一、用重组PCR技术缺失突变人单核细胞趋化蛋白-1基因（论文文献综述）
杨滨僮[1]（2021）在《维氏气单胞菌Hanks样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PrkC功能初步研究》文中提出维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）是一种重要的人、兽及水生动物共患病原菌,其不但可以感染包括鱼类在内的水生动物,也可感染包括人在内的哺乳动物,在给水产养殖业造成巨大经济损失的同时也严重威胁着人类的健康。但目前仍然缺乏针对A.veronii病的有效防控措施,对A.veronii致病机理了解过少,是限制我们制定有效防控措施的重要因素。相关研究表明,细菌Hanks样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（也称类真核细胞样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）是一种重要的调控因子,影响病原菌的致病性。目前,绝大多数Hanks样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶发现于革兰氏阳性菌,仅少数于革兰氏阴性菌中被发现,且在不同细菌中的功能存在明显差异,而目前尚无关于A.veronii Hanks样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能研究的报道。因此,对其功能进行深入研究将有助于我们进一步了解A.veronii的致病机理。本研究对A.veronii TH0426株基因组中存在的两个Hanks样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Prk C和Yih E的功能进行了初步研究,首先构建了prkC和yih E基因缺失菌株,分析与其相关的生物学表型变化,初步明确了Prk C和Yih E的功能;并利用比较蛋白质组学分析A.veronii Hanks样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Prk C参与调控的相关代谢通路,分析Prk C的功能;进一步通过高通量磷酸化修饰定量蛋白质组学技术全面分析prkC缺失前后A.veronii蛋白质磷酸化修饰水平的变化,分析磷酸化差异表达蛋白生物学功能及其参与的相关代谢通路等,最后利用Pull-down-MS技术筛选与Prk C蛋白直接相互作用的靶蛋白,探究Prk C介导磷酸化修饰调控A.veronii相关表型变化的分子机制。主要研究结果如下:（1）成功构建A.veronii prkC和yih E基因缺失菌株,分析发现在对数生长期内缺失株△prkC的生长速度显着低于野生株,而缺失株△yih E的生长速度则与野生株TH0426基本一致,无明显变化,表明prkC基因的缺失影响了A.veronii的生长速度;黏附和侵袭能力检测结果显示,野生株TH0426对EPC细胞黏附和侵袭能力为6.73±0.5%,缺失株△prkC为2.63±0.4%,差异非常显着,而缺失株△yih E为3.76±0.2%,也存在显着差异,表明prkC和yih E基因的缺失均减弱了A.veronii对EPC的黏附和侵袭力,相比yih E,prkC的影响更明显;细胞毒性试验结果显示,在感染2h和3h后,野生株TH0426对EPC毒性分别是缺失株△prkC的6.54倍和5.29倍,差异极显着,是缺失株△yih E的2.94倍和1.64倍,差异显着,表明prkC和yih E基因缺失后,减弱了A.veronii在感染早期对EPC细胞的毒性,且相比yih E,prkC的影响更明显;斑马鱼致病性试验结果显示,缺失株△prkC的LD50比野生株TH0426升高了2.04倍,毒力下降明显,缺失株△yih E则升高了1.44倍,毒力有所下降,但变化并不显着;表明prkC和yih E基因的缺失均减弱了A.veronii对斑马鱼的致病性,但相比yih E,prkC的影响更明显。此外,运动性检测结果表明prkC基因的缺失显着影响了A.veronii的运动能力,且缺失株△prkC的鞭毛发生明显脱落,表明prkC基因的缺失显着影响了A.veronii TH0426鞭毛的形成。（2）比较蛋白质组学分析结果显示,缺失株△prkC与野生株TH0426之间共存在314个差异表达蛋白,其中上调表达蛋白142个和下调表达蛋白172个;生物信息学分析结果表明,prkC基因缺失主要引起与A.veronii趋化过程、鞭毛组装、双组分系统、细菌分泌系统以及生物被膜形成等代谢通路相关蛋白表达量下调;此外,prkC基因的缺失导致A.veronii Mot A、Mot B、Fli M和Fli N等16个鞭毛形成主要相关蛋白的表达量显着下调,与缺失株△prkC鞭毛脱落,运动能力减弱等表型变化一致,表明prkC基因参与调控A.veronii鞭毛的形成。（3）磷酸化修饰组学分析结果显示,缺失株△prkC与野生株TH0426之间共存在75个差异修饰位点,其中上调修饰位点56个,对应蛋白40个,下调修饰位点19个,对应蛋白17个;进一步利用生物信息学对磷酸化差异蛋白功能分析发现,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Prk C通过磷酸化修饰参与了A.veronii转录、翻译、基础代谢及细菌趋化性等多个生物学过程,且分析结果表明Prk C参与调控A.veronii鞭毛蛋白Fli C的磷酸化修饰和蛋白表达。（4）通过Pull-down-MS技术筛选获得8个与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Prk C有潜在相互作用的蛋白,包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、钠离子易位NADH-泛醌还原酶亚基A、细菌鞭毛丝状体蛋白Fli C、细胞分裂蛋白Fts Z、谷氨酸-t RNA连接酶Glt X、细菌趋化蛋白Che V、柠檬酸合成酶Glt A和异柠檬酸脱氢酶Icd;此外,通过体外Pull-down实验证实了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Prk C与鞭毛蛋白Fli C存在直接互作关系,表明Prk C通过磷酸化修饰直接作用于鞭毛蛋白Fli C,进而影响A.veronii鞭毛的形成。综上所述,本研究结果表明A.veronii丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Prk C是一个重要的全局调控因子,参与调控A.veronii的生长分裂、毒力、趋化特性、鞭毛的组装及合成等多个生物学过程,研究结果为进一步明确A.veronii丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Prk C的功能奠定了基础,同时也为进一步阐明维氏气单胞菌致病机理提供了重要依据。
李鹤[2]（2019）在《结核分枝杆菌丝氨酸蛋白酶Rv3194c的特性及其对致病性影响的研究》文中研究表明结核病（Tuberculosis）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）引起的一种慢性、消耗性人兽共患传染病,可通过患者咳嗽或打喷嚏时形成的带菌气溶胶,在人与人、人与动物之间传播。据报道,结核病是全球范围内危害人类健康的十大重要传染病之一,每年约有一千万人感染结核病,造成约一百七十万人死亡。近些年来,由于多重耐药结核分枝杆菌（MDR-TB）及广谱耐药结核分枝杆菌（XDR-TB）的流行及其与HIV病毒的混合感染,使得结核病的防控变得更加困难。因此,迫切需要我们阐明结核病的发病机制,寻找结核病新的药物作用靶点,创制新型疫苗以降低该病给人类健康造成的危害。众所周知,肺泡巨噬细胞是MTB主要感染及入侵的靶细胞,在MTB感染细胞的过程中,许多毒力因子都发挥了重要的作用。而丝氨酸蛋白酶类是MTB的一类重要的毒力因子,与菌体对巨噬细胞的侵袭以及在巨噬细胞中的持留密切相关,但该酶类的理化特性及其在致病性方面所扮演的具体作用仍有待进一步研究。本研究利用生物信息学方法,分析了Rv3194c蛋白可能为MTB的一个潜在的胞外丝氨酸蛋白酶,在大肠杆菌中表达并纯化了结核分枝杆菌Rv3194c蛋白,实验证实了Rv3194c蛋白具有丝氨酸蛋白酶活性:体外可以降解牛血清白蛋白（BSA）、牛乳（Milk）、酪蛋白（Casein）及明胶（Gelatin）,同时在485nm激发波长和535nm吸收波长的条件下能够检测到Rv3194c降解荧光标记的酪蛋白（FITC-Casein）所发出的荧光。进一步的实验表明,Rv3194c蛋白发挥丝氨酸蛋白酶活性所需的最佳温度为40℃、最适pH值为8.0,同时二价金属离子Mn2+离子和Ca2+离子可以促进其酶活性的发挥。体外抑制剂筛选结果表明,中药单体-桦木酸及化学抑制剂-PMSF和Roche inhibitor cocktail能够有效抑制Rv3194c的丝氨酸蛋白酶活性。定点突变研究结果显示,突变S253、G254、S86、G87、D308和S309位点可以降低Rv3194c的丝氨酸蛋白酶活性,特别是D308和S309位点对Rv3194c的丝氨酸蛋白酶活性起着关键性的作用,可降低Rv3194c蛋白酶70%的酶活性。将rv3194c基因及其突变体rv3194cM（D308A和S309A）基因连接到pMV261-AI-N穿梭载体构建重组质粒pMV261-rv3194c及p MV261-rv3194cM,测序鉴定成功后将重组质粒与空载体质粒分别电击转化到耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis,Ms）中,构建重组耻垢分枝杆菌Ms-261-Rv3194c、突变体菌株Ms-261-Rv3194cM及含有空载体的重组耻垢分枝杆菌Ms-261。亚细胞定位分析,结果表明在重组耻垢分枝杆菌及BCG中Rv3194c蛋白均能够在菌体组分全菌体、胞壁、胞浆、胞膜中被检测到,同时Rv3194c蛋白能够在重组耻垢分枝杆菌的培养滤液中被检测到,表明Rv3194c可能为结核分枝杆菌的一个潜在的胞外丝氨酸蛋白酶。同时体外测定Ms-261-Rv3194c重组菌及其突变株的生长曲线,可以发现其与亲本菌株（Ms）在生长速率上并无差异。在抑制巨噬细胞功能和降解补体分子方面,用Rv3194c与其突变体蛋白Rv3194cM（D308A、S309A）分别作用诱导分化的THP-1巨噬细胞后发现,在蛋白处理细胞12 h后,对照组的划痕愈合了约69.47%,而Rv3194c蛋白处理后的细胞,划痕愈合了约28.97%,突变体蛋白Rv3194cM处理后的细胞,划痕愈合了约47.23%。作用24 h后的对照组细胞划痕愈合了约90.57%,而Rv3194c处理的巨噬细胞,细胞划痕愈合率约为47.2%,Rv3194cM实验组的细胞划痕愈合率约为69.29%,结果表明Rv3194c蛋白可明显抑制巨噬细胞的迁移。纯化的Rv3194c蛋白可以体外降解补体成分C3中的C3b,从而抑制THP1巨噬细胞对耻垢分枝杆菌和重组耻垢分枝杆菌的吞噬作用。同时,Rv3194c也能够降解补体成分C5中的C5a分子,从而抑制THP1巨噬细胞的趋化作用。在Rv3194c致病性研究方面,用三组重组菌（Ms-261,Ms-261-Rv3194c,Ms-261-Rv3194cM）分别感染C57BL/6小鼠,结果发现,表达空载体的重组菌Ms-261在感染小鼠14 d时,肺内的重组菌可被完全清除,表达Rv3194c突变体的重组菌（Ms-261-Rv3194cM）在肺内的持留时间直到28 d时才被完全清除,而表达Rv3194c蛋白的重组耻垢分枝杆菌在感染后的28 d时仍然存在于感染小鼠的肺部,结果表明重组菌Ms-261-Rv3194c与其突变体Ms-261-Rv3194c M相较于Ms-261在感染小鼠后均能够提高耻垢分枝杆菌在小鼠肺脏内的定殖与持留。病理组织学研究发现Rv3194c可以诱导小鼠肺脏产生出血性变性和炎性细胞因子的浸润等组织病理学变化。对不同时间点感染后小鼠脾脏淋巴细胞培养上清中细胞因子的检测发现,Rv3194c可以显着提高IFN-γ、IL-1β、TNF-α和IL-6炎性细胞因子的分泌。本研究证明结核分枝杆菌丝氨酸蛋白酶Rv3194c在结核分枝杆菌的致病性方面具有重要作用,有望为治疗结核病提供一个新的药物靶标。
