一、乳腺癌癌旁增生腺上皮的p53蛋白表达（论文文献综述）
李珍,董杏,宿晓晓,杜艳敏,张欢欢,曾宪旭[1]（2021）在《ING4、p53和p21在子宫内膜样癌中的表达及意义》文中进行了进一步梳理目的研究生长抑制因子蛋白家族成员4 （inhibitor of growth family memember 4,ING4）、p53和p21在子宫内膜样癌中的表达及意义。方法采用组织芯片技术和免疫组织化学方法检测正常子宫内膜组（正常子宫内膜组织20例）、不典型增生子宫内膜组（不典型增生子宫内膜组织30例）和子宫内膜样癌组（子宫内膜样癌组织60例）中ING4、p53和p21的蛋白表达情况及其与临床病理特征之间的关系;同时采用Western blot法比较20例子宫内膜样癌组织及对应癌旁正常子宫内膜组织中ING4、p53和p21蛋白表达水平。结果子宫内膜样癌组中ING4和p21的阳性表达率低于不典型增生子宫内膜组和正常子宫内膜组,差异均具有统计学意义（均P<0.05）。子宫内膜样癌组中p53的阳性表达率高于不典型增生子宫内膜组和正常子宫内膜组（均P<0.05）。在不同病理分期、分化程度和肌层浸润的子宫内膜样癌患者组织中ING4、p53和p21蛋白的表达水平比较,差异均具有统计学意义（均P<0.05）。Western blot法结果显示,癌旁正常子宫内膜组织中ING4和p21蛋白表达水平均高于子宫内膜样癌组织（均P<0.05）,p53在子宫内膜样癌组织中的表达水平高于癌旁正常子宫内膜组织（P<0.05）。结论 ING4及p21的表达在子宫内膜样癌中降低,p53表达则升高。ING4、p53及p21的表达与子宫内膜样癌病理分期、分化程度和肌层浸润有关。ING4-p53-p21信号通路在子宫内膜样癌中发挥重要作用。
阮涌[2]（2021）在《BLM-EZH2相互作用影响前列腺癌细胞增殖的分子机制研究》文中提出Rec Q-BLM解旋酶在DNA的修复、复制、重组和转录等细胞代谢过程和维持基因组的稳定性中具有非常重要的作用。BLM基因的缺陷将引起人类Bloom综合症（Bloom syndrome,BS）,且易患前列腺癌、乳腺癌、肺癌等癌症。其中,2020年前列腺癌（Prostate cancer,PCa）在我国男性恶性肿瘤中发病率居第七位,死亡率居第十位,PCa已逐渐成为影响我国男性生命健康的常见肿瘤之一。有研究表明BLM在PCa细胞系中高表达,在干扰或过表达BLM后,PC3细胞恶性程度相应的降低或增强;EZH2蛋白是多梳抑制复合物2（Polycomb Repressive Complex 2,PRC2）的成员之一,也有研究表明EZH2蛋白与PCa的发生存在密切关系。本论文深入研究了BLM、EZH2与PCa相互关联性,阐明了BLM/EZH2/MDM2/P53的信号调控轴途径,从分子、细胞、组织和动物水平探索了BLM与EZH2蛋白相互作用对PCa的影响及其机制。其主要研究结果如下:1.BLM与EZH2蛋白主要定位于细胞核内,实验发现这两个蛋白其存在相互作用,预测它们在PCa组织的m RNA中表达水平呈极显着正相关应用Western Bloting实验检测发现BLM在PCa细胞系中高表达,以BLM为诱饵蛋白,通过免疫共沉淀实验联合质谱分析发现与BLM存在相互作用的蛋白有541个,利用TCGA和STRING数据库分析可视化了BLM的相互作用蛋白网络及它们在细胞内的调控关系,其中EZH2蛋白是其相互作用的蛋白之一,且BLM与EZH2在PCa中的表达呈极显着正相关(P-Value=7.9e-74)。在此基础上,我们应用GST Pull down发现BLM与EZH2存在直接相互作用,进一步通过间接免疫荧光实验发现BLM与EZH2主要定位于细胞核。2.BLM与EZH2蛋白在PCa组织中高表达,BLM与EZH2在PCa临床样本中的免疫组化得分呈极显着正相关分别应用BLM和EZH2抗体对50例PCa组织、20例增生组织和9例前列腺组织进行免疫组化研究。发现BLM和EZH2蛋白在PCa组织中相比于正常前列腺高表达,且分别呈显着（P<0.05）和极显着（P<0.01）差异,BLM和EZH2的高表达均与患者的T分期（P=0.030,P=0.012）、临床分期（P=0.030,P=0.012）和Gleason分数（P=0.006,P=0.029）存在显着或极显着相关性,但是与年龄、Gleason分级、淋巴结转移和远处转移没有显着相关性,BLM与EZH2在PCa临床样本中的免疫组化得分呈极显着正相关（P<0.001）。3.干扰BLM和EZH2蛋白能够显着抑制PC3细胞的增殖、迁移和侵袭,并可能存在BLM/EZH2/P53的信号调控轴利用BLM特异性抑制剂处理PC3细胞5天后,进行活细胞计数检测,发现ML216的药物浓度与细胞活性呈负相关,且药物处理组与阴性对照组相比差异极显着（P<0.001）,检测细胞周期发现其能够引起PC3细胞在G0/G1期细胞数量的增加。应用si RNA分别单独或同时干扰BLM和EZH2时,发现si BLM和si EZH2的联合干扰能够更加显着抑制PC3细胞的增殖、迁移和侵袭能力,且能够上调PC3细胞中P53蛋白的表达水平,结合生物信息学分析发现在PC3细胞中可能存在BLM/EZH2/P53的信号调控轴。4.体内外实验进一步阐明了在PC3细胞中存在BLM/EZH2/MDM2/P53的信号调控轴以EZH2为诱饵蛋白进行了ChIP-seq试验,发现EZH2蛋白并未能够直接结合P53启动子区,而是通过调控MDM2启动子区间接调控P53蛋白的表达。通过体外实验发现过表达EZH2,能促进PC3细胞的增殖、迁移和侵袭,但在同时干扰BLM时,能够部分削弱其增强效应,反之,在干扰EZH2时,则能减弱了PC3细胞的增殖、迁移和侵袭,而在同时过表达BLM时,能够部分抵消EZH2干扰时的减弱效应,体内裸鼠成瘤实验结果也与上述结果一致。表明在PC3细胞中存在BLM/EZH2/MDM2/P53的信号调控轴。综上,本研究发现BLM与EZH2蛋白主要定位于细胞核,通过免疫共沉淀联合质谱分析和Pull down实验发现BLM与EZH2蛋白存在直接相互作用,生物信息学分析显示BLM与EZH2在PCa的发生中均高表达且呈显着相关性,并在PCa组织中进一步印证了BLM与EZH2的相关性。通过干扰BLM和EZH2蛋白能够显着抑制PC3细胞增殖、迁移和侵袭,体内外实验揭示了在PC3细胞中存在BLM/EZH2/MDM2/P53的信号调控轴途径。弄清BLM-EZH2相互作用影响前列腺癌细胞增殖分子机制,以Rec Q-BLM解旋酶为小分子抗癌药物的靶标,另辟和建立治疗前列腺癌的新途径和新方法,具有重要的理论价值和应用前景。
张华[3]（2021）在《TRIM36在食管癌中的功能及相关分子机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,在男性中更为高发,是癌症相关的主要死亡原因之一。食管癌分为食管腺癌和食管鳞状细胞癌,前者主要分布在北欧和西欧,常见于消化道下段;后者则在南亚和中亚地区更为普遍,多出现在上段和中段食管中。食管癌早期症状轻微,因此很多数患者错过最佳治疗期,甚至有患者已经出现了远端转移。目前针对食管癌的治疗手段包括外科手术、放疗、化疗。但是,食管癌患者5年生存率不足20%,预后情况十分不好。因此,急需挖掘可帮助食管癌早期诊断和预后评估的标志性分子,并进一步挖掘食管癌发生和恶性化发展的相关分子机制,以期发现更多有效的治疗措施,为临床治疗提供参考。三方基序（Tripartite motif,TRIM）蛋白家族成员众多,大多数蛋白都由N端的RING指结构域,一个或两个称为B盒（B-box）的锌结合基序和卷曲螺旋基序组成。由于N端RING结构域的特殊性,使得具有RING结构域的大多数TRIM家族成员都具有泛素连接酶的功能。截止目前,已发现有80种TRIM家族蛋白成员,在细胞内多种生理过程、遗传疾病和癌症发生发展等方面都起到了关键的调控作用。TRIM家族成员大多参与肿瘤的发生发展过程,在血液肿瘤中,TRIM家族部分成员通过染色体易位或异常表达的方式对癌症发展进行调控。在实体瘤中,则有更多的TRIM家族成员参与癌症的发生和恶性化进程。Wnt信号通路包括Wnt/β-catenin、Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路Wnt/β-catenin信号通路是经典通路,其在细胞生长、胚胎发育、癌症发展等方面有关键性调节作用。在Wnt信号没有被激活时,细胞内的β-catenin浓度较低。一旦Wnt信号被激活,通过一系列的信号传导,胞内对于β-catenin表达的抑制信号被解除,β-catenin在细胞质内的表达量逐渐增加,并向细胞核内转移。进入细胞核后,β-catenin结合到相应的转录因子上,启动一系列和细胞周期、细胞凋亡有关的分子表达。Wnt//β-catenin信号通路的异常活化和细胞异常增殖及多种癌症恶性化发展有关。激活的Wnt/β-catenin信号通路被认为可促进食管癌的发生及恶性化发展。Wnt/β-catenin通路的激活受到三重基序（TRIM）家族蛋白的调控。TRIM蛋白家族中的一些成员通过和Wnt/β-catenin信号通路相互作用在癌症发生及发展中发挥重要作用,例如 TRIM29、TRIM28、TRIM32、TRIM44 等。TRIM36是一种微管结合蛋白,在胚胎发生、顶体反应、染色体分离和细胞周期进程中起作用。近年来,TRIM36已被确定为雄激素反应基因,并已报道其在前列腺癌中的肿瘤抑制作用。此外,TRIM36在非小细胞肺癌细胞系中表达量下降。在胃癌患者中,高表达TRIM36的患者接受放射治疗OS率更高,因此TRIM36也被认为是影响胃癌患者放疗效果临床预后的重要因素,并可能被视为潜在的放射敏感性基因标志。但是目前还没有报道研究TRIM36和β-catenin之间在食管癌中的相关性及其背后的临床学意义。本研究首先通过TCGA网站上的食管癌RNA测序数据集分析了 TRIM36的表达情况,并利用免疫组化染色明确临床样本中TRIM36及β-catenin的表达,分析了两者表达水平同食管癌患者病理特征指标及预后之间的关系。然后,在体外细胞系系统中初步探究了 TRIM36对食管癌细胞系恶性增殖、细胞凋亡的影响。随后,利用生化手段和细胞功能试验探究了 TRIM36同β-catenin相互作用在食管癌细胞中的功能及两者之间的调控机制。然后,在异种移植小鼠模型中验证了TRIM36及β-catenin对食管癌细胞增殖的影响。最后,检测了临床样本中TRIM36的表达量,进一步建立了 TRIM36同食管癌恶性化发展之间的关系,为今后的分子机制研究及临床治疗提供参考。第一部分TRIM36和β-catenin在食管癌组织中的表达及与预后的关系研究目的:探究TCGA网站食管癌组织RNA测序结果中TRIM36的表达量,并在临床食管癌病变组织中检测TRIM36和β-catenin,分析TRIM36和β-catenin表达水平同临床病理特征之间的关系,以及与预后的关系。研究方法:1.在TCGA网站下载食管癌组织及正常组织的RNA测序信息。采用R语言DESeq程序包对基因表达量比较分析。对数据进行初始数据筛选和数据标准化预处理,分析TRIM36在食管癌组织及正常组织中的表达量差异。满足Fold change of log2≥1及P<0.05被认定为具有统计学意义。利用GSEA法分析TRIM36在食管癌组织中的表达量同Wnt/β-catenin信号通路之间的相关性,预定义的基因集合从MSigDB数据库中选取;2.收集2009年2月到2010年5月之间进行食管癌病变组织切除术的80名患者的临床样本。所有患者均为首次接受食管癌病变组织切除术,无其他原发性肿瘤;在术前未经过包括全身化疗及放射治疗在内的抗肿瘤治疗。对患者肿瘤大小、性别、年龄、淋巴结转移、TNM分期、生命状态等临床特征性资料进行收集统计,并对术中分离组织进行TNM分期;3.利用实时荧光定量PCR的方法检测临床分离的食管癌组织及正常粘膜组织中的TRIM36的mRNA表达量;4.制作组织石蜡切片,并利用免疫组化染色方法对病变组织及对照组织中的TRIM36和β-catenin进行检测;5.采用费希尔精确检验（Fisher’s Exact Test）分析TRIM36表达量和食管癌临床特征之间的相关性;6.Kaplan-Meier法绘制生存曲线,比较载TRIM36、β-catenin不同表达水平下食管癌患者的预后。研究结果:1.在TCGA网站上下载的152个食管癌样本以及21个对照样本中,TRIM36在食管癌样本中的表达量显着降低（P<0.05）。在27对随机选取的临床食管癌组织中,TRIM36在食管癌组织中的表达量显着下降（P<0.001）;2.免疫组化结果表明,在80名食管癌患者汇总,53名患者显示TRIM36低表达,占总人数66.25%;27名患者为TRIM36高表达,占总人数33.75%,且主要表达在细胞质中;β-catenin在细胞质和细胞核中均有表达。其中,39例患者显示为食管癌组织β-catenin低表达,占总患者48.75%,41名患者为食管癌组织中β-catenin高表达,占总患者51.25%;3.GSEA分析发现,TRIM36的表达量和β-catenin信号通路呈现负相关关系;4.费希尔精确检验结果显示TRIM36在食管癌组织中的表达量同肿瘤大小（P=0.0104）、肿瘤分期（P=0.0169）、淋巴结转移（P=0.0021）、病人生存状态（P=0.0443）以及β-catenin表达量（P=0.0329）之间均存在显着的相关性（P<0.05）;5.Kaplan-Meier法绘制的生存曲线显示,TRIM36低表达的食管癌患者的生存率显着低于TRIM36高表达的食管癌患者（P=0.0235）;β-catenin高表达的食管癌患者的生存率低于β-catenin低表达的食管癌患者（P=0.0088）;TRIM36低表达且β-catenin高表达的食管癌患者的总体生存时间最短;高TRIM36表达且β-catenin低表达的食管癌患者的总体生存时间最长（P=0.0028）。结论:1.TRIM36的表达量在食管癌组织中显着降低;2.食管癌组织中的TRIM36的表达量和β-catenin表达量呈现负相关关系;3.TRIM36在食管癌组织中的表达量同淋巴结转移、肿瘤大小、肿瘤分期、病人生存状态以及β-catenin之间均存在显着的相关性;4.食管癌患者TRIM36和β-catenin的表达量同总体生存时间有关。第二部分TRIM36对食管癌细胞生长的影响及相关机制探究研究目的:1.探究TRIM36对食管癌细胞增殖、凋亡的影响;2.探究TRIM36和β-catenin之间的相互作用及调控机制;3.探究TRIM36和β-catenin之间相互作用对食管癌细胞增殖、凋亡的影响;4.在体内模型中验证TRIM36对食管癌细胞增殖、凋亡的影响研究方法:1.利用慢病毒转导的方法构建持续过表达TRIM36及靶向TRIM36的RNA干扰细胞系;2.利用CCK-8试剂盒在过表达TRIM36及靶向TRIM36的RNA干扰细胞系中检测细胞的增殖能力;3.利用流式细胞仪检测过表达TRIM36及靶向TRIM36的RNA干扰细胞的细胞凋亡情况;4.利用免疫印迹法检测过表达TRIM36或基因敲降TRIM36对β-catenin表达的影响;5.利用免疫共沉淀法检测TRIM36和β-catenin之间的相互作用及潜在机制;6.利用β-catenin抑制剂及过表达β-catenin的细胞系检测TRIM36同β-catenin相互作用对细胞增殖的影响;7.在异种移植小鼠模型内检测TRIM36和β-catenin对食管癌细胞增殖的影响;8.检测临床食管癌组织中TRIM36和β-catenin的表达量。研究结果:1.和对照细胞相比,TRIM36在食管癌细胞系中低表达;2.过表达TRIM36显着抑制食管癌细胞系的增殖能力;抑制TRIM36表达则能够促进食管癌细胞增殖;3.过表达TRIM36使食管癌细胞停滞在G0/G1期,同时也促进了食管癌细胞的凋亡,抑制细胞核内β-catenin表达,并降低β-catenin激活的Srvivin、Cyclin D1以及c-Myc的表达。抑制TRIM36表达则得到了相反的结果;4.免疫共沉淀结果显示TRIM36和β-catenin相互作用,并且TRIM36可以在β-catenin的第625位赖氨酸处对β-catenin进行泛素化修饰;5.加入β-catenin的抑制剂XAV939可部分抵消抑制TRIM36对食管癌细胞增殖的促进作用。过表达β-catenin也可以部分抵消过表达TRIM36对食管癌细胞增殖的抑制效应;6.在异种移植小鼠模型体内,过表达TRIM36显着抑制了食管癌细胞的生长,促进了食管癌细胞凋亡,而同时过表达β-catenin则可以部分抵消TRIM36的抑伟效应;7.临床食管癌病变组织样本中,和对照组织相比,TRIM36在肿瘤组织中低表达而β-catenin则在肿瘤细胞的细胞核中高表达。结论:1.TRIM36在体外诱导食管癌细胞滞留在G0/G1期,减缓食管癌细胞的增殖,并诱导更多的食管癌细胞凋亡;2.TRIM36促进人食管癌细胞β-catenin的泛素化修饰;3.TRIM36在异种移植小鼠体内抑制食管癌细胞增殖并促进食管癌细胞凋亡;4.在食管癌患者病变组织中,TRIM36表达量下调,β-catenin表达量上调。
