一、雷公藤甲素对小鼠腹腔巨噬细胞杀伤活性的影响（论文文献综述）
陈清[1]（2021）在《基于HMGB1/RAGE/NF-κB探讨雷公藤甲素的抗炎分子机制》文中认为目的:本研究旨在基于HMGB1/RAGE/NF-κB通路探讨雷公藤甲素（Triptolide,TP）对脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激的小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7增殖的影响及体外抗炎作用的分子机制。方法:体外培养RAW264.7细胞,以0.5μg/m L脂多糖刺激RAW264.7细胞8 h以诱导建立炎症模型,利用CCK8法筛选TP的最佳作用浓度即25n M。实验分为以下3组:空白组,模型组（LPS组）,实验组（LPS+TP组）,按实验因素处理8h后,利用ELISA法检测肿瘤坏死因子（TNF-α）,白介素1β（IL-1β）,白细胞介素-10（IL-10）等炎症因子的分泌情况。利用Western blot（WB）技术检测HMGB1/RAGE/NF-κB通路蛋白的表达,利用RT﹣PCR实验检测HMGB1/RAGE/NF-κB通路的m RNA表达水平。结果:与模型组相比,实验组炎症因子TNF-α,IL-1β和IL 10的分泌水平均显着降低,差异具有统计学意义（p<0.05）;与模型组相比,实验组中HMGB1/RAGE/NF-κB蛋白及m RNA表达均显着降低,差异具有统计学意义（p<0.05）。结论:体外细胞实验结果表明,TP可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子的产生,其机制可能与调节HMGB1/RAGE/NF-κB信号通路有关。
王文平[2]（2021）在《重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究》文中提出研究目的:药源性肝损伤是一项严重的公共卫生问题,据调查统计,我国药源性肝损伤的发病率逐年升高;重楼是一种临床常用中药,因其抗肿瘤活性日益受到重视。重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ是重楼中3种重要的皂苷类成分,越来越多的研究和报道显示其对多种肿瘤细胞均具有杀伤作用。但重楼在抗肿瘤作用的同时毒副作用研究较少,尤其是其单体类成分。本研究围绕重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在毒性及其作用机制进行深入的探索。以期为中药重楼的临床合理应用以及基于重楼皂苷单体的药物研发提供借鉴和参考。研究方法:（1）从细胞、模式生物-斑马鱼、动物3个层面进行了重楼皂苷单体的毒性评价。首先选择了 9种细胞考察了重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性情况,包括3种肝细胞（HepaRG、HL-7702和WRL-68细胞）,3种肾细胞（HK-2、HKC和293T细胞）和3种心脏细胞（H9c2、HUVEC和HCMEC细胞）;利用模式生物-斑马鱼模型考察不同浓度重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼生存率的影响,确定了 LC50、LC10与最大非致死浓度（MNLC）;体视荧光显微镜观察重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ给药前后肝脏、肾脏和心脏的形态,统计斑马鱼的肾脏水肿率、心率和心包水肿率。利用Image-Pro Plus 5.1.0软件统计给予重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ前后斑马鱼肝脏面积和荧光强度、肾脏面积和荧光强度、心脏SV-BA距离,评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在肝、肾、心毒性;通过HE染色和TUNEL染色观察斑马鱼给药前后肝组织病理情况及肝细胞凋亡情况;通过小鼠的急性毒性实验,得出LC50值。然后进行小鼠血清生化检测和组织病理切片分析。各个层面数据相互支持,补充验证,使研究基础更加全面可靠,结论更加合理。（2）选用HepaRG细胞研究重楼皂苷Ⅰ的肝细胞毒性机制。利用酶标仪、流式细胞仪、倒置荧光显微镜等对HepaRG细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放、DAPI染色、活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）、细胞凋亡及细胞周期等进行测定,利用Western blot对凋亡相关蛋白进行检测;选用HUVEC细胞研究重楼皂苷Ⅰ的心血管毒性机制。从抑制新血管生成和促进心血管细胞凋亡两个方面评价了重楼皂苷Ⅰ的血管毒性机制。进行了LDH释放、细胞迁移、细胞凋亡、DAPI染色、细胞周期以及体外血管生成等研究,测定了近30个相关蛋白的表达。（3）利用TMT标记定量蛋白质组学技术检测给药组和对照组小鼠肝脏组织中的差异蛋白,对差异蛋白进行GO及Pathway通路富集分析;利用STRING11.0构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络;采用IPA软件进一步筛选出与表型相关的潜在生物标志物;利用Q300靶向代谢组学技术研究给药组和对照组小鼠血清样本中内源性代谢物的变化情况。采用PCA、OPLS-DA等分析小鼠内源性代谢物的轮廓变化。比较给药前后小鼠血清样本代谢谱的差异,寻找与重楼皂苷Ⅰ致肝毒性相关的代谢差异物及代谢调控网络。使用Cytoscape对蛋白组学和代谢组学做关联分析。采用PCR和Western blot技术对肝毒性机制中的关键蛋白进行进一步的验证。研究结果:（1）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ毒性实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有明显的细胞毒性,能显着的促进H9c2细胞外其余8种细胞的凋亡,且呈现浓度和时间依赖性。对于H9c2细胞,3种皂苷均呈现出低剂量促进增殖,高剂量抑制增殖的作用;斑马鱼实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼的LC50分别为121、213、570 ng/mL,LC10分别为109、178、456ng/mL,MNLC分别为99、146、357ng/mL;毒性器官评价方面,重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼具有显着的肝脏毒性,能明显降低斑马鱼肝脏面积和荧光强度;重楼皂苷Ⅰ能显着影响斑马鱼的心率,提示其具有心血管毒性;重楼皂苷Ⅰ和Ⅶ能降低斑马鱼肾脏面积和荧光强度,具有一定的肾毒性,但3种皂苷均未造成肾水肿;斑马鱼病理切片显示重楼皂苷Ⅰ给药组的肝组织出现空泡和严重的肝细胞坏死;TUNEL染色结果显示重楼皂苷Ⅰ给药组出现了肝细胞凋亡;动物实验结果:小鼠体内实验发现,重楼皂苷Ⅰ具有体内毒性,其LC50为24.5 mg/kg;给药组血清中ALT、AST显着升高,SOD降低;给药组病理切片显示出显着的肝细胞损伤和脂肪样变性以及一定的心脏毒性。（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着升高了 HepaRG细胞中ROS水平,引起MMP下降,Cyt c从线粒体向胞浆中释放,早期及晚期凋亡细胞增多,LDH的释放量升高。改变了周期蛋白P21、cyclinA、cyclinE和CDK2的表达,诱导细胞周期阻滞。并且明显激活了凋亡通路蛋白Fas、P53、caspase-3、caspase-8、caspase-9的表达,且呈现剂量依赖关系;重楼皂苷Ⅰ血管毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着促进了心血管细胞LDH的释放,抑制细胞迁移和血管生成,改变周期分布,诱导细胞凋亡。给药后的细胞中VEGFR2、p-VEGFR2、Src、p-Src、PI3K、Src、P38、PLCy 等近 30 种蛋白的表达均发生了改变。（3）蛋白组学结果:共筛选出302个差异蛋白,其中上调蛋白182个,下调蛋白120个。差异蛋白具有氧化还原酶活性、催化活性等分子功能,参与了脂肪酸代谢、有机酸的代谢、药物代谢、氧化还原过程等生物过程。主要分布在细胞质和细胞内膜结合细胞器包括线粒体、内质网等;Pathway结果显示,差异蛋白在细胞色素P450酶对药物的代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）等途径上富集程度较高;PPI网络分析发现差异蛋白主要聚集在三个功能区域,包括细胞色素P450酶、脂质代谢过程、氧化还原过程;IPA商业数据库筛选出9个与肝毒性相关的差异蛋白作为潜在生物标志物;代谢组学结果:给药组代谢物轮廓明显偏离对照组;通过多维和单维的差异代谢物的交集,筛选并初步鉴定出97种差异代谢物,25条代谢通路。结果归纳显示重楼皂苷Ⅰ造成了体内5个方面的代谢异常,包括氨基酸代谢、脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢、能量代谢、蛋白质合成;其中D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,花生四烯酸代谢,氨酰tRNA生物合成等代谢通路影响值相对较高;代表性差异代谢物为花生四烯酸、焦谷氨酸、乙醇酸、酰基肉碱等。对全文中研究的重楼皂苷Ⅰ的肝毒性情况进行了综合分析,总结并推测了重楼皂苷Ⅰ造成肝毒性的机制。采用qPCR及Western blot验证了关键蛋白Bax、CYP1A2、P53、Fas的表达,对推测的肝损伤机制进行了初步验证。研究结论:（1）细胞实验研究发现重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有肝脏、肾脏、心血管细胞毒性;斑马鱼实验研究确定了 3种皂苷中毒性最强的为重楼皂苷Ⅰ,毒性最明确的毒性靶部位是肝脏和心血管;斑马鱼肝脏病理切片、TUNEL染色,小鼠生化指标、病理切片检测进一步验证了重楼皂苷Ⅰ的肝脏和心脏毒性;（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制为ROS应激通路和死亡受体通路介导的细胞凋亡;心血管毒性主要作用通路为VEGFR2激活的下游PI3K/AKT/mTOR、Src/eNOS、PLCy/ERK/MEK、P38信号通路,JAK2/STAT3信号传导通路和Bcl-2家族介导的凋亡通路,从诱导心血管细胞凋亡和抑制新生血管两方面产生心血管毒性。（3）蛋白质组学和代谢组学实验结果结合全文数据推测重楼皂苷Ⅰ诱导的肝毒性机制可能为CYP450酶和脂质代谢介导的线粒体功能障碍为主体的肝细胞损伤。药物影响了:①多种CYP450酶。主要包括Ⅰ相代谢酶CYP1A1、CYP1A2和Ⅱ相代谢酶GSTA3和UGT1A1表达紊乱,呈现下调趋势。药物在体内的水解、代谢过程被减慢,随着作用时间的延长,药物毒性反应增加。未被代谢的药物作用可能作用于线粒体,造成线粒体功能障碍;也很有可能是Ⅱ相药物代谢酶下调,产生的毒性代谢中间产物作用于线粒体,进一步产生了肝脏毒性;②脂质代谢。线粒体损伤后β-氧化的功能受到影响,体内的游离脂肪酸不能被氧化而转化成甘油三脂,导致了体内脂质的蓄积。同时ATP合成减少,供能障碍。脂质蓄积还能产生脂毒性进一步影响线粒体功能,产生过量ROS;③线粒体氧化应激。过量的ROS生成诱导线粒体氧化应激,释放Cyt c,升高Bax,降低Bcl-2,进而激活caspase家族导致肝细胞凋亡。Western blot验证结果显示药物代谢酶CYP1A2显着下调以及凋亡关键蛋白Bax表达上调。qPCR结果显示凋亡相关基因P53、Bax以及Fas的表达均显着上调,验证实验佐证了机制推论的合理性。