唐小娟[3]（2019）在《武汉市猫传染性腹膜炎病例分析及病毒的分离与鉴定》文中研究表明猫传染性腹膜炎（Feline infectious peritonitis,FIP）是由猫传染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitis virus,FIPV）引起的猫科动物的一种慢性、渐进性、致死性传染病,以腹膜炎、大量腹水积聚或各脏器出现肉芽肿病变以及致死率较高为主要临床特征。该病在世界各地呈地方性流行,其高致死率对伴侣动物行业造成了较大的经济损失。因此,开展对FIP病原学、流行病学、致病机制及预防治疗措施等的研究具有重要意义。本研究旨在调查湖北省武汉市FIP的流行情况,基于华中农业大学动物医院的门诊临床病例,运用猫冠状病毒抗原快速诊断试纸条和RT-PCR检测技术,对2017年11月至2018年9月的1036例临床病例进行FIP检测,并对病例的发病情况和特点进行统计分析。共检出FIP阳性病例61例,检出率为5.9%。从时间分布看,2018年1月的检出率最高,占13.4%,其余月份的检出率为6.0%8.0%。从群间分布看,英国短毛猫和田园猫的患病比例较高,占总阳性病例的63.9%,其中英国短毛猫占到了41.0%,而田园猫比例在10.0%以上。就诊阳性病例中,雄性猫（70.0%）的患病比例明显高于雌性猫（30.0%）,且FIP阳性病例主要为12个月龄以内的幼猫（72.1%）。本研究表明湖北省武汉市猫FIP的发生率与猫的品种、年龄和性别等存在一定的关系。为了分析当前武汉地区FIP阳性猫的分子流行病学特征,本研究对临床FIP猫所感染的病毒进行了分离与鉴定。并从12份阳性病料中成功分离到12株FCoV毒株HN-1HN-12,随机选取其中5株进行了S基因片段测定并采用MEGA6.0软件进行进化树分析,发现其中4株毒株在S基因分型上同属于FCoV I血清型,并且同属猫肠道冠状病毒（Feline enteric coronavirus,FECV）生物型,其中HN-6毒株形成一个单独的亚群。为了更进一步探究其分离毒株毒力相关基因3c和7ab的分子生物学特征,本研究对分离出的12株毒株的3c和7ab进行扩增,对阳性样品构建血清型和生物型遗传进化树。3c血清型遗传进化树分析显示,其中8株属于FCoV I,1株属于FCoV II,另外2株形成一个独立的亚群。3c生物型遗传进化树分析显示,其中8株属于FECV,1株属于FIPV,剩下2株形成一个独立的亚群。7ab基因血清型遗传进化树分析显示,其中3株属于FCoV I,2株属于FCoV II,另外4株形成一个独立的亚群。7ab基因生物型遗传进化树分析显示,其中3株属于FECV,2株属于FIPV,剩下4株形成一个独立的亚群。基于各毒株的S、3c、7ab基因的血清型和生物型遗传进化分析结果,HN-1和HN-8毒株血清型上属于FCoV I,而其它各毒株基于不同基因分型得出不一样的结果,表明进化树分析能够确定其遗传进化关系,但不能分析其血清型和生物型。本研究解析了武汉地区FIP的的分子流行特点,为武汉地区FIP的防控奠定理论基础,并为针对性地开发临床FIP疫苗提供帮助。综上所述:本研究基于武汉市华中农业大学动物医院2017年11月至2018年9月临床病例流行病学情况,掌握了FIP在武汉地区的流行发病特点,并分离出12株FCoV毒株,基于S、3c、7ab基因,进行血清型和生物型遗传进化分析,并探究了毒株3c、7ab的分子生物学特征,为临床该病的防治提供了理论基础。
徐嫚[4]（2019）在《梅毒螺旋体鞭毛核心蛋白致炎分子机制及免疫佐剂作用的初步研究》文中提出背景与目的:梅毒螺旋体（Treponema pallidum,Tp）是性传播疾病梅毒的病原体,可导致多器官系统受累,严重危害人体健康。梅毒与AIDs传播途径基本相同,可增加人体感染HIV风险。近年来,我国梅毒发病率呈上升趋势,在法定报告的传染病中,其发病数已超过淋病而居性传播疾病首位。因此,如何有效预防和控制梅毒已成为一个重要的公共卫生问题。防控梅毒的首要任务是研制有效疫苗,而Tp致病机制尚不清楚阻碍了梅毒疫苗的研制。目前认为,梅毒患者感染Tp后出现的硬下疳等组织病理损伤主要由局部炎症反应所致,但引起炎症反应的致病物质仍不清楚。细菌鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要结构蛋白,其不仅可诱导宿主发生炎症反应,还可作为疫苗载体蛋白或疫苗佐剂,增强相关抗原的免疫保护作用。本研究以人单核细胞为模式细胞,明确Tp鞭毛核心蛋白能否诱导炎症反应,阐明其与受体相互作用的分子机制及相关信号通路,随后在筛选有效Tp候选疫苗的基础上,进一步确定其是否具有免疫佐剂潜力。本研究将为阐明Tp致病机制及设计梅毒疫苗提供新思路,对梅毒的预防及控制具有重要科学意义。方法:1.三个Tp鞭毛核心蛋白刺激THP-1细胞24 h后,q RT-PCR检测IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β和TNF-α的m RNA转录情况,Fla B1、Fla B2或Fla B3刺激THP-1细胞后检测IL-6和IL-8的最佳表达时间和最佳表达浓度;THP-1细胞转染My D88负显性突变体质粒或TLR4、TLR5干扰质粒后以Fla B1、Fla B2或Fla B3刺激细胞,q RT-PCR和ELISA分别检测IL-6和IL-8的m RNA转录水平和蛋白表达水平。2.Fla B1、Fla B2或Fla B3刺激THP-1细胞后,Western Blot检测ERK1/2、p38、JNK和IκBα的磷酸化水平,免疫荧光检测p65的核转位;采用ERK1/2（PD98059）、p38（SB203580）、JNK（SP600125）和NF-κB（BAY117082）的特异性抑制剂预处理细胞后,Western Blot检测ERK1/2、p38和IκBα的磷酸化水平,q RT-PCR检测IL-6和IL-8的m RNA转录水平。3.克隆表达并纯化27个缺失突变体肽段,各肽段刺激THP-1细胞后,q RT-PCR检测IL-6和IL-8的m RNA转录情况,Western Blot检测ERK1/2、p38和IκBα的磷酸化水平,免疫共沉淀检测Tp鞭毛核心蛋白各肽段与TLR5的相互作用;THP-1细胞转染4.0μg psi RNA-h TLR5后,再分别以相应浓度肽段刺激细胞1 h,Western Blot检测ERK1/2、p38和IκBα的磷酸化水平,刺激细胞24 h后,q RT-PCR检测IL-6和IL-8的m RNA转录情况。4.克隆表达并纯化21个Tp鞭毛核心蛋白突变体,各突变鞭毛核心蛋白刺激THP-1细胞后,q RT-PCR检测IL-6和IL-8的m RNA转录情况,免疫共沉淀检测Tp鞭毛核心蛋白突变体与TLR5的结合。5.将新西兰兔随机分为Tp0663免疫组、Tp0136免疫组和佐剂对照组,每组3只,取纯化好的重组蛋白Tp0136和Tp0663与弗氏完全（或不完全）佐剂充分混合,每2 w免疫1次,共免疫3次,ELISA检测兔血清中特异性抗体滴度及INF-γ水平。6.末次免疫2 w后,用8×106 Tp Nichols菌株背部皮内攻击新西兰兔,感染后的03 w期间,每隔3 d观察皮损变化情况,感染21 d后,q RT-PCR检测新西兰兔皮损部位及血液、肝脏、脾脏和睾丸组织中的Tp载量,免疫组化检测皮损和睾丸中的Tp载量,H&E染色观察皮损和睾丸的炎症情况。7.将C57BL/6小鼠随机分为Tp0663免疫组、Fla B3免疫组、Fla B3+Tp0663联合免疫组和PBS对照组,每组8只,取纯化好的重组蛋白每2 w免疫C57BL/6小鼠,共免疫3次。ELISA检测小鼠血清中Tp0663特异性抗体效价和小鼠脾细胞上清中的细胞因子,CCK8检测淋巴细胞的增殖,流式检测小鼠脾淋巴细胞的胞内细胞因子表达。8.末次免疫2 w后,用1×107 Tp Nichols菌株攻击C57BL/6小鼠,感染30 d后,q RT-PCR检测小鼠直肠、脑、淋巴结、血液、肝脏、脾脏和睾丸组织中的Tp载量,免疫组化检测小鼠肝脏、脾脏和睾丸中的Tp载量;取各免疫组经Tp感染30 d后的淋巴结（每组3只）,分别接种至新西兰兔睾丸中,每周抽取兔耳缘静脉血,利用RPR试剂盒和TPPA试剂盒检测血清反应性,9 w后,暗视野观察睾丸组织中的Tp活动性。结果:1.Fla B1、Fla B2和Fla B3刺激THP-1细胞后能诱导IL-6和IL-8表达升高,Fla B1、Fla B2和Fla B3的最佳刺激浓度分别为1.0、10.0和5.0μg/m L,三者诱导IL-6和IL-8的最佳m RNA转录时间均为24 h,最佳蛋白表达时间均为48 h。THP-1细胞转染My D88负显性突变体质粒和TLR5干扰质粒后能显着抑制IL-6和IL-8的表达,转染TLR2负显性突变体质粒和TLR4干扰质粒后不影响IL-6和IL-8的表达。2.Fla B1、Fla B2和Fla B3作用THP-1细胞后可诱导ERK1/2、p38和IκBα发生磷酸化,并诱导p65发生核转位。ERK1/2、p38和NF-κB特异性抑制剂预处理细胞后,Fla B1、Fla B2和Fla B3诱导的IL-6和IL-8表达受到不同程度的抑制。3.各缺失突变体蛋白刺激THP-1细胞后仅含D1结构域的蛋白可诱导IL-6和IL-8表达及ERK1/2、p38和IκBα发生磷酸化,仅含ND1区的肽段缺失突变体可与TLR5结合。THP-1细胞转染TLR5干扰质粒后能明显抑制Tp鞭毛核心蛋白D1区诱导的ERK1/2、p38和IκBα磷酸化和IL-6、IL-8 m RNA转录。4.所有位点突变均不同程度抑制了Tp鞭毛核心蛋白诱导的IL-6和IL-8转录,且不同程度地抑制了Tp鞭毛核心蛋白与TLR5的结合。5.重组蛋白Tp0663和Tp0136免疫新西兰兔后能产生较高水平的特异性抗体,且兔血清中的INF-γ含量也较对照组明显升高。6.Tp0663和Tp0136免疫组Tp感染部位的皮损直径显着小于PBS对照组,感染部位的皮损溃疡率也显着低于PBS对照组;Tp0663和Tp0136免疫组在原始感染部位及血液、肝脏、脾脏和睾丸组织中的Tp载量均显着低于PBS对照组（P<0.05）;Tp0136和Tp0663免疫组与PBS对照组的原始感染部位炎性细胞浸润明显,而远端睾丸组织中,仅PBS对照免疫组出现炎性细胞浸润。7.重组蛋白Fla B3与Tp0633联合免疫C57BL/6小鼠后,小鼠血清中Tp0663特异性抗体的含量、小鼠脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的CD4+T细胞百分比、小鼠脾淋巴细胞上清中分泌的IFN-γ水平及小鼠脾淋巴细胞增殖分化能力均显着高于Tp0663免疫组和PBS对照组免疫组。8.Fla B3+Tp0663联合免疫组小鼠血液、脑、淋巴结、肝脏、脾脏和睾丸组织中的Tp载量均显着低于Tp0663免疫组和PBS对照组（P<0.05）;Fla B3+Tp0663联合免疫组小鼠直肠中Tp载量与PBS对照组和Tp0663免疫组小鼠直肠中Tp载量相当。小鼠淋巴细胞悬液转至新西兰兔睾丸后,PBS对照组、Fla B3免疫组、Tp0663免疫组和Fla B3+Tp0663联合免疫组出现血清转化的时间分别为20、32、32和52 d,暗视野显微镜仅观察到PBS对照组兔睾丸中存在活Tp。结论:1.Tp鞭毛核心蛋白经TLR5/My D88依赖的MAPKs和NF-κB信号途径诱导THP-1细胞表达IL-6和IL-8。2.Tp鞭毛核心蛋白的D1区是激活TLR5的关键区域,其ND1区的R89、L93和E113三个氨基酸位点是与TLR5相互作用的关键位点。3.Tp外膜蛋白Tp0663和Tp0136免疫新西兰兔后可以延缓病损的发展并抑制Tp在新西兰兔体内的扩散。4.Tp鞭毛核心蛋白Fla B3可以增强Tp0663的免疫原性,具有免疫佐剂的潜力。其与Tp0663联合免疫C57BL/6小鼠后,可以抑制Tp在小鼠体内的扩散。
