一、构建基因工程菌生产1,3-丙二醇的研究进展（论文文献综述）
王艳霞[1]（2021）在《高效转化甘油产1，3-丙二醇工程菌的构建》文中研究指明1,3-丙二醇（1,3-propanediol,1,3-PDO）目前在化工行业中应用非常广泛,它除了能够作为制备多种化学物质的溶剂外,在合成新型聚酯材料（如PTT）方面的应用所得到的市场关注也特别高。由壳牌公司研制的PTT是一种新兴的高分子纤维类材料,它是由1,3-丙二醇和对苯二甲酸（1,4-dicarboxybenzene）发生缩聚反应合成的,它不仅具有高弹力、容易染色、不产生静电的优点,而且极易降解,不会对环境造成污染,其精良的特性受到了人们的广泛关注,因此1,3-丙二醇的市场也随之扩大。近年来,伴随着化石燃料资源的日渐贫乏,以石油资源为基础的化学合成法受到了严重的限制,生物转化法生产1,3-丙二醇目前已经成为当前社会的研究热点。本论文分别以肺炎克雷伯氏菌2-1和大肠杆菌BL21为宿主构建了高效转化甘油产1,3-丙二醇的基因工程菌,并从代谢途径改造和发酵条件优化等方面进行了以下研究工作。（1）本研究以肺炎克雷伯氏菌为宿主,将来自奥奈达希瓦式菌MR-1的甲酸脱氢酶（编码基因FdhD）、来自肺炎克雷伯氏菌2-1的1,3-丙二醇氧化还原酶（编码基因dhaT）以及来自大肠杆菌JM109的1,3-丙二醇氧化还原酶的同工酶（编码基因yqhD）分别进行异源表达,构建得到重组菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-yqhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat-dhaT、K.pneumoniae/pET28a-dhat-FdhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat-yqhD-FdhD和K.pneumoniae/pET28a-dhat-dhaT-FdhD。并对重组菌转化甘油生产1,3-丙二醇的能力进行了初步探究。在5 L发酵罐进行分批补料发酵29 h后,其中最优菌株K.pneumoniae/pET28a-dhat-yqhD-FdhD的产量达到77.18 g/L,比野生型菌株（38.99 g/L）提高了97.93%。发酵强度和甘油转化率分别为2.34 g/（L·h）和55.79%。表明了yqhD和FdhD两个基因的协同作用进一步促进了3-羟基丙醛向1,3-丙二醇的转化,同时避免了辅酶供应不足造成中间产物积累,进而提高了1,3-丙二醇的产量。（2）从K.pneumoniae2-1基因组中扩增出4.9 kb的甘油脱水酶（GDHt）及其激活因子（GDr）编码基因（dhaB、dhaC、dhaE、dhaF、dhaG）,构建了重组菌E.coli BL21/p ETDuet-dhaB-dhaC-dhaE-dhaF-dhaG,同时从E.coli JM109基因组中克隆1.16 kb的PDOR同工酶编码基因yqhD,构建了重组菌E.coli BL21/p ETDuet-dhaB-dhaC-dhaE-dhaF-dhaG-yqhD。对重组菌摇瓶发酵24 h后产1,3-丙二醇的能力进行初步考察,结果表明,在E.coli BL21中分别只转入GDHt和GDr编码基因（dhaB、dhaC、dhaE、dhaF、dhaG）得到的重组菌不利于利用甘油产1,3-丙二醇,只有增加yqhD基因的拷贝数,强化表达1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶才能达到高效转化甘油发酵产1,3-丙二醇的目的。在5 L发酵罐进行分批补料发酵30 h后,重组菌E.coli BL21/p ETDuet-dhaB-dhaC-dhaE-dhaF-dhaG-yqhD的1,3-丙二醇产量、转化率和生产强度分别达为50.76 g/L,47%和1.69 g/（L·h）。
