺瘤疾病中的作用机制尚不清楚。本项研究旨在评估胸腺瘤患者外周血Bregs细胞亚群的表达水平,并与临床指标进行相关性分析,以进一步探讨它们在胸腺瘤免疫应答中的作用。方法:使用流式细胞术检测23名胸腺瘤患者和15名胸腺囊肿患者（对照组）外周血中Bregs细胞亚群的百分比。受试者的血清IL-10水平通过微量样本多指标流式蛋白定量技术（CBA）测定。采用统计学方法分析上述细胞及因子在两组之间的差异性及其与临床指标的关系。结果:1.与对照组相比,胸腺瘤患者外周血中循环IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率与血清IL-10的水平显着升高,并与KPS临床评分呈负相关。IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率随着胸腺瘤Masaoka分期等级的升高而显着增加,血清IL-10的水平也体现出了升高的趋势,并且在早期分期中IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率和血清IL-10的水平即出现显着升高。此外,IL-10+Bregs和IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率与血清IL-10的水平均呈正相关,IL-10+Bregs与IL-10+CD24hiCD38hiBregs呈正相关。2.在对胸腺瘤不同亚型的分析中,我们发现B型胸腺瘤中循环IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率与血清IL-10的水平显着升高,且IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率与KPS临床评分呈负相关,与血清IL-10的水平呈正相关。3.手术治疗后,患者外周血中循环IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率和血清中IL-10的水平明显降低。其中B型胸腺瘤中IL-10+Bregs、IL-10+CD24hiCD38hiBregs的细胞频率和血清中IL-10的水平与其它类型的胸腺瘤相比,在治疗后降低的更加显着。结论:本研究表明胸腺瘤患者外周血中CD24hiCD38hiBreg细胞中IL-10的表达增加,尤其在B型胸腺瘤中表现的更加显着,提示Breg细胞可能参与胸腺瘤的致病过程。此外,Breg细胞还可以作为疾病诊断的生物标志物和潜在的治疗靶点。
杨春林[3]（2020）在《自然杀伤细胞及其亚型在实验性自身免疫性重症肌无力中的免疫调节作用》文中指出Ⅰ自然杀伤细胞在实验性自身免疫性重症肌无力中的免疫调节作用研究背景重症肌无力（myastheniagravis,MG）是一种抗体介导的自身免疫疾病。目前认为,重症肌无力的主要发病机制之一是抗乙酰胆碱受体抗体与神经肌肉接头突触后膜的乙酰胆碱受体结合,阻断了神经肌肉接头突触传导,导致肌无力产生。通过主动免疫而建立大鼠实验性自身免疫性重症肌无力模型是研究重症肌无力的有效手段。滤泡辅助T细胞（follicular helperT cells,Tfh细胞）是一种新近发现的CD4+T细胞亚群。其高表达C-X-C趋化因子受体5（C-X-C chemokine receptortype 5,CXCR5）、诱导性共刺激分子（inducible co-stimulator,ICOS）、程序性死亡受体1（programmed cell death 1,PD-1）等分子,在B细胞增殖和分化、抗体亚型转换、抗体亲和力成熟过程中发挥至关重要的作用。研究显示,Tfh细胞在重症肌无力疾病的发生和发展中发挥重要作用。自然杀伤细胞（naturalkillercells,NK细胞）是一类具有天然细胞杀伤功能的淋巴细胞,是固有免疫细胞的一种。研究显示,NK细胞不仅具有抗肿瘤、抗病毒功能,还在自身免疫疾病中发挥关键作用。然而,NK细胞在重症肌无力中的作用及机制尚不清楚;此外,NK细胞对Tfh细胞的免疫调节作用也鲜有报道。研究目的本实验旨在通过体内及体外实验研究NK细胞在实验性自身免疫性重症肌无力中的作用,探讨NK细胞对Tfh细胞的免疫调节作用及机制,为重症肌无力的治疗提供新的靶点和策略。研究方法1.本研究通过向Lewis大鼠尾根部皮下免疫大鼠乙酰胆碱受体α亚基肽段（R97-116）,诱导 EAMG 模型,并将模型鼠随机分成对照组和 NK 细胞组,分别经尾静脉注射PBS和大鼠脾脏来源的NK细胞。初次免疫后,采用盲法监测模型鼠体重和肌无力临床评分。初次免疫后第46天,处死模型鼠,收集血清和脾脏,制备脾脏单个核细胞悬液。2.ELISA法检测血清中抗R97-116肽段抗体水平、抗体亚型、抗体亲和力。3.流式细胞术分析脾脏Tfh细胞及其亚型、调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）、生发中心B细胞、树突状细胞及自然杀伤T细胞（naturalkillerT cells,NKT细胞）的比例。4.将NK细胞与脾脏单个核细胞或CD3+T细胞共培养,流式细胞术分析T细胞、Tfh细胞的数量、比例和细胞凋亡情况。5.采用IL-15处理体外培养的脾脏单个核细胞（IL-15具有激活NK细胞的功能）,流式细胞术分析T细胞、Tfh细胞的数量、比例和细胞凋亡情况,分析B细胞增殖情况。研究结果1.与对照组相比,静脉注射大鼠脾脏来源的NK细胞,能够显着缓解EAMG临床症状。初次免疫后第38天、第40天、第42天、第44天、第46天,NK细胞组EAMG大鼠临床症状明显减轻（p<0.05）。2.ELISA实验结果显示,与对照组相比,NK细胞组大鼠血清内抗R97-116 IgG2a抗体水平明显降低（p<0.01）,但总IgG抗体、IgG1抗体、IgG2b抗体的水平无明显变化。此外,NK细胞组大鼠血清抗R97-116IgG抗体的亲和力有降低趋势（p=0.09）。3.流式细胞术分析显示,NK细胞组EAMG大鼠脾脏生发中心B细胞比例明显降低（p<0.01）,而记忆性B细胞的比例无明显变化。与此同时,NK细胞能够降低EAMG大鼠脾脏Tfh细胞的比例（p<0.05）,但对Tfh细胞亚型无明显影响。而且,静脉注射NK细胞对脾脏Treg、树突状细胞及NKT细胞的比例无影响。4.IL-15处理体外培养的脾脏单个核细胞后,脾脏单个核细胞中NK细胞的比例显着增加,而Tfh细胞的比例降低,T细胞凋亡增加。此外,IL-15能够抑制单个核细胞中B细胞的增殖,这可能与其抑制Tfh细胞相关。5.体外共培养实验研究显示,与脾脏单个核细胞单独培养（对照组）相比,当脾脏单个核细胞与NK细胞共培养时,其Tfh细胞数量降低。此外,与CD3+T细胞单独培养（对照组）相比,当CD3+T细胞与NK细胞共培养时,其Tfh细胞的比例降低,且Tfh细胞的凋亡增加。研究结论1.NK细胞能够通过降低Tfh细胞比例,抑制生发中心B细胞分化,降低EAMG大鼠血清抗体水平,缓解EAMG大鼠临床症状。2.NK细胞通过其细胞毒作用,诱导Tfh细胞凋亡,抑制Tfh细胞分化,降低Tfh细胞比例。Ⅱ GXCR5+NK细胞及GXGR5-NK细胞的表型、分布及免疫调节作用研究背景自然杀伤细胞（naturalkillercells,NK细胞）是一类具有天然细胞杀伤功能的淋巴细胞,是固有免疫细胞的一种。研究显示,NK细胞不仅具有抗肿瘤、抗病毒功能,还在自身免疫疾病中发挥关键作用。NK细胞是一种异质性的淋巴细胞群体,包括多种细胞亚群。不同NK细胞亚群具有不同的表型和功能,发挥不同的免疫调节作用。C-X-C 趋化因子受体 5（C-X-C chemokine receptortype 5,CXCR5）是 C-X-C家族趋化因子受体的一员,其配体是C-X-C趋化因子配体13（C-X-C chemokine ligand 13,CXCL13）。CXCR5 表达于 B 细胞、滤泡辅助 T 细胞（follicularhelper T cells,Tfh细胞）、部分CD8+T细胞及自然杀伤T细胞（natural killer T cells,NKT细胞）。淋巴滤泡内的基质细胞能够分泌大量的CXCL13,趋化表达CXCR5的细胞迁移至淋巴滤泡内。研究显示,Tfh细胞、CD8+CXCR5+T细胞及CXCR5+NKT细胞均具有调节生发中心免疫反应,辅助B细胞抗体产生的功能。论文第一部分的研究结果显示,NK细胞具有调节生发中心B细胞及抗体分泌的能力。而NK细胞是否表达CXCR5及CXCR5+NK细胞的功能尚不清楚。研究目的本实验旨在探讨CXCR5-NK细胞和CXCR5+NK细胞的表型、分布、迁移及功能差别,探讨CXCR5-NK细胞和CXCR5+NK细胞对Tfh细胞的免疫调节作用,揭示不同NK细胞在实验性自身免疫性重症肌无力中的作用,为重症肌无力的治疗提供新的靶点和策略。研究方法1.提取Lewis大鼠外周血、脾脏、淋巴结,制备单个核细胞（mononuclear cells,MNCs）悬液,流式细胞术分析大鼠外周血、脾脏、淋巴结CXCR5+NK细胞的比例。2.免疫荧光染色,检测NK细胞在B细胞区及生发中心的分布。3.分选的NK细胞、CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞,CFSE标记后注射至大鼠体内,检测NK细胞、CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞体内迁移能力。4.流式细胞术分析大鼠CXCR5-NK细胞和CXCR5+NK细胞表面诱导性共刺激分子（inducible co-stimulator,ICOS）、CD25、CD27 的表达水平,分析CXCR5-NK 细胞和 CXCR5+NK 细胞分泌干扰素γ（interferonγ,IFN-γ）、白介素 17（interleukin 17,IL-17）的能力,比较 CXCR5-NK 细胞和 CXCR5+NK细胞表型差异。5.诱导实验性自身免疫性重症肌无力（experimental autoimmune my asthenia gravis,EAMG）及实验性自身免疫性神经炎（experimental autoimmune neuritis,EAN）模型,线性回归分析上述大鼠脾脏或淋巴结CXCR5+NK细胞与Tfh细胞及生发中心B细胞的相关性。6.分选CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞,将脾脏单个核细胞或CD3+T细胞分别与CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞共培养,流式细胞术检测CD4+T细胞及Tfh细胞的数量及比例,分析Tfh细胞表面ICOS的表达水平。研究结果1.大鼠外周血、脾脏、淋巴结NK细胞均可以分成CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞。其中,CXCR5+NK细胞分别占外周血、脾脏、淋巴结NK细胞的0.63±0.03%、2.44±0.17%与 9.75 ± 0.96%。2.免疫荧光及体内示踪实验显示,大鼠脾脏B细胞区存在NK细胞;与CXCR5-NK细胞相比,CXCR5+NK细胞迁移至B细胞区的能力更强。3.与CXCR5-NK细胞相比,CXCR5+NK细胞ICOS及IL-17的表达水平增加、CD27的表达水平降低,而二者CD25及IFN-γ表达水平无明显差异。此外,CXCR5+NK细胞的体积和颗粒度要高于CXCR5-NK细胞。4.线性回归分析表明,EAMG大鼠脾脏CXCR5+NK细胞的比例与Tfh细胞的比例及生发中心B细胞的比例呈正相关,而CXCR5-NK细胞与CXCR5+NK细胞的比值与Tfh细胞的比例及生发中心B细胞的比例呈负相关。在EAN大鼠模型中也观察到相似结果。5.体外实验显示,当CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞与脾脏单个核细胞共培养时,CXCR5-NK细胞能够抑制脾脏单个核细胞中CD4+T细胞及Tfh细胞的数量,而CXCR5+NK细胞对MNCs中CD4+T细胞及Tfh细胞的抑制作用不明显。当CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞与脾脏CD3+T细胞共培养时,CXCR5-NK细胞能够抑制CD4+T细胞中Tfh细胞的比例,而CXCR5+NK细胞对其作用不明显;并且,与CXCR5-NK细胞相比,CXCR5+NK细胞能够促进Tfh细胞表面ICOS的表达,增加CD4+CXCR5+细胞中ICOS阳性的比例。研究结论1.大鼠外周血、脾脏、淋巴结NK细胞可以分成CXCR5-NK细胞和CXCR5+NK细胞。2.CXCR5-NK细胞与CXCR5+NK细胞具有不同表面分子和细胞因子分泌。3.CXCR5-NK细胞能够抑制Tfh细胞的分化;CXCR5+NK细胞能够促进Tfh细胞表面ICOS的表达,促进Tfh细胞的分化和功能。