徐兆坤[5]（2019）在《结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白对A549细胞炎性反应的影响》文中研究指明背景:结核病（Tuberculosis,TB）是结核分枝杆菌（Mycrobacterium tuberculosis,Mtb）感染引起的人畜共患传染病,肺泡上皮细胞是Mtb感染的靶细胞之一。lOkDa培养滤液蛋白（C ulture filtrate protein 10,CFP10）和 6kDa早期分泌性抗原靶蛋白（Early secretary antigenic target-6 kDa,ESAT6）都是减毒牛型结核分枝杆菌（Bacille Calmette-Guerin,BCG）缺失的毒力蛋白。Toll样受体（Toll-likereceptors,TLRs）途径对结核分枝杆菌感染宿主引起的炎性反应有重要的调控作用。目的与方法:本研究利用原核表达系统诱导表达并纯化CFP10和ESAT6蛋白。使用重组蛋白以及BCG处理人肺泡上皮细胞A549,利用实时荧光定量PCR、Western blot以及ELISA等技术分析TLRs信号通路关键分子及其下游炎症因子的变化,以期初步探究CFP10、ESAT6蛋白在结核分枝杆菌感染肺泡上皮细胞过程中对TLR信号通路的影响。结果:（1）经过诱导条件及纯化条件的优化,成功获得高纯度CFP10及ESAT6蛋白。（2）单独使用重组蛋白处理A549细胞时,CFP10显着上调TLR2、TLR4、MyD88、IRAK1、TRAF6和NF-κB p65的表达,下调TICAM1、TRAF3及TBK1等分子的表达,促进IL-6、TNF-α等炎性因子的分泌。ESAT6 显着下调TLR2、TLR4、MyD88、IRAK1、TRAF6、NF-κB p65、TICAM1、TRAF3、TBK1及IRF3的表达,抑制细胞IL-6、TNF-α等炎性因子的分泌。说明CFP10、ESAT6均被可Toll样受体识别进而对A549细胞TLR信号途径产生影响。（3）BCG感染A549细胞后激活了TLR信号途径信号传递,促进了炎性因子的分泌。在BCG感染细胞模型下,CFP10 进一步显着上调TLR2、TLR4、MyD88、IRAK1、TRAF6、NF-κB p65、TICAM1、TRAF3、TBK1和IRF3等分子的表达,增强A549细胞TLR信号通路的信号传递,促进IL-6、TNF-α等炎性因子的分泌。但ESAT6 显着抑制TLR2、MyD88、IRAK1、TRAF6、NF-κB p65、TICAM1、TRAF3、TBK1以及IRF3的表达,从而抑制A549细胞IL-6、TNF-α等炎性因子的分泌。CFP10和ESAT6共同处理时呈现出与ESAT6处理时的相似趋势。结果说明CFP10增强了BCG感染A549细胞时TLR信号途径介导的炎性反应,而ESAT6或者两种蛋白共处理却抑制了BCG感染所导致的A549细胞炎性反应。（4）CFP10、ESAT6能够诱导A549死亡,且随着蛋白处理浓度增加和处理时间加长细胞存活率逐渐降低,且相同浓度和时间条件下,两蛋白共处理细胞存活率高于CFP10或ESAT6处理组。（5）CFP10、ESAT6蛋白对A549细胞TLR信号通路以及炎性反应的不同结果提示,在结核分枝杆菌感染肺泡上皮细胞过程中,CFP10与ESAT6对Toll样受体通路的影响对细胞的炎性反应具有重要的调控作用,并且两种蛋白共同处理时能发挥与单独蛋白处理时不同的作用。结论:CFP10和ESAT6蛋白,可以通过MyD88依赖和MyD88非依赖性途径对A549细胞Toll样信号通路进行调节,进而影响炎性因子的表达。并且CFP10和ESAT6存在相互作用能够影响各自的功能。上述研究为加深对Mtb致病机理及抗结核免疫机制的理解进一步奠定理论基础。
孟兆丽[6]（2014）在《人源单链抗体噬菌体展示文库的构建及抗LOX-1单链抗体的筛选》文中提出凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1（lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1,LOX-1）是氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,oxLDL）的主要受体,分子量约为50 kDa的II型膜蛋白,属于C型凝集素家族。LOX-1胞外结构域（LOX-1 extracellular domain,LOX-1 ECD）被蛋白酶水解并释放到血液中形成可溶性LOX-1（soluble LOX-1,sLOX-1）。LOX-1是动脉粥样硬化（Atherosclerosis,As）及As相关疾病的新型潜在药物靶点。此外,通过LOX-1的靶向成像可实现动脉硬化斑块的定位和危险分层。因此,以LOX-1为靶点的抗体研发对于动脉硬化治疗具有重要意义。尤其是人源抗体在临床诊断和治疗中更加安全、有效,是抗体研究的热点。然而,目前所报道的LOX-1抗体多为动物来源,人源抗体的研究报道极少。噬菌体展示技术避免了杂交瘤技术所必需的动物免疫过程,是体外获得人源抗体的重要手段。它的最大优势是可直接将抗体片段展示于噬菌体表面并与内部包裹的基因信息建立物理连接,便于操作。不同于完整免疫球蛋白分子,单链抗体（single chain variable fragment,scFv）是由重链可变区VH和轻链可变区VL经由一段氨基酸肽段（Linker）连接而成的基因工程小分子抗体。scFv分子量小,免疫原性小,且在组织和肿瘤的渗透性强,在动脉硬化斑块的成像、治疗上具有相当的优势。本文为获得抗LOX-1全人源scFv,构建了库容量为6.2×108的人源scFv噬菌体展示文库,并从中筛选获得了一株亲和常数为5.8×10-6 M的单链抗体scFv-39,本研究为以LOX-1人源抗体为核心的治疗动脉粥样硬化药物的研发奠定了基础。首先,本研究采用大肠杆菌原核表达系统成功地实现了 LOX-1 ECD蛋白的大量可溶性表达,并采用MBP亲和层析和分子筛纯化方法获得了纯化的LOX-1 ECD。通过对宿主细胞和促溶标签的系统性优化,结果表明在宿主细胞Rosetta gami2（DE3）中,LOX-1 ECD与MBP标签融合表达时,融合蛋白的可溶性表达产量最高。通过表达条件优化后发现,MBP-LOX-1 ECD融合蛋白在30℃条件下培养,采用200 μM的IPTG诱导,蛋白的可溶性表达产量最高。本文通过MBP亲和层析和分子筛的纯化,获得了纯化的融合蛋白MBP-LOX-IECD。采用浓度为2.5 U/mg的凝血酶作用于MBP和LOX-1 ECD蛋白之间的氨基酸识别位点,有效地去除融合蛋白中的MBP标签。再通过MBP亲和层析和分子筛结合的纯化方法获得了纯度为95%的LOX-1 ECD蛋白,并具有较高的oxLDL结合活性。其次,采用分子生物学和基因工程的方法构建了一个容量为6.2×108人源scFv噬菌体展示文库。本文分离20名心血管病人PBMC（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,提取总RNA并反转录为cDNA。采用半巢式PCR方法扩增重链可变区VH和轻链可变区Vλ/Vκ基因片段,并通过重叠延伸PCR方法分别将VH和Vλ/κ拼接为scFv。采用基因工程方法连接scFv至噬菌体展示系统的噬菌粒载体,并将重组载体电转化进入TG1细胞,构建了人源scFv噬菌体展示系统,并对文库的阳性率和多样性进行了鉴定。然后本实验以LOX-1 ECD为抗原,从自构建的人源scFv噬菌体展示文库中筛选阳性重组噬菌体。采用固相淘筛方法,首先以免疫管为固相基质,进行了3轮淘筛,并采用噬菌斑计数方法鉴定每轮淘筛的文库输入量和输出量。同时采用多克隆噬菌体ELISA方法鉴定噬菌体与抗原特异性结合信号值的变化。结果表明,通过3轮淘筛,文库中抗LOX-1ECD特异性重组噬菌体得到了有效富集。采用单克隆噬菌体ELISA方法,从富集后的噬菌体中随机挑选了 40个单克隆进行阳性克隆的筛选并获得了 10株阳性克隆。最后本研究采用生物信息学方法对阳性克隆scFv-39序列进行了分析,并对其进行克隆和可溶性表达及亲和力活性测定。通过IMGT数据库工具对scFv-39序列进行分析,确定scFv序列具有人源VH和VL区序列的基因特征,并确定了 CDRs区域。此外,分别采用ExPAsy数据库的SOPMA工具、GENETYX软件对scFv-39的二级结构特征、物理性质进行预测。scFv-39共有735个碱基,编码245个氨基酸序列。scFv-39平均分子量大小为26209.7 Da,等电点为8.98。采用短小芽孢杆菌表达系统实现了 scFv-39的可溶性分泌表达,并在scFv-39的C-端引入6×His标签,采用镍柱亲和层析和分子筛结合的方法获得了纯化的scFv-39。采用间接ELISA方法测定scFv-39的亲和常数为5.8×10-6M。
李文涛[7]（2014）在《猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建及猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞转录组学研究》文中认为猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea, PED）是一种急性、高度传播性的肠道疾病,该病由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起,以急性肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水等为主要临床特征。PED于2010年起在中国再次爆发,该次流行主要以变异毒株的出现为特征,造成80%-100%的哺乳仔猪发病,50%-90%的仔猪死亡。后来该病于2013年5月在美国爆发,给养猪业带来了极大的经济损失。猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）是引起猪圆环病毒相关疾病的重要病原,给当前养猪业造成极大的经济损失,其靶细胞主要是单核巨噬细胞系统和树突状细胞,其感染后主要的临床组织病变为淋巴细胞减少和炎性细胞浸润,最终导致机体免疫功能抑制,从而继发感染其他细菌和病毒。本论文针对这两种猪的重要病原,主要研究内容如下：1.PEDV的流行病学调查通过对2011年2月至2011年10月间从华中、华东、华南、西南地区12个省份的57个猪场采的455份临床样品（包括粪便样品、小肠样品和乳汁样品）,用RT-PCR检测方法检测,结果显示,有45个猪场的278份样品为PEDV阳性,猪场阳性率为78.95%,样品阳性率为61.11%,这些阳性样品包括253份粪便样品、20份小肠样品、5份乳汁样品,总样品阳性率为61.11%,表明PEDV在我国流行十分广泛,感染率相当高,同时本研究还从乳汁中检测到PEDV阳性,说明PEDV可能通过母乳垂直传播给哺乳仔猪。2.PEDV CHGDU株的分离与鉴定尽管PEDV的感染率很高,猪流行性腹泻病毒的分离仍然十分困难。本研究将采自广东省某猪场发病仔猪的小肠样品处理后,接种Vero-CCL81细胞,同时维持液中添加151μg/mL胰蛋白酶,盲传3代后,有一份小肠样品接种的细胞观察到明显的PEDV特征性的多核细胞体病变,分离到的病毒通过RT-PCR和IFA检测,证实PEDV阳性,将该分离株命名为CHGDU。3. PEDV CHGDU株S基因全长测定及分析通过对CHGDU毒株S基因全长测定及分析发现,该毒株与NCBI中登录的另一毒株GD-A毒株S基因的序列同源性为100%,进一步分析S基因的序列特征发现该毒株属于变异毒株,通过与疫苗株CV777 S蛋白相应区域分析结果表明：中和表位COE区域存在3个氨基酸突变（T554S、G599S和Q638S）,而另一中和表位S1D区域包含5个氨基酸的突变（N724S、N728S、P768R、L769S 和 D771S）,与CV777相比,CHGDU在S1/S2结合位（P768R）和S2’位点突变为精氨酸（G896R）,这些位点可被蛋白质转化酶PC （proprotein convertase, PC）所识别和切割,从而增强病毒致细胞病变的能力和毒力。将CHGDU株的S基因与已测定的其他152株GenBank登录的S基因全长序列进行比较,并利用MEGA6软件绘制系统发育树,发现这些毒株可分为两个大群即Genogroup 1和Genogroup 2;其中这两个群又被分为两个亚群即1a、1b 及2a、2b。Genogroup1群主要由2010年以后分离和报道的中国毒株以及2013年和2014年美国流行毒株组成,其中CHGDU株属于1a群,属于PEDV变异株,该毒株与处于2b亚群的疫苗毒株DR13和CV777遗传关系较远。4.病毒的S基因全长克隆及重组病毒rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3/GFP的拯救为进一步验证S基因在病毒致病过程中的作用,本研究首先克隆了CHGDU的S基因全长,成功构建表达载体PCAGGS-CHGDU-S-Flag,通过转染Vero-CCL81,IFA验证S基因能顺利表达,并在5μg/mL胰蛋白酶存在的条件下诱导细胞和细胞的融合,进一步将该基因克隆至穿梭载体, 成功构建穿梭载体PPEDV-CHGDU-S-Flag-dORF3/GFP,通过体外转录RNA,电转至含有鼠肝炎病毒S基因的重组病毒mPEDV感染的Vero-CCM细胞中,通过定向重组的方法拯救出重组病毒rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3/GFP,并且验证该毒株在培养过程中需要外源添加胰蛋白酶,证明S基因是决定PEDV毒株对胰蛋白酶依赖的关键基因。