蒋欢[2]（2020）在《Klebsiella pneumoniae 2e甘油脱水酶活因子的表达及其催化性质研究》文中提出随着生物柴油产业的规模化发展,其低值副产物粗甘油的产量也迅速增加。大量粗甘油的产生与积累已经成为影响生物柴油产业能否可持续发展的重要因素之一。通过微生物发酵将粗甘油直接转化成高值化学品1,3-丙二醇（1,3-propanedio,简称1,3-PDO）是目前极具前景的粗甘油利用途径。甘油脱水酶是微生物合成1,3-PDO中的关键限速酶,该酶对于1,3-PDO的合成速率以及产率起到关键作用,因此研究甘油脱水酶对发酵产1,3-PDO具有重要作用。本研究以一株筛选出的粗甘油耐受型菌株Klebsiellapneumoniae 2e为研究对象,通过对Klebsiella pneumoniae 2e基因组分析,发现Klebsiella pneumoniae 2e基因组中含有两个甘油脱水酶激活因子编码有关的基因,并进行进一步的生物信息学分析得到这两个基因组编码的很可能为新的甘油脱水酶激活因子。本文首先对这两个基因分别进行了生物信息学分析,并克隆表达了这两个甘油脱水酶激活子基因,对其进行酶学性质分析,获得的主要结果如下:1.利用分子生物信息学对甘油脱水酶激活因子基因orfW和orfY分别进行分析,orfW基因与甘油脱水酶激活因子基因dhaB4的序列相似性高达65.47%,而orfY蛋白的结构域和甘油脱水酶激活因子dhaG相同,并通过同源建模获得了这两个基因的三维结构信息以及进化树的构建,发现orfW基因在进化树地位上与Lactobacillus diolivorans二醇脱水酶的再激活酶相近,orfY基因在进化树地位上与Klebsiella pneumoniae的甘油脱水酶的再激活酶地位相近,结果表明这两个基因具有甘油脱水酶再激活酶功能。2.以Klebsiellapneumoniae 2e基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到甘油脱水酶激活因子基因orfW和orfY,分别连接到表达载体pcold-TF上,得到重组质粒pcold-orfW 和 pcold-orfY,测序正确后,将质粒分别转化至 Escherchia.coli Rosseta（DE3）中进行诱导表达,得到可溶性蛋白并将其纯化,纯化后的蛋白经SDS-PAGE结果显示,在70kDa和67kDa处有特异性蛋白,结果与预期相符。在辅酶B12、ATP和Mg2+的存在下,以Klebsiella pneumoniae2e的甘油脱水酶为对象进行激活实验,结果证明,重组质粒pcold-orfW和pcold-orfW的表达产物具有甘油脱水酶激活因子活性。3.在酶活性分析中,失活的甘油脱水酶分别被甘油脱水酶激活因子基因orfW和orfY进行激活,激活程度随时间的增长而逐渐变大,orfW的最适温度和最适pH分别为37℃和8.0,orfY的最适温度和最适pH分别为30℃和9.0,orfW对失活的甘油脱水酶的激活作用大于orfY。将orfW和orfY共同激活失活的甘油脱水酶时,共同作用的结果低于orfW单独激活甘油脱水酶所生成的丙醛含量,但是酶活力大于orfY基因。结果表明,orfW和orfY都是甘油脱水酶激活因子,能对失活的甘油脱水酶进行激活。4.对Klebsiella pneumoniae 2e中甘油脱水酶激活因子基因orfW、orfY、dhaF和dhaG在不同浓度粗甘油杂质中的转录水平进行了检测分析,结果表明Klebsiella pneumoniae 2e中甘油脱水酶基本不受粗甘油杂质影响是因为四个甘油脱水酶激活因子的共同作用。
刘洪玉[3]（2019）在《代谢工程改造微生物生产1,3-丙二醇和2-苯乙醇的研究》文中研究说明醇,是脂肪烃、脂环烃或芳香烃侧链中的氢原子被羟基取代而形成的一大类有机化合物,分为脂肪醇、脂环醇和芳香醇。它们在食品、医疗、能源、化工和材料等领域都具有广泛的用途。随着不可再生化石资源的日益消耗和随之而来的环境问题,使得开发利用可再生资源进行绿色生产的模式受到越来越多的关注。近年来代谢工程和合成生物学研究发展迅猛,利用微生物转化廉价碳源（例如粗甘油、木质素和二氧化碳等）生产多种高值化合物受展现了巨大的前景。基于此,本论文以1,3-丙二醇和2-苯乙醇的微生物合成为主题,主要从以下几个方面展开了研究。首先,利用系统代谢工程的手段构建更高效的细胞工厂,以提高1,3-丙二醇的生物生产。