李静[4]（2020）在《TSP-1+tMSCs及其exosomes对巨噬细胞及CD4+T细胞分化的影响》文中研究说明背景与目的血小板反应蛋白1（Thrombospondin-1,TSP-1）是一种基质细胞糖蛋白,最早发现于活化的血小板中。人体内巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等均能表达和分泌TSP-1,TSP-1可以通过抑制或增强多种细胞因子的分泌来调节组织炎症的发生。胸腺是供T细胞分化发育成熟的中枢免疫器官,包括胸腺上皮细胞（Thymic Epithelial Cell,TEC）和胸腺间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,tMSC）在内的胸腺基质细胞共同孵育发育中的胸腺细胞分化为成熟的T细胞,输出到外周;同时胸腺基质细胞也通过产生的各种细胞因子参与免疫调节。重症肌无力（Myasthenia Gravis,MG）是一种器官特异性慢性自身免疫性疾病,多数患者体内产生了针对自身乙酰胆碱受体（Acetylcholine Receptor,AChR）的抗体。以往研究发现,AChR+MG患者胸腺炎症感染等病变与MG发生机制密切相关,并且MG患者胸腺炎症是由促炎性细胞因子IL-6,IFN-γ,TNFα和IL-17的分泌驱动的。课题组前期通过基因芯片分析MG胸腺组织炎症相关因子的表达发现,除了趋化因子（CCL-2、CCL-3、CXCL-10等）、促炎症因子（IL-6、IFN-γ等）的表达异常,MG胸腺组织TSP-1的表达量上调了20倍,提示TSP-1可能对于MG胸腺炎症微环境的形成有关。本研究通过免疫组织化学染色显示,在胸腺组织中,TSP-1阳性细胞主要分布在胸腺髓质区与小叶间隙。为探讨TSP-1表达上调与胸腺炎症环境的关系,本研究通过干预胸腺间充质干细胞TSP-1的表达,分析外泌体转移MSC表达的TSP-1对巨噬细胞活化以及对CD4+T细胞分化的影响,为明确TSP-1参与组织炎症的方式提供实验依据。方法1.TSP-1在胸腺的表达及分布:收集MG相关患者胸腺和先心患儿正常胸腺标本,制备胸腺石蜡切片,TSP-1免疫组化染色,确定TSP-1在不同病理胸腺中的表达与分布。2.LPS对tMSC中TSP-1表达的影响:LPS刺激tMSC,qRT-PCR以及WB观察TSP-1的表达变化。3.TSP-1干扰慢病毒载体的制备和感染tMSC:构建TSP-1干扰载体质粒shRNA1、shRNA2,用293T细胞包装病毒。分别用sh1、sh2慢病毒感染tMSC细胞72h。qRT-PCR以及WB检测TSP-1的表达改变。4.tMSC分泌的的外泌体的提取与鉴定:利用外泌体分离试剂盒分别提取正常MSC、LPS刺激tMSC、TSP-1干扰慢病毒感染后培养上清中的外泌体,WB、流式细胞术检测外泌体表面标志:CD63、CD9、CD81、电子显微镜检测外泌体形态。流式细胞术检测外泌体中TSP-1表达。5.不同来源巨噬细胞的诱导及鉴定:购买THP1单核细胞系,PMA诱导使其分化为M0,已知INF-γ/LPS诱导M0分化为M1型促炎巨噬细胞,IL-4/IL-13诱导M0分化为M2型抑炎巨噬细胞。或者分离人PBMC,GM-CSF诱导巨噬细胞。加入外泌体共培养后观察巨噬细胞形态变化。6.TSP-1对巨噬细胞活化的影响:外泌体、细胞培养上清（CM）、去除外泌体的细胞培养上清分别与THP1来源的巨噬细胞共培养24h后、RT-PCR检测IL-6、IL-1 β、TNF-α的RNA表达。LPS预处理tMSC后获得的外泌体（以下记做MEXLPS）和LPS预处理tMSC后沉默TSP-1获得的外泌体（以下记做MEXLPS-TSP1sh）与THP-1来源巨噬细胞和人PBMC来源巨噬细胞共培养,RT-PCR和流式细胞术检测巨噬细胞分泌炎症因子的改变。7.TSP-1对CD4+T细胞分化与增殖的影响:免疫磁珠法分选人PBMC中CD4+T淋巴细胞,与MEXLPS、MEXLPS-TSP1sh共培养,通过流式细胞术检测细胞培养上清炎症因子的改变以及CD4+T细胞的分化与增殖情况。结果1.TSP-1在MG相关不同病例胸腺组织中的分布:免疫组化结果显示心先病患儿正常胸腺组织皮髓结构明显,TSP-1表达较少,主要分布在胸腺皮髓交界处,小叶间隙;非肿瘤MG患者胸腺组织明显变小,皮髓边界不清,细胞杂乱空泡较多,TSP1+细胞增高且散在分布。胸腺瘤不伴MG患者胸腺组织皮髓边界不清,TSP-1+细胞量不多且散在分布。MG伴胸腺瘤组织亦无法准确定位,但组织破坏更加严重,TSP-1+细胞分布无明显规律。2.LPS对tMSCs表达TSP-1的影响:通过用LPS对tMSC刺激24h、48h、72h后,WB结果显示随着刺激时间的增加,TSP-1的表达量增加且72h表达量最高（P<0.0001）;qRT-PCR结果中TSP-1的表达也为相同趋势（P<0.05）。3.TSP-1干扰慢病毒的感染tMSC引起TSP-1表达降低:将制成的TSP-1干扰慢病毒sh1、sh2分别感染tMSC72h,WB结果显示sh1、sh2组TSP-1的表达量明显降低（P<0.01）;qRT-PCR结果中TSP-1的表达也为相同趋势（P<0.001）。4.tMSC分泌的外泌体的提取与鉴定:WB结果显示提取的外泌体中CD63、CD9均有表达,流式结果显示CD63、CD81均有阳性表达。电子显微镜下外泌体为直径为40-120nm的双层膜状结构。TSP-1干扰慢病毒感染tMSC后分泌的外泌体中TSP-1的表达荧光强度降低。5.巨噬细胞的诱导培养与鉴定:PMA刺激THP1 24h后使其分化成M0,已知用诱导因子INF-γ/LPS诱导M0分化为M1型巨噬细胞,IL-4/IL-13诱导M0分化为M2型巨噬细胞。MEXLPS和MEXLPS-TSP1sh与M0共培养 12h后用CD86、HLA-DR标记M1型巨噬细胞,用CD163、CD206标记M2型巨噬细胞,发现CD86、HLA-DR的表达升高（P<0.05）,CD163、CD206的表达并没有明显差异（P>0.05）。6.TSP-1对THP1来源巨噬细胞活化的影响:MEXLPS和MEXLPS-TSP1sh分别与THP1来源的M0共培养12h后qRT-PCR的结果显示与对照相比,MEXLPS刺激M0后M1型相关细胞因子IL-6（P<0.001）、IL-1β（P<0.001）、TNF-α（P<0.01）的RNA表达都有明显增高,IL-6（P<0.05）、TNF-α（P<0.01）、MCP-1（P<0.01）、IL-18（P<0.05）的分泌都明显升高。与MEXLPS刺激组相比,MEXLPS-TSP1sh刺激M0后M1型相关细胞因子IL-6（P<0.01）、IL-1β（P<0.01）、TNF-α（P<0.05）的RNA表达都有明显减少,IL-6（P<0.05）、IL-1β（P<0.05）、TNF-α（P<0.01）、MCP-1（P<0.01）、IL-18（P<0.05）的分泌明显减少。7.TSP-1对人PBMC来源巨噬细胞活化的影响:MEXLPS和MEXLPS-TSP1sh分别与人PBMC来源的M0共培养12h后qRT-PCR的结果显示与对照相比,MEXLPS刺激M0后M1 型相关细胞因子IL-6（P<0.01）、IL-1 β（P<0.01）、TNF-α（P<0.01）的RNA表达都有明显增高,IL-6（P<0.001）、IL-1β（P<0.01）、TNF-α（P<0.0001）、IFN-γ（P<0.001）、IL-10（P<0.001）、IL-17a（P<0.01）、IL-18（P<0.01）、IL-23（P<0.01）、IL-33（P<0.01）的分泌都升高。与MEXLPS刺激组相比,MEXLPS-TSP1sh刺激M0后M1型相关细胞因子IL-6（P<0.01）IL-1β（P<0.01）、TNF-α（P<0.01）的RNA表达都有明显减少,IL-6（P<0.001）、IL-1 β（P<0.01）、TNF-α（P<0.0001）、IFN-γ（P<0.001）、IL-10（P<0.001）、IL-17a（P<0.01）、IL-18（P<0.01）、IL-23（P<0.05）、IL-33（P<0.05）的分泌都减少。8.TSP-1对CD4+T细胞分化与增殖的影响:与MEXLPS和MEXLPS-TSP1sh分别与活化的CD4+T细胞共培养12h后流式结果显示与对照相比,Th1、Th2、Th17、Treg细胞的比例无明显变化,T细胞增殖明显减少（P<0.05）,细胞培养上清中IL-6（P=0.01）、TNF-α（P<0.001）明显增加。与MEXLPS刺激组相比,MEXLPS-TSP1sh刺激活化的CD4+T细胞12h后Th1（P<0.05）、Th17（P<0.05）细胞的比例明显减少,Treg（P<0.05）细胞的比例增加,Th2细胞的比例没有明显改变,T细胞增殖明显增加（P<0.05）。细胞培养上清中IL-6（P<0.05）、TNF-α（P<0.001）明显减少。结论外泌体转移tMSC表达的TSP-1可诱导巨噬细胞发生M1极化、CD4+T细胞向Th1、Th17分化,并促进IL-6、TNF-α等炎症因子的分泌,从而参与胸腺炎症的调节和形成。
