一、重组腺病毒介导入野生型p53,GM-CSF和B7-1基因对肿瘤化疗耐药细胞生物学行为的影响（论文文献综述）
李亭玉[1]（2021）在《双特异性重组腺病毒协同依托泊苷对小细胞肺癌抑制作用的研究》文中研究说明癌症即将成为21世纪的首要死亡原因,根据2020年最新癌症数据表明:肺癌、前列腺癌、结直肠癌和乳腺癌,排名癌症的前四位。其中肺癌根据病理学可以比较细化地分为小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancerd,SCLC）和非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）。小细胞肺癌属于高度恶性肿瘤,最主要治疗方法分别是采用手术和放化疗,但是手术治疗只局限于早期患者且效果差,容易引起转移,小细胞肺癌对于化疗药物敏感,但是存在显着的副作用。当前随着分子生物学、细胞生物学和病毒学的快速进步和不断发展,新型溶瘤腺病毒已充分显示表现出了一种不可替代治疗优势,发挥了病毒治疗和基因治疗的双重重要作用及其功能,有望尽快使其发展成为一种治疗小细胞肺癌的有效治疗手段。为了探究双特异性重组腺病毒Ad-Apoptin-hTRETp-E1a（Ad-VT）与依托泊苷（Etopside）联合应用对小细胞肺癌的协同抑制作用。本研究采用WST-1法检测Ad-VT、Etopside及联合组在不同浓度梯度及时间对NCI-H446和BEAS-2B细胞的增殖抑制作用。根据不同治疗组合的抑制率采用Calcu Syn软件分析计算联合指数（Combination Index,CI）,筛选出最佳组合。用结晶紫染色和CFST法检测Ad-VT与Etopside联合对NCI-H446和BEAS-2B的抑制作用。通过Hoechst、Annexin V染色探究Ad-VT与Etopside联合对NCI-H446细胞凋亡的影响。通过JC-1及DHR染色探究Ad-VT与Etopside联合诱导NCI-H446细胞凋亡的途径。通过Transwell及Biocoat法检测治疗后的NCI-H446细胞的迁移及侵袭的能力。体内试验中,建立了裸鼠荷瘤模型,采用测量肿瘤瘤径、小鼠体重和生存分析等方法对不同治疗组的抑瘤作用及其毒性进行检测。研究结果表明:Ad-VT（20 MOI）联合Etopside（400 nm）在48 h时显着抑制NCI-H446细胞并降低Etopside对正常细胞的毒性。通过Calcu Syn软件分析,此联合剂量具有协同作用,与结晶紫染色和CFST结果一致。通过Hoechst、Annexin V染色结果显示,Ad-VT与Etopside联合对NCI-H446细胞具有较强的凋亡诱导作用,通过JC-1及DHR染色结果显示,Ad-VT主要通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡,联合治疗后凋亡作用显着增加。Etopside与Ad-VT联合应用可显着抑制NCI-H446细胞的迁移和侵袭能力。体内肿瘤研究中,Ad-VT和Etopside的联合能够显着地有效抑制恶性肿瘤的生长,增加了肿瘤小鼠生存时间。综上,Ad-VT联合依托泊苷具有协同作用,增加对小细胞肺癌的增殖抑制率,不增加依托泊苷的副作用,并可抑制体内肿瘤生长;Ad-VT联合依托泊苷通过线粒体膜电位去极化诱导小细胞肺癌凋亡并可抑制其迁移与侵袭能力。
崔英丽[2]（2021）在《双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对卵巢癌抑制作用研究》文中研究指明癌症是人类死亡的主要原因之一。2020年全球癌症确诊患者1930万例,1000万人因癌症死亡。其中卵巢癌发病率和死亡率均居女性癌症发病率和死亡率的第八位。卵巢位于盆腔深部,早期病变不易被发现,一经发现,多为晚期,目前针对卵巢癌的治疗以手术与化疗相结合的方式为主,但化疗副作用大,易产生耐药。因此,仍然需要继续寻找更有效地治疗手段。当前随着分子生物学、细胞生物学和病毒学的快速进步和不断发展,基因治疗已经逐渐发展成为一种新型治疗卵巢癌的治疗手段,其中新型溶瘤腺病毒已充分显示表现出了一种不可替代治疗优势,发挥了病毒治疗和基因治疗的双重重要作用及其功能,有望尽快使其发展成为一种治疗卵巢癌的有效治疗手段。Apoptin是一种源自于鸡贫血病毒（CAV）的凋亡诱导蛋白,在正常细胞中没有细胞毒性,而在肿瘤细胞中能够特异性诱导肿瘤细胞发生凋亡。人端粒酶逆转录酶（h TERT）的长度和生存能力与细胞衰老和永生化有关。由于端粒酶逆转录酶（h TERT）基因的限速和催化成分的紧密转录抑制作用,大多数正常人体细胞缺乏端粒酶活性。然而,在高达90%的人类恶性肿瘤中观察到h TERT表达和端粒酶激活,使其具有无限的增殖能力。本课题组前期已构建了含有凋亡素（apoptin）蛋白和h TERTp启动子的人五型腺病毒Ad-Apoptin-h TERTp-E1a（Ad-VT）,该病毒具有只在肿瘤细胞中复制并特异性杀伤多种肿瘤细胞的能力。本研究利用本课题组自行构建的双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT以及其对照病毒Ad-T、Ad-VP3和Ad-MOCK进行了对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞的体内外抑制作用研究。研究目的:通过体内外多种实验分析Ad-VT对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞的抑制作用。研究方法:1.利用pGL4.51转染卵巢癌A2780和SKOV3细胞,并用G418加压筛选稳定表达荧光素酶基因的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并进行生物学特性分析检测。2.通过结晶紫染色和WST-1检测等方法分析Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的杀伤作用。3.通过Hoechst染色、Annexin V流式分析、caspase酶活性检测、活性氧检测以及JC-1染色等方法分析Ad-VT杀伤人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的主要方式。4.通过细胞划痕、Transwell小室侵袭等方法分析Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞迁移和侵袭能力的影响。5.用人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞分别建立裸鼠荷瘤模型,并每周观测肿瘤发光强度、肿瘤大小以及小鼠生存情况来分析Ad-VT在体内对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的抑制作用。研究结果:1.构建成功了表达荧光素酶基因的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并筛选出稳定表达的细胞系,且所构建的细胞与原始细胞没有明显的生物学差异。2.通过结晶紫染色和WST-1实验,显示了Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞具有杀伤作用,且杀伤作用具有剂量效应和时间效应关系。3.通过Hochest染色、Annexin V流式分析、caspase酶活性检测、活性氧检测以及JC-1染色等方法表明,Ad-VT主要通过内源性凋亡途径杀伤人卵巢癌A2780-LUC和人卵巢癌SKOV3-LUC细胞。4.细胞划痕实验、Transwell小室侵袭实验等方法表明,Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的迁移和侵袭具有明显的抑制作用。5.通过构建表达荧光素酶的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的裸鼠肿瘤模型,Ad-VT也可以在体内显着抑制人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC,并延长裸鼠生存期。研究结论:本研究成功构建了人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并通过多种体内外实验证实了Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞具有显着的细胞杀伤作用,表明,Ad-VT具有成为卵巢癌治疗药物的潜力。
徐阳[3]（2020）在《阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究》文中认为背景:近年来,采用微生物载体递送靶向炎症通路的基因在肿瘤治疗中取得了良好的效果。微生物载体主要包括病毒与细菌。病毒类载体可以分成两类:整合型和非整合型病毒载体,细菌主要包括厌氧菌和兼性厌氧菌。尽管已有大量的研究表明,应用减毒沙门菌体内递送基因能取得良好的治疗效果,但是,由于生物载体的安全性问题,限制了其临床转化过程。近期,人工合成载体递送基因抗肿瘤成为研究热点。人工合成载体包括脂质体和阳离子聚合物。聚醚酰亚胺（Polyetherimide,PEI）是经典的阳离子聚合物,并作为阳离子基因载体研究的金标准被广泛应用。但是PEI毒性较高,体内转染效率不高,这使得开发新型阳离子基因载体成为现阶段的研究热点。现阶段国内已开发出一系列合成基因载体用于治疗肿瘤,但是相关的体内研究仅局限于肿瘤本身,机体对合成载体递送基因抗肿瘤的综合反应仍未知。神经母细胞瘤（Neuroblastoma,NB）是儿童最常见的颅外实体肿瘤,最常见的发生部位是肾上腺。约有50%以上的患儿生存率低于40%,探寻有效的治疗靶点是神经母细胞瘤研究的热点。在临床上,神经母细胞瘤组织血运丰富,常出现早期转移,且伴有大量出血、坏死和钙化。抑制炎症致癌信号通路在该肿瘤的治疗中发挥明显作用。维甲酸/干扰素联合应用诱导的细胞凋亡调控基因19（Genes associated with retinoid-interferon-induced mortality 19,GRIM-19）可以通过抑制转录因子信号转导和转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription-3,STAT3）通路抑制恶性肿瘤的生长。虽然近期的研究表明,STAT3信号通路在神经母细胞瘤转移和化疗耐药的患儿中至关重要,但是尚缺乏临床病理分期与GRIM-19的相关性报道。异种移植瘤的体内实验提示抑制STAT3信号通路可以抑制神经母细胞瘤的生长,但是不足以评估抑制该通路后肿瘤局部微环境的改变。我们推测在神经母细胞瘤同种移植瘤中,过表达GRIM-19可能通过抑制STAT3信号通路的机制,抑制肿瘤细胞的生长,促进凋亡,而且抑制MMP-9表达,减轻瘤内出血,提高治疗效果。众所周知,多数肿瘤化疗的一线药物顺铂具有明显的内皮细胞毒性,治疗后可明显增加血浆血管性血友病因子（Von Willebrand factor,v WF）水平。针对致病机制的基因治疗具有高效低毒的特点,理论上对机体毒副作用较小。虽然已经开发出许多脂质体、阳离子载体用于神经母细胞瘤的治疗研究,可是如何在体内达到最大的治疗效果仍需仔细评估。方法:1、基因载体的合成与表征:通过酶促聚合反应合成双亲性嵌段共聚物PCL-b-P（GMA-EA）（PCG）,核磁检测PCG的化学结构,凝胶电泳检测PCG与GRIM-19质粒的结合能力,动态光散射评估PCG与GRIM-19质粒复合物的粒径和ζ电位。在人宫颈癌Hela细胞、人肝癌Hep G2细胞和鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中,用细胞增殖活性检测（CCK-8）检测PCG与EGFP-N1质粒复合物的细胞毒性,用流式细胞仪或荧光显微镜检测PCG的转染效率。2、临床样本的分析:收集吉林大学白求恩第一医院住院确诊为神经母细胞瘤的28例患儿手术标本的石蜡切片,通过免疫组化分析GRIM-19的表达与神经母细胞瘤患儿年龄、性别、肿瘤大小、INSS分期、INPC分期、淋巴结和/或脉管转移的相关性。3、PCG递送GRIM-19基因抑制神经母细胞瘤的体内外研究:用PEI作为阳性对照,采用Western blot检测PCG介导的GRIM-19在鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中的转染效率。体外实验分为6组,分别为对照组、PCG组、裸p GRIM-19组、PCG/p CDNA组、PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组,应用细胞增殖实验（CCK-8）、克隆形成实验、Brd U检测、流式凋亡检测、免疫荧光、划痕及Transwell实验,探讨PCG介导的GRIM-19过表达对肿瘤增殖、凋亡及转移的影响。体内实验中,分为对照组、PEI/p GRIM-19组和PCG/p GRIM-19共3组,应用免疫组化及Western blot检测GRIM-19的转染效率,通过免疫组化检测PCNA的表达,细胞凋亡检测（TUNEL）及Western blot检测分析裸鼠移植瘤治疗后增殖及凋亡的改变。进一步的体内实验分为对照组、顺铂组和PCG/p GRIM-19组共3组,检测各组裸鼠生存期的差异,自动血液分析仪检测裸鼠血红蛋白,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血浆中v WF,HE染色检测荷瘤鼠肺部改变,免疫组化检测肿瘤组织p-STAT3、MMP-9的表达,评价肿瘤组织学、瘤内出血、贫血及肺栓塞等肿瘤相关并发症改变。结果:1、N/P=1（阳离子聚合物中的N和DNA中的P的摩尔比）时,PCG完全阻止GRIM-19质粒DNA在凝胶电泳中的泳动。