5. Vero-hTMPRSS2-HA细胞系的构建与hTMPRSS2在病毒感染过程中作用的研究首先克隆了人丝氨酸蛋白酶TMPRSS2基因,构建了含有HA标签的表达质粒PQCXIN-hTMPRSS2-HA, Western-blot证实该蛋白正确表达,利用MLV系统,构建稳定表达细胞系Vero-hTMPRSS2-HA,并对细胞系进行了IFA和Western-blot检测hTMPRSS2的表达,证实稳定表达hTMPRSS2的细胞系构建成功,再利用含有GFP重组病毒为工具,测定了hTMPRSS2在病毒感染和释放过程中的作用,结果表明,hTMPRSS2在病毒入侵和释放过程中均没有明显的作用。6.猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞的转录组学研究本研究采用WH株体外感染猪原代肺泡巨噬细胞,分别在感染后24小时和48小时取样进行全基因组表达谱分析,结果显示：24小时感染组中共有266个基因差异表达,其中包括212个上调表达和54个下调表达的差异基因；48小时感染组中共有175个基因差异表达,其中包括150个上调表达和25个下调表达的差异基因,但两组间相互比较,仅有6个基因差异表达。24小时感染组差异表达基因主要与细胞的运动、血液系统的形成和功能、免疫细胞运输、细胞-细胞间的信号传递和相互作用和肾脏相关疾病等功能相关,与之相关的生物学进程主要有：免疫反应、炎症应答、抗原递呈、趋化性和抗凋亡等；而48小时感染组差异基因主要与癌症、胃肠疾病、肿瘤的形成、细胞的死亡、组织损伤和免疫细胞的运输等功能相关,与之相关的生物学进程有：炎症应答、免疫反应、趋化性和细胞与细胞信号传递等。在两个感染时间点,均发现大量炎症相关基因的上调表达,炎症因子的上调表达可能PCV2导致系统性的炎症反应的原因。
曹涤非[8]（2012）在《流产布鲁氏菌Omp25与L7/L12促巨噬细胞凋亡的分子机制》文中研究表明布鲁氏菌病（简称布病）是国际公认的自然疫源性疾病,可以在动物群体中自然携带与传播。布病以人、牛、羊、猪最为常见,犬及60多种家畜、家禽及野生动物对布病都有不同程度的易感性。布病流行范围很广,全世界200多个国家和地区中有170多个国家和地区有人及家畜布病的存在。全世界每年因布病造成的经济损失可高达30亿美元。在我国,仅新疆和青海两地每年布病导致的经济损失近1亿元。巨噬细胞是天然免疫的第一道防线,是布鲁氏菌在体内复制的主要侵染细胞。对于布鲁氏菌的存活和扩散起着非常重要的作用。在布鲁氏菌感染的早期,巨噬细胞有可能先通过降解布鲁氏菌并提呈布鲁氏菌抗原来启动免疫应答,一旦此途径受阻,感染的巨噬细胞便可能通过启动凋亡信号使布鲁氏菌失去巨噬细胞提供的保护环境,便于机体将其清除。而事实上,布鲁氏菌能在宿主细胞内复制并且积极维护细胞免于发生凋亡。由此可见,诱导巨噬细胞发生凋亡对布鲁氏菌的感染清除有着重要的意义。有研究发现巨噬细胞功能的调节和细胞因子的分泌与革兰氏阴性菌的菌体蛋白有关。布鲁氏菌外膜蛋白Omp25能调节TNF-α的产生,而TNF-α的产生能够限制或清除巨噬细胞内的细菌；L7/L12蛋白是布鲁氏菌的核糖体蛋白,能促进γ干扰素（IFN-γ）的转录和表达,而IFN-y表达上调与巨噬细胞凋亡直接相关。因此,本研究以Omp25、L7/L12为靶蛋白,体外研究Omp25、L7/L12蛋白对巨噬细胞凋亡的影响。本研究克隆出流产型布鲁氏菌omp25基因和L7/L12基因。将omp25连入原核表达载体pGEX-6p-1,L7/L12连入原核表达载体pET28a-SUMO,表达重组蛋白pGEX-6p-omp25和pET28a-SUMO-L7/L12。制备鼠抗Omp25多克隆抗体和兔抗L7/L12多克隆抗体。将omp25和L7/L12分别插入转移载体pFastBacHTB的多克隆位点,构建杆状病毒重组转移载体在昆虫细胞（sf9）中表达。蛋白体外作用巨噬细胞,对巨噬细胞的吞噬活性、分泌的细胞因子、促细胞凋亡方面进行了检测。结果：1)Omp25和L7/L12对巨噬细胞吞噬活性的影响巨噬细胞分别负载Omp25和L7/L12后,吞噬活性与静息状态相比差异显着（P<0.01）,与阴性对照相比,差异显着（P<0.01）,Omp25与LPS协同作用后,巨噬细胞吞噬活性显着提高,与巨噬细胞负载Omp25后的吞噬活性相比,差异显着（P<0.01）；L7/L12与LPS协同作用后,巨噬细胞吞噬活性显着提高,与巨噬细胞负载L7/L12后的吞噬活性相比,差异显着（P<0.01）。2)Omp25和L7/L12对巨噬细胞分泌细胞因子的影响巨噬细胞负载Omp25后,从6h开始,检测到IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10的分泌,到12hIL-6分泌达到最大值,到48h IL-1p、IL-8、IL-10的分泌达到最大值,与阴性对照相比差异显着（P<0.01）；与LPS协同作用巨噬细胞后,分泌的细胞因子均提高,与LPS相比,差异显着（P<0.01）,与阴性对照相比,差异显着（P<0.01）,多克隆抗体阻断后,各细胞因子分泌量均下降,与未阻断组相比,差异显着（P<0.01）。巨噬细胞负载L7/L12后,从6h开始,检测到IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10的分泌,到12hIL-6分泌达到最大值,到48h IL-1β、IL-8、IL-10的分泌达到最大值,与阴性对照相比差异显着（P<0.01）；与LPS协同作用巨噬细胞后,分泌的细胞因子均提高,与LPS相比,差异显着（P<0.01）,与阴性对照相比,差异显着（P<0.01）,多克隆抗体阻断后,各细胞因子分泌量均下降,与未阻断组相比,差异显着（P<0.01）。3)Omp25和L7/L12对巨噬细胞凋亡的影响巨噬细胞负载Omp25后,可刺激巨噬细胞产少量的caspase-3,与LPS协同刺激后可产生较多的caspase-3;巨噬细胞负载Omp25未能有典型的凋亡小体产生,但Omp25与LPS协同作用可产生典型的凋亡小体；对负载Omp25后的巨噬细胞染色发现,巨噬细胞负载Omp25后细胞有蓝色荧光,并且强于对照组细胞。Omp25与LPS协同刺激后出现强蓝色荧光。Omp25作用巨噬细胞能促进由LPS刺激引起的巨噬细胞分泌的TNF-α的增加。Omp25能促进由LPS激活引起的NF-κB核转位。当omp25与P38MAPK信号转导抑制剂SB203580作用后NF-κB未被激活；当多克隆抗体对omp25进行阻断后,NF-κB未被激活。巨噬负载细胞L7/L12后,可刺激巨噬细胞产生微量的caspase-3,与LPS协同刺激后可产生少量的caspase-3,巨噬细胞负载L7/L12后未能有典型的凋亡小体产生,但L7/L12与LPS协同作用可产生典型的凋亡小体；对负载L7/L12后的巨噬细胞染色发现,巨噬细胞负载L7/L12后细胞有蓝色荧光。L7/L12与LPS协同刺激后出现强蓝色荧光。L7/L12作用巨噬细胞能促进由LPS刺激引起的巨噬细胞分泌的TNF-α的增加。L7/L12能促进由LPS激活引起的NF-κB核转位,当L7/L12与P38MAPK信号转导抑制剂SB203580作用后NF-κB未被激活；当多克隆抗体对L7/L12进行阻断后,NF-κB未被激活。本研究通过以上试验得出：1)Omp25与L7/L12可激活巨噬细胞,提高巨噬细胞的吞噬活性,增强杀菌能力,促进巨噬细胞对病原菌的清除；2)Omp25与L7/L12可体外增强巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6、IL-8的含量。3)Omp25与L7/L12诱导巨噬细胞分泌caspase-3,上调TNF-α的分泌,激活NF-κB,促进由LPS诱导的巨噬细胞的凋亡。
孔凡芝[9]（2012）在《牙龈卟啉单胞菌Rag基因溯源研究及其蛋白免疫原性分析》文中提出牙周病是指发生在牙支持组织的疾病,包括仅累及牙龈组织的牙龈病和波及深层牙周组织的牙周炎两大类。是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一,也是危害人类牙齿和全身健康的主要口腔疾病之一。牙周病与许多系统性疾病如,血管疾病、糖尿病、低体质量早产儿、消化系统疾病等存在着密切的相关性,成为许多系统性疾病的潜在危险因素。因此,及时的治疗牙周病对于预防系统性疾病的发生,提高人民的生活质量具有重要的意义。牙周病作为慢性、非特异性、感染性疾病,其主要感染源为细菌。而牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）是牙周病的重要致病菌,与慢性牙周炎、侵袭性牙周炎、牙周脓肿和牙髓感染以及伴发性全身性系统疾病密切相关。P. gingivalis是革兰阴性短杆菌,专性厌氧、无芽胞、无动力,存在毒力株和无毒株,无毒株形成了口腔正常的微生态群,而毒力株则成为牙周病的重要致病菌。同时也发现毒力株中存在rag基因座（ragA和ragB）,该基因座低（G+C）摩尔百分数、侧端有可移动元件和插入元件,而且rag基因座有4种等位基因型,存在遗传多态性。因此,明确口腔疾病患者P. gingivalis基因型的分布,阐明rag基因座的来源,对于有效地诊断、清除P. gingivalis感染,防治牙周疾病的发生,提高人民生活质量具有重要意义。目的（1）已有研究发现P. gingivalis是牙周炎的重要致病因子,与心血管疾病、消化系统疾病、低体重早产儿、超敏反应及自身免疫性疾病等系统性疾病的发生、发展密切相关,严重影响人民生活健康。那么镇江地区牙周病患者P. gingivalis感染情况如何?已有研究提示rag基因座为P. gingivalis致病岛重要的组成部分,具有遗传多态性。因此,通过本研究的实施,阐明镇江地区口腔疾病患者P. gingivalis感染率及其与牙周病的关系；明确镇江地区流行性P. gingivalis基因型。（2）rag基因座作为P. gingivalis致病岛的重要组成部分,具有rag1-4等四种基因型,该基因座低GC摩尔百分数、侧端有可移动元件和插入元件,这均提示P. gingivalis rag基因座有可能经水平传播获得,在该基因的进化过程其驱动力如何,有待研究证实。因此,通过本研究的实施,从理论上阐明P. gingivalis rag基因座来源的理论基础及其进化的驱动力。（3）鉴于P. gingivalis有致病性和非致病性之分,非致病性P.gingivalis是口腔微环境正常菌群；而致病性P. gingivalis存在rag基因座,与牙周病以及许多系统性疾病的发生密切相关,严重影响人民的身体健康。rag基因座具有遗传的多态性。那么开展针对P. gingivalisrag基因座的预防治疗是否可以切断rag基因的来源,防止致病性牙龈卟啉菌的扩散,有效地的清除牙龈卟啉菌的感染呢?值得进一步探讨,本研究旨在阐明rag外膜蛋白的免疫原性,为其以后疫苗的研究奠定基础。方法（1）镇江地区口腔疾病患者P. gingivalis的感染率及其rag基因的分布收集来医院就诊的口腔疾病患者龈沟液,热煮沸法提取基因组DNA,利用P. gingivalis特异性的16sRNA扩增P. gingivalis,分析其在镇江地区口腔疾病患者中的流行率及其与牙周病发生、发展的关系；设计针对P. gingivalis不同rag基因座亚型的PCR引物,多重PCR方法分析镇江地区流行的P. gingivalis rag基因型。（2） P. gingivalis rag基因座溯源分析分别利用已报道的P. gingivalis ragA-1和ragB-1蛋白序列作为靶序列采用PSI-BLAST搜索策略在美国国立生物技术信息中心蛋白数据库中搜索其相关序列。采用Clustal X软件进行序列比对、校正、去除空格后；采用邻接法（Neighbor-Joining, NJ）、最小进化法（Minimum-Evolution, ME）构建系统进化树,bootstrap值通过检测1000次获得；并利用PAML软件进行选择压力分析。（3） P. gingivalis rag基因的克隆、表达和纯化以P. gingivalis W50基因组为模板,利用PCR扩增目的基因ragB;用BamH I和Hind III双酶切ragBPCR扩增产物,整合至质粒pET-32a（+）,重组质粒转化感受态大肠埃希菌Rosetta。