杨照宇[5]（2020）在《探究Atg12介导的树突状细胞自噬在胸腺瘤合并重症肌无力中的免疫调控作用》文中研究表明目的:比较单纯胸腺瘤与胸腺瘤合并重症肌无力（Myasthenia gravis,MG）肿瘤组织中树突状细胞（Dendritic cells,DCs）的Atg12表达情况和自噬水平,并在细胞水平明确Atg12对自噬的调控,进一步探索胸腺瘤对其微环境中DCs自噬的影响;寻找胸腺瘤各亚型的差异表达基因,探寻可能对Atg12表达产生影响的上游关键因子及通路,完善Atg12介导的自噬的上下游机制;构建动物模型,在体内水平探索Atg12介导的DCs自噬在MG中的潜在作用。内容与方法:1、选取43例各型单纯胸腺瘤及胸腺瘤合并MG的术后肿瘤组织标本,制作石蜡切片,利用多色免疫荧光技术检测CD11c、CD80、HLA-DR、LC3、Atg12等蛋白的在两组标本中表达。2、在胸腺瘤细胞系Thy0517中上调或下调Atg12的表达,利用实时定量PCR（Quantification Real-time PCR,rt-PCR）及免疫蛋白印迹实验（Western Bolt,WB）检测自噬相关基因Atg12、P62、LC3、Beclin1等的表达。3、由THP-1刺激分化得到成熟的DCs,将胸腺瘤细胞Thy0517与DCs经Transwell共培养后,提取DCs的m RNA及蛋白利用rt-PCR及WB检测自噬相关基因Atg12、P62、LC3、Beclin1等的表达。4、挖掘TCGA及GEO数据库中胸腺瘤样本的芯片信息,利用生物信息学手段分析差异基因表达,通过PCR筛选及课题组已有的胸腺瘤芯片数据比对确定KIT proto-oncogene ligand（KITLG）作为潜在的A及AB型胸腺瘤的特征性标志物,进一步分析了KITLG相关的m RNA、micro RNA及信号通路。选取43例各型单纯胸腺瘤及胸腺瘤合并MG标本,利用免疫组化检测KITLG在两组中的表达以及在胸腺瘤各亚型间的表达差异。在Thy0517细胞中进行转染改变KITLG的表达,利用rt-PCR及WB检测MAPK通路关键分子的表达,同时检测下游Atg12及其他自噬相关基因P62、LC3、Beclin1的水平。5、购买利用CRISPR/Cas9技术敲除树突状细胞群Atg12基因的C57BL/6J小鼠,连同正常C57BL/6J小鼠,通过定期注射乙酰胆碱受体（Acetylcholine receptor,Ach R）多肽建立实验性自身免疫性重症肌无力（Experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG）模型。每周对小鼠进行肌无力临床症状的观察和评分并对其进行体重测量。造模后第63天抽取小鼠外周血并分离出DCs,提取DCs的m RNA及蛋白利用rt-PCR及WB检测自噬相关基因Atg12、P62、LC3、Beclin1等的表达。结果:1、通过4种配色方案进行多色免疫荧光显示胸腺瘤合并MG较单纯胸腺瘤患者胸腺瘤组织中的DCs的Atg12表达更高,自噬水平增强,差异有统计学意义（p<0.05）。2、当胸腺瘤细胞系Thy0517中Atg12的表达上调时,P62表达降低,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的水平升高（p<0.05）,而Beclin1的表达无明显改变。当胸腺瘤细胞系Thy0517中Atg12的表达下调时,除Beclin1仍无明显变化外,其余因子的变化与前者呈相反趋势。3、成功建立了THP-1转化成熟DCs的稳定体系。当胸腺瘤细胞自噬增强时,共培养环境中的DCs的Atg12及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的水平升高,P62水平下降（p<0.05）,Beclin1的变化不显着。当胸腺瘤细胞的自噬减弱时,其共培养环境中的DCs各指标变化除Beclin1外均与前者呈相反趋势。4、KITLG在A型和AB型胸腺瘤中的表达较其他亚型明显上调,同时胸腺瘤合并MG的KITLG总体表达也较单纯胸腺瘤更高。当KITLG过表达时还会引发一系列m RNA、mi RNA及信号通路的异常改变。在胸腺瘤细胞中改变KITLG表达,发现MAPK通路中GRB2、磷酸化BRAF、磷酸化MEK1/2及磷酸化ERK1/2水平随着KITLG过表达而升高或随着KITLG低表达而降低（p<0.05）,在m RNA水平,GRB2呈现相似的趋势,而其他分子表达未发生明显变化。此外,当胸腺瘤细胞中的KITLG表达升高后Atg12、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达升高,P62表达下降（p<0.05）,反之亦然。5、EAMG造模之后,Atg12条件性基因敲除小鼠与普通C57BL/6J小鼠的体重均呈现先增高后缓慢下降趋势,前者与后者相比MG出现及进展更加缓慢,同一时间点进行临床评分稍高,测量体重下降幅度更小,但总体差异无统计学意义。此外前者相比后者,外周血中DCs的Atg12表达明显降低,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ下降,P62表达增高（p<0.05）,Beclin1表达无明显变化。结论:1、胸腺瘤合并MG较单纯胸腺瘤组织中的DCs的Atg12表达增高。在胸腺瘤细胞中改变Atg12的表达可调控细胞自噬的状态。不同自噬状态的胸腺瘤细胞与DCs共培养可影响DCs的Atg12表达及其细胞自噬水平,表明胸腺瘤可通过微环境影响Atg12介导的DCs自噬。2、KITLG可能成为A型和AB型胸腺瘤的标志物,同时在合并有MG的胸腺瘤中表达更高。KITLG过表达促进MAPK通路的磷酸化并上调其下游Beclin1、Atg12、LC3等的水平,下调P62表达,促进Atg12介导的自噬发生,表明KITLG可能成为Atg12自噬通路上游的重要靶点。3、树突状细胞群Atg12基因敲除鼠相比普通小鼠,DCs自噬水平出现明显下降,EAMG造模后出现MG症状的时间较晚且程度较轻,表明Atg12介导的DCs自噬可能是MG发生的因素之一。
宋歌[6]（2020）在《FOSL1在重症肌无力胸腺异常增生中的作用》文中指出研究背景与目的重症肌无力（myastheniagravis,MG）是自身抗体介导的自身免疫性疾病。可由多种抗体介导,其中多数患者表现为乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor,AChR）抗体阳性。研究证实,针对AChR抗原产生自身抗体需要T细胞辅助,半数以上MG患者存在胸腺瘤、胸腺增生等异常,切除胸腺后患者症状可以缓解,因此认为MG的发生和发展与胸腺异常密切相关。尤其是在异常增生的MG胸腺中可见生发中心并从中分离出产生针对AChR的自身抗体。为探讨MG患者胸腺异常增生的机制,我们首先选取增生型MG患者胸腺组织进行“人类信号转导通路发现者PCR芯片”分析,观测10类常见的信号转导通路,通过对该芯片结果的分析,发现MG胸腺组织多种信号分子与对照组显着差异表达,结合相关文献和本课题组的研究工作基础,我们选择差异表达倍数较高的FOSL1（Fos related antigen-1）作为研究的核心内容。根据课题组相关研究发现,FOSL1主要表达于胸腺上皮细胞（thymus epithelial cells,TECs）,为进一步明确FOSL1高表达对TECs功能和胸腺细胞增殖的影响,我们分离出TECs和胸腺细胞,通过构建慢病毒FOSL1基因表达和干扰表达载体转染TECs,观察TECs相关信号分子SOCS3、STAT3、BCL2、BAX基因表达的变化,以及TECs对胸腺细胞增殖的影响。材料与方法1.研究对象实验组:临床确诊的MG患者15例,男7例,女8例,年龄21.5±6.17岁。研究纳入标准符合下列5项指标,①具有典型的肌无力症状,眼睑下垂或肢体无力,晨轻暮重,疲劳试验症状加重;②新斯的明试验阳性;③血液中针对乙酰胆碱受体（AChR）的自身抗体阳性;④接受胸腺切除术治疗,症状缓解;⑤胸腺病理检查未见典型胸腺瘤,属于胸腺增生型。对照组:非自身免疫性心脏病且行开胸手术者15例,男9例,女6例,年龄18.3±4.23岁,与实验组没有显着差异。自身抗体阴性,无感染性疾病。样本采集不增加患者损伤并经患者或家属知情同意,符合医学伦理。2.胸腺组织样本采集、保存和运输将手术切除的新鲜胸腺组织,放置于无菌生理盐水中,1h内冷藏运输至实验室。在实验室首先用生理盐水对样本进行清洗、切除坏死组织和筋膜,4h内完成RNA提取、细胞分离培养、组织切片等相关实验。样本处理全过程在冰上、低温条件下进行。其中RNA提取用样本每50mg加入1 mL Trizol试剂后制成匀浆,-80℃冰箱或液氮保存。干冰运输。3.RNA提取、纯化、cDNA合成无菌获取手术切除的胸腺组织块,约50mg,加入1ml TRIZOL试剂制成匀浆。氯仿-水相分离法提取总RNA,消化灭活基因组DNA、并用RNeasy（?）MinEluteTM纯化试剂盒（Qiagen）对RNA进行纯化。常规加入oligo（dT）18、总RNA、dNTPs后定容、65℃水浴。再依次加入第一链Buffer、DTT、RNA酶抑制剂和SuperScriptⅢ RT进行cDNA合成。-20℃保存。4.PCR芯片分析从15例MG患者和15例对照组胸腺组织RNA中分别选取3例,委托上海康成生物工程公司进行PCR Assay。选择含有84个信号分子的“人类信号转导途径发现者PCR芯片”。该芯片中的信号分子分别属于TGFβ信号通路、WNT信号通路、NF□B信号通路、JAK/STAT信号通路、p53信号通路、Notch信号通路、Hedgehog信号通路、PPAR信号通路、Oxidative Stress通路和Hypoxia通路。5.荧光定量PCR验证试验根据芯片结果,对15例患者和对照组胸腺组织进行了基因表达验证实验。从GENE数据库查询FOSL1、CCL5和SOCS3基因序列,采用Primer5.0设计引物,按照SYBRPremix Ex Taq TM（TaKaRa公司）产品说明书进行操作。每个样本做3个复孔,冰上配制每孔20μL反应体系,加入八联排孔中。ABI 7500Fast荧光定量PCR仪中进行反应。导出原始数据,统计分析。6.胸腺上皮细胞（TEC）分离培养、鉴定和FOSL1基因转染取新鲜胸腺组织,去除筋膜和血污,剪成碎块,接种到6孔板,加入含10%胎牛血清（HyClone）和青霉素、链霉素的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养液。37℃5%CO2环境中培养,隔天半量换液,培养7d后观察单个细胞集落形成情况。随机选择5-10个细胞集落,转移到新另一新培养皿继续培养,倒置显微镜观察生长情况,并进行CK8/18单抗染色,对分离的细胞进行鉴定。选取CK8/18+的细胞克隆进行下一步实验。委托公司构建FOSL1慢病毒表达载体（pCDH-CMV-MCS-EF 1-copGfp-FOSL1）和干扰载体（pMAGic7.1-FOSL1shRNA）。取2×105个生长状态良好的TECs,加入2×107TU/mL的慢病毒载体,倒置荧光显微镜下观察感染效率>85%。实验分组:FOSL1基因转染表达组（FOSL1组）、FOSL1表达干扰组（FOSL1-sh组）、过表达的空载体对照组（control）、干扰表达的空载体对照组（control-sh）。加入慢病毒载体后继续放置于37℃5%CO2培养箱中孵育7d,每天观察,记录实验结果。7.FOSL1基因转染或干扰表达对TECs SOCS3及相关信号分子表达的影响收集FOSL1基因转染前后的TECs,PBS洗涤后,提取RNA,经纯化、反转录和荧光定量PCR扩增（参考前述1.4和1.6的方法）,分析TEC表达FOSL1、SOCS3及相关信号分子mRNA水平的变化。离心收集各组TEC,计数。用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液（RIPA）裂解细胞,PierceTMBCA 蛋白检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测定蛋白浓度。将蛋白样品100加热10min,经SDS-PAGE电泳,采用半湿蛋白转印,5%脱脂乳阻断2h,按照常规方法依次加入一抗和辣根过氧化物酶（ZSGB-BIO）标记的二抗,孵育,在 ImageQuant LAS 4000mini Gel 成像系统（GE Healthcare）成像,蛋白表达通过ImageJ量化。