孙文静[3]（2021）在《地锦多糖的制备及对小鼠免疫增强活性研究》文中提出多糖是中药的重要组成部分,具有增强免疫、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、等生物活性。多糖作为免疫增强剂对动物疾病具有增强抵抗力的作用。地锦草在我国分布范围广且药理作用广泛,具有显着的抗氧化、抗肿瘤以及抗菌抗炎的功效,有重要的临床应用和开发价值。本研究选择地锦多糖作为研究对象,从提取纯化、结构鉴定、对淋巴细胞免疫活性、对巨噬细胞功能及对小鼠巨噬细胞的抗氧化等方面初步筛选出3个效果较好的活性部位,进一步研究其体内对免疫抑制小鼠的免疫调节作用。试验Ⅰ地锦多糖的提取纯化采用一步醇沉和分步醇沉法提取粗地锦总多糖(EHPS tc)和各分级多糖EHPS60c、EHPS70c和EHPS80c。然后以脱色率、多糖保留率为指标,采用L25（56）正交设计对双氧水加入量、反应温度、p H值、反应时间等脱色条件进行优选。脱色后EHPStc经DEAE-Sephadex A-25葡聚糖凝胶柱层析,得到纯化的地锦多糖1(EHPStp-1)和地锦多糖2(EHPStp-2),分别用苯酚-硫酸法和考马斯亮兰法测定多糖和蛋白含量。结果表明,EHPStc最优脱色条件为反应温度50℃、反应时间4 h、p H值为2、双氧水加入量4%时,多糖脱色率达到71.10%,保留率为63.31%,多糖含量为74.52%。经柱层析纯化后EHPStp-1糖含量提高为95.36%,EHPStp-2糖含量提高为92.35%。因此可以看出,地锦多糖经过DEAE-Sephadex A-25葡聚糖凝胶柱的洗脱纯化可以显着提高多糖含量;经验证试验发现双氧水脱色工艺有效可行。试验Ⅱ地锦多糖的结构鉴定采用红外光谱法（IR）、紫外光谱法（UVS）、PMP柱前衍生高效液相色谱法（PMP-HPLC）、高效凝胶渗透色谱（HPGPC）法、硫酸咔唑法、刚果红法和核磁共振波谱法（NMR）等方法分析各多糖结构。结果表明,EHPStc和EHPStp-2中可能含有少量蛋白。EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2均符合多糖类物质红外光谱基本特征。EHPStp-1主要包括Glc（83.1%）、Gal（6.1%）、Glc UA（1.6%）;EHPStp-2主要包括Gal（25.6%）、Gal UA（22.2%）、Ara（16.6%）;EHPStc主要包括Glc（53.5%）、Ara（16.8%）、Gal（14.3%）。EHPStc和EHPStp-1的重均分子量分别为26.2和26.0 k Da;EHPStp-2重均分子量分别为145.6 k Da和8.9 k Da。EHPStp-1和EHPStp-2的糖醛酸含量分别为15.9%和27.9%。EHPStc和EHPStp-1均具有明显的三螺旋结构。EHPStp-1存在α构型的单糖;EHPStc存在α和β构型的单糖。经结构鉴定,水提醇沉提取物均为多糖,但多糖结构复杂,要得到具体的结构成分还需进一步检测。试验Ⅲ地锦多糖对淋巴细胞免疫活性的影响将EHPS60c、EHPS70c、EHPS80c、EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2加入到小鼠外周血淋巴细胞培养体系中,用MTT法测定其安全浓度;然后取安全浓度范围内6个多糖,分别单独或协同PHA加入到小鼠外周血淋巴细胞中,培养48 h后,测定淋巴细胞增殖(细胞A570值和最高淋巴细胞增殖率)的变化,筛选增强免疫活性的较好部位;将筛选出的3个多糖在31.25μg/m L时刺激淋巴细胞,分别在24 h、48 h和72 h收集细胞处理后,在流式细胞仪上检测各个时间点的周期分布情况和CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的变化;ELISA法测定免疫球蛋白IgA、IgG和细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-r的含量。结果表明,多糖单独刺激时EHPStp-1在15.625μg/m L时的细胞增殖率最高,为15.099%,其次为EHPStp-2在相同浓度时,达到12.129%;多糖与PHA共同刺激时,EHPStc在15.625μg/m L时的细胞增殖率最高,为23.820%;其次为EHPStp-1在31.25μg/m L时,为20.499%。综合评价,筛选出EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2可能是增强免疫活性的较好部位。细胞周期分布结果表明,与EHPStc相比较,EHPStp-1和EHPStp-2处理细胞48 h和72 h后,SPF值和PI值显着升高。EHPStp-1和EHPStp-2处理细胞48 h后,CD4+、CD8+淋巴细胞百分率显着高于EHPStc对照组。EHPStp-1、EHPStp-2和EHPStc均能显着促进IgA、IgG和IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ的分泌。说明,地锦多糖能够有效提高小鼠淋巴细胞免疫活性,其中EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2免疫增强活性最强。试验Ⅳ地锦多糖对巨噬细胞功能的影响取安全浓度范围内5个浓度的6个多糖,分别单独或协同LPS加入到培养的小鼠腹腔巨噬细胞中,培养48 h后,测定巨噬细胞增殖的变化;检测小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性、NO和iNOS分泌;ELISA法测定细胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ、MCP-1、MIP-1?的含量;流式细胞术分析CD14和MHC-II表达。结果表明,多糖单独刺激时EHPStp-1在31.25μg/m L时的细胞增殖率最高,为23.17%;其次为EHPStc,在31.25μg/m L时的细胞增殖率为16.42%;协同LPS刺激巨噬细胞时,EHPStp-1在31.25μg/m L时的细胞增殖率最高,为20.29%;其次为EHPS60c,在31.25μg/m L时的细胞增殖率为17.41%。在31.25～1.953μg/m L时,EHPStc和EHPStp-1促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用最强,且在31.25～15.625μg/m L时,EHPStc促进噬细胞吞噬作用显着强于EHPStp-1。EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2分别在31.25～1.953μg/m L和31.25～3.907μg/m L时,对小鼠腹腔巨噬细胞NO和iNOS分泌功能显着强于其余多糖组。EHPStp-1、EHPStp-2和EHPStc均能显着促进细胞因子的分泌。在31.25～7.813μg/m L时,EHPStp-1组对CD14和MHC-II的表达显着高于EHPStp-2组和BL组。说明,地锦多糖能够有效促进小鼠腹腔巨噬细胞功能,其中EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2免疫增强活性最强。试验Ⅴ地锦多糖对小鼠巨噬细胞的抗氧化作用取安全浓度范围内5个浓度的EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2,加入到培养的小鼠腹腔巨噬细胞中,培养48 h后,ELSIA法测定EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2对小鼠巨噬细胞的SOD、GSH-PX、MDA及MPO含量。结果表明,EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2均可显着提高小鼠SOD酶、GSH-PX酶活性,其中EHPStp-1组地锦多糖SOD酶、GSH-PX酶活力显着高于其他多糖组。EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2在7.813～31.25μg/m L均能显着降低MDA含量,减少体内脂质过氧化程度。EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2作用小鼠巨噬细胞后MPO酶活力均有显着降低。其中31.25μg/m L组MPO酶活力显着低于其他多糖组。说明,EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2具有显着的抗氧化作用,以减轻动物机体自由基损伤,保护动物机体,增强免疫功能。试验Ⅵ地锦多糖对免疫抑制小鼠的免疫调节作用建立环磷酰胺（CTX）小鼠免疫抑制模型,测定EHPStc和EHPStp-1对免疫抑制小鼠的免疫调节作用。小鼠随机分为5组（n=10）。分别为正常对照组（NC）、模型对照组（MC）、EHPStc组、EHPStp-1组、阳性对照组（PC组）。NC组小鼠,每天灌胃给予生理盐水,2个多糖组小鼠每天灌胃150 mg/kg EHPStc和EHPStp-1,PC组小鼠给予左旋咪唑（100 mg/kg）。实验持续24 d。第15、16、17 d腹腔注射100 mg Cy/kg bw,对小鼠进行免疫抑制造模。NC组和MC组灌胃0.1 m L/10g生理盐水。结果显示,EHPStc和EHPStp-1在大多时间点能促进T淋巴细胞增殖、促进淋巴细胞进入S期和G2/M期,提高CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的百分率,提高血清中免疫球蛋白和细胞因子水平,提高小鼠免疫器官指数及脾脏抗氧化指标。说明,EHPStc和EHPStp-1能够有效提高免疫抑制小鼠细胞免疫、体液免疫能力。综合评价EHPStp-1免疫增强活性最强。本研究首先通过对地锦多糖提取脱色纯化后,获得总多糖和各分级多糖,利用小鼠外周血淋巴细胞、巨噬细胞和免疫抑制小鼠检测了多糖的淋巴细胞免疫活性、巨噬细胞功能和抗氧化能力及其对免疫抑制小鼠的免疫调节作用,发现地锦多糖具有显着的免疫增强作用。本研究为地锦草等中药多糖在防治动物疾病中的推广应用提供了理论依据。
刘佳[4]（2021）在《女贞子免疫增强活性成分分离鉴定及作用机制研究》文中研究说明女贞子Ligustri Lucidi Fructus系木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ail.的干燥成熟果实,性味甘、苦,凉;归肝、肾经;功能补肝肾,强筋骨,明目;主治阴虚内热,腰肢无力,肾虚滑精,视力减退等。研究表明,女贞子主要含有齐墩果酸、熊果酸、特女贞苷、女贞子苷等化学成分,具有免疫调节、保肝、抗炎、抗菌和抗病毒等作用。已有文献证明女贞子可以提高家畜的生产性能和免疫功能,然而目前的研究未能阐释女贞子发挥免疫增强活性的化学成分,对其作用机制的研究更是少见。本研究进行了女贞子免疫增强活性部位筛选、活性成分分离鉴定、活性成分增强巨噬细胞和淋巴细胞免疫活性的作用及机制研究,取得以下主要结果:（1）女贞子免疫增强活性部位的筛选通过乙醇提取法和液-液萃取法制备女贞子五个极性部位,通过巨噬细胞吞噬试验和淋巴细胞增殖试验检测五部位萃取物的免疫活性。结果表明,女贞子石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水部位萃取物得率分别为1.64%、1.28%、1.13%、11.15%和26.96%;女贞子石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位萃取物均可不同程度地提高RAW264.7巨噬细胞吞噬中性红的能力,且正丁醇和乙酸乙酯部位萃取物的增强效果较好;女贞子乙酸乙酯、正丁醇和水部位萃取物均可不同程度地促进淋巴细胞增殖,其中正丁醇和乙酸乙酯萃取物的促增殖效果较好。说明正丁醇和乙酸乙酯部位为女贞子的主要免疫增强活性部位。（2）女贞子免疫增强活性成分的分离纯化与结构鉴定通过大孔树脂、硅胶和Sephadex LH-20柱色谱法及制备薄层色谱法,对女贞子正丁醇部位萃取物进行分离纯化,并运用1H-NMR、13C-NMR和HR-ESI-MS对单体化合物进行结构鉴定;通过巨噬细胞吞噬试验和淋巴细胞增殖试验检测大孔树脂乙醇洗脱段和单体化合物的免疫活性。结果表明,女贞子正丁醇部位萃取物的大孔树脂水洗脱段、30%、50%、70%和90%乙醇洗脱段得率分别为8.54%、25.62%、58.34%、1.42%和1.07%,其中30%乙醇洗脱段的免疫活性较强;对30%乙醇洗脱段进行分离纯化得到10个单体化合物,结构鉴定为:橄榄苦苷酸（oleuropeinic acid）、女贞子苷（nuezhenide）、异女贞子苷（isonuezhenide）、红景天苷（salidroside）、异女贞苷酸（isoligustrosidic acid）、ligulucidumoside A、8（E）-女贞子苷（8（E）-nuezhenide）、羟基酪醇（hydroxytyrosol）、橄榄苦苷（oleuropein）和p-hydroxyphenethyl 7-β-D-glucosideelenolic acid eater,其中橄榄苦苷酸、红景天苷、羟基酪醇、橄榄苦苷和p-hydroxyphenethyl7-β-D-glucosideelenolic acid eater有不同程度增强免疫细胞活性的作用,且羟基酪醇的作用最强。说明羟基酪醇等是女贞子的主要免疫增强活性成分。（3）女贞子活性成分羟基酪醇增强巨噬细胞免疫活性的作用及机制通过荧光显微镜观察羟基酪醇作用于RAW264.7巨噬细胞后细胞抗原摄取能力,ELISA检测细胞因子分泌,Griess法检测一氧化氮（NO）释放,荧光显微镜和流式细胞术检测活性氧（ROS）产生,流式细胞术检测细胞表面分子和共激活分子的表达,并通过Western blot检测NF-κB和TLR4信号通路相关靶点蛋白的表达。结果表明,羟基酪醇能显着增强巨噬细胞对FITC-OVA的摄取能力,提高肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）等分泌,促进NO释放和ROS产生,并显着上调细胞表面分子MHC-Ⅱ和共激活分子CD80和CD86的表达;进一步研究表明,羟基酪醇可以显着上调细胞核NF-κB p65表达,下调细胞浆IκB-α表达,同时还能显着上调TLR4,My D88,TRIF和IKKβ的表达,说明羟基酪醇对RAW264.7巨噬细胞的活化可以通过TLR4/My D88（TRIF）/IKKβ介导的信号反应激活细胞内NF-κB信号通路实现。（4）女贞子活性成分羟基酪醇增强淋巴细胞免疫活性的作用及机制通过ELISA检测细胞因子和免疫球蛋白分泌,流式细胞术检测细胞亚群比例,荧光显微镜和流式细胞术检测细胞内Ca2+浓度,微板法检测细胞中钙调神经磷酸酶（Calcineurin）活力,并通过Western blot检测核转录因子NFAT和NF-κB信号通路相关靶点蛋白表达。结果表明,羟基酪醇可显着增加白细胞介素4（IL-4）、γ干扰素（IFN-γ）和TNF-α分泌,提高淋巴细胞亚群CD3+和CD4+/CD8+比例;进一步研究表明,羟基酪醇可以显着增加细胞内Ca2+浓度,提高Calcineurin活力,并且显着上调细胞核NFAT和NF-κB p65表达,同时下调细胞浆NFAT和IκB-α表达,说明羟基酪醇可以通过促进Ca2+/Calcineurin/NFAT和NF-κB信号通路的级联反应,激活脾淋巴细胞。综上所述,本研究发现女贞子正丁醇和乙酸乙酯部位萃取物为其主要免疫增强活性部位,并分离和筛选得到多个具有免疫增强活性的单体化合物,其中羟基酪醇活性最好;进一步研究阐释了羟基酪醇可以通过影响细胞信号通路的传递,引起NF-κB p65和NFAT的入核来增强巨噬细胞和淋巴细胞的免疫活性。本论文研究结果为今后将女贞子开发为免疫增强剂提供了理论依据,为发展可以替代抗生素的中兽药饲料添加剂提供思路。