挑取阳性克隆,经限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切鉴定,将阳性重组子命名pET-32a-ragB;随机挑取含测序正确重组子的单个菌落接种于3mL含有终浓度100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃振荡培养过夜。次日按1：100接种于新鲜的LB液体培养基（100mg/L氨苄青霉素）,37℃振荡培养达菌液OD600为0.4到0.6时,加入终浓度0.5mmol/LIPTG,30℃振荡培养下诱导4h、6h、8h。分别收集菌液12000r/min离心1min,弃上清,菌体用80 u L生理盐水重悬,冰上超声处理至混合液澄清。以12g/dl的SDS-PAGE分析融合蛋白的最佳诱导条件及表达形式（4） P. gingivalis rag蛋白的纯化和鉴定对大量诱导表达的蛋白,以Ni-NTA亲和层析柱纯化；并用Western-blot进行鉴定。（5） P. gingivalis rag蛋白多克隆抗体的制备及效价鉴定将纯化的融合蛋白与等体积弗氏完全佐剂混匀并充分乳化后,每只100 μg蛋白皮下多点注射家兔,两周后用不完全弗氏佐剂加强免疫2次,方法同前,之后再经耳静脉加强免疫数次,于末次免疫一周后颈动脉放血、分离血清,常规间接ELISA法测定抗血清效价。（6） P. gingivalis外膜蛋白ragB-GITRL真核共表达载体的构建及免疫原性分析应用PCR扩增技术,从pMD18-T-ragB中获得ragB基因编码序列片段,克隆至真核共表达载体pIRES及pIRES-mGITRL。对重组质粒进行双酶切与测序鉴定后,以脂质体介导法转染至COS7细胞,通过Western blot检测其在COS7细胞中的表达。将成功构建的重组质粒免疫小鼠,应用ELISA法检测免疫后小鼠血清中抗RagB的水平。结果（1）在110例病人中有29例检测到P. gingivalis,这29例中有1例来自于慢性局部性牙周炎、9例来自于广泛性慢性牙周炎、19例来自于坏死性牙周炎；在29例P. gingivalis感染的病人中,19例检测到rag基因。其中10例为rag1型、6例为rag2型、3例为rag3型,在镇江地区没有检测到rag4型；19例rag基因检出病人中,18例来自于坏死性牙周炎病人,1例来自于广泛性慢性牙周炎病人。在19例rag基因检出病人中,有3人患有糖尿病,5人患有心血管系统疾病。（2）153个rag蛋白同源序列从美国国立生物技术信息中心蛋白数据库中搜索到,利用DAMBE软件去除冗余的序列后50个蛋白序列后,采用NJ、ME法构建系统进化树。由系统进化树可以看出有明显的三个分支,分别命名为（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）,该系统进化树每个分支具有统计学意义；P. gingivalis ragA其无义突变和有义突变的比值（dN/dS=0.23）; P. gingivalis ragB其无义突变和有义突变的比值dN/dS=0.19)。（3）以P.gingivalis基因组为模板,采用特异性ragB引物,通过PCR扩增得到目的基因,经10g/L的琼脂糖凝胶电泳证实,获得一条大约1506bp大小的特异性条带,与预期目的片段大小相符；将胶回收的PCR扩增产物及pET-32a（+）,分别用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,回收目的片段ragB和载体pET-32a（+）,然后用T4连接酶连接构建成重组质粒pET-32a-ragB；克隆出的目的基因测序显示,其编码区为1506bp,编码501个氨基酸残基。与GenBank已收录的序列（AJ130872）一致。（4）pET-32a-ragB转化的大肠埃希菌Rosetta菌株,经IPTG诱导后其表达蛋白的SDS-PAGE电泳显示：在30℃、200rpm、终浓度0.5mmol/L IPTG诱导6h条件下,融合蛋白表达达到高峰,蛋白条带位于分子量约74kDa处；该融合蛋白主要以可溶性形式存在；镍柱纯化后得到单一条带的目的蛋白。用抗-His mAb进行Western blot鉴定,证实该蛋白条带为RagB融合蛋白。（5）共免疫2只家兔,分离的血清经间接ELISA法检测,两份抗血清效价分别为1:320000和1:160000。（6）PCR扩增目的基因,酶切和测序证实重组质粒pIRES-ragB及pIRES-ragB-mGITRL成功构建,Western blot结果显示目的基因在COS7细胞及肌细胞中均过表达。小鼠血清中检测出高滴度的抗RagB的抗体。结论（1）镇江地区P.gingivalis检出率较低,但在坏死性牙周炎中检出率较高,与牙周炎的发生、发展相关;P.gingivalis rag基因具有多态性,该基因的分布具有明显的地域性差异,镇江地区以rag-1型为主。（2）已有研究显示rag基因座为P.gingivalis致病岛的重要组成部分,仅存于致病性P. gingivalis中；且该基因座具有低（G+C）摩尔百分数、侧端有可移动元件和插入元件；因此,推测该基因座可能经基因水平转移获得。为证实以上假说,从基因数据库中搜索其相关序列,从生物信息学的角度证实rag基因座经水平传播获得,在该基因的遗传过程没有经受任何选择性的压力。（3）既然P. gingivalis具有致病性和非致病性菌株,致病性P.gingivalis含有rag基因座,为其致病岛的重要组成部分,那么该基因座是否能够成为新型的P. gingivalis疫苗侯选；该基因座是否能够有效地的触发免疫应答或者是参与P. gingivalis免疫逃逸机制；有鉴于此,克隆、表达了rag蛋白,同时构建了pIRES-ragB-mGITRL表达载体,为牙龈卟啉菌疫苗研究、预防和牙周炎治疗提供了实验依据。（4） P. gingivalis具有致病性和非致病性之分,非致病性P.gingivalis为口腔正常菌群的重要组成部分；rag基因座为P. gingivalis致病岛的重要组成部分；且rag基因经水平传播获得；因此,开展针对rag基因座的治疗对于预防口腔疾病及其系统疾病的发生,提高人民生活质量具有重要的意义。有鉴于此,制备了针对P. gingivalis rag基因座的多克隆抗体,初步研究表明该抗体具有保护作用。
种靖慧[10]（2010）在《P2X家族受体在白血病中的异常表达及异常功能研究》文中认为核苷酸类物质是新近阐明的细胞间通讯载体,它们结合细胞膜上的P2家族嘌呤受体,调节细胞的生存和功能。根据结构的不同P2家族受体可分为P2X和P2Y两个家族,P2Y为七次跨膜的G蛋白偶联受体,而P2X家族受体是一种ATP门控的离子通道,具有两个跨膜结构域及位于胞内的氨基和羧基末端。P2X受体与配体结合后构象改变,实现通道开启、关闭和离子的通透。P2X7受体是P2X家族特殊成员之一,其羧基末端最长,与其他P2X家族受体亚型在药理学性质和形成溶胞孔方面有明显区别。它对二价阳离子有较强的选择性,在激动剂ATP或BzATP刺激时离子通道选择性地开放,对Na+、K+和Ca2+选择性通透；重复或者延长刺激,该通道形成大孔,可使荧光黄、溴化乙锭和YO-PRO等大分子通过。P2X受体广泛分布于各个组织和细胞,功能呈多样性,参与各种生理和病理过程。且越来越多的证据表明P2X受体各亚型之间的共表达共组装会形成新的功能性通道而发挥独特的功能,这需要我们更全面的研究P2X受体家族在任何一种细胞型或任何生理病理过程中的表达状态,利于更深入阐明他们所发挥的功能。P2X受体在血液系统肿瘤中的意义越来越受到关注,目前多集中于P2X7受体亚型的研究,发现P2X7受体表达异常与C-LL, AML, ALL, MDS, CML等多种白血病有关,目前还没有系统而全面的报道研究P2X受体家族在儿童急性白血病中的表达特点。P2X7的功能受多因素、多环节的调控,随着对P2X7受体研究的逐渐深入,研究者不断发现各种功能异常的P2X7受体。我们在白血病细胞系LCL-H和J6-1中发现了P2X7受体功能的异常,高表达CD39相关的ATP酶活性是LCL-H细胞P2X7受体功能异常的原因,而J6-1细胞中有其他因素影响P2X7受体的功能。我们从J6-1中克隆得到的P2X7受体基因在第559位有一个A→G有义突变,导致Asn187→Asp187（N187D）,我们试图从基因水平解释该突变体功能异常的原因。根据以上的国内外研究背景及我室以往的研究结果,本文以P2X受体家族在儿童急性白血病的表达特点及J6-1细胞系来源的突变型P2X7受体（N187D）功能异常为研究重点,深入探讨P2X受体家族与白血病的关系及突变型P2X7受体功能调控的影响及其在白血病中的意义。本文主要完成了以下研究工作：1.应用real time RT-PCR、western blot和荧光测钙方法,证明了P2X1,4,5,7受体亚型在儿童急性白血病患者的骨髓单个核细胞中广泛表达,且其mRNA和蛋白表达水平均显着高于对照。其中尤为关注的是相对于初诊患者,P2X7受体显着高表达于复发患者中。线性相关分析发现P2X受体亚型之间存在显着的共表达特征,尤其是P2X4和P2X7之间的共表达。另外,经过标准化疗达到完全缓解后,除P2X1受体略有降低外P2X4,5,7受体表达水平均显着降低。提示造血相关的P2X受体与儿童急性白血病的发生、发展和治疗密切相关。2.在该突变体（N187D）序列基础上用overlap PCR方法回复突变得到野生型P2X7,构建了野生型及突变型P2X7真核表达载体,并转染不表达P2X7受体的K562细胞,RT-PCR、Western blot和免疫荧光法证实构建成功,获得了稳定表达细胞株（K562-W/K562-M）;体外实验发现突变型P2X7受体对激动剂刺激敏感性降低,在常规浓度激动剂BzATP刺激下不能引发受体介导的一系列反应,而在高浓度的激动剂刺激下增加细胞凋亡率,介导钙离子内流,引起ERK磷酸化水平升高,并且该突变型P2X7受体敏感性降低与细胞表面ATPase活性无关；相对于K562-W,K562-M细胞在体外及裸鼠体内增殖能力明显增强,凋亡减少,且共聚焦显微镜下显示K562-M瘤块中有大量的CD206阳性的Ⅱ型巨噬细胞浸润和明显的血管新生,实时定量PCR方法证明K562-M瘤组织中人源和鼠源性促血管新生因子VEGF和人源的单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达水平升高,提示血管新生和巨噬细胞在其中发挥重要的作用。上述结果提示除了减少的细胞凋亡因素外,突变型P2X7受体N187D在体内还通过其他复杂的机制促进恶性肿瘤的发展。综上所述,本文首次系统而全面的研究了P2X受体家族在儿童急性白血病中的表达特点及其与疾病治疗的关系,首次在血液疾病中发现了P2X受体亚型之间显着的共表达特点,为深入阐明P2X受体家族介导的信号传递在白血病发生发展中的作用机制奠定了基础；首次确定了一种配体敏感性降低的新P2X7突变类型,区别于以往报道的无功能型和功能增强型P2X7突变体,该突变体功能异常与恶性肿瘤发展相关,为进一步阐明P2X7受体在肿瘤中的作用提供了新的思路和方向。
二、用重组PCR技术缺失突变人单核细胞趋化蛋白-1基因（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用重组PCR技术缺失突变人单核细胞趋化蛋白-1基因（论文提纲范文）
（1）维氏气单胞菌Hanks样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PrkC功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 维氏气单胞菌研究进展 |
| 1.1 维氏气单胞菌简介 |
| 1.2 维氏气单胞菌国内外流行现状 |
| 1.3 维氏气单胞菌毒力因子研究进展 |
| 第二章 细菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能研究进展 |
| 2.1 细菌蛋白质磷酸化修饰 |
| 2.2 细菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶磷酸化修饰 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 维氏气单胞菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PrkC和YihE功能分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 缺失株△prkC/野生株TH0426比较蛋白质组学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 缺失株△prkC/野生株TH0426磷酸化修饰组学分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PrkC互作蛋白初步分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）结核分枝杆菌丝氨酸蛋白酶Rv3194c的特性及其对致病性影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 结核分枝杆菌与结核病的概述 |