β-actin为参照。8.胸腺细胞增殖实验将无菌胸腺组织按上法剪碎,通过机械挤压过100目不锈钢网,获得单个细胞悬液。室温静置2h,去除贴壁细胞,将悬浮细胞用PBS洗2次,进行细胞计数,调整细胞浓度为1 × 105/mL。将FOSL1组、FOSL1-sh组和两个对照组TEC按5.0×103个/孔接种于96孔培养板,待其完全贴壁（8h）后按1:10比例加入胸腺细胞,在1640培养基（含10%胎牛血清）37℃、5%CO2条件下继续培养24h、48h和72h,在培养结束前4h每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL。每孔加DMSO 150 μL震荡10min溶解细胞释放甲臜颗粒,450nm波长全自动酶标仪测定吸光度值（A值）,每组3个复孔。9.数据分析和统计学处理统计学意义评估采用两独立样本t检验,单因素方差分析,检验水准α=0.05,P<0.05为有显着性差异。数据处理用GraphPad Prism version5软件进行处理。结果1.MG患者胸腺组织差异表达基因将芯片中的MG患者胸腺组织信号转导分子mRNA与对照组进行对比分析,发现有显着差异的基因22个（差异倍数大于2）,其中18个基因在MG患者表达显着增高,4个基因表达显着降低。包括ADM、BAX、BCL2A、CDKN1 A、CEBDP、CSF1、EGFR、EMP1、FOSL1、GADD45A、GADD45B、ID1、IRF1、ICAM1、HES1、SERPINE1、SOCS3、WISP1 和WNT2B等,这些信号分子涉及 TGF-β、Notch、JAK/STAT、NF-κB、WNT等多条信号通路。其中BCL2A、FOSL1、SOCS3的差异倍数大于5。2.荧光定量PCR验证为证实芯片中mRNA表达的准确性,对15例MG患者和对照组胸腺RNA选取FOSL1、SOCS3、CCL5进行荧光定量RT-PCR,MG患者胸腺组织SOCS3、FOSL1的表达与对照组相比有显着差异,P<0.05,而CCL5的表达在两组中没有显着差异,这些均与芯片结果一致。3.FOSL1基因转染影响TECs相关信号分子表达从胸腺组织分离TECs进行克隆培养和免疫组化鉴定,选择CK8/18染色阳性的TECs继续培养,将FOSL1慢病毒表达载体和干扰载体分别转染传代生长良好的TECs,观察转染效率和基因转染前后TECs信号分子的表达。结果显示,FOSL1基因转染组（39.01±0.72）与空载体对照组（1.85±0.21）及空白对照组相比,FOSL1 mRNA表达显着增加,P<0.01;SOCS3（3.30±0.58）、STAT3（8.56±0.61）、BAX（10.11±0.67）和BCL2（4.31±0.97）表达也相应增加,与阴性对照组（1.01±0.66、1.39±0.55、2.18±0.89、1.63±0.11）相比有显着差异,P<0.05。FOSL1基因敲低FOSL1-sh组（0.25±0.11）与空载体组（1.10±0.08）及空白对照组相比,FOSL1 mRNA表达显着降低,P<0.01;SOCS3表达也随之降低（0.18±0.04）,与空载体组（0.89±0.14）相比有显着差异,P<0.01;但STAT3（6.33±0.96）、BAX（2.69±0.23）和BCL2（5.72±0.88）的表达仍显着高于阴性对照组（0.92±0.21、1.33±0.53、0.90±0.75）,P<0.01。收集FOSL1转染组和干扰组TECs,裂解细胞提取蛋白,western-blot结果显示,SOCS3和BCL2蛋白水平在FOSL1转染组均显着高于FOSL1干扰组,P<0.05。4.FOSL1高表达TECs促进胸腺细胞增殖通过TECs与胸腺细胞共培养,发现FOSL1高表达的TECs能促进胸腺细胞增殖,共培养24h、48h和72h的细胞增殖吸光度值0.34±0.01、0.58±0.04、0.73±0.03与对照组（0.27±0.02、0.44±0.03、0.37±0.02）相比,48h和72h共培养后胸腺细胞增殖有显着差异P<0.05;FOSL1低表达的TECs对胸腺细胞增殖无显着影响,与对照组相比,P>0.05。结论FOSL1在MG患者增生性胸腺组织高表达,通过调控TECs功能而影响胸腺细胞增殖,参与MG胸腺异常增生。
张蓬[7]（2020）在《实验性自身免疫性重症肌无力体液免疫及胸腺潜在治疗靶点研究》文中进行了进一步梳理研究背景:重症肌无力（myasthenia gravis,MG）是抗体介导的器官特异性自身免疫疾病,其特征在于抗乙酰胆碱受体（anti-acetylcholine receptor,anti-AChR）抗体与神经肌肉接头（neuromuscular junction,NMJ）的突触后膜中的乙酰胆碱受体或相关分子结合,主要临床表现为骨骼肌易疲劳和无力。MG的体液免疫发病机制包括滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells,Tfh）的异常增殖和生发中心（germinal center,GC）的形成。滤泡辅助型T（follicular helper T cells,Tfh）细胞,定义为CD4+CXCR5+ICOS+T细胞,主要作用是促进和维持生发中心（germinal center,GC）的形成并促进GC中B细胞的分化,辅助B细胞产生抗体,在体液免疫中发挥了重要的调节作用。其表面的趋化因子受体CXCR5促进Tfh细胞向GC的迁移。在MG患者中,胸腺增生与异位生发中心的形成相关,从而促进胸腺中B细胞产生抗AChR的抗体。Toll样受体9（toll-like receptor9,TLR9）在免疫系统中发挥着重要的作用,能够识别存在于病毒和原核生物基因组中的未甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸,称为CpG基序,而这些二核苷酸通常在宿主DNA中甲基化。TLR9对感染的识别不仅通过诱导树突状细胞（dendritic cells,DCs）激活幼稚T细胞而且促进GC的形成以及B细胞活化和终末分化成分泌抗体的浆细胞从而调节适应性免疫。寡脱氧核苷酸（oligodeoxynucleotide,ODN）H154是TLR9信号通路的特异性抑制剂。其作用机制是通过模仿哺乳动物DNA的免疫抑制活性并干扰下游信号传导,而非通过抑制CpG的结合或摄取。在适应性免疫中,TLR9激活后可促进树突状细胞（dendritic cells,DC）激活naive T细胞、促进生发中心形成、诱导B细胞激活和分化为分泌抗体的浆细胞。在重症肌无力的相关研究中发现,MG患者外周血中TLR9的表达显着高于健康对照组,且MG患者TLR9的mRNA表达升高,与MG的临床严重程度呈正相关,高度提示TLR9可能通过促进体液免疫参与了 MG的发病机制。胸腺对抗乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor,AChR）抗体的产生发挥了重要的作用。多项研究发现MG患者胸腺中自然调节性T细胞（natural regulatory T cells,nTreg）的数量和功能存在缺陷。nTreg在胸腺中产生,移行到外周后通过多种方式发挥免疫抑制作用诱导免疫耐受,维持免疫稳态。胸腺nTreg细胞的发育受多种因素影响。其分化主要依赖于胸腺基质细胞,包括胸腺上皮细胞（thymic epithelial cells,TEC）和胸腺树突状细胞（thymic dendritic cells,tDC）。发育中的胸腺细胞在皮质内通过皮质上皮细胞（cortical thymic epithelial cells,cTEC）进行阳性选择,随后进入髓质与髓质上皮细胞（medullary thymic epithelial cells,mTEC）或tDC接触并进行阴性选择。在胸腺髓质内通过与表达MHC II分子的细胞相互作用,在双阳性（double positive,DP）阶段分化为Treg细胞,在这个过程中开始表达Foxp3并分化成Foxp3+Treg细胞。外泌体为直径30-150nm的细胞外囊泡,功能涉及T细胞,B细胞和DC等方面,与多种自身免疫疾病相关。我们课题组前期的研究发现他汀类药物可诱导耐受性DC,此耐受性DC具有调节细胞免疫和体液免疫的作用,从而缓解实验性自身免疫性重症肌无力（experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG）大鼠的临床症状。之后,我们通过超离心的方法可分离他汀类药物诱导的耐受性DC所分泌的外泌体（statin-Dex）或DMSO处理的DC所分泌的外泌体（DMSO-Dex）,并且证明了 statin-Dex可缓解EAMG大鼠的临床症状,这种治疗作用主要是通过上调了胸腺和外周淋巴器官中Foxp3+Treg 细胞。基于以上研究背景,本论文的目的旨在寻求重症肌无力的治疗靶点。一方面我们推测TLR9信号通路异常激活诱导的体液免疫反应增强在MG的发病机制中发挥了重要的作用,然而目前未有涉及TLR9信号通路在MG中的研究。另一方面,statin-Dex诱导EAMG免疫耐受的作用虽已证实,但其促进胸腺中nTreg分化的机制尚不明确,胸腺作为重要的中枢免疫器官,在重症肌无力的发病机制中扮演了重要角色。因此,研究内容主要从两部分入手,分别探究TLR9信号通路在MG中的调节作用及statin-Dex对胸腺Treg的诱导作用及机制。研究目的一、通过应用TLR9信号通路的抑制剂来干扰EAMG大鼠模型,探索TLR9信号通路在EAMG体液免疫中的作用并寻求MG的治疗方法。二、探讨statin-Dex上调EAMG大鼠胸腺内Treg细胞的机制,从而临床重症肌无力的治疗提供新的策略。研究方法第一部分:1.EAMG大鼠模型建立及临床评分在雌性Lewis大鼠尾根部皮下注射200 μ1乳化的R-AChR97-116肽段,第30天时加强免疫一次。免疫当天记为第0天,此后每隔一天记录体重和临床评分,临床症状评估标准为:0,正常;1,活动度轻度下降,抓握力降低,声音轻微嘶哑,重复抓握后更明显;2,重复抓握前出现即出现临床症状（震颤,低头,弓背,抓握力明显减弱）;3,运动前出现严重临床症状,不能抓握,垂死状态;4,死亡。2.ODN治疗分别在免疫后的第5、12、19、26、30、37和44天,给予每组大鼠腹腔注射100μg对照 ODN 序列（5,-TCC-ATG-AGC-TTC-CTG-ATGCT-3’）,或等剂量的 TLR9 抑制剂 H154（5’-CCT-CAA-GCT-TGA-GGGG-3’）。3.制备淋巴结和脾单核细胞免疫后第46天处死大鼠,无菌条件下取大鼠腹股沟淋巴结和脾脏。制备单个核细胞（mononuclear cells,MNC）悬液并用于后续实验。制备脾脏单个核细胞悬液时,先裂解去除红细胞,后重悬单个核细胞于完全培养基中。4.体外实验将MNCs置于24孔圆底板中,用R-AChR97-116刺激后并分别加入对照ODN或H154。培养48小时后收集细胞用于流式分析。5.流式细胞术分析和细胞分选通过标准步骤染色,流式细胞分析脾脏及淋巴结Tfh细胞、GC B细胞、浆细胞的比例,及细胞内TLR9水平。如前所述制备脾脏MNC并去除T细胞,通过磁珠分选可得B细胞。经流式细胞术鉴定,分选所得B细胞的纯度>90%。6.免疫荧光取新鲜淋巴结和脾脏,液氮中迅速冷冻,保存于-80℃条件下,OCT包埋后切片。分别加入PNA,IgM,TLR9等抗体。荧光显微镜下观察生发中心和TLR9的表达。7.ELISA免疫后第46天取心脏血,离心得血清。