在w/w（质量比）为5-50的范围内,PCG能将p GRIM-19质粒压缩成200-400 nm大小,表面电势为25-30 m V的纳米粒子。在人宫颈癌Hela细胞、人肝癌Hep G2细胞和鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中,PCG（w/w=20）在细胞中有效递送EGFP-N1质粒,同时对细胞的毒性较小。2、神经母细胞瘤组织中GRIM-19蛋白表达水平较癌旁正常组织下调或缺失。肿瘤组织中GRIM-19表达水平与年龄（P=0.0012）、INSS分期（P=0.0012）、INPC分期（P=0.0299）、淋巴结和/或脉管转移（P=0.0062）呈负相关,与性别及肿瘤原发部位无关。3、体外实验中,PCG载体可以将GRIM-19基因转染进Neuro2a细胞并提高GRIM-19基因的蛋白表达水平,其转染效率高于PEI。在对照组、PCG组、裸p GRIM-19组、PCG/p CDNA组、PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组细胞凋亡增加,细胞增殖和细胞迁移抑制。PCG介导细胞内过表达GRIM-19蛋白抑制了STAT3信号通路,抑制了Cyclin D1、Bcl-2、MMP2和MMP9的表达。体内实验中,在对照组、PEI/p GRIM-19组和PCG/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组移植瘤生长抑制最明显,该组GRIM-19蛋白表达增加,PCNA表达下调,TUNEL染色及Cleaved caspase-3上调。在对照组、顺铂组和PCG/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组小鼠生存期延长最明显,该组大体观见瘤内出血减少,裸鼠血红蛋白升高,v WF下调,HE提示肺栓塞减少,肿瘤组织内p-STAT3下调,下游靶基因MMP-9表达下调。结论:1.人工合成的双亲性阳离子聚合物PCG能在体内外进行有效的基因转染。2.神经母细胞瘤肿瘤组织中GRIM-19的表达下调或缺失,其表达水平与年龄、INSS分期、INPC分期、淋巴结和/或脉管转移呈负相关。3.在裸鼠同种移植瘤模型中,PCG递送p GRIM-19可以有效抑制STAT3信号通路,不仅直接抑制肿瘤细胞的生长,而且抑制MMP-9表达,减轻瘤内出血。顺铂化疗引起荷瘤裸鼠内皮损伤及肺血栓增加,基因递送组v WF下调,肺血栓减少,小鼠生存期延长。阳离子PCG载体递送p GRIM-19抑制神经母细胞瘤的治疗策略可能为肿瘤治疗提供有价值的参考。
王京[4]（2020）在《乳腺癌可视化模型的建立及双特异性重组腺病毒与紫杉醇协同抑制作用的研究》文中研究表明目前,临床上使用的抗癌药物包含许多种,其中治疗乳腺癌的化疗药物主要有紫杉醇和环磷酰胺等。在临床治疗中,化疗药物的应用获得了较好的疗效,但化疗药物同时也是一把双刃剑,同时也给病人带来较大副作用,例如引起了人体的免疫系统、消化道、造血系统、皮肤和粘膜、神经系统、肝功能、心脏、肺毒性、肾功能及其他等伤害,有时还可出现并发症,常见的有感染、出血、穿孔、尿酸结晶等。如何能够在维持甚至提高患者疗效的同时,降低给患者带来的一系列副作用,一直在困扰着临床医生。虽然,已经有乳腺超声、钼靶、核磁等方法被应用于乳腺癌临床中。但是,依然不能满足临床的需求。人们还是应用注射亚甲蓝染料、纳米碳、核素等追踪前哨淋巴结方法去开展一些研究与探讨。萤火虫荧光素酶标记癌细胞在体内成像的方法,可构建稳定表达荧光素酶的细胞系和可视化动物模型。与其它方法相比,此种方法生物学特性稳定,毒性较小,克服了检测时高强的背景噪音,其波长的优势使所发出的光更容易透过组织,萤光信号强,可在短时间内表现出更强的应答等优点。但是,还需要探讨该方法在增加灵敏度的同时,是否会干扰药物抗癌作用等问题进行更深入的研究。作为肿瘤基因治疗,溶瘤病毒疗法已成为治疗癌症的重要手段之一。本课题组在先前的研究中构建了双重特异性抗肿瘤重组腺病毒,将其命名为Ad-apoptin-hTERTp-E1a（Ad-VT）。即,在原有腺病毒中插入肿瘤特异性启动子（hTERTp,人端粒酶逆转录酶）和特异性抑癌基因（apoptin）,由肿瘤特异性启动子（hTERTp,人端粒酶逆转录酶）启动E1A基因（病毒复制必需基因）、巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）启动子启动凋亡素基因（Apoptin）,因此,Ad-VT是一种具有同时在肿瘤细胞中特异性复制和特异性抑制的对正常细胞毒副作用小的溶瘤腺病毒。现如今乳腺癌患者患病率位居女性癌症首位,而且临床综合治疗给女性患者的身心带来很大伤害。各种有效的副作用小的治疗方法不断出现,将给癌症治疗带来曙光。因此,本研究旨在探讨乳腺癌可视化模型构建及重组腺病毒Ad-apoptin-hTERTp-E1a（Ad-VT）与紫杉醇（PTX）联合应用对乳腺癌协同抑制作用,力争为乳腺癌患者带来新的获益。新的治疗方法也有望成为临床中尚未解决难题的希望。方法:1、用pGL4.51质粒转染MDA-MB-231细胞,以构建稳定表达荧光素酶（MDA-MB-231-LUC）的肿瘤细胞,使Ad-VT与紫杉醇（PTX）联合治疗乳腺癌可视化。2、使用Calcusyn软件分析Ad-VT与紫杉醇（PTX）的协同作用,并确定最终的药物浓度。3、结晶紫染色和WST-1实验用于分析Ad-VT和紫杉醇联合对MCF-7,MDA-MB-231和MCF-10A细胞的抑制作用。4、使用Hoechst,Annexin V,JC-1染色和ROS检测,分析Ad-VT和紫杉醇联合诱导的MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡。5、使用caspase酶活性检测和caspase3、PARP以及细胞色素c蛋白水平检测,分析Ad-VT和紫杉醇联合诱导的MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡。6、使用划痕、Transwell迁移和侵袭实验分析检测了Ad-VT和紫杉醇联合后对MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭的抑制作用。7、使用MMP2、MMP9、E-cadherin、Vimentin和Snail蛋白水平检测,分析了Ad-VT和紫杉醇联合后对MCF-7和MDA-MB-231细胞转移的抑制作用。8、通过建立荷瘤裸鼠模型和转移瘤模型来证实Ad-VT和紫杉醇的组合对体内肿瘤的抑制作用。结果:1、不同毒价Ad-VT与不同浓度化疗药物交叉联合,在WST-1实验中所得到的抑制率结果数据引入calcusyn软件,可以得出结论:部分范围数据的CI指数小于1。2、结晶紫染色结果提示Ad-VT可以在MCF-7和MDA-MB-231细胞中引起明显的细胞毒性,但对MCF-10A细胞基本无毒。紫杉醇对MCF-10A细胞具有一定的细胞毒性作用,当Ad-VT和紫杉醇联合使用时,在提高对乳腺癌细胞杀伤作用的同时会降低对正常细胞的毒性。在WST-1实验结果中,我们还发现Ad-VT对两种乳腺癌细胞都有明显的抑制作用,抑制率可以达到40%左右,并且对正常的乳腺上皮细胞没有毒性作用,而紫杉醇具有明显的细胞毒性。在正常的乳腺上皮细胞上（P<0.01）。当Ad-VT和紫杉醇联合使用时,对正常细胞的杀伤显着低于对癌细胞的杀伤作用（P<0.05）,并且联合治疗后对乳腺癌细胞的抑制作用也明显高于单独使用Ad-VT或紫杉醇的抑制作用（P<0.05）,联合时抑制率高于65%。3、在Hoechst染色结果中,Ad-VT和紫杉醇联合使用后,细胞凋亡比例明显高于Ad-VT组和紫杉醇组;在Annexin V结果中,我们还发现Ad-VT和紫杉醇联合使用后,两种类型的乳腺癌细胞的凋亡水平显着增加,达到约75%（p<0.05）。通过JC-1染色发现,Ad-VT联合紫杉醇组对两种乳腺癌细胞的线粒体膜电位变化更为显着。在红绿荧光比值结果中,我们还发现,Ad-VT组的线粒体膜电位明显低于对照组和紫杉醇治疗组（p<0.01）,合并后这种现象更为明显。ROS检测结果表明,Ad-VT在乳腺癌细胞中会使活性氧水平升高,与紫杉醇联合使用后效果更加显着。4、Caspase活性检测和凋亡相关蛋白检测中发现,Ad-VT会使凋亡蛋白水平显着提升,与紫杉醇联合使用后这种现象更为明显。5、在划痕和Transwell迁移试验中,发现Ad-VT,紫杉醇和联合疗法可以抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移能力。Ad-VT的疗效显着高于紫杉醇,联合治疗后的疗效显着高于Ad-VT组和紫杉醇组（p<0.01）。在侵袭检测中也观察到了相似的结果。6、MMP2、MMP9、E-cadherin、Vimentin和Snail蛋白水平检测后发现,Ad-VT和Ad-VT与紫杉醇联合使用后均能使MMP2、MMP9、Vimentin和Snail蛋白水平降低,并提高E-cadherin蛋白水平。7、使用活体成像系统观察肿瘤的生物发光强度变化,并连续观察6周。在4-6周时,1×109 PFU/100μl Ad-VT+20 mg/kg紫杉醇治疗组和1×109 PFU/100μl Ad-VT+10 mg/kg紫杉醇治疗组的平均生物发光强度为显着低于对照组（P<0.05）。Ad-VT联合紫杉醇的抑制作用明显高于单独的病毒或药物。在小鼠存活率结果显示,联合后,小鼠的存活率显着延长,平均存活时间为1×109PFU/100μl Ad-VT+20mg/kg紫杉醇治疗组和1×109 PFU/100μl Ad-VT+10mg/kg紫杉醇治疗组,分别为40.2d和39.6d。42天时,两只治疗组小鼠的存活率分别为80%和70%。8、使用活体成像系统观察转移瘤模型后发现,除了1×109 PFU/100μl Ad-VT+20 mg/kg紫杉醇治疗组和1×109 PFU/100μl Ad-VT+10 mg/kg紫杉醇治疗组以外,在其余治疗组和对照组的肺部中可以明显的看出肿瘤转移的现象。结论:1.成功构建了表达荧光素酶的人乳腺癌细胞MDA-MB-231-LUC,使双特异性重组溶瘤腺病毒Ad-VT与紫杉醇联合在乳腺癌裸鼠体内治疗中疗效可视化。2.使用Calcusyn软件分析Ad-VT与紫杉醇（PTX）联合应用具有协同作用,并确定最终的药物浓度为50 MOI Ad-VT+4 nmol紫杉醇。对正常乳腺上皮细胞的毒副作用较小。3.Ad-VT和紫杉醇联合应用可以显着增加对乳腺癌细胞迁移和侵袭的抑制。通过线粒体途径诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡。4.Ad-VT和紫杉醇联合应用可抑制体内肿瘤生长和转移。而应用荧光素酶标记人乳腺癌细胞MDA-MB-231-LUC在体内抑制实验中,未见明显的毒副作用。综上所述,重组腺病毒Ad-VT具有特异性复制和特异性抑癌的特性,可以抑制乳腺癌细胞的生长并促进其凋亡。同时,与紫杉醇联合使用具有协同作用,并起到减毒增效的作用。并且对三阴性乳腺癌细胞的杀伤与激素依赖型乳腺癌细胞抑制作用基本一致。这将为乳腺癌患者在增高疗效的同时减少毒副作用,为乳腺癌的综合治疗提供了新的线索。
王昊天[5]（2020）在《自噬通过影响EHF入核调控胰腺癌细胞干性的机制研究》文中研究说明背景胰腺癌作为一种恶性程度非常高的消化道肿瘤,具有早期病例难以确诊,缺乏有效治疗手段以及极高的病死率等特点,是名副其实的“癌中之王”。细胞自噬是与凋亡并列的一种真核细胞程序性死亡形式,在胰腺癌乏氧乏血供的特殊肿瘤微环境中,胰腺癌细胞的自噬水平是明显上升的,并可能会通过一些尚未明确的机制影响胰腺癌的发生发展和对药物治疗的反应。本课题组已发现EHF（又名ESE3,是ETS转录家族中的一员）在胰腺癌中起着抑癌转录因子的作用,会负向调控胰腺癌的EMT（上皮间质转化）过程,提示EHF可能和胰腺癌细胞的干性特征也存在负向的关系。在本课题预实验中通过RNA测序发现EHF与P62（又名SQSTM1,中文名为选择性自噬接头蛋白）存在表达上的正相关性,P62的表达又与自噬水平的高低息息相关,而自噬在已有的研究中也被认为会影响肿瘤细胞的干性强弱。但是EHF是否真的会影响胰腺癌细胞的干性表达,以及自噬是否参与了这个过程,并且充当了怎样的角色,这些问题目前尚未有人进行过相关研究。因此,我们设计本实验旨在探讨自噬与EHF是否会影响胰腺癌细胞的干性表达水平,以及二者在这个过程中是否存在关联,并明确其中的作用机制,在此基础上希望可以进一步寻求通过影响自噬与EHF的作用而对胰腺癌的治疗起到促进作用的新方法。方法1.体外培养本课题组常用的6种人源胰腺癌细胞系,并收集它们的蛋白质和RNA,通过Western Blot实验和RT-qPCR实验挑选出EHF表达量相对较低和较高的各两种细胞,随后合成EHF过表达和降表达的病毒液,并对之前筛选出的实验细胞进行EHF表达量的对应稳定过表达和降表达。随后继续通过Western Blot实验和RT-qPCR实验对构建的稳定细胞系进行验证。验证成功后,利用流式细胞术的方法检测胰腺癌细胞中ESA、CD24以及CD44三种指标均为阳性的细胞所占整体细胞的数量百分比,同时利用悬浮细胞成球实验和软琼脂克隆形成实验共同分析胰腺癌细胞中EHF表达水平对胰腺癌细胞干性强弱程度的影响。2.提取EHF过表达细胞系和对照组细胞系的RNA,并送至生物测序公司进行RNA序列测序实验,分析在mRNA水平EHF与P62的表达关系。收集96名在天津医科大学肿瘤医院接受了胰腺癌根治术的患者的肿瘤组织蜡块,利用免疫组化染色实验,通过对组化切片中的染色情况进行评分量化,利用卡方检验分析EHF与P62在肿瘤组织中的表达情况,并收集患者对应的临床病理和预后信息,利用Kaplan-Meier生存曲线分析EHF与P62的表达水平与患者无复发生存及总生存之间的关系,同时观察EHF与P62在细胞中的分布情况。