赵巧云[4]（2021）在《PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究》文中提出研究背景与目的:胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,预后较差。胃癌的发生发展经过了一系列漫长的演变过程,其中幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染是该演变过程中最重要的始动因子。H.pylori通过多种毒力因子如Cag A、Oip A、Vac A等调控胃上皮细胞生物学行为的改变,但其致病机制目前尚不明确。我们前期利用H.pylori 7.13和CCS9803两种野生菌株分别感染胃上皮细胞GES-1,构建体外细菌细胞共培养模型,并进行细胞转录组学测序分析和实验验证,发现H.pylori感染可上调胃上皮细胞GES-1的前列腺跨膜蛋白雄激素诱导基因1（prostate transmembrane protein androgen inducible gene 1,PMEPA1）的m RNA和蛋白的表达,提示了PMEPA1可能参与H.pylori感染相关的胃黏膜病变过程。PMEPA1是于2000年在前列腺组织中被发现的一种新型雄激素诱导基因,主要在细胞膜和亚细胞器如溶酶体、高尔基体等的亚细胞器膜上表达。已知PMEPA1基因是一种TGF-β诱导基因,负性调控TGF-β信号通路。研究发现,PMEPA1在多种肿瘤中高表达,参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学过程。然而,PMEPA1在胃癌中的研究尚不明确,且PMEPA1在H.pylori感染相关胃黏膜改变过程中的作用也未见报道。因此本文通过生物信息学、PMEPA1基因干预、细胞转录组学等多种方法研究了PMEPA1在H.pylori感染相关胃黏膜病变过程中的作用及机制,为进一步挖掘H.pylori感染致病的新的分子机制及为H.pylori相关胃癌的靶向调控提供新的理论依据。材料方法:（一）PMEPA1在胃癌组织中的表达、预后及生物信息学分析1.PMEPA1在胃癌组织中的表达分析:（1）利用Oncomine数据库、GEO数据库、TCGA数据库的胃癌测序数据,分析PMEPA1在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达及PMEPA1在不同劳伦分型胃癌中的表达;（2）从南昌大学第一附属医院手术室收集18对胃癌及癌旁组织标本,通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）及蛋白质印迹（western blot,WB）的方法检测了PMEPA1在胃癌及癌旁组织的表达。2.PMEPA1表达与胃癌患者的预后分析:利用Kaplan-Meier Plotter在线分析数据库,评价PMEPA1与胃癌患者的总体生存期（over survival,OS）,无进展生存期（progression-free survival,FP）和进展后生存期（post-progression survival,PPS）的关系,明确PMEPA1的表达与胃癌患者预后的关系。3.PMEPA1在胃癌的诊断价值:利用p ROC包对TCGA数据库中的375例胃癌和32例正常胃黏膜组织测序样本进行受试者工作曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）分析,并计算曲线下面积（Areas under the curve,AUC）,评估PMEPA1在胃癌的诊断价值。4.生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程:（1）根据PMEPA1的中位表达值,将TCGA数据库的375个胃癌样本分为PMEPA1高表达组和低表达组,利用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）分析两个差异基因集富集的生物学过程;（2）用R语言对TCGA数据库中与PMEPA1基因相关的基因进行批量计算,并对相关基因进行KEGG信号通路富集。（二）H.pylori感染及其毒力因子对胃黏膜上皮细胞PMEPA1表达的影响1.H.pylori及其毒力因子对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响:（1）构建H.pylori 7.13和PMSS1的oip A基因敲除菌株（Hp7.13Δoip A和Hp PMSS1Δoip A）,并制备抗Oip A抗原的抗体,在基因和蛋白水平对oip A基因的敲除效果进行验证;（2）将H.pylori PMSS1野生菌株以不同感染复数（MOI）与胃上皮细胞GES-1共培养不同时间（1h,3h,6h,12h,24h）,检测PMEPA1蛋白表达水平,并检测感染6h时PMEPA1的m RNA表达水平;（3）将H.pylori 7.13和PMSS1野生菌株（Hp7.13wt和Hp PMSS1wt）分别以不同MOI感染AGS细胞6h,检测PMEPA1蛋白的表达水平;（4）将H.pylori 7.13和PMSS1野生菌株（Hp7.13wt和Hp PMSS1wt）、cag A基因敲除菌株（Hp7.13Δcag A和Hp PMSS1Δcag A）及oip A基因敲除菌株（Hp7.13Δoip A和Hp PMSS1Δoip A）分别与胃上皮细胞GES-1细胞和AGS细胞共培养6h,检测PMEPA1的蛋白和m RNA表达水平。2.PMEPA1在不同胃黏膜疾病阶段中的表达及其与H.pylori感染的关系:从南昌大学第一附属医院病理科收集H.pylori感染的不同胃黏膜病理阶段的内镜标本石蜡切片,通过免疫组化法检测PMEPA1的表达。（三）PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制1.PMEPA1过表达及敲减稳转细胞株的构建:分别构建过表达PMEPA1基因的GES-1细胞(PMEPA1highGES-1)及对照细胞(NC-PMEPA1highGES-1)、敲减PMEPA1基因的GES-1细胞(PMEPA1lowGES-1)及对照细胞(NC-PMEPA1lowGES-1)、过表达PMEPA1的BGC-823细胞(PMEPA1highBGC-823)及对照细胞(NC-PMEPA1highBGC-823)。2.PMEPA1对胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响及机制:（1）通过平板克隆形成实验、实时无标记细胞分析（Real Time Cellular Analysis,RTCA）技术、CCK8法检测PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞增殖的影响;（2）通过transwell侵袭和迁移实验、划痕修复实验检测PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞侵袭和迁移的影响;（3）通过生物信息学分析TCGA数据库胃癌数据集中PMEPA1与EMT转录因子的相关性;（4）Western Blot检测EMT相关分子的蛋白表达水平。3.PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响:（1）H.pylori PMSS1的野生菌株、cag A及oip A敲除菌株感染PMEPA1highBGC-823细胞及其对照细胞,RTCA技术、transwell侵袭和迁移实验检测PMEPA1过表达对H.pylori感染的胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;（2）H.pylori 7.13野生型菌株感染PMEPA1lowGES-1及其对照细胞NC-PMEPA1lowGES-1,transwell实验检测PMEPA1敲减对H.pylori感染的胃上皮细胞的侵袭和迁移能力的影响。（四）转录组学分析PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学功能的影响1.转录组学样品准备:将Hp7.13wt和Hp PMSS1wt分别感染PMEPA1lowGES-1及NC-PMEPA1lowGES-1细胞（MOI=100）,将Hp7.13wt、Hp7.13Δcag A和Hp7.13Δoip A感染PMEPA1highGES-1及NC-PMEPA1highGES-1细胞（MOI=100）,H.pylori感染6h后收集细胞总RNA;同时收集PMEPA1highBGC-823及NC-PMEPA1highBGC-823细胞总RNA;每个组设置三个生物学重复,共收集48个RNA样品。2.转录组测序及分析:（1）转录组测序委托上海美吉生物医药科技有限公司,基于Illumina Novaseq 6000测序平台,通过c DNA文库构建、上机测序、测序数据质控、基因注释等步骤获得基因表达量数据;（2）利用DESeq2软件对表达基因进行差异分析,筛选标准为差异基因表达倍数（Fold Change）>1.5,校正P<0.05;（3）采用Goatools软件对差异基因进行GO富集分析,校正P<0.05为显着富集;采用R语言对差异基因进行KEGG富集分析,P<0.05为显着富集。结果:（一）PMEPA1在胃癌组织的表达、预后及生物信息学分析1.PMEPA1在胃癌组织中高表达:（1）Oncomine数据库分析结果显示,PMEPA1在多种癌症组织中显着高表达（P<0.05）,包括乳腺癌、宫颈癌、头颈癌、肺癌及多个消化系统肿瘤如食管癌、胃癌、结肠癌和胰腺癌。（2）利用GEPIA数据库,共纳入408例TCGA胃癌样本和211例包含TCGA及GETx数据库的正常胃黏膜组织样本,分析结果显示,PMEPA1在胃癌组织样本的表达显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（3）从GEO数据库中下载三个胃癌测序数据集（GSE54129,GSE79973,GSE118916）,分析结果显示,在三个GEO数据集中,PMEPA1在胃癌组织中的转录水平均显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（4）利用Oncomine数据库分析PMEPA1在不同劳伦分型胃癌组织中的表达情况,结果显示PMEPA1在不同劳伦分型胃癌组织的表达均显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（5）18例胃癌及癌旁手术标本的q RT-PCR及WB结果显示,PMEPA1在胃癌组织的表达显着高于癌旁组织（P<0.05）。2.PMEPA1高表达与胃癌患者不良预后有关:Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果显示,PMEPA1是胃癌患者预后不良的风险因素（HR>1）,PMEPA1高表达的胃癌患者总体生存期（HR=1.52）、无进展生存期（HR=1.38）及进展治疗后生存期（HR=1.67）显着缩短（P<0.05）。3.PMEPA1诊断胃癌的临床价值:对TCGA数据库的胃癌数据集绘制PMEPA1基因的受试者工作曲线（ROC）,曲线下面积AUC为0.893,说明PMEPA1是良好的胃癌诊断标志物。4.生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程:（1）GSEA分析结果显示,PMEPA1高表达与TGF-β、上皮间充质转化（EMT）、血管生成、缺氧、Wnt信号通路和Hedgehog信号通路显着正相关（FDR q-value<0.05）;（2）批量相关性基因的KEGG富集分析结果显示,PMEPA1及其相关性基因主要富集在E2F靶基因、有丝分裂纺锤体、MYC靶基因、蛋白质分泌、DNA修复、G2M细胞周期检查点、血管生成、Wnt信号通路、TGF-β信号通路、紧密连接、EMT等信号通路,其中PMEPA1与EMT信号通路呈显着正相关（校正P值=0.005）。（二）H.pylori感染对胃黏膜上皮细胞PMEPA1表达的影响1.成功构建了Hp7.13和Hp PMSS1菌株的oip A基因敲除菌株,及抗Oip A抗原的兔多克隆抗体。2.H.pylori感染上调胃上皮细胞PMEPA1蛋白和m RNA表达水平:（1）前期转录组学分析结果显示,Hp7.13和Hp CCS9803菌株感染感染GES-1细胞24h,与未感染H.pylori的细胞相比,PMEPA1表达分别上调1.59倍和1.13倍,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）Hp PMSS1以不同MOI感染胃上皮GES-1细胞1、3、6、12、24h,在感染6h和12h时随着MOI增大,PMEPA1蛋白表达水平逐渐上升,在MOI=50表达水平最高（P<0.05）,PMEPA1的m RNA表达水平在感染6h时MOI=100表达最高（P<0.05）。（3）将Hp 7.13和PMSS1以不同MOI感染胃癌细胞株AGS 6h,随着MOI的增加,PMEPA1蛋白表达水平上升,其中MOI=50在两个菌株中都有统计学差异（P<0.05）。3.Hp毒力因子Cag A和Oip A对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响:（1）Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）和Hp PMSS1wt（或Hp PMSS1Δcag A、Hp PMSS1Δoip A）感染胃上皮GES-1 6h,Western Blot结果显示,Hp7.13wt或PMSS1wt感染后PMEPA1蛋白表达高于未感染的对照组,而cag A和oip A基因敲除菌感染的PMEPA1蛋白表达低于野生组;（2）Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）和Hp PMSS1wt（或Hp PMSS1Δcag A、Hp PMSS1Δoip A）感染胃上皮GES-1和AGS细胞6h,荧光定量PCR结果显示,Hp7.13wt和Hp PMSS1wt感染GES-1和AGS细胞后,PMEPA1的m RNA表达水平显着高于未感染细胞（P<0.05）,而cag A和oip A基因敲除菌感染时PMEPA1的m RNA表达显着低于野生菌感染的细胞（P<0.05）。4.PMEPA1在不同胃黏膜疾病阶段中的表达及其与H.pylori感染的关系:（1）PMEPA1在炎细胞和腺细胞中均有表达,主要定位于细胞质及核膜。