使用ELISA方法检测血清中抗R-AChR97-116抗体水平。收集疾病不同时间点（免疫后第16、26、36和46天）的血清,检测抗R-AChR97-116 肽段的 IgG 抗体。8.统计分析使用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。使用具有95%置信区间的双侧未配对Student’s t检验或非参数Mann-Whitney检验来计算P值。误差线代表标准差（SD）。第二部分:1.EAMG模型的建立及外泌体治疗使用含有结核杆菌的完全弗氏佐剂乳化AChR 97-116肽段,在大鼠尾根部皮下注射诱导EAMG模型。雌性Lewis大鼠分成三组。一组注射PBS作为对照,另外两组分别注射DMSO或他汀类药物处理的BMDCs分泌的外泌体。分别在免疫后第5天,第10天和第15天给予外泌体治疗。免疫后第20天处死大鼠。2.骨髓树突状细胞的培养和外泌体的分离取6-8周龄的Lewis大鼠胫骨和股骨,冲洗骨髓腔并过滤。裂解红细胞后,重悬于含有重组大鼠（rr）GM-CSF和rrIL-4的培养基中。孵育72小时后,轻轻除去非贴壁细胞,进一步培养贴壁细胞。在第7天,收获漂浮细胞和松散粘附的细胞,加入二甲基亚砜（dimethylsulfoxide,DMSO）或溶于DMSO中的阿托伐他汀培养48小时后,收集上清液用于分离外泌体。将上清液2,000g离心10分钟后,再以10,000g离心30分钟,除去细胞和碎片。然后将得到的上清液以100,000g离心70分钟。PBS重悬外泌体,再次以100,000g离心70分钟洗一次。用无菌PBS重悬所得外泌体,通过分光光度计定量。储存在-20℃备用。3.外泌体的鉴定将碳支持膜的电镜铜网浸没于含2%多聚甲醛的外泌体悬浮液中过夜。转移至含2%磷钨酸的管中浸没5分钟,室温下风干1分钟。透射电镜下观察（电压80kV）。通过动态光散射仪（DLS）测量外泌体直径。将外泌体（1μg）重悬于pH7.4的1mL无菌PBS中。通过DLS Nano sizer分析颗粒的尺寸。4.胸腺中的跟踪分析红色荧光染料PKH26标记外泌体,静脉注射到EAMG大鼠体内。3天后,取大鼠胸腺,荧光显微镜下观察胸腺内外泌体的分布。5.胸腺基质细胞的制备取新鲜胸腺组织,剔除脂肪和结缔组织,在70-μm过滤器上研磨胸腺组织。网下部分即为胸腺细胞。网上部分通过酶消化可得胸腺基质细胞。对胸腺细胞和胸腺基质细胞分别进行计数。6.体外Treg细胞诱导实验将胸腺细胞分别与外泌体和TEC、外泌体和BMDCs或仅与外泌体一起培养。胸腺基质细胞消化后,使用CD45抗体标记并通过流式分选可得CD45-细胞。将胸腺细胞和BMDC或CD45-基质细胞与外泌体共培养。2天后收集细胞并通过流式分析CD4+Foxp3+T细胞的比例。7.FACSOX62 阳性细胞为 tDC,CD45-APA+为 cTEC,CD45-UEA1+为 mTEC。胸腺细胞中加入CD4、CD8和CD25抗体染色,固定破膜后中加入抗Foxp3的抗体检测Treg细胞比例。8.免疫荧光对胸腺组织进行免疫荧光测定。样品中加入抗Aire的抗体。使用盲法粗略观察荧光显微镜下Aire的表达。9.Western使用抗Aire和抗GADPH抗体作一抗;辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠或山羊抗兔作为二抗。用Image J软件对条带进行定量计算。10.统计学分析使用GraphPad Prism 7.0进行统计学检验。单因素方差分析检测对照组和实验组之间的差异,Bonferroni检验作为事后检验。P<0.05认为具有统计学意义。研究结果第一部分:1.阻断TLR9信号通路缓解EAMG大鼠的临床症状在免疫后第34天至第46天,H154组大鼠的平均临床评分低于对照ODN组的大鼠,但两组大鼠临床症状出现的时间相同（均为免疫后第34天）。在疾病高峰期,H154组大鼠的平均临床评分为0.7±0.27,对照组为1.58±0.20。两组之间的临床评分差异在免疫后第36、38、42、44和46天具有统计学意义。2.阻断TLR9信号通路抑制EAMG大鼠体内的抗体产生与对照组相比,H154组的大鼠体内IgG（*p<0.05）、IgG2a（*p<0.05）和IgG2b水平均降低（p=0.62）。此外,随着疾病的进展,EAMG大鼠血清中IgG抗体水平持续增加,尤其是强化免疫后,说明本实验中的EAMG动物模型可模拟临床疾病。3.抑制性ODN序列H154可降低脾脏中的Tfh细胞和生发中心B细胞比例H154可抑制脾脏中CD4+T细胞中Tfh细胞的比例。通过流式检测发现H154组大鼠的脾脏生发中心中B细的比例明显低于对照组。我们进一步通过免疫荧光证实了与对照组相比,H154组大鼠的生发中心减少。然而,两组之间的浆细胞比例无明显差异。以上结果说明阻断TLR9信号通路可抑制EAMG大鼠脾脏中的体液免疫反应。4.H154降低了 EAMG大鼠淋巴结中的Tfh 比例与对照组相比,H154组大鼠淋巴结内仅Tfh水平降低,体液免疫中的其他指标无明显差异。5.H154降低了脾脏细胞中B细胞和DC的比例。研究发现,与对照组相比,应用H154阻断TLR9信号通路降低了 EAMG大鼠脾脏中B细胞和DC的比例,这可能是导致Tfh降低的原因。6.体内和体外实验均证实,H154可下调脾脏中TLR9+B细胞比例及B细胞表面TLR9的表达,且体外实验中H154可改变脾脏B细胞的表型。与对照组相比,H154组大鼠脾脏MNCs中TLR9+B细胞比例降低,B细胞表面TLR9表达降低（**p<0.01）。淋巴结中未发现明显改变（数据未显示）。免疫荧光结果显示TLR9表达于淋巴结中的B细胞区。体外实验中提取脾脏B细胞,加对照ODN或H154处理后,H154处理后的脾脏B细胞内TLR9表达水平以及平均荧光强度（MFI）均下降,与体内的结果一致。进一步从脾脏MNC中分选B220+B细胞并加入对照ODN或H154处理,通过流式细胞术分析B细胞内TLR9和表面MHCII的表达。H154可降低B细胞内TLR9和表面MHCII的水平,说明H154可直接抑制TLR9的表达,并影响B细胞的活化。第二部分:1.外泌体鉴定DMSO-Dex和statin-Dex的颗粒直径主要分布在70-140nm范围内。电子显微镜下可观察到外泌体的完整形态,直径约100nm。通过Western方法检测TSG101（一种成熟的外泌体标记物）,可观察到两组外泌体均表达TSG101,大小为49kDa。2.外泌体主要分布于胸腺内皮质及皮髓质交界处外泌体主要位于胸腺内皮质以及皮质和髓质之间的交界处。DMSO-Dex组和statin-Dex组之间的分布无明显差异。此外,可观察到外泌体被角蛋白阳性的胸腺上皮细胞吞噬。3.statin-Dex上调了胸腺细胞中Foxp3的表达三个实验组胸腺CD4+CD8-CD25+Treg细胞比例无统计学差异。与PBS处理的对照组相比,statin-Dex组胸腺CD4+CD8-细胞中Foxp3+Treg细胞的比例升高。4.三组胸腺基质细胞表面MHC Ⅱ和B7分子表达无明显差异。三组胸腺基质细胞表面MHC Ⅱ和B7分子表达无明显差异,提示MHC Ⅱ和B7分子可能不参与外泌体升高Foxp3+Treg细胞的机制。5.外泌体可上调胸腺mTEC和tDC表面CD40的表达。与对照组相比,DMSO-Dex和statin-Dex均上调mTEC和tDC表面CD40的表达,但胸腺cTEC表面的CD40表达无差异。6.statin-Dex可上调胸腺髓质中Aire的表达。免疫荧光结果显示,与对照组和DMSO-Dex组相比,statin-Dex组胸腺髓质上皮细胞中Aire的表达明显增加。Western检测结果定量分析进一步说明,与对照组和DMSO-Dex 组相比,statin-Dex 组胸腺组织中 Aire 表达增加。7.体外实验证实,外泌体通过TEC促进胸腺细胞向Foxp3+Treg方向分化。在胸腺细胞培养体系中分别加入DMSO-Dex,statin-Dex或PBS,48小时后三组中Foxp3+Treg细胞的比例无明显差异,提示外泌体不能直接诱导胸腺中Foxp3+Treg细胞的分化。将BMDCs和胸腺细胞共培养,并分别加入DMSO-Dex,statin-Dex或PBS。48小时后三组中Foxp3+Treg细胞的比例无明显差异,提示外泌体不能通过DC促进Foxp3+Treg细胞的分化。分离CD45-细胞（主要是TEC）与胸腺细胞共培养,并分别加入DMSO-Dex,statin-Dex或PBS。48小时后检测发现,与对照组相比,DMSO-Dex和statin-Dex组中Foxp3+Treg占CD4+胸腺细胞的比例及CD4+Foxp3+Treg占总胸腺细胞的比例均增加。因此,外泌体增加胸腺细胞中Foxp3+Treg的作用主要是由TEC介导的。结论:一、TLR9通路在EAMG的发病机制中发挥重要作用。应用抑制性ODN序列H154阻断TLR9通路可下调EAMG大鼠Tfh细胞和生发中心B细胞比例,从而减少抗AChR抗体产生和抗体类别转换,并最终缓解重症肌无力临床表现。二、statin-Dex可上调胸腺内Foxp3+Treg的比例。statin-Dex和DMSO-Dex均可升高胸腺基质细胞CD40的表达,但只有statin-Dex可增加mTEC内的Aire表达。statin-Dex和DMSO-Dex在体外诱导Foxp3+Treg细胞分化的作用依赖于上皮细胞。
厉辛野[8]（2018）在《探究树突状细胞自噬在胸腺瘤合并MG组织及Thy0517共培养下的表达作用》文中提出背景:胸腺瘤是最常见的前纵隔肿瘤,常合并重症肌无力（myasthenia gravis,MG）、系统性红斑狼疮、干燥综合征等多种自身免疫疾病。MG是乙酰胆碱受体抗体介导的,细胞免疫依赖及补体参与的神经-肌肉接头处传递障碍的自身免疫性疾病,约35-70%胸腺瘤患者伴有MG并且15%的MG患者伴有胸腺瘤。树突状细胞（Dendritic Cells,DCs）是目前所知的功能最强的抗原提呈细胞,DCs的数量与许多肿瘤的发生发展中的免疫机制密切相关。在重症肌无力患者与单纯胸腺瘤或者正常人群对比中,同样发现了DCs的减少,而且在重症肌无力患者进行胸腺切除手术以后,术后的DCs数量也较术前增加。因此DCs可能在重症肌无力的发生以及胸腺免疫功能中起到重要的调控作用。自噬是一种存在于真核生物中具有高度保守性的由Atg12基因参与的生理活动,研究发现自噬相关基因在胸腺瘤合并重症肌无力的肿瘤组织及外周血中较单纯胸腺瘤表达增高。因此认为胸腺瘤中DCs的自噬可能与重症肌无力的发生相关。目的:一、探究单纯胸腺瘤与胸腺瘤合并MG组织中DC的自噬表达水平。二、通过体外诱导分化不同成熟状态的DCs,并和胸腺瘤细胞系共培养,探究不同成熟状态DCs的自噬表达和胸腺瘤细胞系对于树突状细胞的自噬表达影响。方法:一、选取天津医科大学总医院心胸外科2015.9.1—2016.12.30手术切除的单纯胸腺瘤（T组,20例）与胸腺瘤合并MG（T/MG组,30例）组织标本50例,免疫组织化学法检测其中Atg12、Beclin1、p62、LC3B蛋白表达情况,免疫磁珠分选（Magnetic-activated cell sorting,MACS）分离单纯胸腺瘤与胸腺瘤合并MG组织中的CD11c+DCs,流式细胞仪检测细胞纯度,Real-time PCR和Western-blot检测DCs中Atg12、Beclin1、p62、LC3B的mRNA及蛋白表达水平。