在胰腺癌肿瘤组织标本库中随机挑选8对癌与癌旁的配对组织,并分别提取组织的蛋白质和RNA,利用Western Blot和RT-qPCR实验在组织水平研究EHF与P62之间的关系。提取EHF过表达和降表达细胞系及对应对照细胞系的蛋白质和RNA,同样利用Western Blot和RT-qPCR实验在细胞水平研究EHF与P62之间的关系。最后利用ChIP实验和双荧光素酶报告基因实验探索EHF作为转录因子是否通过转录调控的作用影响P62的表达。3.提取EHF过表达和降表达细胞系及对应对照细胞系的蛋白质和RNA,利用Western Blot和RT-qPCR实验在细胞水平研究EHF与胰腺癌细胞自噬水平之间的关系。4.构建过表达和降表达P62的胰腺癌稳定细胞系,并在此基础上构建EHF和P62同时过表达和降表达的稳定细胞系,连同之前已经构建成功的单独过表达和降表达EHF的稳定细胞系和对照细胞系,分别提取这些细胞系的蛋白质和RNA,利用Western Blot和RT-qPCR实验在细胞水平验证稳系构建效果并进一步探讨EHF和P62的上下游关系。在此基础上利用流式细胞术、悬浮细胞成球实验和软琼脂克隆形成实验分析P62对胰腺癌细胞干性强弱程度的影响以及它对于EHF可能存在的反馈性影响作用。5.利用胰腺癌组织切片和胰腺癌细胞体外爬片分别进行免疫荧光染色实验,通过对EHF和P62的同时染色,观察在组织水平和细胞水平二者在空间上是否存在共定位的关系。通过co-IP实验探究EHF与P62在细胞体内是否存在蛋白质之间的相互作用。利用细胞内的核浆蛋白分离实验分析P62是否会影响EHF在细胞内的分布。通过双荧光素酶报告基因实验探索P62是否会影响EHF的转录调控活性。6.利用GST pull-down实验探究EHF与P62是否在细胞体外存在直接的蛋白之间的相互作用。通过NCBI数据库搜索组成EHF与P62的主要结构域的碱基序列,并针对这些结构域构建附加HA或Flag标签的外源性质粒,通过瞬时转染的方法将包含各结构域及标签蛋白的质粒导入工具细胞293T内,利用co-IP实验和Western Blot实验分析EHF与P62之间的相互作用是由各自的哪个结构域进行承担的。7.利用mTOR抑制剂Rapamycin对胰腺癌细胞进行自噬水平的诱导提高,并利用Western blot实验、GFP-RFP-LC3双标荧光自噬流监测系统以及流式细胞术对自噬诱导情况进行检测。通过Western Blot实验和核浆蛋白分离实验分析在自噬水平升高的情况下对于EHF和P62的总量以及各自在细胞内的分布存在怎样的影响。利用流式细胞术、悬浮细胞成球实验和软琼脂克隆形成实验分析自噬对胰腺癌细胞干性强弱程度的影响。通过双荧光素酶报告基因实验探索自噬是否会影响EHF的转录调控活性。8.在给予Rapamycin诱导自噬的情况下,通过外源瞬时转染P62过表达质粒,构建回复实验模型,并行的通过小干扰RNA分别有效降低P62和EHF的表达量,构建阻断实验模型,利用Western Blot实验和RT-qPCR实验验证模型构建是否成功,并通过Western blot实验、GFP-RFP-LC3双标荧光自噬流监测系统以及流式细胞术对自噬诱导情况进行检测。利用流式细胞术、悬浮细胞成球实验、软琼脂克隆形成实验以及双荧光素酶报告基因实验分析自噬是否确实通过P62-EHF这条通路影响胰腺癌细胞的干性表达水平。9.利用生物信息学的KEGG信号通路分析和GSEA基因富集分析寻找EHF调控胰腺癌细胞干性强弱的信号通路。利用Western Blot实验和RT-qPCR实验对筛选出的通路进行上下游的初步验证。再利用有效的信号通路抑制剂构建阻断实验模型,验证模型构建成功后,利用流式细胞术、悬浮细胞成球实验和软琼脂克隆形成实验分析EHF是否确实通过筛选出的信号通路影响胰腺癌细胞的干性表达水平。10.利用EHF过表达的病毒液,构建胰腺癌鼠源细胞系Pan02过表达EHF的稳定细胞系和空白对照细胞系,并对C57BL/6小鼠进行腹股沟区皮下成瘤实验,随后分别给予生理盐水和明确的自噬抑制剂ULK-101进行治疗,观察分析自噬抑制剂对于胰腺癌的治疗作用以及EHF是否可以成为筛选出更好响应自噬抑制剂治疗的患者的生物标志物。在此基础上利用胰腺癌的PDX细胞进行NGS小鼠的皮下成瘤实验,随后分别给予生理盐水、吉西他滨、自噬抑制剂ULK-101以及吉西他滨和ULK-101合用的治疗,观察分析自噬抑制剂和胰腺癌治疗中常用化疗药联合使用在控制胰腺癌发展中的作用情况。结果1.通过对本课题组常用6种人源胰腺癌细胞系进行EHF表达量的检测,挑选出EHF表达量相对较低的PANC-1和MIA PaCa2细胞构建EHF过表达的稳定细胞系,挑选出EHF表达量相对较高的BXPC-3和SW1990构建EHF降表达的稳定细胞系。通过流式细胞术、悬浮细胞成球实验和软琼脂克隆形成实验可以发现EHF具有负向调控胰腺癌细胞干性特征的能力。2.通过RNA测序结果分析发现,EHF与P62在mRNA水平的表达情况存在正相关性。通过免疫组化染色的结果分析发现,EHF与P62在细胞的核与浆中均有分布,而且二者具有染色强度同增同降的趋势,通过染色后评分的统计学分析证实二者表达量的正相关性也是具有统计学意义的,并且二者均对患者的生存起到了保护的作用。通过在体内胰腺癌肿瘤组织以及体外胰腺癌细胞的蛋白水平和RNA水平进行相关实验检测均提示EHF与P62呈表达量正相关的关系。通过数据库分析,发现在P62基因的启动子区具有EHF可能潜在结合的区域,通过染色质免疫共沉淀实验证实EHF确实会结合到P62的启动子区,通过双荧光素酶报告基因实验证实EHF与P62启动子区的这种空间上的结合会最终增强P62的转录活性。3.EHF并不会影响胰腺癌细胞的自噬水平。4.EHF作为转录因子确实会影响P62的表达水平,但是P62作为下游基因并不会影响EHF的表达。P62同样具有负向调控胰腺癌细胞干性特征的能力,但是其影响能力不如EHF的作用大,考虑P62可能以辅助EHF的作用负向调控胰腺癌细胞的干性特征。5.通过对胰腺癌肿瘤组织的切片和胰腺癌细胞体外爬片分别进行免疫荧光发现,EHF与P62确实在细胞的胞核和胞浆中均有分布,而且二者的表达水平呈正相关性,并且两种蛋白在空间存在共定位表现。通过co-IP实验进一步证实在胰腺癌细胞内EHF与P62存在蛋白质之间的相互作用。利用细胞的核浆蛋白分离实验发现,P62在不影响EHF蛋白总量的情况下会影响EHF在细胞内的分布。6.通过GST pull-down实验证实EHF与P62存在直接的蛋白质相互作用。通过构建组成EHF与P62的各主要结构域的且带有特殊标签蛋白的质粒,并利用转染293T工具细胞后的co-IP实验发现EHF通过PNT结构域与P62的ZZ结构域进行结合。7.通过Western blot实验、GFP-RFP-LC3双标荧光自噬流监测系统以及流式细胞术证实mTOR抑制剂Rapamycin确实可以有效提高胰腺癌细胞的自噬水平。而自噬水平提高后并不会影响EHF的总量但会减少P62的总量进而影响EHF在细胞内的分布,并且会降低EHF的转录调控能力,最终正向调控胰腺癌细胞的干性特征。8.通过回复实验和阻断实验证实自噬通过影响P62-EHF这条通路影响胰腺癌细胞的干性特征是有统计学意义的。9.通过生物信息学分析以及Western Blot实验的验证,EHF确实会负向调控Wnt/β-catenin信号通路的活性,利用阻断实验证实EHF会通过调控Wnt/β-catenin信号通路的活性从而有效的影响胰腺癌细胞的干性特征。10.通过对小鼠动物模型植瘤后的治疗实验发现,自噬抑制剂可以有效控制胰腺癌细胞在体内的发展,这种控制效果在EHF表达量高的肿瘤组织中更为明显,而且自噬抑制剂和传统的胰腺癌化疗用药吉西他滨联合使用呈现出对胰腺癌控制加成的作用。结论1.EHF在胰腺癌中是具有抑癌作用的转录因子,对于患者的生存起到了保护的作用,并且可以负向调控胰腺癌细胞的干性特征。2.EHF可以正向转录调控P62的表达,而P62会通过蛋白质之间直接相互作用的方式影响EHF在细胞核中的分布量进而影响EHF的转录调控活性,最终形成正反馈环共同影响胰腺癌细胞的干性特征。3.自噬通过降低P62的表达量进而减少EHF在细胞核中的分布量,最终通过减弱EHF的转录活性,造成下游Wnt/β-catenin信号通路被激活从而提升胰腺癌细胞的干性特征。4.自噬抑制剂可以有效控制胰腺癌细胞的发展程度,和化疗药物吉西他滨联用效果更佳,EHF过表达的胰腺癌细胞对于这种治疗的响应更为明显。
申道福[6]（2020）在《基于p53调控点探讨新藤黄酸诱导A549/Cis细胞周期阻滞影响NSCLC顺铂耐药的分子机制》文中进行了进一步梳理目的:通过体外实验,研究新藤黄酸（GNA）对顺铂耐药非小细胞肺癌（NSCLC）细胞A549/Cis细胞周期、凋亡及顺铂耐药的影响。采用高通量测序（RNA-seq）方法研究GNA影响的A549/Cis细胞转录调控,分析差异基因表达及其功能,探讨GNA引起的A549/C is细胞生物学效应的重要线索,并加以验证。最后,通过在A549/C is细胞中分别过表达MTCYB和沉默TP53来研究二者在GNA介导的生长抑制中的作用,以阐明GNA影响A549/Cis细胞顺铂耐药的潜在调控靶点,为其在治疗顺铂耐药非小细胞肺癌的临床应用提供理论依据。材料与方法:论文一:MTT法验证A549/Cis细胞对顺铂的耐药性。使用不同浓度的顺铂处理A549细胞和A549/Cis细胞,分别于24h、48h、72h后加入MTT（5mg/ml）20μl,37°C孵育4h后,弃上清并加入DMSO溶解甲瓒,然后测定OD值,记录实验结果。MTT法检测GNA对A549细胞、A549/C is细胞生长的抑制作用。Hoechst 33342染色和荧光显微观察检测GNA对A549/Cis细胞形态的影响。GNA分别处理A549/Cis 24h,48h后,用Hoechst 33342（10μg/ml）染色,37?C孵育20min,并通过荧光显微镜观察细胞形态变化。流式细胞术检测GNA对A549/Cis细胞周期分布和凋亡的影响。细胞洗涤并经-20?C预冷的70%酒精固定过夜,用核糖核酸酶（RNase）溶液消化后经碘化丙啶（PI）染色,然后使用流式细胞仪进行细胞周期分析。根据Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒使用说明对细胞进行染色,并用流式细胞仪检测染色细胞的凋亡率,数据通过Flowjo7.6.1软件进行分析。论文二:GNA处理前后A549/Cis细胞转录组学研究。A549/Cis细胞经4μM GNA处理24 h后,用TRIzol法提取总RNA。RNA-seq通过Illumina X10测序平台进行测序。使用Stringtie来分析m RNA的表达水平。使用R package-Ballgown选择|log2 fold change|≥1且具有统计学意义（P<0.05）的差异表达的m RNA和基因。通过DAVID网站（http://david.ncifcrf.gov/）进行GO功能和KEGG信号通路富集分析。实时荧光定量PCR验证差异基因表达。根据Gene JET RNA纯化试剂盒使用说明提取A549/C is细胞总RNA。使用First Strand c DNA合成试剂盒进行c DNA合成,然后使用SYBR?Select Master Mix Kit试剂盒和实时PCR仪进行q PCR。通过比较性2-ΔΔCT法进行定量分析。Western blot检测细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白。根据核蛋白和细胞质蛋白提取试剂盒使用说明提取核蛋白。BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白通过10-12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并转移到PVDF膜。PVDF膜经封闭,特异性一抗孵育,TBST洗涤三次,用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育后通过增强型化学发光底物检测试剂盒进行显色。使用Image J version 1.52软件对蛋白表达水平进行定量分析。论文三:构建MTCYB基因过表达逆转录病毒载体MSCV-PGK-MTCYB-2a-zs Green,转染293T细胞。用经过滤的含病毒293T细胞培养上清液感染A549/Cis细胞,然后通过流式细胞仪分选zs Green表达阳性（绿色荧光）的细胞,并用激光共聚焦显微镜对分选结果进行鉴定。q RT-PCR实验对分选后细胞的MTCYB的m RNA表达进行检测。最后通过MTT法检测过表达MTC YB的细胞对GNA敏感性的变化。构建人TP53基因RNA干扰（RNAi）逆转录病毒载体MSCV-U6-p53sh RNA-EF1-BFP并转染293T细胞,用经过滤的含病毒293T细胞培养上清液感染A549/Cis细胞,然后通过流式细胞仪分选BFP表达阳性（蓝色荧光）的细胞,并通过激光共聚焦显微镜对分选结果进行鉴定。下一步通过Western blot法对分选后的细胞进行p53蛋白表达的测定,鉴定p53沉默效果。最后,采用MTT法检测p53干扰后细胞对GNA的敏感性的变化。结果:论文一1.GNA抑制A549、A549/Cis细胞生长,并诱导A549/C is细胞发生凋亡形态学变化。MTT实验结果显示A549/C is细胞对顺铂的耐药性明显高于亲本细胞（P<0.001）。GNA对A549和A549/C is细胞的抑制效应通过MTT实验被测定,与未处理组相比,GNA显着降低了A549和A549/C is细胞的存活率（P<0.001）。6μM浓度的GNA仅在24h后即能诱导大量的细胞死亡,因此在随后的实验中使用了2μM和4μM浓度的GNA。Hoechst 33342染色实验进一步证明了GNA对A549/C is细胞的抑制作用。与未处理的细胞相比,经GNA处理的A549/Cis细胞增殖受到抑制,并出现明显的形态学改变。此外,在GNA处理的细胞中可观察到核固缩现象。2.GNA诱导A549/Cis细胞周期G1期阻滞和凋亡。