（2）在腺细胞中,PMEPA1的表达在H.pylori感染的轻度慢性非萎缩性胃炎、肠化生和异型增生组均显着高于H.pylori未感染患者（P<0.05）;在炎细胞中,PMEPA1的表达在H.pylori感染的重度非萎缩性炎症、肠化生和异型增生组均显着高于H.pylori未感染患者（P<0.05）。（3）在H.pylori感染的标本中,PMEPA1在轻度和重度非萎缩性胃炎患者标本腺细胞中的表达显着低于肠化生、异型增生和胃癌组（P<0.05）;在轻度非萎缩性胃炎的炎细胞中的表达显着低于其它各组（P<0.05）;在H.pylori未感染患者,无论是腺细胞还是炎细胞,PMEPA1的表达在胃癌组均显着高于其它各组（P<0.05）。以上结果提示,PMEPA1可能参与了H.pylori感染的胃黏膜病变过程。（三）PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制1.PMEPA1促进胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖:（1）平板克隆形成实验、RTCA技术和CCK8增殖实验均显示,PMEPA1highGES-1的增殖能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）;PMEPA1lowGES-1的增殖能力显着低于相应的NC细胞（P<0.05）。（2）体外克隆形成实验、RTCA技术和CCK8增殖实验均显示,PMEPA1highBGC-823的增殖能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）;2.PMEPA1促进胃上皮和胃癌细胞的侵袭和迁移:（1）Transwell侵袭和迁移实验表明,PMEPA1highGES-1和PMEPA1highBGC-823的侵袭和迁移能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）,而PMEPA1lowGES-1细胞的侵袭和迁移能力显着低于相应的NC细胞（P<0.05）。（2）划痕修复实验表明,PMEPA1highGES-1和PMEPA1highBGC-823的迁移能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）。3.PMEPA1与上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）有关:（1）利用Cbioportal数据库分析了PMEPA1与EMT有关基因的相关性,分析结果显示,PMEPA1与间充质细胞标志物N-cadherin的编码基因CDH2、Vimentin的编码基因VIM、EMT间充质细胞转录因子ZEB1、TWIST1、TWIST2显着正相关（P<0.05）,与Snail转录因子编码基因SNAI1和Slug转录因子编码基因SNAI2显着正相关（P<0.05）;与基质金属蛋白酶分子编码基因MMP11、MMP14、MMP7、MMP2、MMP1、MMP17、MMP13和MMP24显着正相关（P<0.05）;（2）Western Blot结果显示,PMEPA1lowGES-1的E-cadherin蛋白表达显着高于NC细胞（P<0.05）,N-cadherin蛋白表达显着低于NC细胞（P<0.05）,而PMEPA1high GES-1则反之（P<0.05）。4.PMEPA1对H.pylori感染的胃癌细胞BGC-823增殖的影响:Hp PMSS1wt感染PMEPA1highBGC-823细胞和对照细胞,RTCA结果显示,H.pylori感染18小时后开始促进NC组细胞的增殖,在感染后的40-78h内,Hp PMSS1wt菌株显着促进NC-PMEPA1highBGC-823细胞的增殖（P<0.05）,而Hp PMSS1Δcag A及Hp PMSS1Δoip A感染组与Hp PMSS1wt感染组相比,细胞增殖无统计学差异（P>0.05）;Hp PMSS1wt菌株及cag A和oip A敲除菌株对PMEPA1highBGC-823细胞的增殖无统计学差异（P>0.05）。5.PMEPA1对H.pylori感染的胃癌细胞和胃上皮细胞迁移和侵袭的影响:（1）PMEPA1过表达对H.pylori感染的BGC-823胃癌细胞迁移和侵袭的影响:H.pylori未感染组中,过表达PMEPA1显着促进BGC-823细胞的迁移和侵袭（P<0.05）;Hp7.13wt感染PMEPA1highBGC-823及对照细胞后细胞迁移和侵袭能力显着高于未感染细胞（P<0.05）,同时Hp7.13wt感染组细胞的迁移和侵袭能力显着高于Hp7.13Δcag A和Hp7.13Δoip A感染组（P<0.05）;Hp PMSS1wt感染PMEPA1highBGC-823和NC细胞后,细胞侵袭能力同Hp7.13菌株,而迁移能力在PMEPA1highBGC-823细胞各组无统计学差异（P>0.05）。（2）PMEPA1敲减对Hp7.13wt感染的胃上皮GES-1细胞的迁移和侵袭的影响:Hp7.13wt感染PMEPA1lowGES-1及对照细胞后,细胞迁移和侵袭能力显着增加（P<0.05）。（四）转录组学分析PMEPA1在H.pylori感染的胃上皮细胞作用的生物学功能1.PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平的影响:（1）PMEPA1过表达或敲减对胃上皮细胞GES-1转录水平的影响:（1）GES-1过表达PMEPA1后共有1025个差异基因,敲减PMEPA1后共有1376个差异基因;（2）差异基因主要富集的GO通路有细胞运动相关如质膜黏附分子的细胞间黏附作用、趋化运动、黏附过程、细胞迁移、细胞运动、细胞外基质成分、细胞运动的调节等生物过程;（3）差异基因富集到的KEGG信号通路主要有细胞粘附分子、TGF-β、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。（2）PMEPA1过表达对胃癌细胞株BGC-823转录水平的影响:（1）共有132个差异基因;（2）主要富集的GO通路有细胞外基质组成、组织形态发生、急性炎症反应、TGF-β的分泌调控等生物过程;（3）主要富集到的KEGG通路包括耶尔森菌感染、小细胞肺癌、内吞、抗坏血酸和醛酸代谢、肌动蛋白细胞骨架的调控、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用、ECM-受体相互作用。综上,PMEPA1过表达或敲减主要影响细胞运动、迁移、细胞黏附、受体配体相关作用、TGF-β信号通路、ECM-受体相互作用等生物学过程。2.H.pylori感染对敲减或过表达PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的影响（1）H.pylori感染对敲减PMEPA1的GES-1细胞转录水平的影响:（1）Hp7.13wt和Hp PMSS1wt感染PMEPA1lowGES-1细胞后,分别有2315和959个差异基因;（2）差异基因富集的GO通路相似,主要包括细胞对缺氧的反应、细胞分裂、血管发育的调控、细胞周期的正向调控、细胞运动的正向调控等生物过程;（3）共同富集的KEGG通路主要有MAPK信号通路、缺氧诱导因子-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。（2）H.pylori感染对过表达PMEPA1的GES-1转录水平的影响:（1）Hp7.13wt感染NC-PMEPA1highGES-1后,共有1646个差异基因,富集的KEGG通路主要有MAPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、AGE-RAGE信号通路的研究、缺氧诱导因子-1信号通路、AMPK信号通路、IL-17信号通路等;（2）Hp7.13wt与Hp7.13Δcag A菌株感染NC-PMEPA1highGES-1细胞的差异基因富集到了17条信号通路,主要有肿瘤中的micro RNAs、细胞周期、P53信号通路、细胞衰老、FOXO信号通路、癌症中的转录调控异常、Wnt信号通路、Hippo信号通路、JAK-STAT信号通路、Hedgehog信号通路等,说明cag A可能通过以上这些通路起作用。（3）Hp7.13wt与Hp7.13Δoip A菌株感染NC-PMEPA1highGES-1细胞的差异基因未富集到KEGG通路。综上,H.pylori感染可能通过转录因子的调控作用、缺氧诱导因子-1信号通路、AMPK信号通路、IL-17信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、JAK-STAT信号通路、Hedgehog信号通路介导敲减或过表达PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的变化,其中毒力因子Cag A可能发挥重要作用。3.PMEPA1对不同H.pylori菌株感染的胃上皮细胞转录水平的影响（1）PMEPA1敲减对Hp7.13（或PMSS1）感染的GES-1细胞的影响:Hp7.13wt（或Hp PMSS1wt）感染PMEPA1lowGES-1及其对照组细胞,差异基因富集的KEGG通路相似,主要包括AGE-RAGE信号通路的研究、癌症中胆碱代谢、细胞衰老、Hippo信号通路、EGFR酪氨酸酶抑制耐受、癌症中的micro RNA、Fox O信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、细胞骨架调控等;（2）PMEPA1过表达对不同H.pylori菌株感染的GES-1细胞的影响:Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）感染PMEPA1highGES-1及其对照细胞,差异基因富集的信号通路相似,主要的GO富集有TGF-β的反应、趋化性的调节、质膜粘附分子的粘附、细胞对生长因子刺激反应等过程等生物过程;主要的KEGG富集有细胞因子-细胞因子受体相互作用、AGE-RAGE信号通路、TGF-β信号通路、Hedgehog信号通路、NOD样受体信号通路、IL-17信号通路等。综上,在H.pylori感染胃上皮细胞的过程中,PMEPA1可能通过多种途径参与H.pylori介导的胃上皮细胞生物过程的改变。结论:1.PMEPA1在胃癌组织高表达,与胃癌不良预后有关,是良好的胃癌诊断标志物。2.PMEPA1高表达促进胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移,与EMT表型相关。3.H.pylori感染调控PMEPA1的表达,促进胃上皮细胞的增殖、侵袭和迁移,部分依赖于毒力因子Cag A和Oip A的作用。4.H.pylori感染胃上皮细胞调控多种生物学过程;PMEPA1通过多种途径参与H.pylori介导的胃上皮细胞生物过程的改变。
孙耀华[5]（2021）在《结直肠癌中ARF6表达的临床意义及其通路分子的研究》文中认为研究背景:结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）是消化系统常见的恶性肿瘤,是威胁人民健康的杀手。尽管随着手术、放化疗及分子靶向治疗等技术的日益完善,CRC患者的生存期得到有效的延长,但整体来看,长期疗效并不理想,5年生存率仍仅为50%。因此,对其恶性进展机制的研究一直是肿瘤研究领域的热点。二磷酸腺苷核糖基化因子6（ADP ribosylation factor 6,ARF6）是Ras相关的G蛋白家族的一种小GTP酶结合蛋白。近年来已有多项研究发现,ARF6可通过介导多条通路调控肿瘤细胞的增殖,与多种恶性肿瘤的侵袭、转移有密切联系。但目前有关ARF6在CRC中的研究尚未见报道。为明确ARF6在CRC恶性进展中的作用,本课题分为三部分,分别探索ARF6在CRC中的表达及临床意义,初步探索CRC中ARF6上游调控因子,在以上研究的基础上进一步通过在线数据库分析ARF6通路分子在CRC中预后意义。第一部分ARF6在结直肠癌中的表达及其临床意义研究1、研究目的:明确ARF6在CRC组织中的表达,及其与CRC的临床病理特征及预后的关系。2、研究方法:收集长海医院资料完整、临床病理诊断明确的CRC共136例。所有病例均由石蜡包埋组织。采用苏木素-伊红染色观察CRC病理形态学特征及侵袭转移情况;根据标准确定组织学分级、TNM分期、肿瘤出芽程度。采用免疫组织化学检测ARF6、Ki-67蛋白表达。采用电话随访的方式采集患者术后及治疗情况。3、研究结果:ARF6在CRC肿瘤组织中的表达情况:ARF6选择性高表达在CRC癌组织,主要表达在细胞浆与细胞膜,阳性表现为黄色至棕褐色颗粒。ARF6在CRC癌组织中的表达水平与肿瘤淋巴结转移、TNM分期等密切相关（P<0.05）,而与患者的年龄、性别、肿瘤部位、Ki67增殖指数、同时伴发腺瘤、家族史、肿瘤大小、肿瘤大体类型、肿瘤分化、肿瘤粘液成分、浸润深度、伴有远处转移、肿瘤出芽、癌结节无明显相关（P>0.05）。ARF6高表达病例的生存曲线与低表达组未发现有明显差异,Log-Rank检验显示两组之间无统计学意义（χ2=2.608,P=0.106）。4、研究结论:ARF6在CRC癌组织中的高表达与淋巴结转移情况、TNM分期有显着相关性。第二部分结直肠癌中ARF6上游调控因子的研究1、研究目的:探索CRC中促进ARF6蛋白表达的可能机制。2、研究方法:采用免疫组织化学方法检测突变型P53蛋白在136例CRC组织中的表达情况,并采用荧光定量PCR检测K-ras、N-ras、BRAF基因突变。分析K-ras、N-ras、BRAF基因突变病例及野生型CRC病例之间ARF6蛋白表达差异。采用EPD真核启动子数据库预测ARF6启动子区结合的转录因子、结合位点及结合元件（Motif）。CRC细胞株感染携带KLF4的腺病毒,采用western blot检测KLF4对ARF6表达的调控作用。3、研究结果:（1）136例CRC患者的肿瘤组织中,P53野生型表达者20例（14.71%）、错义突变型表达者59例（43.38%）、无义突变型表达57例（41.91%）。ARF6蛋白表达水平与癌基因P53基因突变之间无统计学意义（χ2=0.258,P=0.611）。（2）136例CRC肿瘤组织中,检出RAS基因突变50例（36.76%）,其中KRAS基因突变47例,NRAS基因突变3例。ARF6蛋白表达水平与Ras基因突变状态之间无统计学意义（χ2=0.563,P=0.453）。（3）136例CRC肿瘤组织中,检出BRAF基因突变7例（5.15%）。ARF6蛋白表达水平与BRAF基因突变状态之间无统计学意义（χ2=0.007,P=0.653）。（4）生物信息学分析表明ARF6启动子区存在3个KLF4结合位点,结合元件序列为AGGGTGGGGC。高表达KLF4能抑制CRC中ARF6蛋白表达。4、研究结论:在CRC组织中,KLF4抑制ARF6蛋白表达,其分子机制可能是KLF4结合到ARF6启动子区发挥着转录抑制作用,进而抑制ARF6蛋白表达。第三部分ARF6通路分子在结直肠癌中的预后意义研究1、研究目的:探索ARF6通路上的家族分子、激活分子、抑制分子、效应分子等与CRC患者预后的关系。2、研究方法:ARF6通路分子分为5类:家族基因（ARFs）、鸟嘌呤核苷酸交换因子（Guanine nucleotide exchange factors,GEFs）、GTP酶激活蛋白（GTPase-activating proteins,GAPs）、效应因子（Effectors）和ARF6抑制配体受体对（SLITs-ROBOs）。使用String在线工具构建蛋白相互作用网络（protein-protein interactions,PPI）。基于GEPIA数据库总生存率或无病生存率分析,并进一步用Human Protein Atlas数据库验证,查找蛋白在CRC组织中的表达。3、研究结果:（1）GEPIA数据库分析表明ARFs家族分子与CRC患者的预后均无明显相关性。（2）GEPIA数据库分析表明,ARF6 GEFs家族中的IQSEC3/GEP100与CRC患者的总生存率相关;Human Protein Atlas在线数据库尚无IQSEC3/GEP100数据信息。（3）GEPIA数据库分析表明ARF6 GAPs家族中的SMAP1、AGAP3与CRC患者的总生存率相关,AGAP1则与CRC患者的无病生存率相关;Human Protein Atlas在线数据库进一步证实SMAP1、AGAP3是CRC患者预后的重要影响分子。（4）GEPIA数据库分析表明,ARF6 effectors家族中的的MAPL8IP3/JIP3与CRC患者的无病生存率相关;Human Protein Atlas在线数据库进一步证实MAPL8IP3/JIP3是CRC患者预后的重要影响分子。（5）GEPIA数据库分析表明,SLITs-ROBOs家族中的SLIT1与CRC患者的总病生存率相关;Human Protein Atlas在线数据库尚无SLIT1数据信息。4、研究结论:ARF6通路分子中SMAP1、AGAP3、MAPL8IP3/JIP3是CRC患者预后标志物。