产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）是一种革兰氏阴性杆菌,隶属于肠杆菌科。但是,目前利用Klebsiella oxytoca以甘油为底物发酵生产1,3-丙二醇的方法和工艺还存产物浓度低、底物利用效率低等问题。针对以上面临的问题,对一株Klebsiella oxytoca PDL-0进行了系统的代谢工程改造,成功的将甘油氧化途径中部分用于副产物合成的代谢流转到还原途径1,3-丙二醇的合成中,提高了甘油发酵的利用效率,简化后提取工艺,降低废弃物的产生及成本。将K.oxytoca PDL-0的乳酸、乙醇、丁二醇、琥珀酸和乙酸等副产物合成途径进行了逐一或组合失活,通过组合辅因子的再生及细胞呼吸效率的提高,最终1,3-丙二醇的产量可达到74.9 g L-1,与野生型菌株相比提高了107.5%;副产物的量降低了42.8%,并且细胞的生长速度明显提高。本章的工作通过对副产物合成途径进行优化组合改造、结合辅因子再生及细胞呼吸效率改善等,提高工程菌株的生产性能,所使用的代谢工程策略也可对其他生物炼制过程的改进提供借鉴和指导。其次,提出了一种利用天然空间分隔来解决合成生物学中不适配问题的新策略。随着合成生物学的发展,蓝藻由于可以直接转化太阳能和二氧化碳合成所需的化合物进行光合生长,受到了越来越多的关注。然而,在代谢工程改造蓝藻进行光合生产的研究中,由于导入的异源途径和蓝藻宿主间的不适配性限制了目标化合物的光合生产,例如氧敏感、辅因子平衡及代谢产物耐受等。1,3-丙二醇是一种重要的平台化合物,在化妆品、食品、医药和新型聚合物（polytrimethylene terephthalate,PTT）)合成等领域具有广泛的应用。然而,在1,3-丙二醇光合生产的研究中,途径中的关键酶（甘油脱水酶,GDHt）对氧敏感,氧敏感的不适配问题限制了1,3-丙二醇的光合生产。因此,我们选取1,3-丙二醇为目标化合物,利用Anabaena sp.PCC7120的自然细胞分化（异型胞）进行空间分隔,有望通过所提出的空间分隔的策略来解决1,3-丙二醇光合生产中不适配的问题（氧敏感）。分别构建了兼性厌氧菌（Klebsiella pneumoniae）和严格厌氧菌（Clostridium butyricum）基因来源的1,3-丙二醇光合生产模块,及其光合生产菌株。探索在有、无异型胞进行空间分隔的情况下工程菌株（P11、P12、P13和P14）1,3-丙二醇的合成特点。当异型胞存在时含模块KP的工程菌P11的1,3-丙二醇累积量为46mg L-1,比异形胞不存在时大约高出1.7倍。此外,含有模块CB的工程菌株（P12、P13和P14）,仅在异型胞存在时检测到1,3-丙二醇累积。结果表明,利用Anabaena sp.PCC7120的自然细胞分化（异型胞）进行空间分隔,使1,3-丙二醇光合生产中氧敏感元器件在产氧生物中的功能性组装,实现了1,3-丙二醇的光驱动生产。Anabaena sp.PCC7120的特化细胞—异型胞对氧敏感的1,3-丙二醇生物合成模块具有重要的保护效果。这里所提出的利用天然空间分隔来解决光合生产中氧敏感所导致的不适配性问题的策略具有重要的意义和潜在的应用价值。第三,基于代谢途径和光合链可塑性的2-苯乙醇光驱动合成。由于光合效率和代谢刚性的限制,在利用蓝藻进行光合生产时,大多数目标化合物都局限于以靠近碳固定的中心代谢物为出发点来提高合成效率。最近,研究结果表明蓝藻的碳代谢具有一定的可塑性,可以将碳流重定向至一些低通量的途径,以便直接从二氧化碳合成目标化学品。莽草酸通路是植物和微生物中碳代谢中心和芳香氨基酸（AAAs）网络之间的代谢桥梁,是天然芳香化合物的重要来源途径。然而,蓝藻中莽草酸途径的可塑性还未被研究,因而我们以2-苯乙醇为目标化合物,探究蓝藻中莽草酸途径的可塑性。我们构建了两种2-苯乙醇的人工生物合成途径,并将其导入到蓝藻的模式菌株Synechococcus elongatus PCC7942中,实现了直接利用CO2合成2-苯乙醇。随后,构建了一种解反馈抑制模块（FBR模块）,并把它和醇脱氢酶引入到上述2-苯乙醇生产的工程菌株中。