为了研究GNA抑制A549/Cis增殖的细胞进程,我们使用流式细胞仪检测了A549/C is的细胞周期和凋亡情况。结果表明,与未处理组相比,GN A处理A549/C is细胞24h和48h后,细胞周期明显被阻滞于G1期（P<0.05）。4μM GNA作用48h后,sub-G1期亚群细胞数明显高于未处理组（P<0.001）。细胞周期阻滞可以诱导细胞死亡,并可通过流式细胞仪进行检测。Annexin V-APC/7-AAD双染色实验结果显示,4μM GNA作用于A549/Cis细胞48h后,凋亡率明显高于对照组（P<0.001）。论文二1.经GNA处理A549/Cis细胞差异基因表达和富集分析结果。为了探究GNA如何抑制A549/Cis细胞的生长和促进其死亡,我们使用对照细胞和经GNA处理的细胞进行了RN A-seq实验。数据分析表明,GNA的处理引发了全局基因表达的变化。我们以P<0.05且|log2 fold change|≥1为筛选条件对以上基因进行了进一步的筛选,满足以上条件的基因视为差异表达基因（DEGs）。与对照组细胞相比,在GNA处理的细胞中,有353个上调的DEGs和425个下调的DEGs。为了进一步研究DEGs的功能,我们进行了GO功能和KEGG信号通路富集分析。经鉴定,在GO富集分析中,蛋白结合（protein binding）、胞质溶胶（cytosol）、细胞周期（cell cycle）是显着富集的类型。KEGG信号通路富集分析中,有26条显着富集（P<0.05）的信号通路。将上述K EGG信号通路按差异显着性排序后,发现DEGs主要富集于内质网蛋白加工（protein processing in endoplasmic reticulum）、蛋白酶体（proteasome）、细胞周期（cell cycle）、Epstein-Barr病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、p53信号通路（p53 signaling pathway）、DNA复制（DNA replication）。其中细胞周期、DNA复制和p53信号通路与肿瘤增殖密切相关。2.q RT-PCR验证RNA-seq结果。为了验证RNA-seq结果,我们选取14个DEGs进行q RT-PCR分析。结果显示,与未处理组细胞相比,4μM GNA组细胞所有基因的表达差异均有统计学意义（P<0.05）。在这些基因中,有4个基因在GNA处理的A549/Cis细胞中表达上调,另外10个基因在GNA处理的A549/Cis细胞中表达下调。共有10个基因[GADD45A、细胞周期蛋白D3（CCND3）、细胞周期蛋白B1（CCNB1）、CDC20、CDC25B、PCNA、PLK1、MCM2、MCM3和MCM 7]参与细胞周期调控,6个基因[GADD45A、CCND3、CCNB1、SERPIN E1、THBS1和TNFRSF10B]与p53信号通路相关,两个基因（CASPASE7和TNFRSF10B）与细胞凋亡相关。q RT-PCR的结果与RNA-seq分析结果一致。3.GNA处理的A549/Cis细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。为了进一步研究GNA诱导的细胞周期阻滞和凋亡的潜在作用机制,我们检测了与细胞周期检测点和凋亡相关的蛋白表达水平。结果表明,与未处理组相比,经GNA处理的A549/C is细胞中cyclin D1、cyclin D3、CDK4和CDK6的蛋白表达水平显着下调（P<0.05）,而p21、GADD45A、p53和核p53的蛋白表达显着上调（P<0.05）。此外,我们检测了GNA处理的细胞中凋亡调控蛋白的表达。结果显示,与对照组相比,GNA能显着提高caspase3/7蛋白前体及其活性形式的表达水平（P<0.05）,其下游与DNA修复相关的凋亡标志性蛋白PARP在A549/Cis细胞中显着上调（P<0.05）,其裂解作用也明显增强（P<0.05）。论文三1.在A549/Cis细胞中过表达MTCYB融合基因后,其对GNA的敏感性未发生明显变化。本实验设计合成的MTCYB融合基因成功连接入双酶切线性化的表达载体的特定位点,测序结果显示连接正确,将病毒包装质粒和MTCYB过表达载体共转染293T细胞,产生感染性逆转录病毒颗粒,荧光观察证实逆转录病毒载体转导效率高。然后用293T细胞培养基感染A549/Cis细胞,通过荧光显微镜观察证实A549/Cis细胞成功地感染了逆转录病毒颗粒。流式细胞仪分选zs Green阳性表达的细胞,并通过激光共聚焦显微镜鉴定了阳性细胞率。q RT-PCR实验验证MTCYB的m RNA表达,与对照组和MSCV-PGK-Neo-2a-zs Green载体转染（A549/Cis-NC）组相比,A549/Cis-MTCYB组细胞MTCYB表达升高（P<0.05）。使用MTT法测定MTCYB基因过表达后GNA对A549/Cis细胞增殖和细胞活力的影响。GNA对三组细胞都有明显的抑制作用,但抑制作用无明显差异。2.在A549/Cis细胞中沉默p53后,细胞对GNA的敏感性降低。本实验设计合成的p53干扰片段成功连接入双酶切线性化的逆转录病毒表达载体的特定位点,测序结果显示连接正确,将病毒包装质粒和p53 sh RNA表达载体共转染293T细胞,产生感染性逆转录病毒颗粒,荧光观察证实逆转录病毒载体转导效率高。然后用293T细胞培养基感染A549/C is细胞,通过荧光显微镜观察证实A549/C is细胞成功地感染了逆转录病毒颗粒。随后流式细胞仪分选BFP阳性表达的细胞,并通过激光共聚焦显微镜鉴定了阳性细胞率。Western blot实验检测p53蛋白的表达,结果显示,与阴性对照组和MSCV-U6-EF1-BFP载体转染（A549/Cis-sh RNA-NC）组相比,A549/Cis-p53sh RNA1、2、3三组细胞p53蛋白水平均显着降低（P<0.05）,尤其A549/C is-p53sh RNA2组降低最显着（P<0.001）。MTT法测定p53沉默后GNA对A549/Cis细胞增殖和细胞活力的影响。与对照细胞和A549/Cis-sh RNA-NC细胞相比,A549/Cis-p53-sh RNA2细胞活力受到的抑制作用明显减弱（P<0.05）,对GNA敏感性降低。结论:1.GNA可通过介导细胞周期G1期阻滞并诱导细胞凋亡,从而抑制顺铂耐药非小细胞肺癌A549/Cis细胞的生长。2.转录组学研究表明GNA可显着下调A549/C is细胞中MTCYB基因的表达,且GNA通过调控p53/p21/cyclin D-CDK4/6介导A549/Cis细胞周期G1期阻滞,并通过激活caspase3/7诱导细胞凋亡。3.p53是GNA抑制A549/Cis细胞生长机制中的关键调控因子。
戴涛云[7]（2020）在《溶瘤腺病毒rAd.Light治疗小鼠乳腺癌移植瘤的疗效评价及机制研究》文中研究说明乳腺癌是女性最常见的癌症,也是女性癌症死亡的主要原因。目前药物治疗存在耐药性,转移、晚期、难治性乳腺癌仍缺乏有效治疗手段。肿瘤相关的基因治疗发展迅速,其中,腺病毒（Adenovirus,Ad）载体是肿瘤基因治疗最常用的载体之一,主要分为条件复制型腺病毒和复制缺陷型腺病毒。溶瘤腺病毒属于条件复制型腺病毒,可以在肿瘤细胞中选择性复制并溶解肿瘤细胞,不影响正常细胞。但肿瘤微环境中存在抑制性免疫细胞,可抵消溶瘤病毒裂解肿瘤细胞后产生的免疫效应,抑制溶瘤腺病毒发挥作用。使用溶瘤腺病毒搭载免疫基因,可以激活机体免疫系统,增强溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用。LIGHT是肿瘤坏死因子配体家族成员,在T细胞稳态和增殖中发挥关键作用,可选择性地诱导某些肿瘤细胞如同时表达淋巴毒素β受体（LTβR）和TR2/HVEM受体的肿瘤细胞凋亡,如231细胞,HT-29细胞,TIL1200。目前,LIGHT基因对乳腺癌的作用尚未有研究。因此,本研究的目的是评价溶瘤腺病毒r Ad.Light对乳腺癌的治疗效果并初步阐明其作用机制。首先我们需要获得r Ad.light、r Ad.Null、Ad.light和Ad.Null四种病毒。实验室前期已经构建了r Ad.light、r Ad.Null、Ad.light和Ad.Null四种重组腺病毒,并且已制备r Ad.Null和Ad.Null两种对照病毒。在此基础上,我们对r Ad.light和Ad.light病毒进行了扩增,并利用氯化铯密度梯度法进行纯化。采用分光光度法测定病毒颗粒滴度（virus particle,vp）,r Ad.light为1.2×1013vps/m L,r Ad.Null为1.3×1012vps/m L,Ad.light为1.4×1013vps/m L,Ad.Null为1.4×1012 vps/m L。通过半数组织培养物感染剂量法（TCID50）测定病毒感染滴度（每毫升感染单位（IU））,r Ad.light为1.8×109 IU/m L,r Ad.Null为8×109 IU/m L,Ad.light为2.5×109 IU/m L,Ad.Null为8×109 IU/m L。上述结果表明,我们已经成功获得了纯度与滴度均满足后续实验的病毒。其次,我们检测了Light对乳腺癌细胞增殖和凋亡影响。小鼠乳腺癌细胞系4T1细胞分别感染Ad.Light和r Ad.Light,感染48h后采用流式细胞术检测LIGHT蛋白的表达情况,检测结果表明,两种病毒均可很好地介导4T1细胞表达LIGHT。4T1细胞分别感染Ad.Light和Ad.Null,感染48h后利用CCK8法检测LIGHT对4T1细胞增殖的影响。结果表明,与Ad.Null组相比,Ad.Light组4T1细胞存活率降低,表明LIGHT可以抑制4T1细胞的增殖。用不同颗粒滴度的Ad.Light和Ad.Null感染4T1细胞,感染48h后,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果表明,与对照Ad.Null组相比,Ad.Light组细胞凋亡比例更高,且随着病毒颗粒滴度的增加,细胞凋亡比例增加。因此,我们推测LIGHT可能通过抑制肿瘤生长,同时促进细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。然后,对r Ad.Light治疗乳腺癌移植瘤的疗效进行评价。我们使用小鼠乳腺癌4T1细胞,小鼠背部皮下注射的方法建立小鼠乳腺癌移植瘤模型,注射剂量为1×106细胞/只小鼠。荷瘤后第7天对小鼠进行随机分组,分为buffer对照组,r Ad.Null和r Ad.Light两个治疗组。在荷瘤后第7和10天分别进行肿瘤瘤内给药,治疗组病毒给药剂量为2.5?1010vps/次/只小鼠,buffer组注射200μL的PBS。荷瘤后第7、14、18、21、25天记录肿瘤体积变化。荷瘤后第25天处死小鼠,取肿瘤组织,测量瘤重;HE染色进行组织病理学分析。结果表明,溶瘤腺病毒r Ad.Null或r Ad.Light均可抑制4T1移植瘤模型中肿瘤的生长,与r Ad.Null组相比,r Ad.Light对肿瘤生长的抑制作用更强。HE染色后可观察到溶瘤腺病毒治疗组肿瘤坏死面积增大,且r Ad.Light组效果更明显。上述结果表明r Ad.Light可促进肿瘤细胞坏死,抑制肿瘤生长。最后,对r Ad.Light治疗乳腺癌移植瘤的机制进行初步研究。荷瘤后第15和19天取外周血检测T淋巴细胞表型改变。荷瘤后第25天处死小鼠,取肿瘤组织,免疫组化检测CD3和Caspase-3的表达（包括CD3、CD4、CD8、Treg、Tmemory）;提取RNA,通过实时定量PCR法检测LIGHT受体（包括LTβR和HVEM）、Th1型细胞因子（包括IL-2、IFN-γ和TNF-α）和Th2型细胞因子（包括TGF-β和IL-10）的表达情况。肿瘤组织免疫组化分析结果显示,治疗组CD3+T细胞浸润比例增加,caspase3阳性凋亡细胞比例增加,且r Ad.Light组比例更高。实时定量PCR结果显示,溶瘤腺病毒治疗后LIGHT受体LTβR和HVEM表达均升高,且r Ad.Light组比r Ad.Null组升高更明显,二者之间的差异具有统计学意义。Th1型细胞因子表达上调,Th2型细胞因子表达下调,且与r Ad.Null组相比,r Ad.Light组调节作用更强。流式细胞术检测小鼠外周血T淋巴细胞,可看到溶瘤病毒治疗后CD4+T淋巴细胞比例下调,CD8+T淋巴细胞比例上调。且与r Ad.Null组相比,r Ad.Light组出现时间更早,作用更强。r Ad.Light治疗后CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例降低。此外,我们还发现溶瘤腺病毒治疗后CD62LHighCD44+记忆T细胞百分比上调,且r Ad.Light组发挥作用时间更早,效果更强。上述结果表明,r Ad.Light通过促进肿瘤局部CD3+细胞浸润,肿瘤细胞凋亡,LIGHT及受体表达,调节Th1/Th2细胞因子平衡,从而调节肿瘤局部微环境;通过增加CD8+T淋巴细胞比例、促进CD4+T记忆细胞、减少调节性T细胞,从而增强机体抗肿瘤免疫反应。综上所述,LIGHT和溶瘤腺病毒均可诱导乳腺癌细胞的凋亡和死亡。在小鼠乳腺癌皮下移植瘤模型中,r Ad.Light通过诱导肿瘤细胞凋亡和死亡,引起强烈的抗肿瘤免疫反应,包括诱导Treg下调、激活记忆T细胞、增强Th1细胞因子的表达和抑制Th2细胞因子的表达。因此,r Ad.Light作为一种有效的治疗乳腺癌的方法,具有广阔的发展前景。