陈震[6]（2021）在《Hsa＿circ0006332和Hsa＿circ0000069调控宫颈癌发展的机制研究》文中提出研究背景和目的宫颈癌（Cervical Carcinoma,CC）是由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起的常见的妇科恶性肿瘤。我国是CC患病人数最多的国家之一,CC的预防和治疗任务繁重。HPV疫苗和宫颈涂片筛查虽然能够有效的预防CC发生,但晚期CC预后通常很差。环状RNA（circRNAs）在肿瘤的发生和发展中发挥着重要作用,这也包括在CC中。此外,由于具有高稳定性,特异性表达等特点,circRNAs在肿瘤的治疗与诊断中前景可期。然而,当前很大一部分circRNAs的表达和功能尚不清楚。本研究旨在探讨hsa＿circ＿0006332（Hsa＿circ00063322）和hsa＿circ＿0000069（Hsa＿circ0000069）在CC发展中的作用及其表达升高的相关分子机制。研究方法1.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069环状性质验证及其在宫颈癌细胞和组织中的表达通过RnaseR消化实验和基因组DNA扩增实验验证Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的环状结构。放线菌素D实验和核质分布实验检测Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的高稳定性和细胞分布。采用实时定量聚合酶链反应（qPCR）法分别检测CC和正常组织与细胞中Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的表达,以确定宫颈组织癌变后Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的表达变化。2.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069表达升高的机制研究通过数据库分析,发现Hsa＿circ00063322表达可能受转录因子FOXA1调控,而Hsa＿circ0000069表达受RNA m6A甲基化修饰调控。通过染色质免疫共沉淀实验验证FOXA1与Hsa＿circ00063322启动子结合;qPCR法检测FOXA1对Hsa＿circ00063322表达的调节;荧光素酶实验确认了FOXA1与Hsa＿circ00063322启动子区的结合位点。m6A RNA免疫共沉淀（Me-RIP）检测CC和正常细胞中Hsa＿circ0000069的m6A修饰水平,以及METTL3敲低后Hsa＿circ0000069的m6A修饰变化。qPCR法验证METTL3对Hsa＿circ0000069表达的调节。放线菌素D实验检测METTL3敲低对Hsa＿circ0000069稳定性的影响,以及两个m6A修饰位点处m6A修饰分别对Hsa＿circ0000069稳定性的影响。制备Hsa＿circ0000069 m6A修饰位点单突变体和双突变体,然后通过Me-RIP和qPCR实验检测Hsa＿circ0000069两处m6A修饰之间的关系。3.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的细胞功能制备并通过qPCR验证Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069稳定敲低的细胞。制备Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069瞬间过表达细胞。采用细胞计数试剂盒-8（CCK8）和5-乙基-2′-脱氧尿苷（Ed U）检测Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069敲低和过表达细胞的增殖能力。将Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069敲低和过表达细胞进行顺铂和氟尿嘧啶处理,采用流式细胞术检测细胞凋亡,采用划痕和Transwell实验检测Hsa＿circ0000069敲低和过表达细胞的迁移能力。4.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069分别靶向调节miR-548q和miR-4426,miR-548q靶向抑制L2的表达通过qPCR验证Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069分别对miR-548q和miR-4426的调节关系,以及miR-548q对HPV16小衣壳蛋白L2的调节关系。荧光素酶实验验证Hsa＿circ00063322与miR-548q,Hsa＿circ0000069与miR-4426,以及miR-548q与L2的结合位点。qPCR检测肿瘤和正常组织中miR-548q,miR-4426和L2的表达。5.Hsa＿circ00063322/miR-548q/L2和Hsa＿circ0000069/miR-4426信号通路的验证采用qPCR检测Hsa＿circ00063322过表达以及Hsa＿circ00063322和miR-548q同时过表达或者Hsa＿circ00063322敲低以及Hsa＿circ00063322和miR-548q同时敲低后L2表达变化,采用免疫荧光（IF）、Ed U、流式和Transwell实验检测miRNA过表达以及circRNA和miRNA同时过表达或者miRNA敲低以及circRNA和miRNA同时敲低后细胞的功能表型变化。研究结果1.CC组织和细胞中环状RNA Hsa＿circ00063322的表达显着上调,利用Hsa＿circ00063322表达能够准确的区分肿瘤和正常组织（ROC分析AUC=0.8597）。Hsa＿circ00063322具有高稳定性,主要分布在胞浆中。FOXA1是Hsa＿circ00063322的转录因子,与MYBL2（Hsa＿circ00063322亲本基因）启动子区在两个位点结合。2.制备Hsa＿circ00063322稳定敲低细胞系。Hsa＿circ00063322敲低可显着抑制CC细胞的增殖能力,并增加其对顺铂和氟尿嘧啶的敏感性;而Hsa＿circ00063322瞬时过表达可促进其增殖能力,并削弱其对顺铂和氟尿嘧啶的敏感性。3.Hsa＿circ00063322可与miR-548q靶向结合,并且调节miR-548q的表达。与癌旁正常组织相比,宫颈癌组织中miR-548q的表达显着降低,且miR-548q和Hsa＿circ00063322的组织表达水平负相关。4.miR-548q与L2转录本在两个位点结合,介导了Hsa＿circ00063322对L2表达的调节。Hsa＿circ00063322过表达阻遏了miR-548q的抑癌活性,而Hsa＿circ00063322敲低抑制了miR-548q抑制剂的促癌活性。5.CC组织和细胞中环状RNA Hsa＿circ0000069的表达显着上调,利用Hsa＿circ0000069表达能够准确的区分肿瘤和正常组织（AUC=0.7901）。Hsa＿circ0000069具有高稳定性,主要分布在胞浆中。6.相比正常宫颈细胞,CC细胞中Hsa＿circ0000069的m6A修饰水平显着升高。m6A修饰提高了Hsa＿circ0000069稳定性。Hsa＿circ0000069转录本中存在两处m6A修饰位点,二者的作用相互协同。7.制备Hsa＿circ0000069稳定敲低细胞系。Hsa＿circ0000069敲低显着抑制了CC细胞的增殖和迁移能力,而Hsa＿circ0000069瞬时过表达促进了CC细胞的增殖和迁移能力。8.Hsa＿circ0000069可与miR-4426靶向结合,并且调节miR-4426的表达。Hsa＿circ0000069过表达阻遏了miR-4426的抑癌活性,而Hsa＿circ0000069敲低抑制了miR-4426抑制剂的促癌活性。研究结论1.CC中,转录因子FOXA1促进了Hsa＿circ00063322的表达,Hsa＿circ00063322通过吸附miR-548q,防止了L2被降解,并促进了CC细胞的增殖能力,削弱了CC细胞对化疗药物的敏感性。2.CC中,m6A修饰提高了Hsa＿circ0000069的稳定性,Hsa＿circ0000069通过吸附miR-4426,促进了CC细胞的增殖和迁移能力。
王亚伟[7]（2021）在《Ring1b及其介导的染色质重塑在乳腺癌转移中的作用及分子机制》文中进行了进一步梳理乳腺癌是全球女性发病率最高、致死率第二的恶性肿瘤。乳腺癌转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是肿瘤细胞发生远处转移的先决条件。Ring1b是真核生物中多梳蛋白抑制复合物1（Polycomb repressive complex 1,PRC1）的核心亚基。依赖于Ring1b的E3泛素化连接酶活性,PRC1能够通过单泛素化组蛋白H2A第119位赖氨酸（H2AK119ub）,诱导染色质重塑,抑制基因转录,继而决定细胞命运。目前研究发现,Ring1b与多种肿瘤发生、发展密切相关。然而,Ring1b及其依赖的表观重塑在乳腺癌EMT及转移中的作用与分子机制并不十分清楚。本论文研究发现,在TGF-β诱导的乳腺上皮细胞EMT模型中,Ring1b及其介导的表观重塑标志分子H2AK119ub表达可被上调;在体内、外模型中,Ring1b能够通过下调EMT上皮标志分子E-cadherin表达,减弱细胞-细胞间黏附作用,诱导乳腺上皮细胞发生EMT,维持乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力。通过对不同转移能力的乳腺癌细胞解析蛋白-蛋白相互作用发现,Ring1b能够被ATP依赖的RNA解旋酶家族（ATP-dependent DEAD-box RNA helicases,DDXs）成员DDX3X/DDX5和（或）EMT转录因子家族（EMT transcription factors,EMT TFs）成员Snail1/Twist2选择性募集,形成多种PRC1依赖的E-cadherin基因转录抑制复合物。进一步研究发现,DDX3X/DDX5-Ring1b复合物能够通过与E-cadherin基因启动子区远端区域结合,抑制E-cadherin基因转录,诱导乳腺上皮细胞及上皮样乳腺癌细胞EMT起始;结合在E-cadherin基因启动子区近端的Snail1/Twist2-Ring1b复合物能够协同DDX3X/DDX5-Ring1b复合物,进一步沉默间质样乳腺癌细胞E-cadherin基因表达,维持其高转移能力;Ring1b复合物还能够介导E-cadherin基因启动子区组蛋白发生多种表观标志分子重排。临床样本单/多因素分析证明,Ring1b复合物表达与乳腺癌组织E-cadherin缺失、转移行为及多种肿瘤不良预后等具有显着相关性。本论文研究从H2AK119ub介导的染色质重塑角度阐明了Ring1b在乳腺癌转移中的作用,初步揭示了其在E-cadherin基因多层次转录调控中的复杂分子机制。本研究有望为揭示肿瘤转移的分子调控机制提供新的证据,为以Ring1b及其复合物为靶点的抗肿瘤药物设计及临床分子诊治方案提供参考。
李回梦[8]（2021）在《ING3在乳腺癌中的表达及功能研究》文中研究表明[目的]本研究通过生物信息学方法探讨了ING3mRNA表达水平与临床指标（乳腺癌分期、分子分型、绝经状态、年龄、病理学分型等）的相关性;通过生存分析,探讨ING3 mRNA表达水平与乳腺癌患者预后的关系。同时我们在乳腺癌细胞株MCF7和MDA-MB-231中过表达ING3基因,研究ING3对乳腺癌细胞株MCF7、MDA-MB-231增殖能力、细胞凋亡、细胞周期的影响;最后通过GSEA分析,对ING3参与乳腺癌发生发展的信号通路进行预测。为寻找乳腺癌诊治中新的预后、诊断、治疗及疗效评估靶点提供理论基础。[方法]1.从TCGA数据库下载乳腺癌患者的ING3基因表达数据和临床数据,比较癌旁正常组织与癌组织以及不同临床指标问ING3的差异表达情况。2.将乳腺癌患者ING3基因表达数据以中位值区分高低表达再结合乳腺癌患者生存时间进行生存分析。3.通过GSEA分析,对ING3可能参与的信号通路进行预测。4.采用qRT-PCR和western bloting技术检测乳腺癌细胞株MCF7、MDA-MB-231、jimt-1,正常乳腺上皮细胞MCF10A中ING3的表达情况。5.在MCF7、MDA-MB-231细胞中通过脂质体转染过表达ING3质粒,同时设置空载体质粒组作为阴性对照。6.采用qRT-PCR和蛋白印迹实验对ING3过表达情况进行验证。7.采用CCK8法检测过表达ING3后MCF7、MDA-MB-231细胞增殖能力的变化。8.经流式细胞仪检测过表达ING3后MCF7、MDA-MB-231细胞凋亡的变化。9.经流式细胞仪检测过表达ING3后MCF7、MDA-MB-231细胞周期的变化。10.采用qRT-PCR比较过表达ING3后MCF7细胞增殖、凋亡及细胞周期相关基因的表达变化。[结果]1.在乳腺癌组织中ING3mRNA表达明显低于正常乳腺组织,并且ING3表达水平与不同年龄、ER、PR、HER2状态相关。2.ING3 mRNA表达水平可以作为HER2阳性乳腺癌的预后评估因素。3.GSEA 分析提示 ING3 可能参与 KEGGOXIDATIVEPHOSPHORYLATION、KEGGERBBSIGNALINGPATHWAY等信号通路,对乳腺癌发生发展起重要作用。4.qRT-PCR和western bloting显示ING3在乳腺癌细胞株和正常乳腺上皮细胞株间差异表达。5.qRT-PCR和western bloting显示在乳腺癌细胞中转染过表达质粒后ING3表达水平明显升高。6.CCK8增殖实验显示过表达ING3后MCF7、MDA-MB-231细胞增殖能力明显减弱。7.流式细胞仪凋亡检测显示:过表达ING3后MDA-MB-231细胞凋亡细胞明显增多。8.流式细胞仪细胞周期检测显示:过表达ING3后MCF7细胞周期阻滞于G0/GI期。9.过表达ING3后MCF7细胞细胞周期依赖性激酶抑制剂CDKN1A表达上调,细胞周期调控蛋白cyclinD1在过表达ING3后表达下调,增殖细胞核抗原PCNA在过表达ING3后表达下调。[结论]1.与正常乳腺组织对比,ING3在乳腺癌组织中表达明显下调,ING3表达水平与年龄、ER、PR、HER2状态相关。2.在正常乳腺上皮细胞MCF10A和乳腺癌细胞株MCF7、MDA-MB-231、jimt-1中ING3差异表达。3.过表达ING3可引起乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡细胞增多,MCF7细胞周期G0/G1期细胞比例增多,明显抑制MDA-MB-231、MCF7细胞增殖能力。4.过表达ING3影响细胞周期相关基因CDKN1A、cyclinD1和细胞增殖相关基因PCNA的表达,ING3可能参与了 KEGGOXIDATIVEPHOSPHORYLATION、KEGGERBBSIGNALINGPATHWAY等信号通路,对乳腺癌发生发展起重要作用。