宋慧娜[5]（2020）在《线粒体靶向的雷公藤甲素衍生物的合成及其抗肿瘤活性研究》文中认为肿瘤（Tumor）严重威胁着人类的生命健康和生活质量。肿瘤细胞的显着特征为不死性（无限增殖）,迁移性和接触抑制现象消失。线粒体是重要的能量代谢和生物合成的工厂,对细胞正常功能和人类健康至关重要,肿瘤细胞的线粒体明显异于正常细胞的线粒体,肿瘤细胞的特殊表现与线粒体功能异常有密切的关系,如今,癌症也被认为是一种线粒体代谢疾病,线粒体成为肿瘤细胞治疗的重要靶点。相关研究表明,肿瘤细胞的线粒体膜电位远大于正常细胞。电子移位亲脂性阳离子化合物（DLCs）可以利用肿瘤细胞膜电位这一差异在肿瘤细胞线粒体内选择性地积聚,而小分子抗肿瘤活性化合物可与DLCs连接作为线粒体靶向性化合物,实现一定肿瘤细胞选择性,增强抗肿瘤活性。目前为止使用和研究最多的DLCs是三苯基膦盐（TPP+）,其靶向线粒体的功能被多篇文献报道证实。雷公藤甲素（Triptolide,TP）是从雷公藤根部提取分离得到的具有抗肿瘤活性的天然成分,但因水溶性差、全身毒性大、治疗窗口窄等缺点,使其不能在临床上得到系统应用。为考察TPP+的线粒体靶向性是否可以保持雷公藤甲素的抗肿瘤活性,增加其对肿瘤细胞选择性,从而降低毒性,本论文设计并合成了雷公藤甲素的TPP+衍生物,进而评价了其体内外抗肿瘤活性。经过活性筛选发现我们设计并合成的5个雷公藤甲素TPP+衍生物中,Mito-TP-2不仅能保持雷公藤甲素的抗肿瘤活性,在肝正常细胞HL-7702与肝肿瘤细胞HepG-2中的表现显示一定的肿瘤细胞选择性;RP-HPLC法测定细胞内的积聚量,发现Mito-TP-2在HepG-2细胞线粒体的积聚量约是母药雷公藤甲素的3倍,证明其有一定的线粒体靶向性。进一步实验结果表明Mito-TP-2将肿瘤细胞阻滞于G0/G1期,并能引起细胞内LDH释放量增加,ROS升高,线粒体膜电位降低。在斑马鱼HepG-2移植瘤模型中,1 μM Mito-TP-2具有与TP相当的抑制作用,且对斑马鱼幼鱼无明显毒性影响,而同等剂量的TP对斑马鱼幼鱼毒性大,可见明显心包水肿。雷公藤甲素与Mito-TP-2的毒性试验还显示,雷公藤甲素在较低浓度组即出现致畸现象,随着浓度加大孵化率和体长均不断降低,且具有明显的肝脏毒性;而Mito-TP-2在同等剂量下的各浓度组均未出现明显毒性。在化合物Mito-TP-2高浓度发育毒性实验中发现,当化合物Mito-TP-2浓度高达12 μM时偶有心包水肿出现,但在浓度≤12 μM时,Mito-TP-2对斑马鱼的死亡率、孵化率、畸形率和体长均没有影响。说明化合物Mito-TP-2保持母药的抗肿瘤活性的同时降低了母药的毒性。本论文是对保持雷公藤甲素抗肿瘤药效的同时降低其毒性的探索,为基于天然产物的药物开发提供了研究基础与思路。
张笛[6]（2020）在《白杨素联合香叶木素或雷公藤甲素体内及体外抗肝癌活性研究》文中认为目的:研究白杨素与香叶木素或雷公藤甲素单用及两药联合对人肝癌Hep G2细胞增殖、迁移、细胞周期阻滞及细胞凋亡的影响;其次研究白杨素与香叶木素或雷公藤甲素单用及两药联合对H22实体瘤小鼠的影响,并评价药物在体内的药效。方法:采用MTT比色法检测黄芩苷、黄芩素、香叶木素和白杨素在体外对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞、胃癌BGC-823细胞、肝癌Hep G2细胞增殖的抑制作用;MTT比色法检测白杨素（1.25、2.5、5、10、20μmol/L）与香叶木素（3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L）或雷公藤甲素（0.78、1.56、3.125、6.25、12.5 nmol/L）单用及两药联用24、48、72 h后对人肝癌Hep G2细胞增殖抑制作用;Hoechst 33258染色荧光显微镜下分别观察白杨素（10μmol/L）与香叶木素（25μmol/L）或雷公藤甲素（6.25nmol/L）单用及两药联用48 h后对人肝癌Hep G2细胞的形态变化;细胞划痕愈合实验观察白杨素（10μmol/L）与香叶木素（25μmol/L）或雷公藤甲素（6.25nmol/L）单用及两药联用0、24、48 h后对人肝癌Hep G2细胞划痕愈合的影响;流式细胞仪结合Annexin V-FITC/PI双染法、PI单染法分别检测白杨素（10μmol/L）与香叶木素（25μmol/L）或雷公藤甲素（6.25nmol/L）单用及两药联用48 h后对人肝癌细胞Hep G2细胞凋亡和细胞周期的影响;ICR小鼠腋下接种H22细胞建立体内H22实体瘤小鼠模型,将接种后的小鼠分为为正常组（生理盐水）、模型组（药物溶剂）、阳性药组（五氟尿嘧啶,20mg/kg）、雷公藤甲素单用组（0.075 mg/kg）、白杨素单用组（10 mg/kg）、香叶木素单用组（25 mg/kg）、雷公藤甲素+白杨素组（0.075 mg/kg+10 mg/kg）、白杨素+香叶木素组（10 mg/kg+25 mg/kg）,观察不同给药组对实体瘤小鼠肝指数、胸腺指数、脾指数、瘤重及淋巴细胞亚群的影响。结果:（1）MTT实验结果:白杨素和香叶木素均对肝癌Hep G2细胞最敏感,IC50值分别为18.21μmol/L和20.94μmol/L。白杨素与香叶木素或雷公藤甲素单用及两药联用24、48、72 h均可抑制人肝癌Hep G2细胞,其抑制作用与药物浓度和作用时间呈正相关,且联合应用药物IC50值更小。（2）细胞划痕实验结果:雷公藤甲素、香叶木素均能明显抑制细胞迁移,但白杨素抑制细胞迁移作用不明显。（3）Hoechst 33258荧光染色结果:单药组和联合组图像中均观察到细胞核边集固缩、碎裂、染色质高度凝集、出现凋亡小体等现象,其中以联合用药组凋亡细胞数量最多。（4）细胞周期结果:雷公藤甲素对Hep G2细胞各个周期无明显阻滞作用,白杨素阻滞细胞于G1期,香叶木素阻滞细胞于G2期,雷公藤甲素和白杨素联合能阻滞细胞于G1期和G2期,香叶木素与白杨素联用能阻滞细胞于S期和G2期。（5）细胞凋亡结果:白杨素单药组的细胞凋亡率为16.39%,香叶木素单药组的细胞凋亡率为35.17%,雷公藤甲素单药组的细胞凋亡率为5.07%,白杨素+香叶木素组的细胞凋亡率为41.5%,白杨素+雷公藤甲素组的细胞凋亡率为24.9%,均明显高于空白组的3.21%,且联用组高于单药组。（6）H22实体瘤实验:白杨素+香叶木素可显着抑制H22荷瘤小鼠的肿瘤的生长,抑制率达到38.83%,对免疫系统具有一定保护作用;白杨素+雷公藤甲素对H22荷瘤小鼠的肿瘤生长无明显抑制作用,且对免疫系统无明显调节作用。结论:白杨素联合雷公藤甲素、白杨素联合香叶木素这两种联合应用方式,均比单一给药对Hep G2细胞增殖、迁移、周期和凋亡的作用强。体内实验表明白杨素联合香叶木素比单一给药对H22实体瘤的抑制作用强。
刘洋[7]（2019）在《雷公藤-黄芪药对中有效成分治疗胶原诱导关节炎模型实验研究》文中研究指明目的:基于文献数据库挖掘治疗类风湿关节炎的雷公藤-黄芪药对,并探索药对中有效成分（毛蕊异黄酮、雷公藤甲素）治疗胶原诱导关节炎小鼠的可能机制,为后期两个成分联合应用开发新药提供前期基础。方法:1.基于文献挖掘分析雷公藤—黄芪药对治疗类风湿关节炎的组方规律。（1）以“雷公藤”、“类风湿”、“试验”为关键词检索中国生物医学文献数据库1998-2018年所有临床处方;（2）通过中医传承辅助系统分析其配伍规律,挖掘出雷公藤—黄芪药对。2.黄芪有效成分之一毛蕊异黄酮通过调控M1型巨噬细胞治疗胶原诱导关节炎研究。（1）通过CCK-8细胞毒性实验、流式细胞仪检测毛蕊异黄酮对原代腹腔来源巨噬细胞和原代骨髓来源巨噬细胞的毒性。（2）利用实时定量PCR检测毛蕊异黄酮对炎症刺激下两种来源的原代巨噬细胞的炎症因子产生的影响。（3）高通量转录组测序寻找其可能作用信号通路,Western Blot检测毛蕊异黄酮能够抑制P65磷酸化,降低转录活性达到减轻炎症的目的。（4）毛蕊异黄酮能够有效改善胶原诱导关节炎小鼠症状评分。（5）ABOG、TRAP、Micro-CT显示毛蕊异黄酮能够有效改善胶原诱导关节炎小鼠骨与软骨的破坏,抑制滑膜增生,减少骨量丢失。（6）全自动生化分析仪检测肝肾生化指标（AST、ATL、CRE、BUN）变化。3.雷公藤有效成分之一雷公藤甲素纳米剂型改造治疗胶原诱导关节炎研究。（1）利用材料的亲疏水效应,将疏水性药物雷公藤甲素包裹进纳米粒子内部的疏水区域。（2）在亲水部分引入了具有p H响应性的聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（PDMAEMA）。（3）通过动态光散射和透射电子显微镜检测纳米药物表征。（4）不同p H环境下,检测纳米药物体外释放效率。（5）CCK-8、流式细胞仪检测雷公藤甲素纳米药物对细胞凋亡的影响。（6）流式细胞仪检测雷公藤纳米剂型ROS活性产生。（7）实时定量PCR检测雷公藤纳米药物细胞水平抗炎效果。（8）利用小动物活体成像观察雷公藤纳米药物在小鼠关节处富集效率。（9）ABOG、TRAP、Micro-CT观察不同剂量雷公藤纳米药物对小鼠关节软骨破坏和滑膜增生的影响。（10）肝肾生化指标血清学检测AST、ATL、CRE、BUN指标变化。（11）HE染色观察雷公藤纳米药物对小鼠肝脏、肾脏及脾脏的影响。结果:1.探究出符合中医“扶正祛邪”理念的雷公藤—黄芪药对,为临床治疗类风湿关节炎提供配伍思路。2.明确黄芪有效成分之一毛蕊异黄酮有效改善胶原诱导关节炎小鼠关节炎症,其机制可能是通过调控M1型巨噬细胞,抑制P65磷酸化降低转录活性,达到抗炎的目的。3.针对雷公藤有效成分之一雷公藤甲素的理化性质,将其成功地进行剂型改造,在其机制明确的基础上,通过剂型改造增加疗效并有效降低毒性。结论:毛蕊异黄酮和雷公藤甲素能够治疗胶原诱导关节炎小鼠。
杜小雪[8]（2019）在《雷公藤甲素对缺血性脑损伤的抗炎机制研究》文中进行了进一步梳理背景脑卒中是一种常见的由脑出血或缺血导致局部神经功能损伤的神经系统疾病,具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点。近年来,对脑缺血内胶质细胞参与的免疫应答及炎症反应的研究日益增加。小胶质细胞是大脑中的“巨噬细胞”,其活化对于调节脑缺血后神经元凋亡、促进神经发生和功能恢复至关重要。CSF1R全称为集落刺激因子1受体,是一种跨膜络氨酸激酶,主要负责调控小胶质细胞增殖和分化。研究发现Ko20227是CSF1R的特异性抑制剂可跨越血脑屏障,抑制CSF1R磷酸化来调节小胶质细胞的活性和数目。在全脑缺血模型中,Ki20227调节脑缺血后小胶质细胞的形态和密度,进而调节神经元突触可塑性。其次,小胶质细胞数目的改变或M1/M2表型转变可能参与调节脑缺血病灶处的炎症反应。雷公藤甲素（Triptolide,TP）是典型的抗炎药物,提炼于中药雷公藤的根部,用于治疗多种癌症和自身免疫性疾病,也是调节自噬和氧化应激的重要因子,在很多中枢系统疾病中起神经保护作用。在脑缺血小鼠中,TP调节脑内小胶质细胞的活化状态从而实现对NLRP3小体炎症的抑制作用。前期研究结果表明TP可以显着降低脑缺血模型大鼠的脑梗死面积,降低半影区NF-κB介导的炎症反应,调节自噬水平。自噬在缺血性脑卒中等中枢神经系统疾病的神经炎症反应中起重要作用,而小胶质细胞自噬主要负责调节大脑中细胞因子。最近的研究显示小胶质细胞自噬对小鼠神经突触发育以及社交行为调节具有重要作用。抑制小胶质细胞自噬会使突触小体降解受损,改变不同脑区之间的联系。因此,消除小胶质细胞或抑制小胶质细胞自噬为研究脑缺血中小胶质细胞的功能提供有力工具。以小胶质细胞介导的炎症的反应为切入点,明确TP在脑缺血中起神经保护作用的具体机制,对阐明脑缺血的病理机制和药物靶点研究有重要意义和影响。目的1.探究消除小胶质细胞或抑制小胶质细胞自噬对脑缺血小鼠大脑皮层小胶质细胞和神经元的影响。2.探究TP对消除小胶质细胞或抑制小胶质细胞自噬小鼠脑缺血后大脑皮层小胶质细胞和神经元的影响以及可能调节机制。方法1.双光子活体成像检测CX3CR1-GFP小鼠在Ki20227给药不同时间内大脑皮层小胶质细胞数目变化。2.利用玫瑰红光化学诱导法构建局灶性脑缺血模型。3.TTC染色方法检测局灶性脑缺血模型的建立是否成功。4.基于Cre-loxp系统,利用CX3CR1-Cre和ATG5flox/flox小鼠构建小胶质细胞自噬缺陷小鼠。5.电生理技术检测正常小鼠和CX3CR1+/-ATG5flox/flox小鼠在脑缺血前后大脑皮层半阴影区锥体神经元兴奋性变化。6.疲劳转棒实验、体重变化、神经行为评分和旷场实验检测造模前后各组小鼠行为学的变化。7.免疫荧光和免疫印迹方法检测造模前后各组小鼠大脑皮层损伤部位小胶质细胞和神经元相关蛋白的表达变化。8.荧光定量PCR方法检测造模前后各组小鼠大脑皮层损伤部位小胶质细胞炎症相关和神经元突触相关因子的mRNA表达变化。结果第一部分1.双光子活体成像和Iba1免疫荧光结果显示,随着给药时间的延长,小胶质细胞数目逐渐减少。和对照组相比,给药7天时,小胶质细胞数目减少约13.7%。2.TTC染色结果显示注射玫瑰红（10mg/mL）5分钟后,6000kcal的冷光源照射15分钟造成约15%的大脑皮层梗死。此结果显示成功建立了玫瑰红光化学诱导局灶性脑缺血小鼠模型。3.行为学检测显示单纯Ki20227药物处理对正常小鼠的平衡能力,体重以及神经行为评分没有影响。缺血后,Ki20227给药组小鼠在转棒上的停留时间有显着性降低,神经行为评分增加,体重无显着性变化。TP增加Ki20227给药脑缺血小鼠在转棒上的停留时间,降低其行为学评分,促进小鼠行动能力的恢复。