二、Ficoll分离液分离10例人脐血单个核细胞,MACS分离CD34+细胞,在含5%FBS、1%青链霉素、GM-CSF、IL-4的RMPI1640的培养条件下刺激诱导分化DCs,培养第6日收集一半未成熟树突状细胞（iDCs）,同时在另一半加入TNF-α培养24h后收集成熟树突状细胞（mDCs）,通过MACS检测DCs纯度,取一半iDCs和mDCs与胸腺瘤细胞系Thy0517共培养,分别将DCs接种于Transwell上室,Thy0517接种于下室,共培养3天后收集所有细胞,Western-blot和Real-time PCR检测所有DCs中Atg12、Beclin1的mRNA以及蛋白表达水平。结果:一、在50例单纯胸腺瘤与胸腺瘤合并MG组织标本中,T组和T/MG组在性别、年龄、BMI指数、病理分型等方面差异均无统计学意义（P<0.05）;免疫组织化学结果表示:Atg12、Beclin1、LC3B在胸腺瘤合并MG（T/MG组）中的阳性表达率分别为73.3%（21/30）、70%（21/30）、63.3%（19/30）,高于在单纯胸腺瘤（T组）中的阳性表达率分别为30%（6/20）、40%（8/20）、25%（5/20）,差异均有统计学意义（P<0.05）;p62在单纯胸腺瘤（T组）和胸腺瘤合并MG（T/MG组）分别65%（13/20）和40%（12/30）,差异无统计学意义（P>0.05）;经MACS分离CD11c+DCs纯度达99%,Real-time PCR结果表示比较于T组,T/MG组织分离的DCs中Atg12、Beclin1、LC3B的mRNA表达升高,p62表达降低（P<0.05）;Western-blot结果提示T/MG组织分离的DCs较T组Atg12、LC3B、Beclin1蛋白表达升高,p62蛋白表达降低,差异有统计学意义（P<0.05）。二、诱导分化后的iDCs、mDCs经MACS分离CD11c+DCs后纯度接近99%,经Thy0517共培养后,Western-blot结果表示mDCs比较于iDCs、T-mDCs比较于T-iDCs的自噬相关蛋白Atg12、Beclin1的相对表达含量均明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;同时,在单纯诱导分化和Thy0517共培养后的iDCs和mDCs中,T-iDCs比较于iDCs、T-mDCs比较于mDCs的的自噬相关蛋白Atg12、Beclin1的相对表达含量均明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;Real-time PCR结果同样表示mDCs和T-mDCs分别较iDCs和T-iDCs的Atg12、Beclin1mRNA表达升高,且T-iDCs和T-mDCs分别较iDCs和mDCs的Atg12、Beclin1mRNA表达同样升高,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:1、胸腺瘤合并MG较单纯胸腺瘤在组织中的自噬水平明显升高,且通过高纯度分离DCs后,在DCs中的自噬表达结果与组织中相一致,说明胸腺瘤自噬尤其是组织中DCs的自噬增加与胸腺瘤合并重症肌无力的发生有一定关系。2、通过体外诱导分化的mDCs较iDCs的自噬表达增加,且与胸腺瘤细胞系共培养后,T-mDCs的自噬表达依旧高于T-iDCs,表明刺激树突状细胞成熟可能是树突状细胞自噬水平升高的主要因素。3、mDCs和iDCs在通过与胸腺瘤细胞系共培养后自噬表达均升高,因此胸腺瘤细胞共培养可以引起树突状细胞自噬增加,并可能是重症肌无力发生的相关机制之一。
庞琳[9]（2018）在《白芍总苷在重症肌无力中的抗炎及免疫调节作用》文中研究指明研究背景及目的重症肌无力（Myasthenia gravis,MG）是一种依附于T细胞,补体参与,和抗烟碱型乙酰胆碱受体抗体传送的,针对神经肌肉接头处突触后膜上乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor,AChR）持续性伤害破坏的一种自身免疫性疾病[1,2]。该病的发生已8-20/10万为高,并有逐年增加的趋势。临床主要特征是局部或全身横纹肌于活动时易于疲劳无力。主要累及眼外肌、四肢、延髓诸肌肉,严重时出现呼吸肌无力（重症肌无力危象）,常危及生命。EAMG（Experimental autoimmune myasthenia gravis）与人类MG有不少近似之处,尤其是在临床特征、电生理变化、机体调节机制及病理病生方面有不少近似之处,近期国内外研究均证实Lewis重症肌无力大鼠模型可用以研究MG的信号传导通路及新型免疫抑制剂的开发。目前MG的临床治疗方法主要包括:抗胆碱脂酶类药物、糖皮质激素、静脉用免疫球蛋白、胸腺切除术和血浆替换疗法等。这些方法虽然对疾病有效,但常不能完全控制疾病,且花费巨大,副作用较大。所以,若能研发出获取方便、价格低廉、毒副作用小的免疫抑制剂治疗MG,将会造福广大患者,带来巨大的社会效益和产业前景。白芍是芍药（paeonialactif lora）的干燥根,芍药是毛科植物中较典型的一种。其在类风湿关节炎、滑膜行关节炎、SLE等自身免疫性疾病中发挥的作用日益加重,已成功吸引国内外临床医学及制药业的高度重视。其作用物质已被成功获得,关键是一组糖苷类物质,统称为白芍总苷（total glucosidesof peony,TGP）,它被称为总glucosidesof（TGP）,牡丹和芍药苷的含量,这是牡丹的一个重要组成部分,超过对白芍总苷的总甙90%[4]。近期来自于国内外研究进一步证实,TGP同其它免疫抑制剂一样,存在较有效的对抗炎症、免疫调节及较好的抵制氧化功能[5-7],Jing Li等利用实验性动脉硬化动物模型研究发现TGP及TNFα、IL-6等炎性分子水平[8],Ming Zhao等发现TGP通过增加狼疮患者CD4+细胞中的FOXP3去甲基化,进而上调CD4+CD25+T细胞数量[9]。TGP可有效治疗SLE（systemic lupus erythematosus）的相关报道已经发布,持续服用TGP 5年以上者,明显减少糖皮质激素及甲氨蝶呤等的应用水平[10]。目前国内外尚没有TGP治疗MG及EAMG的报道,综上所述,TGP抗炎作用确切,而且TGP胶囊1998年被中国国家食品药品监督管理局批准为治疗类风湿关节炎（rheumat-oid arthritis,RA）的抗炎及免疫调节类药物（批号:x-456）,其在RA治疗的临床应用已较成熟,安全性高,若能应用于MG治疗,将比其他免疫抑制剂更胜一筹。1材料1.1试验:是6-8周龄雌性Lewis大鼠选用体重约140-160g。1.2主要抗原:乙酰胆碱受体α亚基97-116。2实验方法2.1 EAMG模型的诱导和临床评分第一次免疫:给予大鼠相应抗原进行第一次免疫。各组大鼠200ul抗原乳剂（含50克r97-116肽、2毫克结核分枝杆菌,不完全弗式佐剂）自尾根慢慢注入到皮下组织,形成皮丘,无抗原乳液外溢。该过程应在大鼠饲养第7天进行（普通条件下）,可有效减少大鼠死亡率。记第一次免疫当天为第0天。免疫后第30 d继续上述免疫一次,也称加强免疫,注意仔细操作,避免大鼠尾根部溃烂。采用双盲法每天记录大鼠的体重和准确评分。用Lennon标准评价各组大鼠肌肉强度的变化。2.2白芍总苷治疗EAMG将18只Lewis大鼠随机分成白芍总苷大剂量组（150mg/Kg.d）、白芍总苷小剂量组治疗组（50mg/Kg.d）和对照组（等体积的溶剂CMC-Na）。于EAMG大鼠发病初期开始每日给予白芍总苷灌胃治疗,直至大鼠发病高峰期第54 d。2.3流式细胞仪检测大鼠淋巴结中Foxp3、IFN-γ、IL-4的表达在实验室超洁净工作台迅速分离腹股沟淋巴结,并立即选择相应的细胞滤器和培养皿,充分切除淋巴结,尽可能多地准备淋巴结单核细胞悬液。经离心、洗涤、破膜、染色、再洗涤、再离心等处理后,使用流失细胞仪检测淋巴细胞中膈细胞因子的含量。2.4 CCK-8细胞增殖实验分为R97-116刺激组和对照组。细胞培养64 h后,吸取每孔细胞培养上清液,-20℃保存,择日检测细胞因子,继而每孔加入10 L CCK-8,4 h后酶标仪测定其光密度值（OD值）。2.5 ELISA检测大鼠血清抗R97-116抗体大鼠饲养第54天,即大鼠重症肌无力发病高峰期,麻醉后解剖大鼠,注射器抽取心脏血2-3ml,ELISA法测血清中抗R97-116抗体的含量。3数据处理与统计学分析采用spass 20.0统计软件分析,对两组标本进行独立样本t检验,p<0.05具有统计学意义。结果表达为均值±标准差。结果:1)TGP干预后,观察EAMG发病情况,看有无缓解。2)TGP干预后,检测Th1/Th2/Th17型等成分在EAMG治疗组及对照组中的变化情况。3)TGP干预后,检测EAMG淋巴结FOXP3的表达情况。4)TGP干预后,检测EAMG的淋巴细胞增生活性。5)TGP干预后,检测EAMG的淋巴细胞的凋亡。6)TGP干预后,检测EAMG淋巴细胞各亚群的比例,尤其是调节性T细胞（Treg）,看对EAMG有无免疫调节作用。7)TGP干预后,检测体外EAMG淋巴细胞培养液上清中Th1/Th2/Th17细胞因子。8)TGP干预后,检测EAMG淋巴结单个核细胞IL-4、IFN-γ型细胞因子表达情况。结论:1白芍总苷能改善EAMG大鼠临床症状,延缓病情进展。2白芍总苷下调EAMG大鼠淋巴结IFN-γ的表达。3白芍总苷对细胞增殖实验的影响。4白芍总苷可有效上调细胞因子IL-4的表达。5白芍总苷降低EAMG大鼠血清抗R97-116抗体水平。6白芍总苷可提高Treg的比例,对免疫调节有重要作用。7白芍总苷使EAMG机体产生Th1/Th2/Th17细胞因子,介入机体免疫调节。白芍总苷通过上调调节性T细胞（Treg）和Th2型细胞因子IL-4,及下调其他相关炎症因子如IFN-γ等,降低血清中抗R97-116抗体水平,使EAMG临床症状得到改善,延缓病情进展。
马永磊[10]（2018）在《Fk506修饰的DCs对EAMG大鼠的影响及机制的探讨》文中研究指明目的:重症肌无力（myasthenia gravis,MG）是由乙酰胆碱受体抗体引起,T细胞、B细胞依赖的补体参与的自身免疫性疾病。实验性自身免疫性重症肌无力（experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG）是目前最理想的人类重症肌无力模型。树突状细胞（dendritic cell,DC）能提呈抗原,能最大效能活化原始CD4+T细胞。树突状细胞有成熟和未成熟两种状态,未成熟状态能诱导免疫耐受或者延迟免疫应答。免疫抑制剂他克莫司多用于器官移植后的免疫排斥反应,可以影响树突状细胞的成熟状态。RelB是一种转录调控因子,RelB基因敲除的小鼠,在脾脏及胸腺的生发中心、边缘区和髓质区缺少树突状细胞结构。本研究的主要目的:利用人工合成大鼠来源的乙酰胆碱受体抗原肽构建大鼠EAMG模型。在体外用Fk506诱导大鼠髓源性树突状细胞生成耐受性DCs,进而治疗大鼠EAMG。探讨MG与RelB表达的相关性。期望能够为重症肌无力的治疗及诊断提供一个新的途径。方法:1、耐受性树突状细胞的制备及鉴定:利用大鼠骨髓制备细胞悬液,分别与终浓度为0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的Fk506共培养,6天后,流式检测各浓度下树突状细胞表面共刺激分子CD80、CD86、MHC-II的表达情况。剩下的细胞培养至第10天,收获前18h部分细胞加入LPS,流式检测。2、构建EAMG大鼠模型:在Lewis大鼠双肩及背部脊柱两侧各处皮下注射乳化完全的抗原50ul,共计200ul（PBS 100ul,TB 1mg,CFA 100ul,Ag 100ug）,记为0天。