闫欢[9]（2020）在《基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究》文中研究表明研究背景卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,世界范围内,其发病率在发达国家为9.1/10万,在发展中国家为5.0/10万,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢上皮性癌（ovarian epithelial cancer）占卵巢癌的85～90%,在早期诊断时,卵巢癌患者可以采用手术联合化疗药物治疗,5年生存率接近90%,由于卵巢癌的频繁复发和转移,晚期患者5年生存率降至30%左右。肿瘤的起始和进展与多种抑癌基因失活或者促癌“诱导”基因的过度激活密切相关。近年来,分子靶向治疗发展迅猛,以分子靶向药物治疗为代表的生物治疗模式可以从分子水平调控肿瘤进展,为改善卵巢癌患者预后带来希望。因此,迫切需要探索卵巢癌发生和转移相关的分子机制,探究卵巢癌分子靶向治疗的潜在靶点,提高卵巢癌患者早期诊断率。抑癌基因p53位于17号染色体17p13.1的位置,p53是人类癌细胞中突变率最高的基因。以往的研究发现,p53功能缺陷(p53-/-)在诱导小鼠卵巢上皮细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞的形态和功能中发挥重要作用。促癌基因c-Myc位于8号染色体8q24.21位点,在早期应答中发挥重要作用。c-Myc过表达可使细胞出现无限增殖、分化以及恶性转化。研究发现,约30%的卵巢肿瘤存在c-Myc扩增。蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK2）,又称局灶性粘附激酶（focal adhesion kinase,FAK）,位于染色体8q24.3位点。PTK2在人类多种实体瘤中表达上调,发挥着促癌的作用。研究发现,PTK2过表达与p53突变在人乳腺癌中高度相关,PTK2 N端结构域与p53 N端反式激活结构域可相互作用。PTK2和c-Myc协同调控肿瘤细胞侵袭,抑制整合素/PTK2信号轴和c-Myc可以协同调控卵巢癌恶性生物学行为。有趣的是,我们分析了癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）,发现在同一组卵巢浆液性癌患者中,包括PTK2、c-Myc和p53在内的三种基因同时发生异常改变,其中88%的卵巢癌患者p53基因发生突变,45%的卵巢癌患者c-Myc基因上调或扩增,同时,超过60%的卵巢癌患者PTK2上调或扩增。因此,我们提出猜想,在p53功能缺陷(p53-/-)的小鼠卵巢上皮细胞中,将癌基因c-Myc和PTK2同时过表达（p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达）,是否可以促使卵巢上皮细胞发生转化,使其获得卵巢癌恶性生物学功能,是否可以模拟卵巢癌的发生和进展过程,形成卵巢癌细胞?如果该细胞株构建成功,希望能广泛应用于人类卵巢上皮性癌起始和转移的分子机制研究。本研究试图通过基因修饰构建一种小鼠卵巢癌细胞株。课题组利用CRISPR/Cas9系统敲除p53基因,构建了p53敲除质粒,同时构建了c-Myc和PTK2过表达质粒,本研究利用慢病毒载体系统包装质粒并将修饰后的目的基因,以单个或组合方式转染小鼠卵巢上皮细胞,观察其细胞功能性改变,将具有潜在肿瘤生成作用的细胞株种植到小鼠卵巢组织内,建立小鼠卵巢癌模型,进一步观察其在小鼠体内的成瘤效果和肿瘤转移情况。卵巢癌的分子靶向治疗近年来引起人们的广泛关注以及深入研究。基于本课题以上研究,我们看到PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用,那么,以PTK2为治疗靶点的研究将指导我们更好地理解卵巢癌发生和发展的过程,为卵巢癌的分子靶向治疗带来新的思路。GSK2256098是一种靶向抑制PTK2激酶活性以及Y397位点磷酸化的小分子抑制剂。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除PTK2基因,同时选用GSK2256098靶向抑制PTK2 Y397位点的磷酸化,首次评估敲除和靶向抑制PTK2对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等细胞生物学行为的影响及可能机制,以及对卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移的作用。通过以上研究,希望为卵巢癌的分子靶向治疗及分子机制研究提供研究基础和理论支持。本课题分为三个部分,对以上内容进行探讨。第一部分基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建目的本部分旨在构建小鼠卵巢癌细胞株,并利用该细胞株建立小鼠卵巢原位移植瘤模型进行功能验证。材料与方法1.材料1.1细胞株:C57BL/6小鼠卵巢上皮细胞,购自美国Cell Biologics公司。1.2质粒:在实验前期,课题组成功构建了p53基因敲除质粒、c-Myc基因过表达质粒以及PTK2基因过表达质粒。1.3动物:选用4周大小的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Sz J（NSG）免疫缺陷雌性小鼠,购自Jackson实验室。2.方法2.1将成功构建的质粒进行转化和提取,利用慢病毒载体系统包装p53敲除质粒、c-Myc过表达质粒以及PTK2过表达质粒。2.2建立稳定转染细胞株及分组将包装后的质粒以单个、两两组合、三者组合的形式分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞,共分为8组:p53敲除组(p53-/-组)、c-Myc过表达组（c-Myc组）、PTK2过表达组（PTK2组）、p53敲除+c-Myc过表达组(p53-/-+c-Myc组)、p53敲除+PTK2过表达组(p53-/-+PTK2组)、PTK2过表达+c-Myc过表达组（PTK2+c-Myc组）、p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达组(p53-/-+c-Myc+PTK2组)以及空质粒载体转染组（对照组）。Western blot方法检测8组细胞p53、c-Myc以及PTK2蛋白水平。2.3 MTT方法、单层细胞克隆形成试验和软琼脂细胞克隆形成试验检测8组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力和细胞克隆形成能力。细胞迁移和侵袭实验检测8组基因修饰细胞迁移和侵袭能力。2.4筛选出具有潜在肿瘤生成能力的基因修饰细胞株,将该组细胞种植到免疫缺陷NSG小鼠卵巢组织,观察其成瘤效果及转移情况。2.5采用SPSS 22.0进行统计分析,结果统计采用（x±s）表示,进行正态性检验,两组比较采用独立样本t检验,超过两组采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。结果1 PTK2、c-Myc和p53蛋白在基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的表达与对照组（0.06±0.02）相比,PTK2蛋白在PTK2组（1.22±0.11）、PTK2+c-Myc组（1.11±0.11）、p53-/-+PTK2组（0.86±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.34±0.16）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.08±0.02）相比,c-Myc蛋白在c-Myc组（0.56±0.04）、PTK2+c-Myc组（1.01±0.12）、p53-/-+c-Myc组（0.76±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.23±0.15）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.45±0.05）相比,p53蛋白在p53-/-组（0.01±0.01）、p53-/-+c-Myc组（0.02±0.01）、p53-/-+PTK2组（0.03±0.01）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（0.04±0.01）基因修饰细胞株表达水平下降,差异均具有统计学意义（P<0.001）。2基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力与对照组及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力显着上升,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-+PTK2组、p53-/-+c-Myc组及PTK2+c-Myc组细胞增殖能力上升（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-组、c-Myc组及PTK2组细胞增殖能力在整个测定期内均无统计学差异（P>0.05）。3基因修饰小鼠卵巢上皮细胞克隆形成结果与对照组（4.33±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组单层细胞克隆形成数量（93.67±6.11）显着增加（P<0.001）。与对照组（4.33±1.53）相比,p53-/-组（15.00±0.07）、p53-/-+PTK2组（23.33±3.06）及p53-/-+c-Myc组（36.00±2.65）单层细胞克隆形成数量增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,PTK2+c-Myc组、PTK2组及c-Myc组单层细胞克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（6.67±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞软琼脂中克隆形成数量显着增加（82.67±6.81）,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组相比,其他6组基因修饰细胞软琼脂中克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。4基因修饰小鼠卵巢上皮细胞迁移和侵袭结果与对照组（16.00±1.00）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞迁移数量（85.33±5.03）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-+PTK2组（26.00±2.00）和p53-/-+c-Myc组（34.00±3.60）细胞迁移数量增加（P<0.01）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-组（15.33±1.53）、PTK2组（14.00±2.00）、c-Myc组（18.67±2.08）及PTK2+c-Myc组（17.33±1.53）细胞迁移数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（11.00±1.00）及其他6组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞侵袭数量（60.30±6.11）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（11.00±1.00）相比,p53-/-组（20.33±2.52）、PTK2+c-Myc组（21.00±3.46）、p53-/-+PTK2组（20.67±3.06）及p53-/-+c-Myc组（21.00±2.65）细胞侵袭数量增加（P<0.05）。与对照组（11.00±1.00）相比,PTK2组（12.33±0.58）和c-Myc组（14.00±1.00）细胞侵袭数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。5基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的筛选诱发小鼠原代细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞特征,能在悬浮状态下成簇生长是本研究能否成功的关键。p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力、细胞克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力显着高于对照组和其他6组基因修饰细胞株（P<0.01）。虽然p53-/-+PTK2组和p53-/-+c-Myc组单层细胞克隆形成、细胞侵袭和迁移数量高于对照组（P<0.05）,然而p53-/-+PTK2和p53-/-+c-Myc组软琼脂细胞克隆形成数量与单基因修饰组相比,无统计学差异（P>0.05）,而p53-/-+c-Myc+PTK2组软琼脂细胞克隆形成数量显着多于其他各组（P<0.001）。软琼脂中克隆形成试验结果可以反应细胞锚定非依赖性生长能力,即悬浮状态下细胞成簇生长能力,可以作为评判细胞是否具有肿瘤生长特性的金标准。结果说明只有p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞获得了肿瘤细胞锚定非依赖性生长的特性。因此,我们认为在8组基因修饰组合细胞中,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞具有潜在成瘤能力,本课题筛选出p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株进行小鼠卵巢原位移植瘤模型构建。6荧光素酶基因标记小鼠卵巢上皮细胞利用慢病毒载体包装荧光素酶基因,分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞和p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株,传代培养后测定细胞荧光强度值,结果显示两组细胞的荧光值均大于106,说明荧光素酶基因已经整合到小鼠细胞DNA中,可以进行后续移植瘤模型的构建。7基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在NSG小鼠成瘤将p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在显微镜下种植到NSG小鼠单侧卵巢组织,构建小鼠卵巢原位移植瘤模型。每周进行荧光强度值监测,12周后可以观察到基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠卵巢组织形成肿瘤。