与野生型菌株相比,工程光合菌株P120的2-苯乙醇的产量最高可达119.5 mg L-1,固碳率和光合放氧分别提高了68.7%和29.9%,其中30%以上的固定碳被重定向到莽草酸途径来进行芳香化合物的合成。结果表明,由于引入的2-苯乙醇合成双途径和FBR模块的协作在工程蓝藻菌株中产生了一个“陷阱点”,创建了一个强大的“碳流陷阱”,它将碳流重新定向至低通量的莽草酸途径,从而直接从二氧化碳中产生有价值的芳香族化合物。结合基因转录水平测定分析,FBR模块导入后导致了工程菌电子链的重构,使得电子传递、光能捕获的效率提高和代谢流的重定向。这一发现为为提高植物光合效率和人工光合自养体系设计提供了指导。1,3-丙二醇、2-苯乙醇及其衍生物有着广泛的应用,同时在微生物代谢中具有重要的生理作用。本论文通过代谢工程改造微生物,研究了工程菌株进行生物合成过程中异源表达模块的不适配问题及代谢途径的可塑性。本论文研究的开展,有助于提升我们对光合生产不适配和代谢途径可塑性的了解,并将为代谢工程改造微生物合成其他目标化合物提供帮助。
潘多涛[4]（2019）在《克雷伯氏杆菌发酵甘油生产1，3-丙二醇过程的代谢分析与优化》文中认为生物经济的蓬勃发展对以生产生物质化学品为代表的生物炼制提出了更高的要求。1,3-丙二醇（1,3-PD）是重要的化工原料,广泛应用于各个行业。近30年来,生物法发酵甘油生产1,3-PD备受人们关注,其具有绿色环保、可再生及废弃物资源化等优势,但相比于传统的化学生产方法,仍不具有成本优势,目前亟待解决的问题是甘油转化率和生产强度仍然不理想。本文针对克雷伯氏杆菌发酵甘油生产1,3-PD的过程,通过数学建模分析对其代谢过程进行了深入研究,预测发酵过程的动态行为,并提出优化控制策略,主要的研究内容如下:首先,将基因组尺度的通量平衡分析与胞外代谢物的动力学模型结合,构建了基于动态通量平衡分析的优化方法。经过计算分析获得了拓展的代谢途径,几个新增的重要节点包括:在二羟基丙酮（DHA）节点引入了能为系统提供更多还原当量的磷酸戊糖途径（PPP）;在3-磷酸甘油酸（3PG）节点存在合成氨基酸的支路;在三羧酸循环（TCA）中的α-酮戊二酸节点引入谷氨酸以及其他氨基酸的合成代谢途径,构建了更完整的通路。在此基础上,重点分析了代谢途径中关键节点支路的动态通量分布与1,3-PD产率的关系:DHA进入磷酸戊糖途径的动态通量变化与1,3-PD产率呈正相关;TCA循环途径中通量变化与产率成正相关。此外,发现TCA循环通过α-酮戊二酸和半胱氨酸与其他代谢途径形成复杂的耦合关系,与1,3-PD的产率构成相关性;氨基酸合成代谢途径中,辅酶四氢叶酸构成的反馈循环会对TCA的通量变化产生干扰。其次,利用整体建模方法克服发酵过程模型的不确定性,提高了模型的预测性能。通过灵敏度分析,确定对模型影响较大的参数作为整体建模的调节参数;经过对比选定适合的模型误差阈值,在可适范围内利用均匀采样方法生成尽可能多的等效参数集合,在并行计算的基础上开展整体建模的应用。结果显示,在连续发酵过程中,整体建模的预测值与实验测量值的平均相对误差由原来的11.90%降低为7.95%,显着优于常规单参数模拟结果,表明该方法能够有效提高模型预测能力。此外,分别确定了最优生产强度和产率以及对应的操作条件:在间歇过程中,最大生产强度为37.45 mmol·L-1·h-1、产率为0.70 mol·mol-1,对应的初始甘油浓度分别是1020 mmol·L-1和1070 mmol·L-1;在连续过程中,最大生产强度为93.94 mmol·L-1·h-1,对应的最佳操作条件是初始甘油浓度为780 mmol·L-1、稀释速率为0.23 h-1,而最优产率为0.68 mol·mol-1,对应的初始甘油浓度为880 mmol·L-1、稀释速率为 0.09 h-1。最后,通过数学函数连续性分析深入研究了单罐、双罐连续发酵的多稳态及振荡特性。在不同的初始甘油浓度或稀释速率下,系统均会出现多稳态现象,并通过双因素分析,得到多稳态出现的临界区域,该区域内部的稳态是不稳定的。之后,采用数学规划方法对双罐发酵过程中的两级稀释速率及初始甘油浓度进行了优化,得到了最佳操作条件:初始甘油浓度为900 mmol·L-1,#1反应器的稀释速率为0.21 h-1,#2反应器的稀释速率为1.37 h-1。