4.脑缺血引起各组小鼠大脑皮层半阴影区小胶质细胞数目显着增加,小胶质细胞炎症因子（TNF-α,IL-10,IL-6）和表面受体（CD86,Arg-1,CXCL1,CCL-1）的表达显着增加。TP预处理促进Ki20227给药组小鼠脑缺血后大脑皮层半阴影区小胶质细胞数目减少和TNF-α,IL-6等炎症因子的表达降低。5.单纯Ki20227给药处理可抑制NF-κB的蛋白表达。脑缺血后,对照组和Ki20227给药组NLRP3炎症小体相关蛋白表达增加,NF-κB的蛋白表达增高。TP预处理降低NF-κB的表达,降低NLRP3炎症小体相关蛋白表达。6.单纯Ki20227给药处理对神经元数目,神经元树突棘密度和突触蛋白PSD95,SYN的表达无影响。缺血后,神经元数目显着减少,树突棘密度降低,突触蛋白PSD95,SYN的表达降低;而TP预处理能够增加Ki20227给药缺血小鼠大脑皮层神经元数目,促进神经元树突棘密度和突触蛋白PSD95,SYN的表达增加。7.缺血后,Ki20227给药组小鼠大脑皮层损伤部位自噬相关蛋白LC3Ⅱ,ATG5表达增加,P62,Beclin1表达降低;而BDNF,AKT和p-ERK蛋白表达显着减弱;TP预处理抑制Ki20227给药小鼠大脑皮层损伤区域LC3Ⅱ,ATG5表达,促进P62,Beclin1,BDNF,AKT 和 p-ERK 表达的增加。第二部分1.成功构建小胶质细胞自噬缺陷小鼠。敲除小胶质细胞atg5基因显着抑制小胶质细胞自噬,但对小鼠的运动能力没有影响。2.脑缺血后,小胶质细胞自噬缺陷小鼠在疲劳转棒上停留的时间显着降低,行为学评分显着增高。TP能增加小胶质细胞自噬缺陷脑缺血小鼠在疲劳转棒上的停留时间,降低行为学评分,对体重变化无影响。3.抑制小胶质细胞自噬对小鼠大脑皮层小胶质细胞数目无影响,但小胶质细胞相关因子TNF-α等的炎症因子mRNA的表达显着增加。TP显着降低脑缺血小鼠半阴影区小胶质细胞的数量和炎症相关因子TNF-α,IL-10等的表达。4.抑制小胶质细胞自噬降低小鼠大脑皮层神经元数目,神经元树突棘密度,突触相关蛋白PSD95,SYN的表达。脑缺血后,各组的神经元指标显着降低。TP预处理减轻脑缺血后大脑皮层神经元数量和树突棘密度的减少以及树突相关蛋白的丢失。5.抑制小胶质细胞自噬促进大脑皮层锥体神经元发放动作电位。而脑缺血后,椎体神经元发放动作电位减少。但TP预处理促进了缺血后大脑皮层锥体神经元动作电位发放个数。6.小胶质细胞自噬缺陷小鼠大脑皮层NLRP3,NF-κB和Caspase1蛋白表达量增加;脑缺血加重损伤部位NLRP3,NF-κB和Caspase1的蛋白表达增加。而TP显着降低NF-κB、NLRP3的表达和Caspase1活化。7.脑缺血后,小胶质细胞自噬缺陷小鼠损伤部位BDNF蛋白表达降低,LC3Ⅱ蛋白表达进一步增加。TP增加BDNF,AKT,p-ERK蛋白的表达,降低LC3Ⅱ,P62等自噬相关蛋白的表达。结论消除小胶质细胞降低脑缺血后TNF-α和NF-κB等炎症因子的表达实现对神经元的保护作用;抑制小胶质细胞自噬会促进脑缺血后小胶质细胞炎症相关因子和NLRP3炎症小体的表达,抑制BDNF-AKT通路,损坏神经元树突棘密度以及突触蛋白。TP预处理促进小胶质细胞数目缺失或自噬抑制小鼠脑缺血后大脑皮层小胶质细胞数目减少,降低相关炎症因子的表达,进而抑制NLRP3炎症小体和整体自噬水平,激活BDNF-AKT信号通路,从而增加树突棘密度,突触蛋白的表达和神经元数目,最终促进神经行为功能的恢复。
夏琦[9]（2019）在《土茯苓免疫调节作用的物质基础和机制研究》文中研究说明目的:土茯苓性平,味甘、淡,入脾、胃、肝经。临床常用于治疗慢性肾炎、湿疹、银屑病等免疫相关疾病,提示土茯苓可影响免疫调节。因此本课题通过亢进及抑制的免疫模型,期望揭示土茯苓免疫调节作用,及其主要物质基础,并初步探讨相关作用机制,为土茯苓研究填补空缺,也为免疫调节剂的研发积累数据。方法:1.土茯苓水提取液对环孢素免疫抑制模型影响:小鼠分为正常对照组、模型对照组、左旋咪唑阳性对照组、土茯苓水提液（低、中、高）剂量组。除正常组外,其他各组均用环孢素A溶液连续腹腔注射造模五天。成模后,土茯苓治疗组分别给予高（13.65 g·kg-1）、中（9.1 g·kg-1）、低（4.45g·kg-1）剂量土茯苓水提浓缩液,阳性对照组给予左旋咪唑溶液,正常对照组和模型组给予生理盐水,连续给药五天;在无菌条件下取小鼠脾脏,研磨成细胞浆,利用流式细胞测定仪分别考察土茯苓水提液对小鼠脾脏淋巴细胞CD3+CD4+,CD3+CD8+的影响;小鼠脾脏组织经过包埋、切片、HE染色、中性树胶封片的过程,使用光镜显微镜拍照观察土茯苓水提液对脾脏的影响;小鼠脾脏组织研磨裂解后,酶标仪570nm波长下测定OD值,计算各个样本的蛋白浓度;通过酶联免疫吸附法测定小鼠脾脏中IL-6、IL-2、IFN-γ蛋白水平,判断土茯苓水提液对免疫抑制下的脾细胞因子的影响。2.落新妇苷对血瘀银屑病模型小鼠免疫功能的影响:建立小鼠脾虚血瘀模型,除正常组外,其他小鼠冰水游泳加饥饱失常15日;此后,造模小鼠分为模型对照组、落新妇苷低（30.7 mg·kg-1）、中（61.4 mg·kg-1）、高（92.1 mg·kg-1）剂量组、甲氨蝶呤组（3.79 mg·kg-1）,小鼠背部涂抹5%普萘洛尔乳剂制备血瘀-银屑病模型,造模同时给予对应治疗药物6日,正常对照和模型对照给予生理盐水;对小鼠背部皮损进行PASI评分;取材后测定小鼠脾指数、胸腺指数、脾淋巴细胞、淋巴结淋巴细胞Treg/Th1/Th17细胞数量;对小鼠皮肤病理切片进行Baker评分;酶联免疫吸附法测定小鼠皮肤炎症因子IL-6/IL-17/IFN-γ以考察落新妇苷对血瘀银屑病模型影响。3.土茯苓多糖对环磷酰胺免疫抑制模型影响:小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、土茯苓多糖低（0.3595 g·kg-1）、中（0.7189 g·kg-1）、高（1.0784 g·kg-1）剂量组,左旋咪唑组（7.58 mg·kg-1）,每组6只。除了正常组,其余小鼠均环磷酰胺（40 mg·kg-1）腹腔注射造膜,造模同时给药,连续十天。造模结束后取材,测定小鼠脾指数、胸腺指数、脾脏CD3+CD19+细胞数量,考察土茯苓多糖对T、B细胞影响;通过细胞毒性试验,考察土茯苓多糖对刀豆蛋白刺激的脾淋巴细胞增殖活性的影响;通过免疫荧光法测定,考察土茯苓多糖对小鼠脾T细胞的影响。结果:1.土茯苓水提取液对环孢素免疫抑制模型影响:环孢素A造模后,小鼠体重增长缓慢,脾脏肿大,脾指数显着增加,而胸腺指数显着降低,提示造模成功。左旋咪唑组和土茯苓中剂量组显着降低小鼠的脾脏指数;除此之外,左旋咪唑组可使环孢素诱导降低的胸腺指数升高,土茯苓水提液对胸腺指数无显着影响;流式测定结果显示,土茯苓显着增加脾脏中T淋巴细胞CD4+的数量,对CD8+无显着影响;病理切片结果显示造模后脾脏被膜增厚浮肿,白髓萎缩,土茯苓可缓解脾脏白髓萎缩状态;土茯苓水提液可显着调低环孢素诱导后小鼠体内升高的IFN-γ的含量但对IL-6、IL-2无影响。2.落新妇苷对血瘀银屑病模型免疫功能影响:血瘀银屑病造模后,小鼠背部皮肤发红、增厚,部分小鼠有红斑,轻触有疼痛表现。落新妇苷中剂量、高剂量组小鼠背部皮肤皮损发红现象稍退,红斑处开始结痂脱落;落新妇苷高剂量组小鼠背部红色消退明显,效果与阳性对照组类似;PASI评分结果显示,模型组小鼠PASI评分显着升高,落新妇苷可剂量依赖性减轻皮损及降低小鼠PASI评分,降低幅度低中高分别为10.42%、17.71%、27.08%;皮肤Baker评分结果显示,落新妇苷中剂量组可显着降低Baker评分;流式细胞仪检测发现,造模后小鼠淋巴结中Treg、Th17及Th1数量显着增加,落新妇苷低、中、高剂量均显着降低Treg、Th1数量,但落新妇苷对小鼠脾脏Treg影响不大;小鼠皮损部位细胞因子检测结果显示,血瘀银屑病造模后IL-17A、IL-6、IFN-γ在银屑病皮损部位显着升高,而落新妇苷可降低皮损部位IL-17A、IL-6、IFN-γ 含量,对 IL-17A、IFN-γ 影响更显着。3.土茯苓多糖对环磷酰胺免疫抑制模型影响:模型组小鼠脾脏淋巴细胞增殖活力明显降低;多糖各给药剂量组可剂量依赖性逆转该趋势,以高剂量组效果最突出;流式检测结果显示模型组脾T、B淋巴细胞数量均降低,多糖可显着增加CD3+标记的T淋巴细胞数量,对CD19+标记的B淋巴细胞无显着影响;免疫荧光结果显示高剂量多糖组脾脏CD4+T淋巴细胞增加。结论:本课题结果表明,土茯苓水提液可促进T细胞介导的免疫作用,土茯苓多糖为其有效部位;土茯苓水提液中主要黄酮类成分落新妇苷对血瘀型银屑病模型有免疫抑制作用。落新妇苷和土茯苓多糖共同作用构成了土茯苓的免疫调节活性。
孙朝跃[10]（2019）在《野黄芩苷增敏顺铂抗非小细胞肺癌以及对顺铂肾毒性保护作用研究》文中提出目的:肺癌是我国发病率和死亡率均最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的87%,65%-80%的NSCLC患者确诊时已属中晚期,常失去外科手术机会。顺铂依然是治疗中晚期NSCLC的一线化疗药物。然而,顺铂治疗后会产生获得性耐药和肾脏毒性。目前,顺铂耐药以及肾毒性机制尚未完全阐明,且缺乏有效的减缓或逆转策略,其已成为困扰NSCLC治疗的一大难题。野黄芩苷是存在于天然植物中的一种黄酮类化合物,为传统中药灯盏细辛的主要活性成分,具有提高机体免疫力、抗炎、抗氧化、抗微生物、抗肿瘤等多种药理作用。我们前期研究证实,野黄芩苷能够有效抑制NSCLC细胞的增殖;野黄芩苷能也够增加化疗药博来霉素的抗肝癌活性,并且可以显着减轻博来霉素诱导的肺纤维化毒性,但是目前尚不清楚野黄芩苷能否增强顺铂对NSCLC毒性作用以及减轻顺铂的肾毒性。本实验主要通过体外、体内实验探讨野黄芩苷是否能够协同顺铂杀伤NSCLC细胞;同时通过动物实验考察野黄芩苷对顺铂诱导的急性肾损伤的保护作用并探讨其作用机制。方法:1.野黄芩苷协同顺铂对A549/DDP细胞增殖的影响采用MTT法检测野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞增殖的影响,使用CompuSyn软件评价野黄芩苷与顺铂是否具有协同抗肿瘤作用,使用显微镜观察野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞形态的影响,采用细胞流式术检测野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞周期分布的影响。2.野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞凋亡的影响采用细胞流式术检测野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞凋亡的影响,采用蛋白印迹法检测野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞凋亡蛋白Caspase3、Cleaved caspase3、PARP、p53表达的影响,使用p53抑制剂PFT探讨p53蛋白对野黄芩苷联合顺铂诱导的细胞凋亡的影响,采用蛋白印迹法检测野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞ERK蛋白表达的影响,使用ERK抑制剂U0126探讨ERK蛋白对野黄芩苷联合顺铂诱导的细胞凋亡的影响。3.野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞自噬的影响采用蛋白印迹法检测野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞自噬蛋白LC3、p62表达的影响,采用透射电镜观察A549/DDP细胞自噬小体数量变化,使用自噬抑制剂HCQ探讨自噬在野黄芩苷协同顺铂抗肿瘤中的作用,采用蛋白印迹法检测野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞自噬上游蛋白Akt、c-Met以及Stat3的影响,使用Akt或c-Met抑制剂MK-2206以及Crizotinib探讨Akt或c-Met对野黄芩苷协同顺铂诱导自噬以及抑制细胞生长的影响,采用瞬时转染过表达Stat3方法探讨Stat3蛋白对野黄芩苷协同顺铂诱导自噬以及抑制细胞生长的影响。4.野黄芩苷联合顺铂对裸鼠移植瘤生长抑制作用研究构建裸鼠皮下移植瘤模型,采用随机分组法将裸鼠分为对照组、顺铂给药组、野黄芩苷给药组、顺铂联合野黄芩苷组,给药处理21天后,期间测量裸鼠体重、肿瘤体积,采用小动物活体成像系统检测各组裸鼠给药前后荧光强度变化,给药结束后,剥离瘤体,称重,采用蛋白印迹法检测各组肿瘤组织中p-Stat3、c-Met、p-Akt、p62、LC3、ERK、p53的表达情况。5.野黄芩苷对顺铂诱导的肾毒性保护作用研究将C57BL/6小鼠随机分为6组:空白对照组、野黄芩苷60 mg/kg组、顺铂组、顺铂+野黄岑苷30 mg/kg组、顺铂+野黄芩苷60 mg/kg组、顺铂+地塞米松4 mg/kg组。给药组动物预先给予野黄芩苷或地塞米松干预5天,给药结束后,除对照组以及野黄芩苷组之外,其余组小鼠均接受单剂量腹腔注射顺铂,顺铂造模72小时后,称取小鼠体重,收集小鼠血液,处死动物,取小鼠肾脏组织,使用试剂盒检测小鼠血清中BUN和CRE含量,HE染色观察肾脏组织病理学变化,采用ELISA法检测肾脏组织中炎症因子IL-6和TNF-α含量,采用蛋白印迹法检测各组小鼠肾脏组织中IL-6、TNF-α、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Cleaved PARP、p53、LC3、p62、Atg5、Atg7、Atg12、p-JNK、p-p38、p-ERK、p-Stat3,采用免疫组化法检测各组小鼠肾脏组织中p-JNK、p-p38、p-ERK、p-Stat3 表达情况。