处死小鼠,发现基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠出现血性腹水。剥离卵巢,发现卵巢组织周围出现肿瘤组织。查看肿瘤转移情况,发现p53-/-+c-Myc+PTK2组小鼠出现广泛腹腔转移,转移的脏器包括肝脏、脾脏和肠等。结论本部分成功构建了p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株,并应用p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株成功建立了小鼠卵巢癌模型,模拟了卵巢癌体内形成和转移的过程,该细胞株有望用于卵巢癌发生和发展的分子机制研究。第二部分PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为中的作用。材料与方法1材料1.1细胞株:SKOV3、OVCAR8细胞购于美国菌种中心。1.2质粒:PTK2基因敲除质粒。2方法2.1统计分析Kaplan Meir Plot数据库PTK2在卵巢癌组织中的表达情况及与预后的关系;采用免疫荧光方法检测卵巢癌组织及癌旁组织中PTK2的表达。2.2利用慢病毒载体包装PTK2基因敲除质粒。建立PTK2基因敲除质粒稳定转染细胞株,对照组为空质粒转染组。同时采用小分子抑制剂GSK2256098抑制PTK2关键激活位点（p-FAK）Y397,进行靶向抑制PTK2活化,对照组为DMSO对照。2.3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,MTT方法、细胞克隆形成实验检测细胞增殖、克隆形成能力变化情况。Transwell迁移/侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力变化情况。2.4统计方法见第一部分。结果1 PTK2在卵巢癌组织中高表达且与卵巢癌患者预后相关PTK2高表达组患者生存期显着低于PTK2低表达组（P<0.05）。PTK2在肿瘤细胞胞浆中强染色,与癌旁组织相比,PTK2在卵巢癌组织中高表达。2敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞中PTK2蛋白及磷酸化水平敲除PTK2基因,在SKOV3和OVCAR8细胞系中均检测不到PTK2的表达。检测GSK2256098对PTK2的主要激活位点Y397的抑制效果,GSK2256098给药浓度分别为0、5、10、20、40μmol/L,作用时间24 h。与对照组相比,当GSK2256098浓度为40μmol/L时对卵巢癌细胞中p-FAK抑制效果显着,差异具有统计学意义（P<0.001）。3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的增殖能力与敲除对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在PTK2敲除组显着降低（P<0.05）。与加药对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在GSK2256098组显着降低（P<0.05）。4敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的克隆形成能力与敲除对照组（75.67±5.50）、（46.33±6.50）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（18.67±4.50）、（11.00±4.60）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（53.67±4.16）、（34.00±4.00）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（17.00±4.00）、（13.7±4.04）显着降低（P<0.05）。5敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力与敲除对照组（106.30±8.50）、（39.67±8.08）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（43.70±8.50）、（20.67±4.51）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（73.33±8.02）、（55.00±7.21）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（27.67±3.51）、（28.00±7.00）显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞侵袭实验结果表明,与敲除对照组（79.33±6.03）、（42.00±4.58）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（19.00±2.00）、（23.00±3.00）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（80.30±8.96）、（36.33±5.69）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（22.67±2.52）、（18.33±2.52）显着降低（P<0.05）。结论PTK2在卵巢癌中发挥促癌作用;PTK2敲除或靶向抑制降低了卵巢癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力;PTK2有望成为卵巢癌的早期治疗靶点。第三部分PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用。材料与方法1材料动物:实验选用4周大小的NSG免疫缺陷雌性小鼠。2方法2.1敲除PTK2基因后,构建人卵巢癌SKOV3细胞NSG免疫缺陷小鼠原位移植瘤模型,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.2将人卵巢癌细胞OVCAR8种植到小鼠卵巢组织,随机分成两组,一组采用GSK2256098治疗（灌胃,75 mg/kg/d,每周治疗5天,共4周）,另一组采用DMSO进行对照治疗,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.3统计方法同第一部分。结果1 PTK2敲除后抑制卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与敲除对照组相比,PTK2敲除组卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离肿瘤组织,与敲除对照组相比,PTK2敲除组小鼠卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。对照组小鼠肝脏、脾脏和肠等多个器官均出现肿瘤组织转移,而PTK2敲除组小鼠未发现肿瘤组织转移情况。2抑制PTK2活性后降低卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离小鼠肿瘤组织,与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠原位卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。治疗对照组出现肝脏、脾脏及肠肿瘤组织转移,而GSK2256098治疗组未发现肿瘤组织转移现象。结论PTK2敲除或靶向抑制降低卵巢癌小鼠原位移植瘤的形成和转移能力
许聪[10]（2020）在《AJAP1在乳腺癌进展过程中的作用及其机制的探讨》文中提出研究目的乳腺癌是一种起源于上皮细胞的异质性肿瘤,多年来也是世界范围内威胁女性身体健康的头号杀手。粘合连接是上皮细胞的三大主要连接方式（另外两个是紧密连接,桥粒与半桥粒）之一,已经被证实在各种癌症进展中起着至关重要的作用。而对于粘合连接在乳腺癌中的报道还很少。另外一方面,粘合连接相关蛋白1（AJAP1）,又被称作Shrew-1,是最初在上皮细胞中发现的一种新的与粘合连接相关的蛋白。其已被证实在多种肿瘤发展过程中起着重要作用。但是AJAP1在乳腺癌中的作用还未得到充分阐述。本研究旨在分析AJAP1在乳腺癌中的作用以及结合生信结果探索其影响乳腺癌进展的相关机制,并提高对于粘合连接的认识。研究方法1.首先运用数据库分析AJAP1的研究价值,然后运用临床数据分析AJAP1与乳腺癌患者的临床病理参数关系以及对于患者预后的影响;接着选取相关细胞系构建AJAP1过表达和敲除的细胞系,运用MTT、Transwell、划痕、平板克隆、流式细胞学技术来分别检测AJAP1对乳腺癌细胞的迁移、增殖、侵袭能力的影响;2.运用STRING软件分析,找出与AJAP1互作的蛋白β-catenin,然后运用免疫组织化学的方法,根据β-catenin的不同定位并分别分析其与乳腺癌患者的临床病理参数和生存的关系以及与AJAP1表达之间的关系;Co-IP实验、核浆分离实验、泛素化实验、luciferase等实验进一步明确AJAP1与β-catenin的相互调控作用以及对下游通路的影响;在AJAP1 KD组中设计敲除β-catenin的回复实验,体内、体外探讨AJAP1是否是通过β-catenin来发挥其抑制乳腺癌迁移、侵袭、增殖的功能;3.进一步分析并验证AJAP1调控β-catenin轴的上游分子,通过Co-IP实验、免疫荧光、核浆分离实验、luciferase、构建小鼠体内模型等实验明确EGF/EGFR轴对于AJAP1-β-catenin的调控作用;4.另外一方面,在构建AJAP1和Sh AJAP1细胞系过程中,发现细胞形态发生明显变化,接着通过相关实验观察AJAP1对EMT以及TGF-β1诱导的EMT、乳腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响;5.运用mi Rtarbase和mi RDB数据库网站预测与AJAP1相结合的靶向microRNA,同时通过构建不同区段的突变体,运用luciferase等实验验证AJAP1与其靶向microRNA两者之间的特异性靶向调控关系;并通过MTT等细胞功能学实验确定其靶向microRNA在乳腺癌中的具体作用;随后设计挽救实验验证AJAP1是否能够特异性抑制其靶向mi RNA在乳腺癌中的作用;然后通过Jasper网站预测并用ChIP等实验验证调控AJAP1的EMT相关转录因子(锌指E盒结合蛋白1（Zinc-finger E-box binding protein 1）ZEB1的具体结合位点,从而进一步提示ZEB1-miR-3941-AJAP1在TGF-β1诱导的乳腺癌的迁移侵袭增殖方面的具体调控机制。研究结果1.GOBO、Oncomine和KM-plotter等数据库及283例乳腺癌组织免疫组化结果表明:AJAP1低表达与乳腺癌更高的组织学分级和较多的淋巴结转移个数有关,并且预示着患者的不良预后;细胞功能学实验结果表明AJAP1过表达抑制乳腺癌的增殖、迁移和侵袭能力并且流式细胞学周期实验结果证明AJAP1高表达抑制G0/G1期的细胞,提高S期和G2期的细胞比率;2.283例乳腺癌的组织样本的免疫组化结果表明AJAP1的表达水平与β-catenin的不同定位有关,实验结果证实无论内源性还是外源性AJAP1都可以与β-catenin相互结合,形成复合体,而敲除AJAP1过后抑制了β-catenin的泛素化降解,促进了β-catenin在细胞质中积聚进而可以进一步进入到细胞核里,从而激活了β-catenin的转录活性和下游基因的表达;并且回复实验结果证明在Sh AJAP1细胞中敲除β-catenin过后,ShAJAP1促进乳腺癌的增殖、迁移和侵袭的作用被β-catenin明显削弱,说明β-catenin是AJAP1发挥其抑癌作用的中间调控子。3.进一步分析调控AJAP1-β-catenin的上游分子,结果发现EGF能显着降低AJAP1的表达,促进β-catenin的入核活动,Co-IP实验结果证实EGF抑制AJAP1与β-catenin两者复合体的结合效率,luciferase等实验证实EGF抑制β-catenin转录活性,促进β-catenin下游基因C-myc和Cyclin D1的表达,另一方面敲除EGFR过后结果显示明显抑制了AJAP1的表达,并且回复实验结果也证实EGFR/AJAP1 KD组相对于EGFR KD组明显促进β-catenin的启动子活性,而AJAP1也抵消了EGFR在体内促癌作用,以上结果也证明EGF/EGFR信号轴削弱AJAP1的表达进而进一步促进β-catenin的核定位。4.构建AJAP1敲除和过表达细胞系,通过RT-q PCR、Western blot和免疫荧光实验结果发现敲除AJAP1过后显着促进乳腺癌细胞发生EMT,使得上皮标记物E-cadherin表达减少,而间质标记物N-cadherin和Vimentin表达增加,过表达AJAP1过后则取得相反结果;除此之外,通过向细胞中添加TGF-β1观察发现AJAP1能够抑制TGF-β1引起的乳腺癌细胞的增殖、侵袭和EMT。5.为了探究可能调控AJAP1的靶向miRNA,本研究通过数据库及构建相关突变体和luciferase等实验发现miR-3941靶向调控AJAP1的表达,并且KMplotter数据库和相关实验等结果证实miR-3941在乳腺癌组织中含量高,并且其高表达提示患者的较差的预后,此外miR-3941高表达能显着增强细胞的增殖、迁移和侵袭能力,随后Chip等实验结果证实ZEB1能够结合在AJAP1启动子上的第一个和第三个E-box区域,转录抑制AJAP1的表达同时ZEB1的表达却能被mi R-3941激活。结论在乳腺癌细胞中,目前发现并证实了AJAP1可以通过以下两种路径调控乳腺癌的进展:首先EGF/EGFR负反馈于AJAP1对β-catenin的调控,促进β-catenin入核和其下游基因的表达来调控乳腺癌的进展;另一方面,ZEB1可以结合在AJAP1启动子区域的第一个和第三个E-box区域转录抑制AJAP1的表达,而此过程促进了miR-3941的表达,进一步激活乳腺癌细胞发生EMT和促进TGF-β1诱导的乳腺癌细胞的一系列恶性行为的发生。
二、乳腺癌癌旁增生腺上皮的p53蛋白表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乳腺癌癌旁增生腺上皮的p53蛋白表达（论文提纲范文）
（1）ING4、p53和p21在子宫内膜样癌中的表达及意义（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 组织芯片的制备 |
| 1.3.2 免疫组织化学染色方法 |
| 1.3.3 Western blot法 |
| 1.4 阳性结果判定 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 组织芯片质量 |
| 2.2 三组子宫内膜组织中ING4、p53和p21蛋白的定位及阳性表达率 |
| 2.3 ING4、p53和p21蛋白表达情况与子宫内膜样癌临床病理特征之间的关系 |
| 2.4 Western blot检测子宫内膜样癌和癌旁组织ING4、p53和p21蛋白表达情况 |
| 3 讨论 |
（2）BLM-EZH2相互作用影响前列腺癌细胞增殖的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 文献综述 |
| 1 前列腺癌 |
| 1.1 PCa发病现状 |
| 1.2 PCa形成因素 |
| 1.3 PCa发生发展分子机制 |
| 1.4 PSA与PCa的关系 |
| 2 肿瘤分子标志物与PCa |