分别于第9天和第26天,在相同位置相同剂量二次、三次加强免疫,共计200ul（PBS 100ul,IFA 100ul,Ag 100ug）。每天观察大鼠临床表现,做肌力检测,每日或隔日称量体重。3、动物分组:动物分为四组,分别为他克莫司修饰的DCs组、未经他克莫司修饰的DCs组、他克莫司组、PBS对照组。在初次免疫后第8天和17天腹腔注射相应的DCs（2×106个/只）。初次免疫10天后,对照组大鼠每日或隔日给与腹腔注射PBS 200ul,Fk506组大鼠每日或隔日给与腹腔注射Fk506溶液1mg/kg.次。观察每组大鼠并隔日称量体重,记录临床症状。4、淋巴结细胞悬液制备:无菌取下大鼠腹主动脉旁、下颌下及腋窝淋巴结淋巴结,经研磨后制备悬液并计数。5、细胞增殖实验:96孔板中,每孔加入4×105个淋巴结细胞,设置R97-116组和PBS组。培养40h,加入10ulCCK-8,避光培养4h后,450nm测OD值。6、检测细胞周期:24孔板中加入淋巴结细胞悬液,分为R97-116组和PBS组,培养40和60h后收集细胞,逐滴加入-20℃预冷的乙醇中,4℃过夜。洗涤后加入PI染液,在4℃环境下避光30min,上机流式检测。7、流式检测大鼠外周血中DCs表面共刺激分子的表达:留取各组大鼠外周血300ul,加入荧光标记抗体,避光30min,裂解红细胞,洗涤后流式检测。8、ELISA检测大鼠外周血血浆中R97-116抗体含量:留取各组大鼠腹主动脉血浆,ELISA检测其R97-116抗体水平。9、RT-PCR检测各组EAMG大鼠及MG患者外周血中RelB mRNA的水平。结果:1、流式检测结果表明,Fk506浓度为10ng/ml时培养出的DCs表面共刺激分子CD80、CD86、MHC-II的表达水平与其他各浓度比最低（P<0.05）;培养6天的DCs比10天的低表达表面共刺激分子,有统计学差异。2、经抗原免疫的大鼠外周血中AChR抗体水平比正常对照组高,imDCs治疗组和Fk506治疗组比PBS对照组和mDCs治疗组抗体低,具有统计学意义（P<0.05）。imDCs治疗组和Fk506治疗组大鼠的临床评分和另外两组比明显降低,从第22天开始有显着差异,大鼠体重也有不同程度升高。3、淋巴细胞增殖实验结果显示,在抗原肽刺激下imDCs治疗组和Fk506治疗组OD值和PBS对照组和mDCs治疗组比降低,具有显着性差异。细胞周期结果表明,培养40和60h后,imDCs治疗组和Fk506治疗组S期和G2/M细胞数量少,和其他组比具有统计学意义（P<0.05）。4、大鼠外周血DCs检测结果表明,imDCs治疗组大鼠外周血DCs高表达CD86分子,与其他组比具有显着性差异。5、RT-PCR结果显示,大鼠EAMG组外周血中RelB mRNA表达水平与正常对照组比显着升高;imDCs治疗组和Fk506治疗组与PBS对照组和mDCs治疗组比,外周血中RelB mRNA表达水平下调,具有统计学意义。临床MG患者和正常体检者比,外周血中RelB mRNA表达水平同样上调,具有显着性差异。结论:1、Fk506能够在体外诱导大鼠髓源性DCs生成耐受性DCs。10ng/ml为最适诱导浓度,并且培养6天即能收获耐受性DCs。2、利用人工合成的鼠源性R97-116肽段能够成功造出大鼠EAMG模型。3、他克莫司修饰的DCs和Fk506均能降低重症肌无力大鼠的临床评分,增加一定体重,缓解临床症状。4、他克莫司修饰的DCs和Fk506能诱导EAMG大鼠免疫耐受与降低大鼠血清抗乙酰胆碱受体抗体、抑制淋巴细胞增殖、下调RelB mRNA的表达水平有关。5、造模成功的EAMG大鼠和临床MG患者外周血中的RelB mRNA表达水平升高,这说明重症肌无力的发生与RelB的表达密切相关。
二、人重症肌无力胸腺树突状细胞的分离和培养（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人重症肌无力胸腺树突状细胞的分离和培养（论文提纲范文）
（1）小鼠胸腺和脾脏增龄性变化的转录组和蛋白组学研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 不同年龄组小鼠免疫器官组织学变化研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器及器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 样本采集 |
| 1.2.2 石蜡切片制备与HE染色 |
| 1.2.3 免疫组化 |
| 1.2.4 电镜检测 |
| 1.2.5 ELISA检测 |
| 1.2.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 免疫器官重量及指数变化 |
| 2.2 免疫器官组织学变化 |
| 2.2.1 胸腺 |
| 2.2.1.1 HE染色 |
| 2.2.1.2 免疫组化 |
| 2.2.1.3 超微结构观察 |
| 2.2.2 脾脏 |
| 2.2.2.1 HE染色 |
| 2.2.2.2 免疫组化 |
| 2.2.2.3 超微结构观察 |
| 2.3 细胞因子检测 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 基于RNA-seq转录组和 TMT 蛋白组技术研究不同年龄组小鼠胸腺组织差异表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验样本 |
| 1.1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器及器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 转录组测序 |
| 1.2.2 TMT蛋白质组学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 胸腺转录组分析 |
| 2.1.1 转录测序数据分析 |
| 2.1.2 基因表达分析 |
| 2.1.3 生物信息学分析 |
| 2.1.4 差异表达基因验证 |
| 2.2 胸腺蛋白质组分析 |
| 2.2.1 差异表达蛋白筛选 |
| 2.2.2 生物信息学分析 |
| 2.3 差异表达蛋白验证 |
| 2.4 转录组学与蛋白质组学关联性分析 |
| 3.讨论 |
| 第三部分 基于RNA-seq转录组和 TMT 蛋白组技术研究不同年龄组小鼠脾脏组织差异表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验样本 |
| 1.1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器及器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 转录组测序 |
| 1.2.2 TMT蛋白质组学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同年龄组脾脏转录组分析 |
| 2.1.1 转录测序数据及质量 |
| 2.1.2 基因表达分析 |
| 2.1.3 生物信息学分析 |
| 2.1.4 差异表达基因验证 |
| 2.2 脾脏蛋白质组分析 |
| 2.2.1 差异表达蛋白筛选 |
| 2.2.2 物信息学分析 |
| 2.3 验证差异表达蛋白 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 文献综述 胸腺增龄性变化以及与疾病相关性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间学术成果 |
| 附录 |
（2）调节性B细胞亚群在胸腺瘤患者中的表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 综述 胸腺上皮肿瘤发病机制的研究进展 |
| 2.1 胸腺上皮肿瘤的相关免疫学因素 |
| 2.1.1 天然免疫与胸腺上皮肿瘤相关研究 |
| 2.1.2 适应性免疫与胸腺上皮肿瘤相关研究 |
| 2.2 胸腺上皮肿瘤的相关遗传及环境影响因素 |
| 2.3 小结与展望 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 研究对象 |
| 3.1.1 胸腺瘤患者 |
| 3.1.2 对照组 |
| 3.2 标本采集与处理 |
| 3.3 主要试剂和仪器 |
| 3.3.1 主要仪器 |
| 3.3.2 主要试剂 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 外周血单个核细胞的提取 |
| 3.4.2 细胞计数 |
| 3.4.3 诱导细胞因子的表达 |
| 3.4.4 流式细胞仪检测外周血Breg细胞亚群 |
| 3.4.5 微量样本多指标流式蛋白定量技术(CBA)检测血清IL-10 |
| 3.4.6 统计学处理方法 |
| 第4章 胸腺瘤患者外周血中Breg细胞亚群的检测及其临床意义 |
| 4.1 胸腺瘤患者的一般信息和临床特征 |
| 4.2 胸腺瘤患者外周血中IL-10~+B细胞的频率 |
| 4.3 胸腺瘤患者外周血中IL-#10~+B细胞亚群的频率以及血清IL10的水平 |
| 4.4 胸腺瘤患者外周血中IL-10~+B细胞亚群频率、血清IL-10水平与临床参数的相关性分析 |
| 4.5 胸腔镜下纵隔肿瘤切除术治疗前后胸腺瘤患者外周血中IL-10~+B细胞亚群频率以及血清IL-10水平的变化 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）自然杀伤细胞及其亚型在实验性自身免疫性重症肌无力中的免疫调节作用（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.附图 |
| 7.参考文献 |
| 论文Ⅱ |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.附图 |
| 7.参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的论文成果 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（4）TSP-1+tMSCs及其exosomes对巨噬细胞及CD4+T细胞分化的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstrat |
| 中英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试剂配制 |
| 2.2.2 正常胸腺以及各种胸腺病理组织中TSP-1的免疫组织化学染色 |
| 2.2.3 胸腺中MSC的鉴定 |
| 2.2.4 LPS对tMSC中TSP-1表达的检测 |
| 2.2.5 TSP-1干扰慢病毒载体的制备 |
| 2.2.6 TSP-1干扰慢病毒感染tMSC |
| 2.2.7 qRT-PCR、WB检测TSP-1的mRNA表达 |
| 2.2.8 巨噬细胞的诱导、培养与鉴定 |
| 2.2.9 tMSCs的外泌体的提取、鉴定与功能实验 |
| 2.2.10 外泌体与M0共培养 |
| 2.2.11 qRT-PCR检测IL-6、IL-1β、TNF-α等mRNA表达 |