结果:1.野黄芩苷协同顺铂对A549/DDP细胞增殖的影响80、120μM野黄芩苷对A549/DDP细胞没有明显的抑制作用,80、120μM野黄芩苷能够协同增强顺铂对A549/DDP增殖抑制作用;当顺铂剂量为10μg/ml,野黄芩苷剂量为120μM的时候,两药协同指数为0.58,两药联用效果最明显;与正常组相比,顺铂处理后细胞形态明显变长,细胞密度明显减少,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组细胞形态明显变短,细胞密度明显减少;与正常组相比,顺铂能够将A549/DDP细胞阻滞在G2期,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷将A549/DDP细胞阻滞在S期。2.野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞凋亡的影响与正常组相比,顺铂处理组细胞凋亡率显着升高,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组细胞凋亡率明显升高;与正常组相比,顺铂处理组细胞Cleavedcaspase3、PARP、p53、ERK表达上调,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组细胞Cleavedcaspase3、PARP、p53、ERK表达上调;p53抑制剂PFT-α能够显着抑制野黄芩苷联合顺铂诱导的细胞凋亡;ERK抑制剂U0126能够显着抑制野黄芩苷联合顺铂激活的p53蛋白表达;ERK抑制剂U0126能够显着抑制野黄芩苷联合顺铂诱导的细胞凋亡。3.野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞自噬的影响与正常组相比,顺铂处理组细胞LC3II表达水平明显升高,同时p62表达水平明显下降,自噬小体数量增加,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组细胞LC3II表达水平明显升高,同时p62表达水平明显下降,自噬小体数量增加;使用自噬抑制剂HCQ能够显着抑制野黄芩苷对顺铂的增敏作用;与正常组相比,顺铂处理组细胞c-Met表达明显下调,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组细胞p-Akt、c-Met表达明显下调;使用Akt抑制剂MK-2206能够显着增强野黄芩苷联合顺铂诱导的自噬;使用c,Met抑制剂Crizotinib能够显着增强野黄芩苷联合顺铂诱导的自噬,同时抑制p-Akt的蛋白表达;使用MK-2206或Crizotinib能够明显增强野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞增殖抑制作用;与正常组相比,顺铂处理组细胞p-Stat3表达明显降低,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组细胞p-Stat3表达明显降低;过表达p-Stat3能够明显抑制强野黄芩苷联合顺铂诱导的自噬,同时显着降低野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP的增殖抑制作用。4.野黄芩苷联合顺铂对裸鼠移植瘤生长抑制作用研究动物实验研究表明,给药21天后,与正常组相比,顺铂组裸鼠移植瘤荧光强度、体积、重量明显明显增加,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组裸鼠移植瘤荧光强度、体积、重量明显明显下降;与正常组相比,顺铂组裸鼠体重明显下降,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组裸鼠体重明显增加;与对照组相比,顺铂干预组裸鼠肿瘤组织中p-Stat3、c-Met、p-Akt表达均出现显着下调,LC3II表达明显上调,与顺铂组相比,顺铂+野黄芩苷组瘤体组织中p-Stat3、c-Met、p-Akt、p62表达明显下调,p-ERK、p53、LC3II表达明显上调。5.野黄芩苷对顺铂诱导的肾毒性保护作用研究与正常组相比,顺铂模型组小鼠血清中的BUN和CRE值明显升高,与顺铂模型组相比,野黄芩苷高剂量组或地塞米松组小鼠血清中BUN和CRE水平显着降低;顺铂造模后小鼠体重显着下降,野黄芩苷高剂量或地塞米松给药后,小鼠体重明显上升;与正常组相比,顺铂模型组小鼠肾脏皮质肾小球中可见红细胞增多,出现明显的肾小管变性、坏死（胞浆空泡样变）,管腔内有大量受损的管型,管腔内可见脱落的上皮细胞,细胞排列紊乱,皮质血管扩张充血,与顺铂模型组相比,野黄芩苷高剂量或地塞米松给药后小鼠病理损伤得到明显改善;与正常组相比,顺铂模型组小鼠肾脏组织中IL-6和TNF-α值明显升高,野黄芩苷高剂量或地塞米松预先给药处理能够显着抑制炎症因子IL-6和TNF-α水平;与正常组相比,顺铂模型组小鼠肾脏组织中Bax/Bcl-2比率和Cleaved caspase-3、Cleaved PARP、p53的蛋白表达水平显着升高,野黄芩苷高剂量或地塞米松预先给药处理能够显着抑制Bax/Bcl-2比率和Cleaved caspase-3、Cleaved PARP、p53的蛋白表达水平;与正常组相比,顺铂模型组小鼠肾脏组织中LC3Ⅱ/Ⅰ比率以及Atg7蛋白表达显着下调,同时p62蛋白表达水平明显上升,野黄芩苷高剂量预先给药处理组小鼠肾组织中LC3Ⅱ/Ⅰ比率Atg7蛋白表达明显增加,p62蛋白水平显着下降;与正常组相比,顺铂模型组小鼠肾脏组织中p-JNK、p-p38、p-ERK、p-Stat3蛋白表达水平明显上升,野黄芩苷高剂量预先给药处理组小鼠肾组织中p-JNK、p-p38、p-ERK、p-Stat3 明显下降。结论:1.野黄芩苷能够协同增加顺铂对A549/DDP耐药细胞的增殖抑制作用;野黄芩苷联合顺铂能够将A549/DDP细胞阻滞在S期;2.野黄芩苷也能够协同增强顺铂对A549/DDP细胞的促凋亡、促自噬作用;3.野黄芩苷联合顺铂能够通过激活A549/DDP细胞ERK/p53信号通路诱导细胞凋亡;4.能够通过抑制c-Met/Akt或Stat3信号通路诱导A549/DDP细胞发生自噬性死亡;5.动物实验证实野黄芩苷能够显着增加顺铂对裸鼠实体瘤生长抑制作用。6.野黄芩苷能够显着改善顺铂导致的小鼠肾功能紊乱和肾脏组织结构的损伤;野黄芩苷能够抑制顺铂诱导的小鼠肾脏组织炎症反应;野黄芩苷能够抑制顺铂诱导的小鼠肾脏组织肾细胞凋亡;野黄芩苷能够提高顺铂抑制的小鼠肾脏组织肾细胞自噬;野黄芩苷能够抑制肾损伤小鼠肾脏组织中MAPK和Stat3信号通路。
二、雷公藤甲素对小鼠腹腔巨噬细胞杀伤活性的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、雷公藤甲素对小鼠腹腔巨噬细胞杀伤活性的影响（论文提纲范文）
（1）基于HMGB1/RAGE/NF-κB探讨雷公藤甲素的抗炎分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RAW264.7 细胞培养(细胞复苏,细胞传代及细胞冻存) |
| 2.2.2 ELISA法检测LPS刺激RAW264.7 细胞后肿瘤坏死因子水平 |
| 2.2.3 CCK-8 法检测TP对 RAW264.7 细胞安全范围 |
| 2.2.4 ELISA法检测TP对 LPS刺激的RAW264.7 细胞中炎症因子表达水平影响 |
| 2.2.5 Western blot技术检测细胞通路相关蛋白的表达 |
| 2.2.6 RT﹣PCR技术检测通路中HMGB1,RAGE,NFKB1的m RNA表达 |
| 2.2.7 统计学处理 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 LPS不同浓度及时间对RAW264.7 细胞TNF-α表达的影响 |
| 3.2 不同浓度TP对RAW264.7 细胞存活率的影响 |
| 3.3 LPS刺激后TP对 RAW264.7 细胞中HMGB1﹣RAGE﹣NF-κB信号通路蛋白表达及下游炎症因子表达水平影响 |
| 3.4 WB实验检测LPS刺激后TP对 RAW264.7 细胞中炎症通路HMGB1﹣RAGE﹣NF-κB中各蛋白表达的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 第6章 综述 |
| 6.1 雷公藤甲素的药理作用 |
| 6.2 巨噬细胞与炎症 |
| 6.3 脂多糖引起raw264.7 细胞炎症 |
| 6.4 炎症相关的炎症因子 |
| 6.5 HMGB1 与炎症 |
| 6.6 RAGE受体 |
| 6.7 NF-κB激活与炎症 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 重楼的药效成分、药理作用和不良反应研究现状 |
| 1 药效成分 |
| 2 药理作用 |
| 3 不良反应研究现状 |
| 4 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药药源性肝损伤机制研究进展 |
| 1 CYP代谢 |
| 2 线粒体稳态 |
| 3 氧化损伤 |
| 4 细胞凋亡 |
| 5 胆汁淤积 |
| 6 Ca~(2+)浓度平衡破坏 |
| 7 免疫激活介导的炎症因子释放 |
| 8 特异反应 |
| 9 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 第一章 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 第一节 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 2 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 3 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 本章总结与讨论 |
| 第二章 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 第一节 肝细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 心血管细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 肝细胞毒性机制研究 |
| 2 心血管毒性机制研究 |
| 本章总结 |
| 第三章 基于蛋白组学和代谢组学探索重楼皂苷Ⅰ的体内肝毒性机制 |
| 第一节 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 生物信息分析 |
| 6 机制分析 |
| 7 PPI网络 |
| 8 潜在生物标志物 |
| 第二节 Q300靶向代谢组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 通路富集 |
| 6 通路分析 |
| 7 潜在生物标志物 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 2 Q300靶向代谢组学 |
| 3 蛋白组学-代谢组学关联分析 |
| 第四节 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制验证 |
| 1 动物组织Western blot验证 |
| 2 斑马鱼qPCR实验验证 |
| 3 小结与讨论 |
| 结语 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 2 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 3 重楼卓苷Ⅰ的蛋白组学和代谢组学研究 |
| 4 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制推测与分析 |
| 5 不足与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）地锦多糖的制备及对小鼠免疫增强活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 地锦草的研究进展 |
| 1.1.1 地锦草的化学成分 |
| 1.1.2 地锦草的药理作用 |
| 1.1.3 地锦草的临床应用 |
| 1.2 多糖的研究进展 |
| 1.2.1 多糖的生物活性 |
| 1.2.2 多糖结构的研究 |
| 1.2.3 多糖的提取及分离纯化 |
| 1.2.4 多糖在动物生产中的应用 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 第二章 地锦多糖的提取与脱色纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 药材 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 地锦样品的前处理 |
| 2.2.2 地锦多糖的提取 |
| 2.2.3 地锦多糖的含量测定 |
| 2.2.4 地锦多糖中蛋白含量测定 |
| 2.2.5 地锦多糖双氧水脱色的最佳条件的优化 |
| 2.2.6 地锦多糖的纯化 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 地锦多糖的提取结果 |
| 2.3.2 地锦多糖的纯化结果 |
| 2.3.3 地锦多糖双氧水脱色的单因素试验结果 |
| 2.3.4 地锦多糖双氧水脱色的正交试验结果 |