| 2.1 肿瘤分子标志物与癌症 |
| 2.2 PCa的肿瘤分子标志物 |
| 2.3 肿瘤标志物在PCa药物靶向治疗中的应用 |
| 3 BLM解旋酶 |
| 3.1 BLM解旋酶的结构与功能 |
| 3.2 BLM解旋酶的细胞生物学功能 |
| 3.3 BLM解旋酶与肿瘤 |
| 4 EZH2 蛋白 |
| 4.1 EZH2蛋白的结构与分子功能 |
| 4.2 EZH2蛋白与肿瘤 |
| 5 BLM、EZH2与PCa |
| 5.1 BLM、EZH2在PCa的靶向研究 |
| 5.2 BLM和EZH2与PCa的相关性分析 |
| 6.本研究的目的意义 |
| 7.研究内容与技术路线 |
| 7.1 研究内容 |
| 7.2 技术路线 |
| 第一章 BLM相互作用蛋白筛选和MS鉴定及BLM/EZH2 的定位 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要实验仪器 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 细胞系 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 蛋白提取 |
| 2.3 蛋白含量测定(BCA微孔酶标仪法) |
| 2.4 免疫共沉淀(免疫磁珠法) |
| 2.5 SDS-PAGE电泳 |
| 2.6 Western Blotting检测 |
| 2.7 生物信息学分析 |
| 2.8 原核表达载体构建和蛋白诱导表达 |
| 2.9 原核蛋白提取 |
| 2.10 GST-pull down |
| 2.11 间接免疫荧光 |
| 2.12 高效液相色谱质谱分析 |
| 2.13 数据统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 BLM蛋白在RWPE-1、PC3、22RV-1、LNcap细胞中的表达 |
| 3.2 免疫沉淀联合质谱分析,筛选与BLM具有互作的蛋白 |
| 3.3 生物信息学分析筛选互作蛋白 |
| 3.4 Co-IP正反向验证BLM与EZH2存在相互作用 |
| 3.5 BLM蛋白与EZH2蛋白体外相互作用验证 |
| 3.6 前列腺癌细胞中BLM与EZH2的亚细胞定位 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 BLM及EZH2蛋白在前列腺癌组织中的表达水平及其关联 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验标本 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 免疫组化实验 |
| 2.2 生物信息学分析 |
| 2.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 BLM和EZH2在癌组织和对照组织中的差异性比较 |
| 3.2 BLM和EZH2在癌组织和对照组织中的表达分布 |
| 3.3 BLM和EZH2在前列腺组织中的表达与临床病理资料相关性分析 |
| 3.4 生物信息学分析前列腺癌组织和正常组织中蛋白表达情况 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 BLM和EZH2干扰对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 细胞系 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞蛋白提取和浓度测定 |
| 2.3 蛋白的WB检测 |
| 2.4 siRNA干扰序列的合成 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 细胞存活率检测 |
| 2.7 细胞周期检测 |
| 2.8 细胞侵袭和迁移实验 |
| 2.9 细胞划痕实验 |
| 2.10 细胞克隆形成实验 |
| 2.11 细胞增殖实验(MTS法) |
| 2.12 数据统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 前列腺癌细胞系的侵袭、迁移和增殖能力检测 |
| 3.2 BLM特异性抑制剂对PC3细胞活性及细胞周期的影响 |
| 3.3 BLM、EZH2和P53蛋白干扰前后在癌细胞中的表达情况 |
| 3.4 干扰BLM和EZH2后对PC3细胞增殖、迁移、侵袭、划痕愈合和克隆形成的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 BLM和EZH2干扰或表达对前列腺癌细胞的影响及其机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 细胞系及载体 |
| 1.4 实验试剂及配制方法 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞蛋白提取和浓度测定 |
| 2.3 蛋白的WB检测 |
| 2.4 重组质粒的构建 |
| 2.5 ChIP-seq实验 |
| 2.6 双荧光素酶活性的检测 |
| 2.7 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 2.8 数据统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 ChIP-seq实验检测EZH2可能作用的启动子区 |
| 3.2 利用双荧光素酶实验验证EZH2蛋白与MDM2启动子区的结合 |
| 3.3 干扰或过表达BLM和EZH2对PC3细胞P53和MDM2蛋白的影响 |
| 3.4 干扰或过表达BLM和EZH2对PC3细胞增殖、迁移、侵袭、划痕愈合、克隆形成的影响 |
| 3.5 BLM和EZH2相互作用对PC3细胞P53信号通路的影响 |
| 3.6 裸鼠成瘤实验检测BLM和EZH2对PC3细胞成瘤能力的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论、创新点及展望 |
| 1.结论 |
| 2.创新点 |
| 3.展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ:在读博士期间取得的科研成果 |
| 附录Ⅱ:论文涉及的试剂配方 |
（3）TRIM36在食管癌中的功能及相关分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 TRIM36和β-catenin在食管癌组织中的表达及与预后的关系 |
| 前言 |
| 材料及方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图及附表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TRIM36对食管癌细胞生长的影响及相关机制探究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图及附表 |
| 参考文献 |
| 综述TRIM家族成员在肿瘤发生及发展过程中的功能 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English articles |
| Article Ⅰ |
| Article Ⅱ |
| 附：原始资料 |
（4）PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 H.pylori主要的致癌因子 |
| 1.3 H.pylori感染胃黏膜改变的关键分子PMEPA1 |
| 第2章 PMEPA1在胃癌组织中的表达、预后及其生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 临床组织标本及资料收集 |
| 2.1.2 生物信息学数据库 |
| 2.1.3 主要试剂耗材 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学数据挖掘 |
| 2.2.2 组织蛋白提取、BCA定量及免疫印迹实验 |
| 2.2.3 RNA提取、逆转录及荧光定量PCR实验 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PMEPA1在胃癌组织中显着高表达 |
| 2.3.2 PMEPA1与胃癌患者预后的关系 |
| 2.3.3 PMEPA1诊断胃癌的临床价值 |
| 2.3.4 生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 H.pylori感染及其毒力因子对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 临床组织标本收集 |
| 3.1.2 细胞系及实验菌株 |
| 3.1.3 质粒及感受态细胞 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.1.6 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 幽门螺杆菌的复苏、鉴定、传代 |
| 3.2.2 H.pylori7.13和PMSS1 oipA基因敲除菌株的构建 |
| 3.2.3 制备抗oipA重组抗原的免疫兔多克隆抗体 |
| 3.2.4 细胞培养及细菌细胞共培养模型的构建 |
| 3.2.5 蛋白提取、BCA定量及免疫印迹实验 |
| 3.2.6 RNA提取、逆转录及荧光定量PCR实验 |
| 3.2.7 石蜡切片及免疫组织化学 |
| 3.2.8 细胞转录组学 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Hp7.13和PMSS1 菌株的oipA基因敲除菌株的构建及鉴定 |
| 3.3.2 H.pylori感染上调胃上皮细胞中PMEPA1的表达水平 |
| 3.3.3 H.pylori cag A和 oipA影响胃上皮细胞PMEPA1的表达 |
| 3.3.4 PMEPA1在不同胃黏膜病变阶段的表达及与H.pylori感染的关系 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞系及实验菌株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 慢病毒稳转细胞株的构建 |
| 4.2.2 CCK8 细胞增殖实验 |
| 4.2.3 实时无标记细胞增殖实验 |
| 4.2.4 Transwell细胞迁移和侵袭实验 |
| 4.2.5 划痕修复实验 |
| 4.2.6 克隆形成实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 成功构建PMEPA1过表达和敲减稳转细胞株 |
| 4.3.2 PMEPA1对胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 4.3.3 PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮和胃癌细胞的生物学行为的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 PMEPA1在H.pylori感染胃上皮细胞改变的转录组学研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞系及实验菌株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞转录组测序流程 |
| 5.2.2 转录组测序数据分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 测序样品的RNA验证 |
| 5.3.2 PMEPA1过表达或敲减对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平的影响 |
| 5.3.3 Hp感染对过表达或敲减PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的影响 |
| 5.3.4 PMEPA1对不同Hp菌株感染的胃上皮细胞转录水平的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 小结和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述一 PMEPA1在肿瘤中的作用及机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 幽门螺杆菌外膜蛋白致病机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（5）结直肠癌中ARF6表达的临床意义及其通路分子的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词表 |
| 主要材料和仪器 |
| 前言 |
| 一、结直肠癌 |
| 二、ARF6 概述 |
| 参考文献 |
| 第一部分 ARF6 在结直肠癌中的表达及临床意义研究 |
| 一、方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 结直肠癌中ARF6 上游调控因子的研究 |
| 一、方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ARF6 通路分子在结直肠癌中的预后意义研究 |
| 一、方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 综述 ARF6在实体肿瘤演进中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（6）Hsa＿circ0006332和Hsa＿circ0000069调控宫颈癌发展的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 Hsa_circ00063322 吸附miR-548q促进宫颈癌细胞增殖、减弱药物敏感性并调节HPV L2 表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 相关实验仪器及材料 |
| 2.1.2 实验步骤与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 宫颈癌中Hsa_circ00063322 的表达特征及转录调节 |
| 2.2.2 Hsa_circ00063322 影响CC细胞增殖和药物敏感性,以及在体肿瘤生长 |
| 2.2.3 Hsa_circ00063322 作为miRNAs海绵吸附miR-548q |
| 2.2.4 Hsa_circ00063322 通过miR-548q调节L2 表达,以及细胞增殖和药物敏感性 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Hsa_circ0000069 通过吸附miR-4426 促进宫颈癌细胞增殖和迁移 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 相关实验仪器及材料 |
| 3.1.2 实验步骤与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 宫颈癌中Hsa_circ0000069 的表达特征 |
| 3.2.2 m6A修饰提高了Hsa_circ0000069 转录本的稳定性 |