| 1.2 结核病的流行病学概述 |
| 1.3 结核病的微生物学和致病机制研究 |
| 1.3.1 结核分枝杆菌和宿主之间的相互作用 |
| 1.3.2 结核分枝杆菌的毒力研究 |
| 1.3.3 结核病的免疫学研究 |
| 1.3.4 肉芽肿的形成 |
| 1.3.5 结核分枝杆菌的耐药性研究 |
| 1.4 丝氨酸蛋白酶 |
| 1.4.1 丝氨酸蛋白酶的种类 |
| 1.4.2 丝氨酸蛋白酶的结构 |
| 1.4.3 丝氨酸蛋白酶的功能 |
| 1.5 革兰氏阴性菌中的丝氨酸蛋白酶 |
| 1.5.1 蛋白酶的转运机制 |
| 1.5.2 HtrA及 HtrA样丝氨酸蛋白酶 |
| 1.6 革兰氏阳性菌中的丝氨酸蛋白酶 |
| 1.7 结论 |
| 1.8 本研究的目的与意义 |
| 第二章 RV3194C蛋白的纯化与多克隆抗体的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物、载体和菌株 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物的设计 |
| 2.2.2 结核分枝杆菌rv3194和rv0983基因的扩增 |
| 2.2.3 rv3194和rv0983基因原核表达质粒的构建 |
| 2.2.4 重组质粒的诱导与表达 |
| 2.2.5 Rv3194c和 Rv0983c蛋白的纯化 |
| 2.2.6 蛋白质的质谱验证 |
| 2.2.7 抗Rv3194c蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 目的基因的扩增与重组质粒双酶切鉴定 |
| 2.3.2 Rv3194c和 Rv0983c蛋白的表达 |
| 2.3.3 Rv3194c和 Rv0983c蛋白的纯化 |
| 2.3.4 Rv3194c蛋白的Westernblot鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 结核分枝杆菌RV3194C丝氨酸蛋白酶活性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Rv3194c蛋白酶活性与蛋白酶底物的测定 |
| 3.2.2 不同pH值及温度对Rv3194c酶活性的影响 |
| 3.2.3 不同二价金属离子对Rv3194c酶活性的影响 |
| 3.2.4 Rv3194c蛋白酶活性的动力学研究 |
| 3.2.5 Rv3194c蛋白酶抑制剂的筛选 |
| 3.2.6 Rv3194c蛋白酶活性中心的确定 |
| 3.2.7 圆二色谱分析Rv3194c及其突变体二级结构的稳定性 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Rv3194c丝氨酸蛋白酶活性的鉴定 |
| 3.3.2 不同pH和温度对Rv3194c活性的影响 |
| 3.3.3 不同二价金属离子对Rv3194c活性的影响 |
| 3.3.4 Rv3194c蛋白酶活性的动力学研究 |
| 3.3.5 Rv03194c酶活性抑制剂的筛选 |
| 3.3.6 点突变蛋白的纯化与活性测定 |
| 3.3.7 圆二色谱分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结核分枝杆菌RV3194C的致病性研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物和细胞 |
| 4.1.2 菌株和载体 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 重组耻垢分枝杆菌的构建 |
| 4.2.2 细菌组分分离与蛋白的亚细胞定位 |
| 4.2.3 重组菌生长曲线的测定及抑菌实验 |
| 4.2.4 细胞实验 |
| 4.2.5 小鼠感染试验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 重组耻垢分枝杆菌及BCG中 Rv3194c的定位分析 |
| 4.3.2 重组菌生长曲线的测定及桦木酸体外抑菌实验 |
| 4.3.3 Rv3194c抑制巨噬细胞迁徙、吞噬和趋化作用 |
| 4.3.4 重组菌在小鼠肺内的定殖能力及肺脏病理检测 |
| 4.3.5 Rv3194c上调炎性细胞因子的表达 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）武汉市猫传染性腹膜炎病例分析及病毒的分离与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 FIP病原学 |
| 1.2 FIP的流行病学 |
| 1.3 FCoV的3c和7ab的分子特点 |
| 1.4 FIP的发病机理 |
| 1.5 FIP的临床症状 |
| 1.6 FIP的病理变化 |
| 1.7 FIP的诊断 |
| 1.8 FIP的治疗和防控 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 武汉市猫传染性腹膜炎的流行病学调查 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病例来源 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 病料采集 |
| 3.2.2 临床诊断 |
| 3.2.3 样品检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 总体情况 |
| 3.3.2 时间分布 |
| 3.3.3 群间分布 |
| 3.4 讨论 |
| 4 FCoV病毒的分离鉴定及遗传进化分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株及细胞 |
| 4.1.2 引物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要培养基及试剂的配置 |
| 4.1.5 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 病料的处理 |
| 4.2.2 细胞培养和病毒的分离鉴定 |
| 4.2.3 FCoV 3c、7ab的扩增及遗传进化分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 FCoV毒株的分离 |
| 4.3.2 FCoV S基因的鉴定及遗传进化分析 |
| 4.3.3 FCoV 3c基因的扩增及遗传进化分析 |
| 4.3.4 FCoV 7ab基因的扩增及遗传进化分析 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）梅毒螺旋体鞭毛核心蛋白致炎分子机制及免疫佐剂作用的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 梅毒螺旋体鞭毛核心蛋白通过TLR5/MyD88 依赖途径激活THP-1 细胞表达IL-6和IL- |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 梅毒螺旋体鞭毛核心蛋白与TLR5相互作用的关键位点分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 梅毒螺旋体外膜蛋白Tp0136和Tp0663 免疫保护作用初步研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 梅毒螺旋体鞭毛核心蛋白Fla B3 增强Tp0663 在小鼠体内的免疫保护作用初步研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的科研成果 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
（5）结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白对A549细胞炎性反应的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英汉缩写词对照 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 结核病概况 |
| 1.2 肺泡Ⅱ型上皮细胞与结核 |
| 1.3 Toll样受体信号通路概述 |
| 1.4 Toll样受体信号通路在结核分枝杆菌致病机制中的研究进展 |
| 1.5 结核分枝杆菌蛋白CFP10、ESAT6的研究进展 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第二章 重组蛋白CFP10、ESAT6的表达纯化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 CFP10、ESAT6对A549细胞TLR信号通路的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 CFP10、ESAT6对A549细胞炎性反应的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）人源单链抗体噬菌体展示文库的构建及抗LOX-1单链抗体的筛选（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 LOX-1的研究进展 |
| 1.1.1 LOX-1的基因结构 |
| 1.1.2 LOX-1的蛋白结构 |
| 1.1.3 LOX-1的生物功能 |
| 1.1.4 LOX-1是动脉硬化疾病的新型药物靶点 |
| 1.1.5 sLOX-1的研究进展 |
| 1.2 基因工程抗体 |
| 1.2.1 基因工程抗体概论 |
| 1.2.2 基因工程抗体与抗体人源化 |
| 1.2.3 单链抗体 |
| 1.3 噬菌体展示技术的研究进展 |
| 1.3.1 噬菌体抗体展示技术概论 |
| 1.3.2 噬菌体抗体展示原理 |
| 1.3.3 噬菌体抗体展示库的分类 |
| 1.3.4 噬菌体文库的生物淘筛 |
| 1.4 本论文的研究意义和内容 |
| 第2章 LOX-1 ECD的原核可溶性表达和纯化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器和材料 |
| 2.2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2.2 主要材料与试剂 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 扩增人源LOX-1 ECD基因 |
| 2.3.2 PCR产物纯化 |
| 2.3.3 构建重组载体pENTR-LOX-1 ECD |
| 2.3.4 构建融合蛋白重组表达载体 |
| 2.3.5 表达宿主细胞的选择 |
| 2.3.6 蛋白可溶性表达情况的分析 |
| 2.3.7 优化融合蛋白MBP-LOX-1 ECD的可溶性表达条件 |
| 2.3.8 LOX-1蛋白的纯化 |
| 2.3.9 LOX-1 ECD蛋白浓度测定 |
| 2.3.10 LOX-1 ECD结合oxLDL活性的测定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 重组融合蛋白表达载体的构建 |
| 2.4.2 融合蛋白在宿主细胞中的可溶性表达 |
| 2.4.3 标签蛋白对LOX-1 ECD可溶性表达的影响 |
| 2.4.4 MBP-LOX-1 ECD可溶性表达条件优化 |
| 2.4.5 LOX-1 ECD蛋白的纯化 |