| 2.3.5 地锦多糖双氧水脱色的验证试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 地锦多糖的提取方法 |
| 2.4.2 多糖的含量测定方法 |
| 2.4.3 地锦多糖的双氧水脱色 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 地锦多糖的结构鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 地锦多糖 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 地锦多糖的紫外光谱分析 |
| 3.2.2 地锦多糖的红外光谱分析 |
| 3.2.3 地锦多糖的单糖组成分析 |
| 3.2.4 地锦多糖的分子量检测 |
| 3.2.5 地锦多糖的糖醛酸含量测定 |
| 3.2.6 地锦多糖的刚果红试验 |
| 3.2.7 地锦多糖的核磁共振波谱测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 地锦多糖的紫外光谱分析结果 |
| 3.3.2 地锦多糖的红外光谱分析结果 |
| 3.3.3 地锦多糖的单糖组成结果 |
| 3.3.4 地锦多糖的分子量结果 |
| 3.3.5 地锦多糖的糖醛酸含量结果 |
| 3.3.6 地锦多糖的刚果红试验结果 |
| 3.3.7 地锦多糖的核磁试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 多糖的光谱分析 |
| 3.4.2 多糖的分子量及及糖醛酸分析 |
| 3.4.3 多糖的核磁分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 地锦多糖对小鼠外周血淋巴细胞免疫活性的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 地锦多糖 |
| 4.1.2 试验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 小鼠外周血淋巴细胞的分离和培养 |
| 4.2.2 地锦多糖对小鼠外周血淋巴细胞最大安全浓度的测定 |
| 4.2.3 地锦多糖对小鼠外周血淋巴细胞增殖的影响 |
| 4.2.4 地锦多糖对小鼠外周血淋巴细胞周期的影响 |
| 4.2.5 地锦多糖对小鼠外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.2.6 地锦多糖对小鼠淋巴细胞免疫球蛋白IgA、IgG的影响 |
| 4.2.7 地锦多糖对小鼠淋巴细胞细胞因子分泌的影响 |
| 4.2.8 数据分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 地锦多糖对小鼠外周血淋巴细胞最大安全浓度的测定 |
| 4.3.2 地锦多糖单独刺激时各组淋巴细胞增殖的结果 |
| 4.3.3 地锦多糖协同PHA刺激时淋巴细胞增殖的结果 |
| 4.3.4 地锦多糖对小鼠外周血淋巴细胞周期的影响结果 |
| 4.3.5 地锦多糖对CD4~+、CD8~+T 淋巴细胞亚群的影响结果 |
| 4.3.6 地锦多糖对小鼠外周血淋巴细胞免疫球蛋白IgA、IgG的影响结果 |
| 4.3.7 地锦多糖对小鼠外周血淋巴细胞细胞因子分泌的影响结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 地锦多糖对细胞生长的影响 |
| 4.4.2 地锦多糖对淋巴细胞增殖的影响 |
| 4.4.3 地锦多糖对淋巴细胞周期的影响 |
| 4.4.4 地锦多糖对CD4~+、CD8~+T 淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.4.5 地锦多糖对淋巴细胞细胞因子分泌的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 地锦多糖 |
| 5.1.2 试验动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的分离和培养 |
| 5.2.2 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞最大安全浓度的测定 |
| 5.2.3 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响 |
| 5.2.4 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响 |
| 5.2.5 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO和iNOS生成的影响 |
| 5.2.6 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞细胞因子的影响 |
| 5.2.7 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞CD14和MHC-II表达 |
| 5.2.8 数据分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞最大安全浓度的测定 |
| 5.3.2 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响结果 |
| 5.3.3 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响结果 |
| 5.3.4 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO和iNOS生成的影响结果 |
| 5.3.5 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞细胞因子的影响结果 |
| 5.3.6 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞CD14和MHC-II表达的影响结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 地锦多糖对巨噬细胞增殖的影响 |
| 5.4.2 地锦多糖对巨噬细胞吞噬能力的影响 |
| 5.4.3 地锦多糖对巨噬细胞分泌NO和iNOS生成的影响 |
| 5.4.4 地锦多糖对巨噬细胞细胞因子的影响 |
| 5.4.5 地锦多糖对巨噬细胞CD14和MHC-II表达的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的抗氧化作用研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 地锦多糖 |
| 6.1.2 试验动物 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.1.4 主要试剂 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的分离和培养 |
| 6.2.2 小鼠腹腔巨噬细胞形态学观察 |
| 6.2.3 地锦多糖对H_2O_2诱导的巨噬细胞氧化损伤细胞存活率影响 |
| 6.2.4 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞抗氧化作用的测定 |
| 6.2.5 数据分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞形态的影响 |
| 6.3.2 地锦多糖对H_2O_2诱导的小鼠腹腔巨噬细胞氧化损伤细胞存活率影响 |
| 6.3.3 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞SOD酶活力的影响 |
| 6.3.4 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞GSH-PX酶活力的影响 |
| 6.3.5 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞MDA含量的影响 |
| 6.3.6 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞MPO酶活力的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 地锦多糖对巨噬细胞SOD酶活力的影响 |
| 6.4.2 地锦多糖对巨噬细胞GSH-PX酶活力的影响 |
| 6.4.3 地锦多糖对巨噬细胞MDA含量的影响 |
| 6.4.4 地锦多糖对巨噬细胞MPO酶活力的影响 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 地锦多糖对免疫抑制小鼠的免疫调节作用研究 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 地锦多糖 |
| 7.1.2 试验动物 |
| 7.1.3 主要仪器 |
| 7.1.4 主要试剂 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 动物分组及处理 |
| 7.2.2 地锦多糖对免疫抑制小鼠免疫器官指数分析 |
| 7.2.3 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾细胞增殖和腹腔巨噬细胞增殖的影响 |
| 7.2.4 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞周期的影响 |
| 7.2.5 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞CD4~+、CD8~+T亚群的影响 |
| 7.2.6 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞免疫球蛋白的影响 |
| 7.2.7 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞细胞因子分泌的影响 |
| 7.2.8 地锦多糖对免疫抑制小鼠抗氧化作用指标的测定 |
| 7.2.9 数据分析 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 地锦多糖对免疫抑制小鼠免疫器官指数分析 |
| 7.3.2 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾细胞增殖和腹腔巨噬细胞增殖的结果 |
| 7.3.3 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞周期的影响结果 |
| 7.3.4 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞CD4~+、CD8~+T亚群的影响结果 |
| 7.3.5 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞免疫球蛋白IgA、IgG的影响结果 |
| 7.3.6 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞细胞因子分泌的影响结果 |
| 7.3.7 地锦多糖对免疫抑制小鼠抗氧化活性的影响结果 |
| 7.4 讨论 |
| 7.4.1 多糖对免疫抑制小鼠周期和CD4+、CD8+的影响 |
| 7.4.2 多糖对免疫抑制小鼠细胞因子和免疫球蛋白的影响 |
| 7.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）女贞子免疫增强活性成分分离鉴定及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 中药增强免疫研究进展 |
| 1.1.1 中药促进免疫器官发育 |
| 1.1.2 中药增强免疫细胞功能 |
| 1.1.3 中药调节免疫分子生成 |
| 1.1.4 中药影响信号通路传递 |
| 1.2 女贞子研究进展 |
| 1.2.1 女贞子化学成分 |
| 1.2.2 女贞子药理作用 |
| 1.2.3 女贞子兽医临床应用 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 第二章 女贞子免疫增强活性部位的筛选 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 药材 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 女贞子五部位萃取物得率 |
| 2.2.2 女贞子不同部位萃取物对巨噬细胞活性的影响 |
| 2.2.3 女贞子不同部位萃取物对巨噬细胞吞噬功能的影响 |
| 2.2.4 女贞子不同部位萃取物对淋巴细胞增殖的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 女贞子五部位萃取物的制备 |
| 2.3.2 女贞子免疫增强活性部位的筛选 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 女贞子免疫增强活性成分的分离纯化与结构鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 药物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 大孔树脂吸附法分离女贞子正丁醇部位萃取物试验结果 |