| 3.2.3 Hsa_circ0000069 促进宫颈癌细胞增殖和迁移 |
| 3.2.4 Hsa_circ0000069 通过吸附miR-4426 促进宫颈癌细胞增殖和迁移 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 妇科肿瘤分子标志物及其个体化精准医疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间学术成果 |
| 致谢 |
（7）Ring1b及其介导的染色质重塑在乳腺癌转移中的作用及分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照 |
| 一、前言 |
| 1.乳腺癌研究进展 |
| 1.1 乳腺癌概况 |
| 1.2 乳腺癌的病理特征简介 |
| 1.3 乳腺癌的诊疗进展简介 |
| 1.4 乳腺癌转移及其分子机制研究进展 |
| 2.Polycomb Group(PcG)蛋白家族研究进展 |
| 2.1 PcG蛋白家族概况 |
| 2.2 PcG蛋白的募集机制研究进展 |
| 2.3 PcG蛋白抑制基因转录的分子机制研究进展 |
| 2.4 Ring1b的结构及其分子机制研究进展 |
| 2.5 Ring1b对细胞命运的调控简介 |
| 2.6 Ring1b与肿瘤研究进展 |
| 3.DEAD-box RNA解旋酶(DDX)家族研究进展 |
| 3.1 DDX家族概况 |
| 3.2 DDX3X的结构、功能及在肿瘤中研究进展 |
| 3.3 DDX5的结构、功能及在肿瘤中研究进展 |
| 4.上皮-间质转化转录因子(EMT TF)家族研究进展 |
| 4.1 EMT简介 |
| 4.2 EMT标志分子与肿瘤转移简介 |
| 4.3 E-cadherin与肿瘤EMT研究进展 |
| 4.4 EMT TFs的结构、功能及在肿瘤转移中的研究进展 |
| 5.本研究立题依据与研究内容 |
| 5.1 立题依据 |
| 5.2 研究内容 |
| 二、实验材料及仪器 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 乳腺癌组织芯片 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 细胞系 |
| 1.4 质粒 |
| 1.5 抗体 |
| 1.6 试剂 |
| 1.7 耗材 |
| 2.实验仪器 |
| 三、实验方法 |
| 1.细胞培养 |
| 1.1 培养条件 |
| 1.2 细胞复苏 |
| 1.3 细胞传代 |
| 1.4 细胞冻存 |
| 2.RNA提取及浓度测定 |
| 3.cDNA文库构建 |
| 4.普通PRC及产物纯化 |
| 4.1 PCR反应 |
| 4.2 PCR产物纯化 |
| 5.凝胶DNA回收 |
| 6.重组质粒构建 |
| 6.1 pcDNA3.1(+)重组质粒构建 |
| 6.2 p LVTHM重组质粒构建 |
| 6.3 p WPXLD重组质粒构建 |
| 7.质粒转化 |
| 8.质粒小量提取 |
| 9.重组质粒鉴定 |
| 9.1 PCR验证 |
| 9.2 质粒测序 |
| 10.质粒大量提取 |
| 11.质粒瞬时转染 |
| 11.1 293T细胞转染 |
| 11.2 其他细胞转染 |
| 12.慢病毒制备及感染 |
| 13.si-RNA转染 |
| 14.实时荧光定量PCR |
| 15.蛋白提取及浓度测定 |
| 16.免疫印迹 |
| 17.蛋白银染及质谱分析 |
| 18.细胞免疫荧光 |
| 19.细胞周期分析 |
| 20.细胞增殖分析 |
| 21.细胞迁移及侵袭 |
| 21.1 细胞迁移 |
| 21.2 细胞侵袭 |
| 22.免疫共沉淀 |
| 23.染色质免疫共沉淀 |
| 23.1 DNA-蛋白交联 |
| 23.2 细胞核提取及染色质消化 |
| 23.3 染色质消化及浓度分析 |
| 23.4 染色质免疫共沉淀 |
| 23.5 DNA-染色质解交联 |
| 23.6 DNA纯化及定量分析 |
| 24.乳腺癌转移小鼠模型 |
| 24.1 乳腺癌转移小鼠模型构建 |
| 24.2 肺转移GFP~+肿瘤细胞分析 |
| 25.石蜡包埋及切片 |
| 26.H&E染色 |
| 27.IHC染色及分析 |
| 27.1 IHC染色 |
| 27.2 IHC阳性率分析 |
| 28.图像处理及统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 1.乳腺癌细胞转移伴随着Ring1b介导的染色质重塑 |
| 1.1 乳腺癌细胞转移过程伴随着Ring1b表达激活及H2AK119ub依赖的染色质重塑 |
| 1.2 Ring1b是介导乳腺癌细胞转移过程中H2AK119ub依赖的染色质重塑的关键因子 |
| 1.3 Ring1b及 H2AK119ub可能与乳腺癌的发生、发展密切相关 |
| 2.Ring1b通过调控EMT相关基因表达促进乳腺癌细胞转移 |
| 2.1 Ring1b是 TGF-β诱导和维持的乳腺癌细胞EMT的必要条件 |
| 2.2 Ring1b能够促进乳腺癌细胞发生体内远端转移 |
| 2.3 Ring1b能够调控乳腺癌细胞EMT相关基因表达 |
| 3.Ring1b在乳腺癌细胞中能够形成多种E-cadherin转录抑制复合物 |
| 3.1 Ring1b能够与多种转录因子相结合 |
| 3.2 Ring1b复合物能够选择性地表达于不同转移能力的乳腺癌细胞中 |
| 3.3 Ring1b复合物能够抑制乳腺癌细胞E-cadherin表达 |
| 3.4 Ring1b复合物组分的高表达可能是募集Ring1b的必要条件 |
| 4.Ring1b介导的染色质重塑能够抑制进乳腺癌细胞E-cadherin基因转录 |
| 4.1 Ring1b复合物能被选择性地募集至E-cadherin基因启动区 |
| 4.2 Ring1b复合物能抑制乳腺癌细胞E-cadherin基因转录 |
| 4.3 Ring1b蛋白复合物能够通过其介导染色质重塑抑制E-cadherin基因转录 |
| 4.4 结合于E-cadherin 基因启动子不同位点的Ring1b复合物能够协同抑制E-cadherin 基因转录 |
| 5.Ring1b复合物是乳腺癌转移及预后的潜在临床标志物 |
| 5.1 Ring1b复合物能够预示乳腺癌转移 |
| 5.2 Ring1b复合物的表达能够预示乳腺癌组织E-cadherin的表达缺失 |
| 5.3 Ring1b复合物组分之间的表达在乳腺癌组织中具有协同性 |
| 5.4 Ring1b复合物的表达能够预示乳腺癌不良预后 |
| 5.5 Ring1b复合物在乳腺癌组织中的其他临床意义 |
| 6.Ring1b复合物是多种肿瘤不良预后的潜在临床标志物 |
| 6.1 Ring1b复合物是肺腺癌不良预后的潜在临床标志物 |
| 6.2 Ring1b复合物是肝癌不良预后的潜在临床标志物 |
| 6.3 Ring1b复合物是肾癌不良预后的潜在临床标志物 |
| 6.4 Ring1b复合物不能预示头颈部癌、胃癌及宫颈癌等肿瘤的不良预后 |
| 五、讨论 |
| 1.Ring1b是TGF-β诱导乳腺癌细胞EMT发生发展的关键因子 |
| 1.1 Ring1b的表达激活及其依赖的染色质重塑可能在EMT发生中具有普遍性 |
| 1.2 Ring1b能在多个层面参与调控乳腺癌细胞EMT进程 |
| 2.Ring1b复合物的选择性结合与表达能够影响乳腺癌细胞转移 |
| 2.1 Ring1b复合物在细胞中的选择性结合可能与E-cadherin表达水平及EMT“能级跃迁”有关 |
| 2.2 不同Ring1b复合物对E-cadherin表达抑制具有协同性 |
| 3.Ring1b复合物介导的染色质重塑与多种表观遗传标志分子有关 |
| 4.Ring1b复合物的募集方式与其所属PRC1亚型密切相关 |
| 5.Ring1b复合物能够作为多种肿瘤诊治的潜在临床标志物 |
| 5.1 Ring1b复合物是乳腺癌转移潜在的临床标志性物 |
| 5.2 Ring1b复合物是多种肿瘤预后潜在的临床标志性物 |
| 5.3 Ring1b复合物不适用于预示综合性临床病理进程 |
| 5.4 Ring1b复合物组分可能是潜在的肿瘤治疗靶点 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
（8）ING3在乳腺癌中的表达及功能研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 ING3在恶性肿瘤研究中的新进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 PTK2 在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 本课题创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 PTK2在肿瘤中的研究新进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（10）AJAP1在乳腺癌进展过程中的作用及其机制的探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、AJAP1在乳腺癌中的表达和作用 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 AJAP1在乳腺癌中的表达情况 |
| 1.2.2 AJAP1的表达水平与乳腺癌患者的临床病理参数的关系 |
| 1.2.3 AJAP1对乳腺癌的迁移,侵袭和增殖的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、AJAP1与β-catenin的不同定位在乳腺癌组织中的关系 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 β-catenin在乳腺癌中的表达情况 |
| 2.2.2 β-catenin的不同定位与乳腺癌患者的临床病理参数关系 |
| 2.2.3 AJAP1与β-catenin的不同定位的关系 |
| 2.2.4 亚组分析β-catenin的不同定位和AJAP1 的表达对于评估患者总生存的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、AJAP1 通过调控β-catenin入核来调控乳腺癌的进展 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 统计学方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Co-IP实验验证外源性AJAP1与β-catenin相互作用 |
| 3.2.2 Co-IP实验验证内源性AJAP1与β-catenin相互作用 |
| 3.2.3 AJAP1 抑制β-catenin从细胞质转移到细胞核 |
| 3.2.4 AJAP1 缺失抑制了β-catenin的泛素化降解 |
| 3.2.5 AJAP1 调控β-catenin的转录活性和下游基因C-myc和 Cyclin D1 的表达 |
| 3.2.6 AJAP1 调控β-catenin来发挥其抑制乳腺癌进展的作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、EGF/EGFR信号轴削弱AJAP1 的表达促进β-catenin的核定位 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 统计学方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 EGF抑制AJAP1 的表达并且促进β-catenin的核表达 |
| 4.2.2 EGF抑制AJAP1与β-catenin复合体的形成,激活β-catenin的启动子活性和其下游基因的表达 |
| 4.2.3 EGFR促进β-catenin的核定位以及下游基因的表达 |
| 4.2.4 AJAP1 抵消了EGFR在体内的促癌作用 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 五、AJAP1调控乳腺癌的上皮间质转化 |
| 5.1 对象和方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.1.3 统计学方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 AJAP1 调节EMT来控制乳腺癌的恶性行为 |
| 5.2.2 AJAP1 抑制TGF-β诱导的EMT和增殖和侵袭 |
| 5.2.3 体内实验证明AJAP1 抑制肝肺转移和EMT |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 六、miR-3941-ZEB1 调控AJAP1 抑制乳腺癌EMT的机制 |
| 6.1 对象和方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验方法 |
| 6.1.3 统计学方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 AJAP1是miR-3941 的靶基因 |
| 6.2.2 miR-3941促进乳腺癌的侵袭和增殖能力 |
| 6.2.3 AJAP1 过表达抑制miR-3941 的致瘤能力 |
| 6.2.4 ZEB1 通过结合到AJAP1 启动子区域的E-box区域抑制AJAP1 的表达 |
| 6.2.5 miR-3941 促进ZEB1 的表达 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 肌上皮细胞与乳腺导管原位癌浸润机制的研究新进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、乳腺癌癌旁增生腺上皮的p53蛋白表达（论文参考文献）
- [1]ING4、p53和p21在子宫内膜样癌中的表达及意义[J]. 李珍,董杏,宿晓晓,杜艳敏,张欢欢,曾宪旭. 实用肿瘤杂志, 2021(03)
- [2]BLM-EZH2相互作用影响前列腺癌细胞增殖的分子机制研究[D]. 阮涌. 贵州大学, 2021(01)
- [3]TRIM36在食管癌中的功能及相关分子机制研究[D]. 张华. 山东大学, 2021(11)
- [4]PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究[D]. 赵巧云. 南昌大学, 2021(01)
- [5]结直肠癌中ARF6表达的临床意义及其通路分子的研究[D]. 孙耀华. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(09)
- [6]Hsa＿circ0006332和Hsa＿circ0000069调控宫颈癌发展的机制研究[D]. 陈震. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [7]Ring1b及其介导的染色质重塑在乳腺癌转移中的作用及分子机制[D]. 王亚伟. 东北师范大学, 2021(09)
- [8]ING3在乳腺癌中的表达及功能研究[D]. 李回梦. 昆明医科大学, 2021(01)
- [9]基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究[D]. 闫欢. 郑州大学, 2020(02)
- [10]AJAP1在乳腺癌进展过程中的作用及其机制的探讨[D]. 许聪. 天津医科大学, 2020(06)