| 2.4.6 LOX-1 ECD结合oxLDL活性测定结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 人源SCFV噬菌体展示文库构建及抗LOX-1单链抗体的筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和试剂 |
| 3.2.1 主要药品 |
| 3.2.2 培养基及溶液配制方法 |
| 3.2.3 建库引物 |
| 3.2.4 仪器设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 人外周血PMBC的分离 |
| 3.3.2 总RNA的提取 |
| 3.3.3 cDNA的合成 |
| 3.3.4 scFv基因的拼接 |
| 3.3.5 pCANTAB5E载体及scFv片段的连接 |
| 3.3.6 连接产物电转化感受态细胞TG1 |
| 3.3.7 单链抗体噬菌体展示文库的鉴定 |
| 3.3.8 抗LOX-1 ECD scFv的淘筛 |
| 3.3.9 多克隆Phage ELISA |
| 3.3.10 单克隆Phage ELISA |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 人PMBC总RNA的提取及cDNA合成 |
| 3.4.2 VH和VL基因的扩增 |
| 3.4.3 重叠延伸PCR扩增scFv |
| 3.4.4 pCANTAB5E-scFv载体制备 |
| 3.4.5 scFv抗体库的鉴定 |
| 3.4.6 文库的富集淘筛 |
| 3.4.7 单克隆Phage ELISA筛选 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 单链抗体的分子鉴定、表达纯化和功能分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 仪器与试剂 |
| 4.2.1 主要仪器与设备 |
| 4.2.2 主要试剂与材料 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 阳性重组噬菌体质粒DNA的提取 |
| 4.3.2 单链抗体的生物信息学分析 |
| 4.3.3 scFv表达载体的构建 |
| 4.3.4 重组单链抗体表达菌株的构建 |
| 4.3.5 重组单链抗体的表达 |
| 4.3.6 重组单链抗体的纯化 |
| 4.3.7 蛋白浓度测定 |
| 4.3.8 western blot鉴定纯化的scFv |
| 4.3.9 scFv-39的活性测定 |
| 4.3.10 scFv-39的亲和力常数测定 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 scFv-39的序列分析 |
| 4.4.2 scFv-39的IMGT分析 |
| 4.4.3 scFv-39的ExPAsy分析 |
| 4.4.4 scFv的可溶性表达和纯化 |
| 4.4.5 scFv的亲和力测定 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间的科研成果 |
| 致谢 |
（7）猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建及猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞转录组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表(ABBREVIATION) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒研究进展 |
| 1.1.1 PED的流行 |
| 1.1.2 PEDV的分类地位 |
| 1.1.3 PEDV的分子结构 |
| 1.1.4 5'UTR和3’UTR |
| 1.1.5 复制酶基因ORF1 |
| 1.1.6 S基因的结构、功能及应用 |
| 1.1.7 M基因的结构与功能 |
| 1.1.8 E基因的结构与功能 |
| 1.1.9 ORF3基因的结构与功能 |
| 1.1.10 N基因的结构与功能 |
| 1.1.11 PEDV的受体研究进展 |
| 1.2 冠状病毒感染性克隆研究进展 |
| 1.3 猪圆环病毒研究进展 |
| 1.3.1 猪圆环病毒概述 |
| 1.3.2 PCV2生物学特性 |
| 1.3.3 PCV2基因组成 |
| 1.3.4 PCV2编码的蛋白质 |
| 1.3.5 PCV2病毒的复制 |
| 1.3.6 PCV2的传播途径 |
| 1.3.7 PCV2感染与临床疾病 |
| 1.3.8 PCV2致病机理 |
| 1.3.9 PCV2与宿主免疫系统的相互作用 |
| 第2章 PEDV CHGDU株感染性克隆的构建 |
| 2.1 研究的目的及意义 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 病料 |
| 2.2.2 细胞与菌株 |
| 2.2.3 载体与质粒 |
| 2.2.4 工具酶及主要试剂 |
| 2.2.5 重要仪器和设备 |
| 2.2.6 培养基配制 |
| 2.2.7 感受态细胞制备 |
| 2.2.8 分子生物学分析软件 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 病料采集与处理 |
| 2.3.2 病毒的分离 |
| 2.3.3 PEDV的增殖 |
| 2.3.4 TCID_(50)的测定 |
| 2.3.5 病毒RNA提取 |
| 2.3.6 引物的设计与合成 |
| 2.3.7 反转录合成cDNA |
| 2.3.8 质粒转染实验 |
| 2.3.9 间接免疫荧光(IFA) |
| 2.3.10 RNA定向重组 |
| 2.3.1 1病毒空斑纯化 |
| 2.3.12 病毒生长曲线的绘制 |
| 2.3.13 重组病毒对胰蛋白酶依赖性测定 |
| 2.3.14 MLV系统构建稳定细胞系Vero-hTMPRSS2-HA筛选 |
| 2.3.15 hTMPRSS2在重组病毒感染过程中的作用 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 猪流行性腹泻病毒流行病学调查 |
| 2.4.2 病毒的分离 |
| 2.4.3 PEDV CHGDU株病毒毒价的测定 |
| 2.4.4 病毒的RT-PCR检测 |
| 2.4.5 间接免疫荧光实验(IFA) |
| 2.4.6 病毒的S基因全长序列测定及分析 |
| 2.4.7 病毒的S基因全长克隆及IFA验证 |
| 2.4.8 穿梭质粒pPEDV-CHGDU-S-Flag-dORF3/GFP的构建 |
| 2.4.9 重组病毒rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP的拯救 |
| 2.4.10 重组病毒rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP生长曲线的绘制 |
| 2.4.11 rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP对胰蛋白酶依赖性测定 |
| 2.4.12 稳定表达蛋白酶hTMPRSS2的Vero-CCL81细胞系的构建 |
| 2.4.13 蛋白酶TMPRSS2在PEDV感染中的作用测定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 PEDV流行病学调查及CHGDU毒株的分离鉴定 |
| 2.5.2 PEDV CHGDU株S基因全长测序及序列分析 |
| 2.5.3 重组病毒rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP的拯救 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞转录组学研究 |
| 3.1 研究目的及意义 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 毒株及细胞 |
| 3.2.2 培养基与相关试剂的配制 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要仪器 |
| 3.2.5 试验动物 |
| 3.2.6 肺泡巨噬细胞的分离鉴定 |
| 3.2.7 PCV2感染实验设计 |
| 3.2.8 肺泡巨噬细胞总RNA的提取 |
| 3.2.9 样品RNA荧光标记 |
| 3.2.10 芯片的杂交与清洗 |
| 3.2.11 基因芯片扫描 |
| 3.2.12 基因芯片图像的采集与数据分析 |
| 3.2.13 芯片结果实时荧光定量PCR分析 |
| 3.2.14 细胞因子检测 |
| 3.2.15 差异表达基因的互作分析 |
| 3.2.16 统计学分析 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 感染前仔猪的检测 |
| 3.3.2 PCV2感染后和qPCR和IFA检测结果 |
| 3.3.3 样品RNA质量检测 |
| 3.3.4 芯片杂交结果及差异表达基因GO聚类分析 |
| 3.3.5 差异基因互作网络分析 |
| 3.3.6 芯片结果qPCR验证 |
| 3.3.7 PCV2感染后细胞上清中细胞因子检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 CD74在PCV2感染中的作用 |
| 3.4.2 Toll样受体通路分析 |
| 3.4.3 MHCII类分子与PCV2感染 |
| 3.4.4 细胞凋亡和生长抑制 |
| 3.4.5 钙结合蛋白在PCV2感染中的作用 |
| 3.4.6 炎症反应 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 CHGDU毒株S基因核苷酸序列 |
| 附录2 CHGDU毒株S蛋白氨基酸序列 |
| 附录3 rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3/GFP S基因的氨基酸序列 |
| 附表1 PCV2感染后猪肺泡巨噬细胞差异表达的可注释的基因 |
| 附表2 差异表达基因生物学进程(GO)分析 |
| 个人资料 |
| 致谢 |
（8）流产布鲁氏菌Omp25与L7/L12促巨噬细胞凋亡的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 布鲁氏菌的概况 |
| 1.2 布鲁氏菌的传播与流行 |
| 1.3 布鲁氏菌病原特性 |
| 1.4 布鲁氏菌基因组研究概况 |
| 1.5 布鲁氏菌的抗原和毒力因子 |
| 1.5.1 主要外膜抗原 |
| 1.5.2 毒力相关因子 |
| 1.6 布鲁氏菌在巨噬细胞内的生存机制 |
| 1.6.1 布鲁氏菌对巨噬细胞的侵袭作用 |
| 1.6.2 影响布鲁氏菌侵袭作用的相关分子 |
| 1.6.3 布鲁氏菌在巨噬细胞内的复制 |
| 1.7 巨噬细胞的凋亡 |
| 1.7.1 细胞凋亡的形态学变化 |
| 1.7.2 细胞凋亡的生化特征 |
| 1.7.3 导致巨噬细胞凋亡的因素 |
| 1.8 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物和细胞 |
| 2.1.2 载体、质粒及菌株 |
| 2.1.3 引物设计 |
| 2.1.4 工具酶 |
| 2.1.5 试剂 |
| 2.1.6 抗体 |
| 2.1.7 主要溶液的配制 |
| 2.1.8 主要仪器 |
| 2.2 流产布鲁氏菌omp25原核表达与纯化及多克隆抗体的制备 |
| 2.2.1 基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 目的基因的克隆 |
| 2.2.3 重组表达载体构建 |
| 2.2.4 Omp25表达及纯化 |
| 2.2.5 鼠源抗流产布鲁氏菌Omp25多克隆抗体的制备 |
| 2.3 流产布鲁氏菌L7/L12小泛素化表达纯化与多克隆抗体的制备 |
| 2.3.1 基因组DNA的提取 |
| 2.3.2 目的基因的克隆 |
| 2.3.3 克隆载体的构建 |
| 2.3.4 重组原核表达载体pET28a-SUMO-L7/L12的构建及鉴定 |
| 2.3.5 融合蛋白的诱导表达与纯化 |
| 2.3.6 U1p1蛋白酶的表达及纯化 |
| 2.3.7 SUMO标签的切除试验 |