| 3.2.2 不同乙醇洗脱段的免疫活性检测结果 |
| 3.2.3 分离纯化和结构鉴定结果 |
| 3.2.4 单体化合物的免疫活性检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 女贞子正丁醇部位萃取物的分离纯化 |
| 3.3.2 女贞子免疫增强活性化合物的筛选 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 女贞子活性成分羟基酪醇增强巨噬细胞免疫的作用机制 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 药物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 羟基酪醇对巨噬细胞摄取FITC-OVA的影响 |
| 4.2.2 羟基酪醇对细胞因子TNF-α和IL-1β分泌的影响 |
| 4.2.3 羟基酪醇对NO释放的影响 |
| 4.2.4 羟基酪醇对ROS产生的影响 |
| 4.2.5 羟基酪醇对细胞表面分子MHC-Ⅱ及共激活分子CD80、CD86表达的影响 |
| 4.2.6 羟基酪醇对NF-κB信号通路关键蛋白表达的影响 |
| 4.2.7 羟基酪醇对TLR4/MyD88(TRIF)/IKKβ通路蛋白表达的影响 |
| 4.2.8 信号阻断试验 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 羟基酪醇增强巨噬细胞免疫活性 |
| 4.3.2 羟基酪醇活化巨噬细胞的分子机制 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 女贞子活性成分羟基酪醇增强淋巴细胞免疫的作用机制 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 药物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 羟基酪醇对细胞因子和免疫球蛋白分泌的影响 |
| 5.2.2 羟基酪醇对淋巴细胞亚群的影响 |
| 5.2.3 羟基酪醇对胞内Ca~(2+)浓度的影响 |
| 5.2.4 羟基酪醇对钙调神经磷酸酶的影响 |
| 5.2.5 羟基酪醇对核转录因子NFAT和NF-κB转运的影响 |
| 5.2.6 信号阻断试验 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 羟基酪醇增强淋巴细胞免疫活性 |
| 5.3.2 羟基酪醇激活淋巴细胞的分子机制 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）线粒体靶向的雷公藤甲素衍生物的合成及其抗肿瘤活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 雷公藤甲素与其抗肿瘤活性研究现状 |
| 1.1 雷公藤甲素的来源与结构 |
| 1.2 雷公藤甲素的抗肿瘤活性与作用机制 |
| 1.2.1 呼吸系统肿瘤 |
| 1.2.2 血液系统恶性肿瘤 |
| 1.2.3 消化系统恶性肿瘤 |
| 1.2.4 泌尿生殖系统肿瘤 |
| 1.2.5 其他肿瘤 |
| 1.3 雷公藤甲素毒性研究 |
| 1.3.1 心血管循环系统毒性 |
| 1.3.2 消化系统毒性 |
| 1.3.3 泌尿生殖系统毒性 |
| 1.3.4 免疫系统毒性 |
| 1.3.5 其他毒性 |
| 1.4 雷公藤甲素的结构改造与抗肿瘤活性 |
| 1.4.1 C-14β-OH的修饰 |
| 1.4.2 α,β-不饱和五元内酯环(D环)的修饰 |
| 1.4.3 C5,6-位的修饰 |
| 1.4.4 环氧基的修饰 |
| 1.4.5 其他修饰 |
| 第二章 线粒体靶向雷公藤甲素衍生物的设计与合成 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 目标产物与合成路线 |
| 2.3 雷公藤甲素衍生物的波谱数据 |
| 2.4 实验部分 |
| 2.4.1 实验试剂与实验设备 |
| 2.4.2 雷公藤甲素衍生物的合成方法 |
| 2.4.3 雷公藤甲素衍生物的纯度检查 |
| 第三章 线粒体靶向雷公藤甲素衍生物的抗肿瘤活性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞与动物 |
| 3.1.2 化合物 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 仪器 |
| 3.1.5 常用试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 MTT法测细胞活力 |
| 3.2.2 LDH法检测细胞毒性 |
| 3.2.3 RP-HPLC法检测化合物TP和Mito-TP-2在线粒体内的分布与聚集 |
| 3.2.4 DAPI染色法观察细胞凋亡 |
| 3.2.5 DCFH-DA染色检测胞内ROS水平 |
| 3.2.6 JC-1染色法检测线粒体膜电位 |
| 3.2.7 Annexin/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 3.2.8 PI染色法测细胞周期 |
| 3.2.9 化合物TP和Mito-TP-2抗肿瘤药效和毒性研究 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 雷公藤甲素衍生物的抗肿瘤活性评价 |
| 3.3.2 Mito-TP-2对LDH释放量的影响 |
| 3.3.3 Mito-TP-2在线粒体里的聚集与分布 |
| 3.3.4 Mito-TP-2对细胞内ROS的影响 |
| 3.3.5 Mito-TP-2对线粒体膜电位(ΔΨm)的影响 |
| 3.3.6 Mito-TP-2诱导细胞凋亡 |
| 3.3.7 Mito-TP-2对细胞周期的影响 |
| 3.3.8 化合物TP和Mito-TP-2抗肿瘤药效和毒性研究 |
| 总结与讨论 |
| 附录 化合物谱图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）白杨素联合香叶木素或雷公藤甲素体内及体外抗肝癌活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 .肝癌研究现状 |
| 1.1.1 肝癌简介 |
| 1.1.2 治疗肝癌药物 |
| 1.2 .白杨素研究进展 |
| 1.2.1 白杨素的理化性质 |
| 1.2.2 白杨素的药理作用 |
| 1.3 .香叶木素研究进展 |
| 1.3.1 香叶木素的理化性质 |
| 1.3.2 香叶木素的药理作用 |
| 1.4 .雷公藤甲素研究现状 |
| 1.4.1 雷公藤甲素的理化性质 |
| 1.4.2 雷公藤甲素的药理作用 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 四种黄酮化合物体外抗肿瘤活性筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 药物与试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 药物的配制 |
| 2.2.2 细胞的复苏、传代及冻存 |
| 2.2.3 MTT法检测四种黄酮化合物体外对四种细胞株增殖的影响 |
| 2.2.4 MTT法检测四种黄酮化合物体外对Hep G2 细胞增殖的影响 |
| 2.2.5 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 四种黄酮化合物体外对四种细胞株增殖的影响 |
| 2.3.2 四种黄酮化合物体外对HepG2细胞增殖的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 白杨素联用香叶木素或雷公藤甲素对肝癌HepG2细胞增殖、迁移和凋亡的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 药物与试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 试剂配制 |
| 3.2.2 MTT法检测雷公藤甲素与白杨素联合应用对HepG2细胞增殖的影响 |
| 3.2.3 MTT法检测白杨素与香叶木素联合应用对Hep G2 细胞增殖的影响 |
| 3.2.4 Hoechst33258 染色观察细胞凋亡 |
| 3.2.5 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 |
| 3.2.6 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 3.2.7 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 3.2.8 Western blot实验 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 白杨素与雷公藤甲素联合应用对HepG2细胞的影响 |
| 3.3.2 白杨素与香叶木素联合应用对HepG2细胞的影响 |
| 3.3.3 Hoechst33258 染色结果 |
| 3.3.4 细胞划痕实验结果 |
| 3.3.5 细胞周期结果 |
| 3.3.6 细胞凋亡检测实验结果 |
| 3.3.7 Western Blot结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 联合用药体内抗肿瘤作用研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 动物 |
| 4.1.3 药品与试剂 |
| 4.1.4 仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 溶液的配制 |
| 4.2.2 细胞的复苏、传代及冻存 |
| 4.2.3 建立H22小鼠腹水瘤模型 |
| 4.2.4 建立稳定的H22小鼠实体瘤模型 |
| 4.2.5 分组及用药 |
| 4.2.6 观测指标 |
| 4.2.7 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 各用药组对H22实体瘤小鼠日常行为状态及体重的影响 |
| 4.3.2 各用药组对小鼠脏器指数的影响 |
| 4.3.3 各用药组对H22实体瘤小鼠肿瘤生长的影响 |
| 4.3.4 各用药组对H22实体瘤小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.3.5 组织病理学检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 全文总结 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 研究的创新性 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（7）雷公藤-黄芪药对中有效成分治疗胶原诱导关节炎模型实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 引言 |
| 第一部分 基于文献挖掘分析雷公藤—黄芪药对治疗类风湿关节炎的组方规律 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 数据录入 |
| 1.4 药物有效成分体外抗炎验证 |
| 2.结果 |
| 2.1 以雷公藤为核心治疗类风湿的药物分析 |
| 2.2 雷公藤—黄芪药对为核心治疗类风湿的药物组合分析 |
| 2.3 雷公藤—黄芪药对有效成分抗炎效果体外验证 |
| 分析与讨论 |
| 第二部分 黄芪有效成分之一毛蕊异黄酮治疗胶原诱导关节炎研究 |
| 前言 |
| 实验一:毛蕊异黄酮治疗胶原诱导关节炎小鼠 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 症状评分 |
| 2.2 体重观察 |
| 2.3 血清中炎症因子表达 |
| 2.4 ABOG |
| 2.5 TRAP |
| 2.6 Micro-CT |
| 2.7 双染免疫荧光标记滑膜M1型巨噬细胞 |
| 2.8 肝肾功能生化指标 |
| 2.9 胸腺及脾脏指数 |
| 实验二:毛蕊异黄酮体外细胞实验抗炎水平研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CCK-8 细胞毒性检测 |
| 2.2 流式细胞凋亡检测 |
| 2.3 q-PCR 检测 LPS/IFN-γ刺激下巨噬细胞炎症因子变化 |
| 2.4 ELISA 检测细胞上清炎症因子表达水平 |
| 2.5 RNA-seq高通量转录组测序 |
| 2.6 免疫印迹法Western Blot检验蛋白磷酸化 |
| 分析与讨论 |
| 第三部分 雷公藤有效成分之一雷公藤甲素治疗胶原诱导关节炎研究 |
| 前言 |
| 实验一:基于 POSS-PCL-b-PDMAEMA 为载体的 TP 纳米药物的制备和表征 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 构建(POSS-(PCL-b-PDMAEMA)_8)载体 |
| 2.2 动态光散射(DLS)形态表征 |
| 2.3 透射电子显微镜(TEM)形态表征 |
| 2.4 不同p H环境下纳米药物释放效率 |
| 分析与讨论 |