杨春华[8]（2019）在《双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究》文中研究指明第一部分构建双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒目的:构建双调控并荷载精子相关抗原9（sperm associated antigen 9,SPAG9）短发卡RNA（Short hairpin RNA,shRNA）的溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9并验证调控SPAG9蛋白表达的效果。方法:1.将包含DD3基因启动子和SPAG9基因shRNA的载体质粒p DD3-ZD55-SPAG9shRNA与骨架质粒p BHGE3（含有腺病毒右臂序列）通过Lipofectamine TM2000共转染至HEK-293细胞内,包装成溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9。2.琼脂糖电泳验证正确后大量扩增病毒,通过Cs Cl密度梯度离心法纯化,半数组织细胞感染剂量（Tissue culture infective dose,TCID50）法测定滴度。3.通过Western Blot检测DD3-ZD55-SPAG9对PC-3和DU145细胞SPAG9基因的沉默效果。结果:1.成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9,经扩增纯化后,DD3-ZD55-SPAG9的病毒滴度为9.46×10^8 pfu/ml。2.Western Blot结果显示DD3-ZD55-SPAG9可以有效沉默PC-3和DU145细胞内SPAG9蛋白的表达,与对照组相比,差异存在统计学意义（P<0.05）。结论:成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9,并可以有效沉默PC-3和DU145细胞内SPAG9基因的表达第二部分溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛体外治疗去势抵抗性前列腺癌目的:观察溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛（Docetaxel,DTX）在体外对去势抵抗性前列腺癌的治疗效果。方法:1.结晶紫染色和CCK-8观察各组对前列腺癌PC-3和DU145与正常前列腺细胞WPMY-1细胞的毒性作用和增殖抑制效果。2.划痕实验和Transwell侵袭实验检测各组对PC-3和DU145细胞迁移侵袭能力的抑制。3.Hoechst-33258染色实验检测各组PC-3和DU145细胞的凋亡。4.Western Blot实验检测PC-3和DU145细胞内SPAG9,侵袭和凋亡相关蛋白的表达。结果:1.结晶紫染色结果:各病毒治疗组对PC-3和DU145细胞的细胞毒性呈时间和滴度依赖性,DTX对PC-3和DU145细胞呈浓度和时间依赖性,各组处理48小时后,高浓度的DTX（>4ng/ml）,高滴度的ZD55-SPAG9（MOI>20）会对WPMY-1细胞产生毒性作用,而DD3-ZD55-SPAG9在MOI>50时才会对WPMY-1细胞产生毒性作用,提示DD3-ZD55-SPAG9较对照病毒具有更高的安全性。2.CCK-8结果:随病毒和药物作用时间的延长,对前列腺癌细胞的增殖抑制效果均逐渐增强,且随病毒滴度和药物浓度的升高,对细胞的增殖抑制效果也逐渐增强。感染48小时后,联合组对前列腺癌细胞的增殖抑制效果明显高于各单一治疗组。各处理组48小时后WPMY-1细胞增殖较对照组无明显差异。3.划痕实验结果:24小时后,在PC-3和DU145细胞内,各治疗组的划痕愈合面积百分比均低于PBS组,且联合组划痕愈合面积明显低于单一治疗组。4.Transwell实验结果:48小时后,在PC-3和DU145细胞内,各治疗组穿透小室膜的细胞数均低于PBS组,联合组穿透细胞数明显低于单一治疗组。5.Hoechst-33258染色结果:48小时后,各治疗组的细胞凋亡率均高于PBS组,且联合组细胞凋亡率明显高于单一组。6.Western Blot实验结果显示:各治疗组内SPAG9蛋白表达均低于PBS组,侵袭相关蛋白E-cadherin的表达均高于PBS组,Vimentin和MMP-2的表达均低于PBS组,凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-8的表达均高于PBS组。联合组内SPAG9,Vimentin,MMP-2的表达量明显低于单治疗组,同时E-cadherin、caspase-3和caspase-8的表达量明显高于单治疗组。结论DD3-ZD55-SPAG9可以在体外有效抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移侵袭能力,并可以有效诱导PC-3和DU145凋亡,效果略低于ZD55-SPAG9,但对WPMY-1细胞具有更高的安全性。对前列腺癌细胞侵袭能力的抑制作用,其机制之一可能是沉默SPAG9基因表达后,通过调控与上皮细胞间质化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）进程相关蛋白,上调E-cadherin,下调Vimentin,MMP-2的表达有关。对前列腺癌细胞凋亡诱导机制可能是通过促进caspase8与caspase3介导的内源性凋亡实现,联合使用多西他赛可起协同作用,增强DD3-ZD55-SPAG9的抗肿瘤效果。第三部分溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛治疗裸鼠移植瘤目的:观察溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛对裸鼠移植瘤的治疗效果。方法:1.建立前列腺癌PC-3细胞荷瘤鼠模型。监测不同处理组对移植瘤的生长的影响。苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE）检测各组肿瘤的生长状况。2.原位末端缺口标记法（Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL）法检测各组移植瘤细胞的凋亡情况。3.免疫组化和Western Blot检测各组移植瘤细胞中的侵袭相关蛋白E-cadherin、Vimentin和MMP-2的表达情况。结果:1.成功构建裸鼠移植瘤,各治疗组肿瘤生长速度均低于对照组,HE结果显示各治疗组内均存在肿瘤细胞凋亡坏死,联合组更为明显。2.TUNEL结果显示各治疗组内均存在明显的肿瘤细胞凋亡,联合治疗组较单一治疗组凋亡现象更为明显。3.免疫组化和Western Blot结果显示各治疗组内SPAG9、Vimentin和MMP-2蛋白表达降低,E-cadherin蛋白表达增多,联合组对上述蛋白的表达调控更为显着。结论:DD3-ZD55-SPAG9可以有效抑制裸鼠移植瘤的生长,并促进移植瘤细胞凋亡,抑制SPAG9、Vimentin和MMP-2蛋白表达,促进E-cadherin蛋白表达。但效果略低于ZD55-SPAG9。联合使用多西他赛后可以获得较单一治疗更高的移植瘤治疗效果。
程欣茹[9]（2019）在《miR-34a通过靶向抑制ATG5抑制小儿神经母细胞瘤细胞增殖、转移和自噬的机制研究》文中进行了进一步梳理背景和目的:神经母细胞瘤是婴幼儿中一种常见的恶性肿瘤,其特点为具有较强的转移能力,也是其死亡率居高不下的主要原因。尽管神经母细胞瘤具有多种治疗手段,再发或转移的神经母细胞瘤患者仍然具有极差的预后,伴随着不到40%的生存率。到目前为止,神经母细胞瘤的发生、发展、转移的分子机制尚不十分明确。因此,探究针对神经母细胞瘤的新的治疗靶点,以期提高预后仍是非常必要的。miRNAs作为一组内源性单链非编码RNA片段,其长度约18-25个核苷酸,这类非编码RNA在肿瘤形成和进展中发挥关键的调控作用。近期研究表明,这些miRNAs可以通过不完全的碱基互补配对与靶基因3’-UTR或者编码区结合,从而抑制靶基因翻译成蛋白质或者直接降解靶基因mRNA片段。这些数据表明,miRNAs可作为诊断肿瘤的生物标志物并发挥其致癌或抑癌的作用。据报道,许多miRNAs,例如miR-26a,miR-27,miR-92,miR-338-3p等等,参与了神经母细胞瘤的生长、转移等过程。既往研究表明,miR-34a参与多种肿瘤的发生发展过程。虽然近年来miR-34a已得到广泛研究,然而它在神经母细胞瘤发生和发展中的功能以及分子机制仍知之甚少。本课题包括以下三部分:第一部分:miR-34a调节小儿神经母细胞瘤细胞增殖、转移和自噬的相关研究;第二部分:miR-34a靶向调节ATG5的相关研究;第三部分:ATG5逆转miR-34a调控神经母细胞瘤细胞功能的机制研究。第一部分miR-34a调节小儿神经母细胞瘤细胞增殖、转移和自噬的相关研究方法:1.通过qPCR的方法分别检测miR-34a在神经母细胞瘤组织和细胞系（SH-SY5Y细胞、SK-N-SH细胞）中的表达水平,并分析其表达量与患者临床病理特征、生存率的相关性。2.通过MTT实验检测过表达或抑制miR-34a对神经母细胞瘤细胞增殖的影响。3.细胞克隆实验检测过表达或抑制miR-34a对神经母细胞瘤细胞克隆的影响。4.Transwell法检测miR-34a对神经母细胞瘤细胞迁移、侵袭的影响。5.定量分析miR-34a表达量对GFP-LC3阳性细胞百分比以及自噬相关蛋白（LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62蛋白）表达量的影响。结果:1.神经母细胞瘤组织以及细胞系中miR-34a的表达水平显着下调,并与患者肿瘤分级相关。2.miR-34a表达量上调显着提高神经母细胞瘤患者的生存率。3.miR-34a过表达抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增殖、克隆,抑制miR-34a表达促进SK-N-SH细胞的增殖、克隆。4.miR-34a过表达抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的迁移、侵袭,抑制miR-34a表达促进SK-N-SH细胞的迁移、侵袭。5.miR-34a过表达降低GFP-LC3阳性细胞百分比,抑制miR-34a表达增加GFP-LC3阳性细胞百分比。6.miR-34a过表达抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平,增加p62蛋白水平;抑制miR-34a的表达增加神经母细胞瘤SK-N-SH细胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平,降低p62蛋白水平。第二部分miR-34a靶向调节ATG5的相关研究方法:1.通过生物信息学分析推测miR-34a的靶基因。2.构建野生和突变型的ATG5 3’-UTR的重组质粒,通过双荧光素酶报告和RIP实验验证miR-34a的靶基因。3.通过qPCR检测ATG5在神经母细胞瘤组织和细胞系（SH-SY5Y细胞、SK-N-SH细胞）中的表达水平,并分析其与miR-34a表达量的相关性。4.通过Western blot检测miR-34a过表达和敲减后ATG5的表达。结果:1.生物信息学预测显示ATG5为miR-34a的靶基因。2.双荧光素酶报告基因和RIP实验验证ATG5为miR-34a的靶基因。3.ATG5在神经母细胞瘤组织和细胞系中表达量上调,且其表达量与miR-34a成线性负相关。4.miR-34a过表达可以抑制神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中ATG5的表达;敲减miR-34a促进SK-N-SH细胞中ATG5的表达。第三部分ATG5逆转miR-34a调控神经母细胞瘤细胞功能的机制研究方法:1.通过Western blot检测miR-34a模拟物与过表达ATG5或anti-miR-34a与siRNA ATG5共转染对ATG5表达水平的影响。2.通过MTT检测回复ATG5的表达量对神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y细胞、SK-N-SH细胞）增殖活性的影响。3.通过克隆形成实验检测回复ATG5的表达量对神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y细胞、SK-N-SH细胞）克隆形成的影响。4.通过Transwell实验检测回复ATG5的表达量对神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y细胞、SK-N-SH细胞）迁移、侵袭的影响。5.通过定量分析以及Western blot检测GFP-LC3阳性比例以及自噬相关蛋白（LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62）的表达水平。结果:1.过表达miR-34a和ATG5共转染显着增加SH-SY5Y细胞中ATG5蛋白表达量;敲减miR-34a和ATG5共转染显着降低SK-N-SH细胞中ATG5蛋白表达量。2.回复ATG5的表达量显着逆转miR-34a对神经母细胞瘤细胞增殖、克隆、侵袭、迁移、自噬的抑制作用。结论:1.miR-34a在神经母细胞瘤中表达量下调,与临床肿瘤分级相关。2.miR-34a表达量上调显着提高患者的生存率。3.miR-34a过表达可以抑制神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y细胞、SK-N-SH细胞）增殖、克隆、侵袭、迁移、自噬。4.ATG5为miR-34a的直接靶位基因。5.ATG5在神经母细胞瘤中表达量上调,与miR-34a的表达量呈负相关。6.miR-34a通过调节ATG5发挥其对神经母细胞瘤细胞恶性生物学特性的抑制作用。