| 2.3.8 兔源抗流产布鲁氏菌L7/L12多克隆抗体的制备 |
| 2.4 流产布鲁氏菌L7/L12蛋白对T淋巴细胞增殖实验的影响及γ干扰素产生的检测· |
| 2.4.1 淋巴细胞增殖实验 |
| 2.4.2 γ干扰素产生的检测 |
| 2.5 流产布鲁氏菌Omp25与L7/L12在昆虫细胞中的表达 |
| 2.5.1 重组转移载体的构建 |
| 2.5.2 重组杆粒的获得及鉴定 |
| 2.5.3 重组杆粒DNA转染昆虫细胞 |
| 2.5.4 重组杆状病毒DNA的PCR鉴定 |
| 2.5.5 重组蛋白的表达 |
| 2.5.6 重组蛋白的检测 |
| 2.6 Omp25与L7/L12对小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响 |
| 2.6.1 Omp25对巨噬细胞吞噬活性的影响 |
| 2.6.2 L7/L12蛋白对巨噬细胞吞噬活性的影响 |
| 2.7 Omp25与L7/L12对巨噬细胞分泌细胞因子的影响 |
| 2.7.1 Omp25对巨噬细胞分泌细胞因子的影响 |
| 2.7.2 L7/L12对巨噬细胞分泌细胞因子的影响 |
| 2.8 Omp25与L7/L12对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 2.8.1 Omp25对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 2.8.2 L7/L12对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 流产布鲁氏菌omp25原核表达与纯化及多克隆抗体的制备 |
| 3.1.1 流产布鲁氏菌omp25基因的克隆 |
| 3.1.2 重组克隆载体的构建 |
| 3.1.3 重组原核表达载体的构建 |
| 3.1.4 omp25原核表达及纯化 |
| 3.1.5 鼠源抗流产布鲁氏菌Omp25多克隆抗体的制备 |
| 3.2 流产布鲁氏菌L7/L12小泛素化表达纯化与多克隆抗体的制备 |
| 3.2.1 流产布鲁氏菌L7/L12基因的克隆 |
| 3.2.2 重组克隆载体的构建 |
| 3.2.3 L7/L12原核表达载体的构建 |
| 3.2.4 L7/L12表达及纯化 |
| 3.2.5 U1p1蛋白酶的表达及纯化 |
| 3.2.6 SUMO标签的切除试验 |
| 3.2.7 L7/L12蛋白多克隆抗体的制备 |
| 3.3 L7/L12对T淋巴细胞增殖的影响及Y干扰素产生的检测 |
| 3.3.1 L7/L12对T淋巴细胞增殖的影响 |
| 3.3.2 γ干扰素生成的检测 |
| 3.4 流产布鲁氏菌Omp25与L7/L12在昆虫细胞中的表达 |
| 3.4.1 重组转移载体的构建 |
| 3.4.2 重组杆粒的获得及鉴定 |
| 3.4.3 重组杆粒转染昆虫细胞鉴定 |
| 3.4.4 重组蛋白的鉴定 |
| 3.5 Omp25与L7/L12对小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响 |
| 3.5.1 Omp25对巨噬细胞吞噬活性的影响 |
| 3.5.2 L7/L12对巨噬细胞吞噬活性的影响 |
| 3.6 Omp25与L7/L12对巨噬细胞分泌细胞因子的影响 |
| 3.6.1 Omp25对巨噬细胞分泌细胞因子的影响 |
| 3.6.2 L7/L12对巨噬细胞分泌细胞因子的影响 |
| 3.7 Omp25与L7/L12对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 3.7.1 Omp25对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 3.7.2 L7/L12对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Omp25的原核表达 |
| 4.2 L7/L12的原核表达及对T淋巴细胞增殖与IFN-γ产生的影响 |
| 4.3 Omp25与L7/L12对巨噬细胞吞噬活性的影响 |
| 4.4 细胞因子对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 4.4.1 IL-6和IL-8对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 4.4.2 IL-1β和IL-10对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 4.5 Omp25与L7/L12对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 4.5.1 Omp25与L7/L12调节TNF-α的转录对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 4.5.2 Omp25与L7/L12诱导caspase-3的产生对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 4.5.3 Omp25与L7/L12对NF-κB的激活对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（9）牙龈卟啉单胞菌Rag基因溯源研究及其蛋白免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 P.gingivalis致病岛 |
| 1.1.1 rag基因座 |
| 1.1.2 PG0819～0844和PG1435～1454基因座 |
| 1.1.3 P.gingivalis其它致病基因 |
| 1.2. P.gingivalis与宿主的相互作用 |
| 1.2.1 P.gingivalis与宿主细胞作用的主要受体 |
| 1.2.2 P.gingivalis与宿主相互作用所依赖的信号传导途径 |
| 1.3 宿主对P.gingivalis感染的应答机制 |
| 1.3.1 固有免疫在P.gingivalis感染中的作用 |
| 1.3.2 适应性免疫应答在P.gingivalis感染中的作用 |
| 1.4 P.gingivalis引起的牙周炎与其他系统性疾病 |
| 1.4.1 牙周炎与心血管疾病 |
| 1.4.2 牙周炎与低体重早产儿 |
| 1.4.3 牙周炎与类风湿性关节炎 |
| 1.4.4 牙周炎与超敏反应性疾病 |
| 1.4.5 牙周炎与糖尿病 |
| 1.4.6 牙周炎与消化系统疾病 |
| 1.4.7 牙周炎与呼吸系统病 |
| 1.5 本研究的立题依据和目的及意义 |
| 1.6 研究内容和技术路线 |
| 参考文献 |
| 第二章 牙周炎患者P.gingivalis感染情况的流行病学调查 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 P.gingivalis的流行情况 |
| 2.2.2 Rag基因的分布 |
| 2.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 牙龈卟啉单胞菌rag基因的溯源研究 |
| 3.1 数据库和研究方法 |
| 3.1.1 所使用数据库 |
| 3.1.2 所使用软件 |
| 3.1.3 rag蛋白序列搜索策略 |
| 3.1.4 序列比较 |
| 3.1.5 进化分析 |
| 3.1.6 rag基因与其高度同源序列保守区域分析 |
| 3.1.7 rag基因进化压力分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 rag基因进化分析 |
| 3.2.2 GC含量分析 |
| 3.2.3 P.gingivalis RagA/Bacteroides sp Sus序列特征分析 |
| 3.2.4 P.gingivalis Rag在进化过程中选择性压力 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 P.gingivalis外膜蛋白RagB的基因克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 ragB基因的PCR扩增结果 |
| 4.2.2 重组质粒pET-32a-ragB构建及鉴定 |
| 4.2.3 测序结果及分析 |
| 4.2.4 ragB融合蛋白的表达、纯化及Western blot鉴定 |
| 4.2.5 多克隆抗体的制备及效价分析 |
| 4.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 牙龈卟啉菌外膜蛋白ragB-GITRL真核共表达载体的构建及免疫原性研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 牙龈卟啉菌外面蛋白ragB基因的PCR扩增结果 |
| 5.2.2 重组质粒pIRES-ragB及pIRES-ragB-mGITRL的构建及鉴定 |
| 5.2.3 重组质粒pIRES-ragB-mGITRL在COS7细胞以及小鼠腿部肌肉中的表达 |
| 5.2.4 重组质粒免疫原性分析 |
| 5.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 主要结论及展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 在读期间已发表和待发表的论文 |
| 在读期间主持的科研项目 |
| 在读期间参加的学术会议 |
| 在读期间取得的学术成绩 |
| 在读期间社会兼职 |
| 附录 |
| 附录1 本研究中常用试剂的配制 |
| 附录2 本研究中所有缓冲液的配制 |
| 附录3 本研究中所用到的主要仪器设备 |
| 致谢 |
（10）P2X家族受体在白血病中的异常表达及异常功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 PZX家族受体在儿童急性白血病中的异常表达 |
| 一、材料与试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第二章 突变型PZX7受体异常功能的研究 |
| 一、材料和试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 论文综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 缩写词 |
| 博士学位论文的资助项目 |
| 致谢 |
四、用重组PCR技术缺失突变人单核细胞趋化蛋白-1基因（论文参考文献）
- [1]维氏气单胞菌Hanks样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PrkC功能初步研究[D]. 杨滨僮. 吉林农业大学, 2021
- [2]结核分枝杆菌丝氨酸蛋白酶Rv3194c的特性及其对致病性影响的研究[D]. 李鹤. 中国农业科学院, 2019(01)
- [3]武汉市猫传染性腹膜炎病例分析及病毒的分离与鉴定[D]. 唐小娟. 华中农业大学, 2019
- [4]梅毒螺旋体鞭毛核心蛋白致炎分子机制及免疫佐剂作用的初步研究[D]. 徐嫚. 南华大学, 2019
- [5]结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白对A549细胞炎性反应的影响[D]. 徐兆坤. 宁夏大学, 2019(02)
- [6]人源单链抗体噬菌体展示文库的构建及抗LOX-1单链抗体的筛选[D]. 孟兆丽. 吉林大学, 2014(01)
- [7]猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建及猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞转录组学研究[D]. 李文涛. 华中农业大学, 2014(01)
- [8]流产布鲁氏菌Omp25与L7/L12促巨噬细胞凋亡的分子机制[D]. 曹涤非. 东北农业大学, 2012(02)
- [9]牙龈卟啉单胞菌Rag基因溯源研究及其蛋白免疫原性分析[D]. 孔凡芝. 江苏大学, 2012(01)
- [10]P2X家族受体在白血病中的异常表达及异常功能研究[D]. 种靖慧. 中国协和医科大学, 2010(10)