| 2.2.12 流式细胞术检测炎症因子表达 |
| 2.2.13 不同来源的外泌体与CD4+T细胞共培养 |
| 2.2.14 流式细胞术检测CD4+T细胞的分化指标与炎症因子分泌指标 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 MG胸腺组织中TSP-1的表达与分布 |
| 3.2 胸腺MSC的鉴定 |
| 3.3 LPS促进tMSC TSP-1的表达 |
| 3.4 TSP-1干扰慢病毒感染tMSC结果 |
| 3.4.1 TSP-1干扰载体sh1、sh2的构建与慢病毒的包装 |
| 3.4.2 TSP-1干扰慢病毒感染tMSC |
| 3.4.3 TSP-1在tMSC中的mRNA、蛋白表达 |
| 3.5 tMSC外泌体的鉴定与TSP-1的表达 |
| 3.5.1 tMSC外泌体的鉴定 |
| 3.5.2 tMSC外泌体中TSP-1的表达 |
| 3.6 携带TSP-1的外泌体对巨噬细胞活化的影响 |
| 3.6.1 巨噬细胞的诱导与极化 |
| 3.6.2 巨噬细胞吞噬外泌体 |
| 3.6.3 巨噬细胞与外泌体共培养后表面蛋白的表达 |
| 3.6.4 外泌体对巨噬细胞分泌炎症因子的影响 |
| 3.7 携带TSP-1的外泌体对CD4+T细胞分化的影响 |
| 3.7.1 CD4+T细胞的分选与鉴定 |
| 3.7.2 CD4+T细胞与外泌体共培养后T细胞增殖的检测 |
| 3.7.3 CD4+T细胞与外泌体共培养后Th1、Th17、Treg细胞的检测 |
| 3.7.4 CD4+T细胞与外泌体共培养后分泌的炎症因子的表达结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 携带TSP-1的外泌体促进巨噬细胞向M1的极化,从而改变胸腺炎症微环境 |
| 4.2 携带TSP-1的外泌体影响CD4+T细胞的增殖与分化 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 TSP-1的免疫调控作用以及在炎症中的多种功能 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）探究Atg12介导的树突状细胞自噬在胸腺瘤合并重症肌无力中的免疫调控作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、胸腺瘤上调Atg12介导的树突状细胞自噬促进重症肌无力发生的体外研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验细胞系 |
| 1.1.2 实验材料 |
| 1.1.3 多色免疫荧光检测树突状细胞自噬水平 |
| 1.1.4 Thy0517贴壁细胞的培养 |
| 1.1.5 THP-1悬浮细胞的培养 |
| 1.1.6 树突状细胞的刺激分化、培养与鉴定 |
| 1.1.7 大肠杆菌的培养和储存 |
| 1.1.8 pcDNA3.1(+)质粒的提取 |
| 1.1.9 细胞RNA提取及逆转录 |
| 1.1.10 Atg12基因克隆质粒的构建 |
| 1.1.11 细胞转染 |
| 1.1.12 Thy0517细胞与树突状细胞的Transwell共培养 |
| 1.1.13 rt-PCR检测细胞自噬基因表达水平 |
| 1.1.14 蛋白提取与浓度测定 |
| 1.1.15 免疫蛋白印迹实验检测细胞自噬水平改变 |
| 1.1.16 统计及作图工具 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 多色免疫荧光检测树突状细胞的Atg12在两组胸腺瘤组织中的表达情况 |
| 1.2.2 树突状细胞培养与鉴定 |
| 1.2.3 Atg12基因克隆质粒的构建与鉴定 |
| 1.2.4 在Thy0517细胞中改变Atg12的表达后细胞自噬的变化 |
| 1.2.5 Atg12介导的Thy0517自噬水平改变对其共培养环境中的树突状细胞自噬产生的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、KITLG在胸腺瘤中通过MAPK通路促进Atg12介导的自噬的体外研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验细胞系 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 生物信息学分析 |
| 2.1.4 MACS磁珠分选胸腺瘤细胞用于基因测序 |
| 2.1.5 免疫组化检测各型胸腺瘤细胞KITLG表达水平 |
| 2.1.6 细胞转染 |
| 2.1.7 rt-PCR检测细胞KITLG及MAPK通路表达水平 |
| 2.1.8 免疫蛋白印迹实验检测细胞KITLG及MAPK通路表达水平 |
| 2.1.9 统计及作图工具 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 TCGA-THYM与GEO--GSE29695数据集的分析与挖掘 |
| 2.2.2 免疫组化观察KITLG在胸腺瘤中的表达情况 |
| 2.2.3 在Thy0517细胞中改变KITLG的表达对MAPK通路的影响 |
| 2.2.4 在胸腺瘤细胞中调控KITLG的表达对Atg12及细胞自噬水平的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、Atg12介导的树突状细胞自噬与重症肌无力发生的体内研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 动物实验环境 |
| 3.1.3 实验材料 |
| 3.1.4 动物模型的建立 |
| 3.1.5 从小鼠外周血中分离并收集树突状细胞 |
| 3.1.6 小鼠树突状细胞自噬水平的测定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 普通C57BL/6J小鼠与条件性基因敲除小鼠经EAMG造模后的临床症状及体重评估 |
| 3.2.2 普通C57BL/6J小鼠与条件性基因敲除小鼠经EAMG造模后的外周血树突状细胞自噬水平检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 树突状细胞自噬在抗原交叉呈递中的作用的相关研究 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）FOSL1在重症肌无力胸腺异常增生中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 生发中心在重症肌无力胸腺中形成的机制 |
| 参考文献 |
| 个人简历和发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）实验性自身免疫性重症肌无力体液免疫及胸腺潜在治疗靶点研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明Ⅰ |
| 论文Ⅰ Toll样受体9信号通路抑制剂对实验性自身免疫性重症肌无力大鼠体液免疫的调节作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 符号说明Ⅱ |
| 论文Ⅱ 他汀修饰的树突状细胞源性外泌体对实验性自身免疫性重症肌无力大鼠胸腺调节性T细胞的诱导作用及机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 英文文章Ⅰ |
| 英文文章Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）探究树突状细胞自噬在胸腺瘤合并MG组织及Thy0517共培养下的表达作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、单纯胸腺瘤与胸腺瘤合并MG组织的树突状细胞中自噬表达水平 |
| 1.1 对象与方法 |
| 1.1.1 临床标本和资料 |
| 1.1.2 主要实验设备、器材与试剂 |
| 1.1.3 实验方法和步骤 |
| 1.1.4 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 一般临床资料结果统计 |
| 1.2.2 单纯胸腺瘤与胸腺瘤合并MG组织中免疫组化结果 |
| 1.2.3 自噬相关基因及蛋白在T组和T/MG组的组织DCs中表达情况 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、胸腺瘤细胞系共培养对体外诱导分化CD34~+造血干细胞来源DCs自噬影响 |
| 2.1 对象与方法 |
| 2.1.1 标本和细胞系来源 |
| 2.1.2 主要实验设备、器材与试剂 |
| 2.1.3 实验方法和步骤 |
| 2.1.4 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Western-blot检测DCs中自噬蛋白表达情况 |
| 2.2.2 Real-timePCR检测DCs中自噬基因mRNA情况 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 自噬相关基因Beclin1的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）白芍总苷在重症肌无力中的抗炎及免疫调节作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料及方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）Fk506修饰的DCs对EAMG大鼠的影响及机制的探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、人重症肌无力胸腺树突状细胞的分离和培养（论文参考文献）
- [1]小鼠胸腺和脾脏增龄性变化的转录组和蛋白组学研究[D]. 张丽. 重庆医科大学, 2021(01)
- [2]调节性B细胞亚群在胸腺瘤患者中的表达及其临床意义[D]. 李婷婷. 吉林大学, 2021(01)
- [3]自然杀伤细胞及其亚型在实验性自身免疫性重症肌无力中的免疫调节作用[D]. 杨春林. 山东大学, 2020(09)
- [4]TSP-1+tMSCs及其exosomes对巨噬细胞及CD4+T细胞分化的影响[D]. 李静. 郑州大学, 2020(02)
- [5]探究Atg12介导的树突状细胞自噬在胸腺瘤合并重症肌无力中的免疫调控作用[D]. 杨照宇. 天津医科大学, 2020(06)
- [6]FOSL1在重症肌无力胸腺异常增生中的作用[D]. 宋歌. 郑州大学, 2020(02)
- [7]实验性自身免疫性重症肌无力体液免疫及胸腺潜在治疗靶点研究[D]. 张蓬. 山东大学, 2020(02)
- [8]探究树突状细胞自噬在胸腺瘤合并MG组织及Thy0517共培养下的表达作用[D]. 厉辛野. 天津医科大学, 2018(02)
- [9]白芍总苷在重症肌无力中的抗炎及免疫调节作用[D]. 庞琳. 泰山医学院, 2018(06)
- [10]Fk506修饰的DCs对EAMG大鼠的影响及机制的探讨[D]. 马永磊. 大连医科大学, 2018(01)