王丽[10]（2019）在《DUSP5通过调控IL-33抑制卵巢癌进展的机制研究》文中研究表明卵巢癌（Ovarian cancer,OC）)是女性第四大恶性肿瘤、世界上第六大癌症,同时也是导致女性癌症死亡的第七大原因。在临床中,如果能够早期诊断卵巢癌,则临床治愈率会得到很大提高;但是,由于患者在其疾病早期阶段通常没有临床症状,因此给临床早期诊断带来很大难度。据统计,约80%的卵巢癌患者在早期发现并且治疗的话可以有90%的存活率,但对于卵巢癌III期和IV期的患者,其存活率急剧下降到不足30%。常规的盆腔检查、CA-125检查和超声检查等是卵巢癌的一般筛查方法,但其对诊断的参考价值较为有限。虽然有多种靶向药物已经用来治疗卵巢癌,但患者的整体生存率仍不理想。因此,探索卵巢癌发生、发展的机制对卵巢癌的诊断和临床治疗至关重要。白介素33（Interleukin 33,IL-33）于2005年被发现。它通过膜受体ST2发生的相关信号通路被认为能够激活丝裂原活化蛋白激酶和核因子（NF）-κB反应,最终导致体外T辅助细胞2极化型反应。关于IL-33在肿瘤发生中的机制研究近期被广大学者关注。多项研究表明IL-33在胆管癌、结肠癌、乳腺癌中都具有促进肿瘤进展的作用。IL-33已被确认为诊断或预测非小细胞肺癌预后的生物标志物。但也有研究显示IL-33对结肠癌有抗肿瘤作用,这些提示IL-33在肿瘤的发病机制中有复杂的作用。已有研究显示,在卵巢癌中发现IL-33和ST2水平升高,且IL-33通过下调p27、Fas和TRAILR1促进卵巢癌细胞增殖并抑制其凋亡,表明IL-33对卵巢癌具有显着的促癌作用。但是,其上游调控机制尚未完全阐明。双特异性MAP激酶磷酸酶（DUSPs）在近10年才被发现,是一类酶分子,可分为两类,非典型的双特异性磷酸酶和典型的双特异性磷酸酶。双特异性磷酸酶能够使酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸残基去磷酸化,激活细胞外信号调节激酶和氨基末端激酶。已有研究显示,目前多数家族成员均以丝裂原活化蛋白激酶的负向调节剂参与细胞分化、增殖、基因转录、代谢、细胞间通信等。如,双特异性MAP激酶磷酸酶（DUSP5）是抑癌基因p53的直接转录靶点,在多种类型的肿瘤中具有抑癌作用;DUSP5在前列腺癌和胃癌中表达下调,且DUSP5的表达缺失与不良预后有关;小鼠表皮DUSP5缺陷增加皮肤癌致癌物诱导模型中H-Ras驱动的乳头状瘤形成;在胃癌中,DUSP5的过表达降低了细胞核p-ERK水平,减缓了细胞生长;低DUSP5表达与结直肠癌不良预后有关。然而,DUSP5在卵巢癌发生进展中的作用尚未被报道。基于上述资料,IL-33在卵巢癌中高表达,而DUSP5能够抑制多种肿瘤的形成以及改善预后,我们提出假设:（1）DUSP5在卵巢癌中表达下调;（2）DUSP5能够抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;（3）DUSP5表达的下调能增强IL-33在卵巢癌细胞中的表达和分泌;（4）可通过上调DUSP5的表达来降低IL-33的水平,从而抑制卵巢癌细胞的生物学行为。综上,DUSP5能够通过调节IL-33的表达来影响卵巢癌的发生发展。本课题首先检测DUSP5在卵巢癌组织的表达情况及其对卵巢癌细胞生物学行为的影响;其次研究DUSP5的低表达与IL-33表达和卵巢癌细胞生物学行为之间的关系,以及上调DUSP5后IL-33表达的变化和卵巢癌生物学行为的变化。第一部分卵巢癌组织中DUSP5的表达水平及其与预后的相关性研究目的:探讨双特异性MAP激酶磷酸酶5（DUSP5）在人卵巢癌组织、癌旁卵巢组织中的表达情况,并探讨DUSP5表达水平与临床预后的关系。方法:（1）收集2014年-2017年在苏州大学第一附属医院就诊的卵巢癌患者的组织标本;（2）统一对其进行实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）分析;（3）从Gene Expression Omnibus数据集（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载DUSP5（NM＿004419.3）的表达模式,登录号为GSE49997,进行生存分析探讨DUSP5水平与临床预后的关系。（4）对60例卵巢癌组织芯片和15例癌旁卵巢组织标本进行免疫组织化学染色,进一步检测DUSP5在人卵巢癌组织和癌旁卵巢组织中的表达水平。为更客观,本部分采用组织化学评分法定量表达DUSP5的免疫组化染色程度。结果:（1）与癌旁卵巢组织相比,DUSP5在癌组织中的表达明显下调（P<0.001）;（2）生存分析结果显示,DUSP5低表达的患者,其整体生存期缩短,HR=0.77（0.69-0.86）,logrank P=4e-06;（3）通过组织化学评分法,将卵巢组织标本进行对比分析,结果显示15例癌旁组织标本的DUSP5均呈阳性,H值中位数为79.5;60例卵巢癌组织芯片中,有42份DUSP5染色较弱或未能检出,H评分在5-30之间。提示DUSP5在OC组织中的表达显着下调（P<0.001）。结论:卵巢癌组织中DUSP5呈低表达趋势,且DUSP5越低,患者的生存期限越短,提示DUSP5的低表达有潜力作为卵巢癌预后的参考指标。需通过较大样本进一步分析。第二部分DUSP5对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响目的:探讨DUSP5对卵巢癌细胞的生物学行为,如增殖、迁移和侵袭能力的影响,分析DUSP5在卵巢癌的生成和发展中的作用。方法:（1）通过定量聚合酶链反应（real-time PCR）和western blot方法,检测DUSP5在人类卵巢癌细胞株SK-OV-3和Cavo-3细胞系中的沉默效率;（2）用CCK8法检测DUSP5沉默对SK-OV-3和Cavo-3细胞增殖的影响;（3）用细胞划痕实验（Wound healing assay）和侵袭实验（Invasion assay）研究siRNA沉默DUSP5后,对SK-OV-3和Cavo-3细胞的迁移和侵袭能力的影响;（4）用定量聚合酶链反应（real-time PCR）和western blot法,验证DUSP5在人类卵巢癌细胞株SK-OV-3和Cavo-3细胞系中的过表达效率;（5）用CCK8法检测DUSP5的过度表达对SK-OV-3和Cavo-3细胞增殖的影响;（6）用细胞划痕实验（Wound healing assay）和侵袭实验（Invasion assay）研究过表达DUSP5后,对SK-OV-3和Cavo-3细胞系迁移和侵袭能力的影响;结果:（1）沉默DUSP5后,SK-OV-3和Cavo-3细胞的增殖能力显着增加（P<0.05）;（2）沉默DUSP5后,SK-OV-3和Cavo-3细胞的迁移和侵袭能力明显增加（P<0.05）;（3）过表达DUSP5后,SK-OV-3和Cavo-3细胞的增殖能力受到显着抑制（P<0.05）,但是细胞的迁移（P>0.05）和侵袭（P>0.05）能力无显着变化。结论:DUSP5能够抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,但其作用的机制尚不明确,需要进一步的实验探索。第三部分DUSP5的表达下调对IL-33在卵巢癌细胞中的表达和分泌影响目的:探索人为干预致使DUSP5表达下调后,IL-33在SK-OV-3和Cavo-3细胞中的表达水平和分泌的变化。方法:（1）使用siRNA转染SK-OV-3和Cavo-3细胞,沉默DUSP5表达;转染实验包含4种处理类型:si-NC,si-DUSP5,oe-NC,oe-DUSP5;（2）用RT-PCR法检测DUSP5沉默前后SK-OV-3和Cavo-3细胞中IL-33m RNA表达水平变化;（3）用酶联免疫吸附试验和蛋白印迹法检测沉默DUSP5前后,SK-OV-3和Cavo-3细胞中IL-33的表达水平;（4）使用野生型IL-33启动子（pGL3-2.5k-luc）进行荧光素酶分析,探索DUSP5下调是否会诱导IL-33转录。结果:（1）沉默DUSP5显着增加IL-33的转录;（2）ELISA检测结果显示,沉默DUSP5后,SK-OV-3和Cavo-3细胞中IL-33的分泌量显着增加;（3）蛋白印迹法结果显示,沉默DUSP5后,SK-OV-3（P<0.001）和Cavo-3（P<0.001）细胞中前体IL-33和成熟IL-33的水平显着增加;（4）荧光素酶结果显示,下调DUSP5后,SK-OV-3（P<0.01）和Cavo-3（P<0.001）细胞中IL-33-Luc被激活,即IL-33启动子活性显着增强。结论:DUSP5的表达下调能够增强IL-33在卵巢癌中的表达和分泌,提示DUSP5可能是通过IL-33信号通路来影响卵巢癌的发生和发展,需要进一步实验来证实。第四部分DUSP5依赖于IL-33信号传导来抑制卵巢癌的发生和发展目的:进一步探索DUSP5和IL-33信号通路之间的关系,即抑制IL-33信号传导是否能够降低DUSP5抑制卵巢癌的生物学行为。方法:（1）用IL-33中和抗体（抗IL-33）处理SK-OV-3和Cavo-3细胞;（2）用CCK8法检测沉默DUSP5时,IL-33中和抗体对SK-OV-3和Cavo-3细胞增殖能力的影响;（3）用细胞划痕实验检测沉默DUSP5时,IL-33中和抗体对SK-OV-3和Cavo-3细胞迁移能力的影响;（4）用Transwell实验检测沉默DUSP5时,IL-33中和抗体对SK-OV-3和Cavo-3细胞侵袭能力的影响;（5）在野生型和DUSP5过表达的SK-OV-3和Cavo-3细胞中加入重组IL-33,然后用CCK8法、细胞划痕实验和Transwell法检测细胞的迁移能力和侵袭能力。结果:（1）CCK8结果显示,抗IL-33处理DUSP5沉默后的SK-OV-3和Cavo-3细胞,其抑制了沉默DUSP5增加的两组细胞增殖能力（P<0.05）;（2）细胞划痕实验显示,抗IL-33处理SK-OV-3和Cavo-3细胞后,其抑制了沉默DUSP5对两组细胞的迁移能力（P<0.05）;（3）Transwell实验结果显示,抗IL-33处理SK-OV-3和Cavo-3细胞后,其抑制了沉默DUSP5对两组细胞的侵袭能力（P<0.05）;（4）CCK8结果显示,在DUSP5过表达细胞中,加入重组IL-33蛋白显着降低了DUSP5过表达抑制的细胞增殖作用（P<0.05）（5）细胞划痕实验和Transwell实验结果显示,在野生型和DUSP5过表达的SK-OV-3和Cavo-3细胞中,加入重组IL-33蛋白显着促进了两组细胞的迁移能力（P<0.05）和侵袭能力（P<0.05）。结论:本部分实验提示IL-33具有明确的致癌作用,而且DUSP5抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的功能很大程度上依赖于对IL-33表达的转录抑制,即DUSP5通过调控IL-33信号通路来影响卵巢癌的发生和发展。
二、重组腺病毒介导入野生型p53,GM-CSF和B7-1基因对肿瘤化疗耐药细胞生物学行为的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组腺病毒介导入野生型p53,GM-CSF和B7-1基因对肿瘤化疗耐药细胞生物学行为的影响（论文提纲范文）
（1）双特异性重组腺病毒协同依托泊苷对小细胞肺癌抑制作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 肺癌概述 |
| 2 小细胞肺癌的治疗 |
| 3 溶瘤腺病毒的抗肿瘤机制 |
| 3.1 溶瘤腺病毒的选择性复制机制 |
| 3.2 溶瘤腺病毒与基因治疗 |
| 3.3 溶瘤腺病毒与免疫治疗 |
| 3.4 溶瘤腺病毒联合其他疗法 |
| 4 凋亡素 |
| 4.1 鸡贫血病毒 |
| 4.2 凋亡素的结构 |
| 4.3 凋亡素的定位与调控 |
| 5 端粒酶 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞复苏 |
| 2.2 细胞传代 |
| 2.3 细胞冻存 |
| 2.4 扩增溶瘤腺病毒 |
| 2.5 重组腺病毒病毒滴度的测定 |
| 2.6 WST-1检测 |
| 2.7 联合指数计算 |
| 2.8 结晶紫染色 |
| 2.9 CFDA-SE荧光染色 |
| 2.10 Hoechst染色 |
| 2.11 Annexin V-FITC/PI检测 |
| 2.12 JC-1检测 |
| 2.13 活性氧(ROS)检测 |
| 2.14 Transwell检测 |
| 2.15 Biocoat检测 |
| 2.16 划痕试验检测 |
| 2.17 Western blot检测 |
| 2.18 体内抑瘤试验 |
| 2.19 药物毒性测定 |
| 2.20 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 重组腺病毒与Etopside联合应用的协同作用测定 |
| 1.1 WST-1法检测重组腺病毒与Etopside联合应用对NCI-H446细胞的增殖抑制作用 |
| 1.2 WST-1法检测重组腺病毒与Etopside联合应用对BEAS-2B细胞的增殖抑制作用 |
| 1.3 CalcuSyn软件分析Ad-VT与Etopside的协同作用检测结果 |
| 2 Ad-VT与Etopside联合应用对小细胞肺癌的抑制作用结果 |
| 2.1 结晶紫染色结果 |
| 2.2 CFDA-SE活细胞染色结果 |
| 3 Ad-VT与Etopside联合诱导NCI-H446细胞凋亡的研究结果 |
| 3.1 Hoechst染色结果 |
| 3.2 Annexin V-FITC/PI检测结果 |
| 3.3 JC-1检测结果 |
| 3.4 ROS染色结果 |
| 3.5 凋亡蛋白水平检测结果 |
| 4 Ad-VT与Etopside联合抑制NCI-H446细胞迁移和侵袭能力能力的研究结果 |
| 4.1 划痕试验结果 |
| 4.2 Transwell试验结果 |
| 4.3 Biocoat试验结果 |
| 4.4 肿瘤转移相关蛋白水平检测结果 |