| 实验二TP纳米药物的体外细胞水平研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 CCK-8 细胞毒性检测 |
| 2.2 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3 探针法检测ROS产生 |
| 2.4 q-PCR检测LPS/IFN-γ刺激下RAW264.7 细胞炎症因子m RNA表达 |
| 分析与讨论 |
| 实验三 炎症关节内纳米药物释放富集效率 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 活体成像检测体内 pH 环境释药效率 |
| 实验四 高剂量TP纳米药物治疗CIA模型疗效及毒副作用 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 药物剂量及干预方式 |
| 2.2 症状评分 |
| 2.3 ABOG |
| 2.4 TRAP |
| 2.5 肝肾功能生化指标 |
| 2.6 HE染色 |
| 实验五 低剂量 TP 纳米药物治疗 CIA 模型疗效及毒副作用 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 药物剂量及干预方式 |
| 2.2 症状评分 |
| 2.3 血清中炎症因子表达 |
| 2.4 ABOG |
| 2.5 TRAP |
| 2.6 Micro-CT |
| 2.7 步态分析 |
| 2.7 胸腺、脾脏指数及肝肾功能生化指标 |
| 2.8 HE染色 |
| 分析与讨论 |
| 研究创新点 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1：文献综述 淋巴回流功能与炎症性关节炎相关性及中医药调控机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录2：在校期间论文发表情况 |
（8）雷公藤甲素对缺血性脑损伤的抗炎机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 雷公藤甲素对Ki20227给药小鼠脑缺血后小胶质细胞和神经元的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第二部分 雷公藤甲素对小胶质细胞自噬缺陷小鼠脑缺血后小胶质细胞和神经元的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文总结和讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（9）土茯苓免疫调节作用的物质基础和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 土茯苓研究现状 |
| 1.1.1 土茯苓的临床研究 |
| 1.1.2 土茯苓化学成分研究 |
| 1.1.3 土茯苓药理药效研究现状 |
| 1.2 中药免疫调节研究进展 |
| 1.2.1 免疫系统调节原理 |
| 1.2.2 免疫系统对疾病的调节 |
| 1.2.3 中药对体液免疫的影响 |
| 1.2.4 中药对细胞免疫的影响 |
| 1.3 免疫调节作用研究动物模型概况 |
| 1.3.1 免疫抑制模型 |
| 1.3.2 免疫亢进模型 |
| 1.4 本文研究目的 |
| 第二章 土茯苓水提液免疫调节作用研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 动物 |
| 2.1.2 药物 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 试药和试剂的配制 |
| 2.2.2 环孢素免疫抑制模型制备[68]及给药 |
| 2.2.3 脾脏淋巴细胞前处理及检测 |
| 2.2.4 小鼠脾脏HE染色切片制备及观察 |
| 2.2.5 小鼠脾脏细胞因子测定 |
| 2.3 数据统计与处理 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 土茯苓水提液对免疫抑制小鼠脾指数、胸腺指数的影响 |
| 2.4.2 土茯苓水提液对免疫抑制小鼠脾脏组织的影响 |
| 2.4.3 土茯苓水提液对免疫抑制小鼠脾脏淋巴细胞数量的影响 |
| 2.4.4 土茯苓水提浓缩液对免疫抑制小鼠脾细胞因子调控的影响 |
| 2.5 讨论与小结 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 土茯苓主要成分落新妇苷对亢进模型的免疫调节作用探究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 动物 |
| 3.1.2 药物 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 土茯苓提取液中落新妇苷的含量测定 |
| 3.2.2 药液的制备 |
| 3.2.3 普萘洛尔微乳制备 |
| 3.2.4 血瘀模型的制备 |
| 3.2.5 血瘀银屑病模型制备[78]及给药 |
| 3.2.6 试验观察与评分 |
| 3.2.7 皮肤HE染色切片制备及观察 |
| 3.2.8 小鼠脾脏T调节细胞测定 |
| 3.2.9 小鼠淋巴结Th1/Th17辅助细胞亚群及T调节细胞测定 |
| 3.2.10 小鼠皮肤细胞因子测定 |
| 3.3 数据统计与处理 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 含量测定结果 |
| 3.4.2 模型制备情况 |
| 3.4.3 落新妇苷对小鼠血瘀-银屑病模型皮损程度的影响 |
| 3.4.4 Baker评分考察落新妇苷对小鼠血瘀-银屑病皮损影响 |
| 3.4.5 Baker评分考察落新妇苷对小鼠血瘀-银屑病皮损影响 |
| 3.4.6 落新妇苷对血瘀-银屑病小鼠皮肤细胞因子的影响 |
| 3.4.7 落新妇苷对血瘀-银屑病小鼠淋巴细胞的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 土茯苓多糖对环磷酰胺免疫抑制模型免疫功能的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 动物 |
| 4.1.2 药物 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.1.4 试剂 |
| 4.2 实验用药配制及提取 |
| 4.2.1 土茯苓多糖提取 |
| 4.2.2 溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 环磷酰胺免疫抑制模型的制备[117]及给药 |
| 4.3.2 脾淋巴细胞增殖活力测定 |
| 4.3.3 小鼠脾T、B淋巴细胞流式检测 |
| 4.3.4 小鼠脾T细胞免疫荧光法检测 |
| 4.4 数据统计与处理 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 土茯苓多糖对环磷酰胺免疫抑制模型脾指数和胸腺指数的影响 |
| 4.5.2 土茯苓多糖对小鼠脾脏淋巴细胞数量的影响 |
| 4.5.3 土茯苓多糖对脾脏细胞增殖活力的影响 |
| 4.5.4 土茯苓多糖对小鼠脾脏CD4~+T淋巴细胞的影响 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1: 随机数表 |
| 附录2: 随机数字分组 |
| 附录3: 英文缩略语 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（10）野黄芩苷增敏顺铂抗非小细胞肺癌以及对顺铂肾毒性保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 非小细胞肺癌研究现状 |
| 1.2 顺铂抗肿瘤机制 |
| 1.3 顺铂耐药机制 |
| 1.3.1 细胞内顺铂的积累量减少 |
| 1.3.2 顺铂的失活增多 |
| 1.3.3 DNA的损伤修复 |
| 1.3.4 细胞凋亡抑制 |
| 1.4 自噬在肿瘤化疗药耐药中的作用 |
| 1.4.1 抑制自噬增强肿瘤细胞对药物的敏感性 |
| 1.4.2 过度激活自噬促进肿瘤细胞凋亡逆转肿瘤耐药 |
| 1.5 中药单体在调控自噬中的作用 |
| 1.5.1 中药单体诱导肿瘤细胞发生自噬性死亡 |
| 1.5.2 中药单体诱导肿瘤细胞发生保护性自噬 |
| 1.5.3 中药单体抑制肿瘤细胞自噬 |
| 1.6 中药单体对肿瘤化疗药顺铂的增敏研究 |
| 1.6.1 抑制NF-κB信号通路 |
| 1.6.2 抑制Nrf2信号通路 |
| 1.6.3 抑制Akt信号通路 |
| 1.6.4 调控MAPKs信号通路 |
| 1.7 野黄芩苷抗肿瘤以及抗炎研究进展 |
| 1.7.1 野黄芩苷抗肿瘤研究 |
| 1.7.2 野黄芩苷抗炎作用研究 |
| 第二章 野黄芩苷对顺铂抗非小细胞肺癌增敏实验研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 实验药物 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 主要仪器与耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞实验 |
| 2.2.2 动物实验 |
| 2.2.3 统计方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 野黄芩苷协同顺铂对A549/DDP细胞增殖抑制的影响 |
| 2.3.2 野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞周期的影响 |
| 2.3.3 野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞凋亡的影响 |
| 2.3.4 野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞ERK蛋白的影响 |
| 2.3.5 野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞自噬的影响 |
| 2.3.6 野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞自噬上游蛋白Akt和c-Met的影响 |
| 2.3.7 野黄芩苷联合顺铂对A549/DDP细胞Stat3蛋白的影响 |
| 2.3.8 野黄芩苷联合顺铂对裸鼠移植瘤生长的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 野黄芩苷对顺铂导致的急性肾损伤保护作用机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验药物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物分组以及给药方式 |
| 3.2.2 肾功能指标测定 |
| 3.2.3 肾组织病理形态学检查 |
| 3.2.4 试剂盒测定IL-6、TNF-α水平 |
| 3.2.5 Western Blot检测蛋白表达 |
| 3.2.6 免疫组化 |
| 3.2.7 统计方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 野黄芩苷对顺铂诱导的急性肾损伤小鼠肾功能的影响 |
| 3.3.2 野黄芩苷对顺铂导致的急性肾损伤小鼠肾脏组织形态学的影响 |
| 3.3.3 野黄芩苷对顺铂导致的急性肾损伤小鼠炎症水平的影响 |
| 3.3.4 野黄芩苷对顺铂导致的急性肾损伤小鼠凋亡的影响 |
| 3.3.5 野黄芩苷对顺铂导致的急性肾损伤小鼠自噬的影响 |
| 3.3.6 野黄芩苷抑制顺铂导致的肾损伤小鼠MAPKs和Stat3的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
四、雷公藤甲素对小鼠腹腔巨噬细胞杀伤活性的影响（论文参考文献）
- [1]基于HMGB1/RAGE/NF-κB探讨雷公藤甲素的抗炎分子机制[D]. 陈清. 宜春学院, 2021(08)
- [2]重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究[D]. 王文平. 北京中医药大学, 2021(02)
- [3]地锦多糖的制备及对小鼠免疫增强活性研究[D]. 孙文静. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [4]女贞子免疫增强活性成分分离鉴定及作用机制研究[D]. 刘佳. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [5]线粒体靶向的雷公藤甲素衍生物的合成及其抗肿瘤活性研究[D]. 宋慧娜. 山东大学, 2020(04)
- [6]白杨素联合香叶木素或雷公藤甲素体内及体外抗肝癌活性研究[D]. 张笛. 武汉轻工大学, 2020(06)
- [7]雷公藤-黄芪药对中有效成分治疗胶原诱导关节炎模型实验研究[D]. 刘洋. 上海中医药大学, 2019
- [8]雷公藤甲素对缺血性脑损伤的抗炎机制研究[D]. 杜小雪. 浙江大学, 2019(03)
- [9]土茯苓免疫调节作用的物质基础和机制研究[D]. 夏琦. 广州中医药大学, 2019(04)
- [10]野黄芩苷增敏顺铂抗非小细胞肺癌以及对顺铂肾毒性保护作用研究[D]. 孙朝跃. 广州中医药大学, 2019(03)