| 5 Ad-VT与Etopside联合应用对小细胞肺癌NCI-H446细胞的体内抑制研究 |
| 5.1 异种移植瘤抑制情况 |
| 5.2 生存分析 |
| 5.3 体重测定 |
| 5.4 药物毒性分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 作者简介 |
| 附录B 攻读学位期间发表论文目录 |
（2）双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对卵巢癌抑制作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.卵巢癌概述 |
| 2.溶瘤腺病毒 |
| 2.1 腺病毒的细胞进入、复制和免疫原性 |
| 2.2 肿瘤选择性复制腺病毒的研究现状 |
| 2.3 溶瘤腺病毒的临床发展 |
| 2.4 改造溶瘤腺病毒 |
| 3 凋亡素 |
| 3.1 凋亡素的序列和结构 |
| 3.2 凋亡素的IDP性质允许与细胞蛋白进行广泛的相互作用 |
| 3.3 凋亡素与DNA的相互作用 |
| 3.4 几种激酶介导凋亡素的细胞毒活性 |
| 3.5 通过细胞周期检查点感知细胞增殖状态 |
| 3.6 细胞是如何死亡的 |
| 3.7 凋亡素的传递方式 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 荧光素酶标记的人卵巢癌细胞的构建与鉴定 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 重组腺病毒Ad-VT对 A2780-LUC和 SKOV3-LUC细胞的抑制作用和抑制途径的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 重组腺病毒Ad-VT对 A2780-LUC和 SKOV3-LUC细胞的体内抑制研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 基因治疗载体的研究进展 |
| 1.1.1 病毒载体 |
| 1.1.2 细菌载体 |
| 1.1.3 人工合成载体 |
| 1.1.4 结语与展望 |
| 1.2 神经母细胞瘤 |
| 1.2.1 神经母细胞瘤的发生及流行病学 |
| 1.2.2 神经母细胞瘤分子生物学特征及动物研究模型 |
| 1.2.3 神经母细胞瘤的临床表现及分期分层 |
| 1.2.4 神经母细胞瘤的治疗 |
| 1.2.5 结语与展望 |
| 1.3 GRIM-19的研究进展 |
| 1.3.1 GRIM-19的发现、结构及分布 |
| 1.3.2 GRIM-19的突变及下调与恶性肿瘤的关系 |
| 1.3.3 GRIM-19的功能 |
| 1.3.4 结语与展望 |
| 第2章 实验部分 |
| 2.1 PCG阳离子聚合物的合成及转染肿瘤细胞的检测 |
| 2.1.1 前言 |
| 2.1.2 材料和方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 GRIM-19蛋白在神经母细胞瘤组织中的表达 |
| 2.2.1 前言 |
| 2.2.2 材料和方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 阳离子聚合物递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的作用及机制研究 |
| 2.3.1 前言 |
| 2.3.2 材料和方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 第3章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）乳腺癌可视化模型的建立及双特异性重组腺病毒与紫杉醇协同抑制作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 溶瘤腺病毒的研究现状 |
| 1.2 乳腺癌与治疗 |
| 第2章 实验部分 |
| 第一部分 荧光素酶标记人乳腺癌MDA-MB-231-LUC细胞的构建、鉴定以及裸鼠体内荷瘤模型的构建 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 小结 |
| 第二部分 Ad-VT与紫杉醇(PTX)协同作用研究 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 小结 |
| 第三部分 双特异性溶瘤腺病毒和紫杉醇联合对乳腺癌细胞的体外抑制方式研究 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.3.4 小结 |
| 第四部分 双特异性溶瘤腺病毒和紫杉醇联合应用对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力影响的研究 |
| 2.4.1 实验材料 |
| 2.4.2 实验方法 |
| 2.4.3 结果 |
| 2.4.4 小结 |
| 第五部分 双特异性溶瘤腺病毒和紫杉醇联合应用对荧光素酶标记人乳腺癌MDA-MB-231 细胞的体内抑制作用研究 |
| 2.5.1 实验材料 |
| 2.5.2 实验方法 |
| 2.5.3 结果 |
| 2.5.4 小结 |
| 第3章 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）自噬通过影响EHF入核调控胰腺癌细胞干性的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、EHF负向调控胰腺癌细胞的干性特征 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 细胞系 |
| 1.1.2 主要抗体 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要耗材 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.1.6 主要试剂的配制 |
| 1.1.7 实验方法及步骤 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 EHF在不同胰腺癌细胞系中的基础表达量不同 |
| 1.2.2 成功构建EHF过表达和降表达的稳定细胞系 |
| 1.2.3 EHF负向调控胰腺癌细胞的干性特征 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、EHF正向转录调控P62在胰腺癌中的表达 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 组织标本 |
| 2.1.3 主要抗体 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要耗材 |
| 2.1.6 主要仪器设备 |
| 2.1.7 主要试剂的配制 |
| 2.1.8 实验方法及步骤 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 RNA测序结果显示EHF与P62的mRNA表达量呈正相关 |
| 2.2.2 EHF与P62在组织标本中的表达量呈正相关并且是患者预后的保护因素 |
| 2.2.3 EHF与P62在组织蛋白和RNA水平的表达量呈正相关 |
| 2.2.4 EHF与P62在细胞蛋白和RNA水平的表达量呈正相关 |
| 2.2.5 EHF直接调控P62的转录翻译 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、EHF不影响胰腺癌细胞的自噬水平 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 主要抗体 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要耗材 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.1.6 主要试剂的配制 |
| 3.1.7 实验方法及步骤 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 EHF与P62在细胞蛋白和RNA水平的表达量呈正相关 |
| 3.2.2 EHF不影响胰腺癌细胞的自噬水平 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、P62辅助EHF负向调控胰腺癌细胞的干性特征 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 细胞系 |
| 4.1.2 主要抗体 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要耗材 |
| 4.1.5 主要仪器设备 |
| 4.1.6 主要试剂的配制 |
| 4.1.7 实验方法及步骤 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 EHF会正向影响P62的表达量而P62不会影响EHF的表达量 |
| 4.2.2 P62同样可以负向调控胰腺癌细胞的干性特征,但是影响能力弱于EHF |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 五、P62以蛋白互作的方式影响EHF在细胞内的分布 |
| 5.1 对象和方法 |
| 5.1.1 细胞系 |
| 5.1.2 组织标本 |
| 5.1.3 主要抗体 |
| 5.1.4 主要试剂 |
| 5.1.5 主要耗材 |
| 5.1.6 主要仪器设备 |
| 5.1.7 主要试剂的配制 |
| 5.1.8 实验方法及步骤 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 EHF与P62无论是在组织水平还是细胞水平均存在空间上的共定位 |
| 5.2.2 EHF与P62在细胞内存在蛋白之间的相互作用 |
| 5.2.3 P62在不影响EHF总量的情况下影响了EHF在细胞内的分布 |
| 5.2.4 P62通过影响EHF进入细胞核的数量最终影响了EHF的转录调控活性 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 六、EHF通过PNT结构域与P62的ZZ结构域直接结合 |
| 6.1 对象和方法 |
| 6.1.1 细胞系 |
| 6.1.2 主要抗体 |
| 6.1.3 主要试剂 |
| 6.1.4 主要耗材 |
| 6.1.5 主要仪器设备 |
| 6.1.6 主要试剂的配制 |
| 6.1.7 实验方法及步骤 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 EHF与P62存在直接的蛋白相互作用 |
| 6.2.2 成功构建带有标签的EHF与P62全长及各自主要结构域的质粒 |
| 6.2.3 带有HA标签的EHF蛋白与带有Flag标签的P62蛋白依然存在相互作用 |
| 6.2.4 EHF通过PNT结构域与P62蛋白发生相互作用 |
| 6.2.5 P62通过ZZ结构域与EHF蛋白发生相互作用 |
| 6.2.6 EHF的PNT结构域与P62的ZZ结构域直接发生相互作用 |
| 6.2.7 通过竞争性抑制结合实验证实PNT结构域与ZZ结构域的重要性 |
| 6.2.8 突变掉PNT或ZZ结构域将阻断EHF与P62之间的相互作用 |
| 6.2.9 突变掉PNT或ZZ结构域将阻断P62影响EHF在细胞内分布的作用 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 七、自噬通过降低P62的表达影响胰腺癌细胞的干性特征 |
| 7.1 对象和方法 |
| 7.1.1 细胞系 |
| 7.1.2 主要抗体 |
| 7.1.3 主要试剂 |
| 7.1.4 主要耗材 |
| 7.1.5 主要仪器设备 |
| 7.1.6 主要试剂的配制 |
| 7.1.7 实验方法及步骤 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 自噬水平提高后会降低P62的表达但不会影响EHF的含量 |
| 7.2.2 自噬水平提高后会通过降低P62的表达来影响EHF在细胞内的分布 |
| 7.2.3 自噬通过减少EHF进入细胞核的数量最终降低了EHF的转录调控活性 |
| 7.2.4 自噬可以正向调控胰腺癌细胞的干性特征 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 八、通过回复和阻断实验证实自噬—P62—EHF通路的意义 |
| 8.1 对象和方法 |
| 8.1.1 细胞系 |
| 8.1.2 主要抗体 |
| 8.1.3 主要试剂 |
| 8.1.4 主要耗材 |
| 8.1.5 主要仪器设备 |
| 8.1.6 主要试剂的配制 |
| 8.1.7 实验方法及步骤 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 通过诱导自噬后回复P62证实自噬确实通过影响P62的含量最终调控胰腺癌细胞的干性特征 |
| 8.2.2 通过阻断P62的实验证实自噬确实通过影响P62的含量最终调控胰腺癌细胞的干性特征 |
| 8.2.3 通过阻断EHF的实验证实自噬确实通过EHF的介导最终调控胰腺癌细胞的干性特征 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 九、EHF通过下调Wnt/β-catenin通路影响胰腺癌干性表达 |
| 9.1 对象和方法 |
| 9.1.1 细胞系 |
| 9.1.2 主要抗体 |
| 9.1.3 主要试剂 |
| 9.1.4 主要耗材 |
| 9.1.5 主要仪器设备 |
| 9.1.6 主要试剂的配制 |
| 9.1.7 实验方法及步骤 |
| 9.2 结果 |
| 9.2.1 通过生物信息分析发现Wnt/β-catenin通路会介导EHF对胰腺癌细胞干性特征的调控作用 |
| 9.2.2 在胰腺癌细胞中EHF的表达水平与Wnt/β-catenin通路的活性呈负相关 |
| 9.2.3 成功构建阻断Wnt/β-catenin通路的细胞模型 |
| 9.2.4 外源性阻断Wnt/β-catenin通路可以有效的抑制由于EHF水平降低所造成的胰腺癌细胞上调的干性特征 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 十、EHF高表达是提高抗自噬治疗效果的标记 |
| 10.1 对象和方法 |
| 10.1.1 细胞系 |
| 10.1.2 实验动物 |
| 10.1.3 主要抗体 |
| 10.1.4 主要试剂 |
| 10.1.5 主要耗材 |
| 10.1.6 主要仪器设备 |
| 10.1.7 主要试剂的配制 |
| 10.1.8 实验方法及步骤 |
| 10.2 结果 |
| 10.2.1 成功构建EHF过表达的Pan02稳定细胞系 |
| 10.2.2 自噬抑制剂ULK-101可以有效抑制肿瘤的发展并且在EHF表达水平高的细胞中表现出了更强的抑瘤作用 |
| 10.2.3 ULK-101与吉西他滨联用可以提高动物模型中胰腺癌的治疗效果 |
| 10.3 讨论 |
| 10.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞自噬及其与肿瘤关系的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）基于p53调控点探讨新藤黄酸诱导A549/Cis细胞周期阻滞影响NSCLC顺铂耐药的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 新藤黄酸诱导 A549/Cis 细胞周期阻滞及凋亡,影响 NSCLC 顺铂耐药的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 基于RNA-seq 技术的新藤黄酸干预下 A549/Cis 细胞转录组学研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 新藤黄酸影响 A549/Cis 细胞顺铂耐药调控靶点的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 新藤黄酸抗肿瘤作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 非小细胞肺癌化疗中顺铂耐药机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（7）溶瘤腺病毒rAd.Light治疗小鼠乳腺癌移植瘤的疗效评价及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 病毒及细胞 |
| 2.1.3 主要试剂及配置 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Ad.Light和 r Ad.Light的扩增纯化及鉴定 |
| 2.2.2 Ad.Light和 r Ad.Light颗粒滴度和感染滴度测 |
| 2.2.3 LIGHT对小鼠乳腺癌4T1 细胞增殖和凋亡的影响 |
| 2.2.4 小鼠乳腺癌移植瘤模型的建立、分组及治疗 |
| 2.2.5 溶瘤腺病毒治疗后肿瘤的体积和重量的记录 |
| 2.2.6 肿瘤组织病理学检测 |
| 2.2.7 肿瘤组织免疫组化分析 |
| 2.2.8 肿瘤组织中的目的基因LIGHT、LIGHT受体及相关细胞因子的表达检测 |
| 2.2.9 外周血T淋巴细胞表型检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 Ad.Light和 r Ad.Light的扩增纯化及鉴定 |
| 3.1.1 Ad.Ligh和 r Ad.Light的扩增与纯化 |
| 3.1.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定Ad.Light和 r Ad.Light病毒 |
| 3.1.3 流式细胞术检测小鼠4T1 细胞感染Ad.Light和 r Ad.Light后 LIGHT表达情况 |
| 3.2 LIGHT对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.3 r Ad.Light治疗小鼠乳腺癌移植瘤的疗效评价 |
| 3.3.1 r Ad.Light抑制4T1 移植瘤的生长 |
| 3.3.2 r Ad.Light促进肿瘤细胞坏死及免疫细胞浸润 |
| 3.4 r Ad.Light治疗小鼠乳腺癌移植瘤的机制研究 |
| 3.4.1 r Ad.Light促进肿瘤细胞凋亡及CD3+细胞浸润 |
| 3.4.2 RT-PCR分析肿瘤组织中LIGHT基因及其受体表达 |
| 3.4.3 RT-PCR分析肿瘤组织中炎性细胞因子表达 |
| 3.4.4 r Ad Light治疗对T淋巴细胞表型的影响 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 基因治疗中常用溶瘤病毒载体的研究进展 |
| 1 癌症基因治疗的出现 |
| 2 基因治疗中常用的溶瘤病毒 |
| 2.1 腺病毒 |
| 2.2 Ⅰ型单纯疱疹病毒 |
| 2.3 痘苗病毒 |
| 3 总结与展望 |
| 参考文献 |
（8）双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 构建双调控并荷载SPAG9 基因shRNA的溶瘤腺病毒 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞、质粒、培养基 |
| 1.2 主要试剂、材料 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 试剂的配制 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 |
| 2.DD3-ZD55-SPAG9 的扩增、纯化与滴度测定 |
| 3.DD3-ZD55-SPAG9 抑制前列腺癌细胞内SPAG9 蛋白表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 联合多西他赛体外治疗去势抵抗性前列腺癌 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞、培养基 |
| 1.2 主要试剂、材料 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 试剂的配制 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.结晶紫染色检测DD3-ZD55-SPAG9+DTX对细胞的毒性作用 |
| 2.溶瘤腺病毒ZD55-SPAG9 及多西他赛抑制前列腺癌细胞的生长 |
| 3.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制前列腺癌细胞迁移能力 |
| 4.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制前列腺癌细胞侵袭能力 |
| 5.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX促进前列腺癌细胞凋亡 |
| 6.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX下调SPAG9、Vimentin、MMP-2 蛋白,上调E-cadherin、caspase-8、casepase-3 蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 联合多西他赛治疗裸鼠移植瘤 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 2. 方法 |
| 结果 |
| 1.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制裸鼠移植瘤生长 |
| 2. HE 染色 |
| 3.TUNEL凋亡试剂盒检测肿瘤凋亡 |
| 4.免疫组化法检测肿瘤组织中SPAG9 蛋白与EMT相关蛋白 |
| 5.Western Blot检测肿瘤组织内SPAG9和EMT相关蛋白表达情况 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 研究创新 |
| 存在的问题和改进方法 |
| 参考文献 |
| 综述(一) 溶瘤腺病毒介导的抗肿瘤治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述(二) 嵌合抗原受体 T 细胞免疫治疗前列腺癌现状及进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 Abbreviation |
| 攻读学位期间参与发表的学术成果 |
| 致谢 |
（9）miR-34a通过靶向抑制ATG5抑制小儿神经母细胞瘤细胞增殖、转移和自噬的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 miR-34a调节小儿神经母细胞瘤细胞增殖、转移和自噬的相关研究 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 miR-34a靶向调节ATG5 的相关研究 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 ATG5 逆转miR-34a调控神经母细胞瘤细胞功能的机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 miRNA和神经母细胞瘤研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（10）DUSP5通过调控IL-33抑制卵巢癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 序言 |
| 第一部分 卵巢癌组织中DUSP5的表达水平及其与预后的相关性研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第二部分 DUSP5对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第三部分 DUSP5 的表达下调对IL-33 在卵巢癌细胞中的表达和分泌的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第四部分 DUSP5 依赖于IL-33 信号传导来抑制卵巢癌的发生和发展 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述(一) DUSPs对致癌Ras/ERK信号传导调控的研究 |
| 参考文献 |
| 综述(二) IL-33的多效免疫调节功能及其肿瘤免疫的意义 |
| 参考文献 |
| 本研究所获的基金资助 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论文 |
| 附录 |
| 卵巢癌患者临床病理资料 |
| 组织芯片信息 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
四、重组腺病毒介导入野生型p53,GM-CSF和B7-1基因对肿瘤化疗耐药细胞生物学行为的影响（论文参考文献）
- [1]双特异性重组腺病毒协同依托泊苷对小细胞肺癌抑制作用的研究[D]. 李亭玉. 延边大学, 2021
- [2]双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对卵巢癌抑制作用研究[D]. 崔英丽. 吉林大学, 2021(01)
- [3]阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究[D]. 徐阳. 吉林大学, 2020(03)
- [4]乳腺癌可视化模型的建立及双特异性重组腺病毒与紫杉醇协同抑制作用的研究[D]. 王京. 吉林大学, 2020(08)
- [5]自噬通过影响EHF入核调控胰腺癌细胞干性的机制研究[D]. 王昊天. 天津医科大学, 2020(06)
- [6]基于p53调控点探讨新藤黄酸诱导A549/Cis细胞周期阻滞影响NSCLC顺铂耐药的分子机制[D]. 申道福. 辽宁中医药大学, 2020(01)
- [7]溶瘤腺病毒rAd.Light治疗小鼠乳腺癌移植瘤的疗效评价及机制研究[D]. 戴涛云. 安徽医科大学, 2020(02)
- [8]双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究[D]. 杨春华. 苏州大学, 2019(06)
- [9]miR-34a通过靶向抑制ATG5抑制小儿神经母细胞瘤细胞增殖、转移和自噬的机制研究[D]. 程欣茹. 郑州大学, 2019(07)
- [10]DUSP5通过调控IL-33抑制卵巢癌进展的机制研究[D]. 王丽. 苏州大学, 2019