此外,基于反馈控制理论,设计优化了受残余甘油和产物1,3-PD浓度影响的稀释速率控制策略,可作为实践中连续培养的进料方案。控制稀释速率可提高产物浓度,同时极大地缩短了系统达到稳定所需的时间。在单罐和双罐发酵过程中,调整时间分别从77.82/53.66 h缩短到31.24/22.68 h,可显着降低发酵初期阶段甘油的损耗,同时提高了生产强度。综上所述,通过数学模拟对克雷伯氏杆菌的甘油代谢途径的深入分析,克服了模型的不确定性,提高了模型的预测能力,优化控制发酵过程,这些工作为提高1,3-PD的发酵生产性能提供了理论指导,具有潜在的实践应用价值。
巢美洁[5]（2019）在《缺失D-ldhA的短乳杆菌工程菌的构建及其产1,3-丙二醇发酵优化研究》文中研究说明1,3-丙二醇（1,3-PDO）在工业上存在广泛的应用,特别是作为新型合成材料聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT）的单体,有着无可替代的作用。全球对1,3-PDO的需求逐年在增加。用生物发酵方法产1,3-PDO更适应时代的发展,既能增加1,3-PDO的产量,又可做到生产过程低耗能高环保。本研究为了减少短乳杆菌产1,3-PDO过程中副产物乳酸的产量,提高1,3-PDO产量和甘油转化率,利用同源重组的方法敲除了短乳杆菌的D-ldhA基因。敲除后的短乳杆菌在24 h的乳酸脱氢酶酶活为30.8 U/mL,比原始菌株的酶活下降了34.7%。用2%葡萄糖和2%甘油发酵,在48 h的乳酸产量为10.07 g/L,比未敲除菌株的乳酸产量下降25.8%;1,3-丙二醇的产量和甘油转化率分别为13.26 g/L和0.78 mol/mol,分别提高了33.33%和19.2%。为了提高1,3-PDO的产量和转化率,对敲除D-ldhA的短乳杆菌的发酵碳源和氮源进行优化。结果显示短乳杆菌工程菌在葡萄糖或果糖作为甘油发酵的共碳源时效果最好;而酵母提取物和蛋白胨按等量组合作为氮源效果较好;甘油和葡萄糖按等量各20 g/L发酵产1,3-PDO的效果最佳。在优化条件下发酵1,3-PDO的最大产量和甘油转化率分别为16.43g/L和0.83 mol/mol。采用分批补料发酵进一步提高1,3-PDO的总产量和转化率,48 h时1,3-PDO的产量达到最大为28.19 g/L,甘油转化率为0.87 mol/mol,生产效率为0.59 g·L-1·h-1。副产物乳酸和乙酸的产量最大为13.44 g/L和12.75 g/L。
杨苗苗[6]（2019）在《酪酸梭菌的诱变育种及其1,3-丙二醇的发酵与耐受机制的研究》文中进行了进一步梳理1,3-丙二醇（1,3-propanediol,1,3-PD）是一种重要的化学品,在食品、药品、化工等领域具有广泛应用。微生物合成法是一种成本低廉、环境友好的新型合成方法,但天然的1,3-PD生产菌株都面临产物耐受性低、副产物对原菌的毒性等问题。Clostridium butyricum作为其中一种生产菌株,具有菌种为益生菌和不需要昂贵辅酶添加的优势。本研究针对C.butyricum转化甘油生产1,3-PD中的产物低耐受性问题,对原始菌株进行了NTG和ARTP相结合的物理化学复合诱变的方法,获得了一株1,3-PD高耐受菌株;随后,利用C.butyricum高耐受菌株发酵生产1,3-PD,优化了甘油转化1,3-PD的条件。最后,对原始株和突变株进行多组学的分析,挖掘与1,3-PD耐受性相关的基因与蛋白,初步验证部分蛋白质的功能。主要的研究结果如下:（1）采用一系列1,3-PD浓度确定了原始菌株C.butyricum XYB11的初始耐受性,随后利用NTG和ARTP的物理化学复合诱变,得到了突变株C.butyricum YP855,其1,3-PD耐受性相比原始出发菌株提高了30.8%。（2）采用单因素法和响应面法对突变株C.butyricum YP855进行1,3-PD分批发酵条件的优化,得到1,3-PD分批发酵的最佳条件为:甘油浓度81.0 g/L,酵母提取物浓度1.6 g/L,发酵时间为21.7 h,发酵温度为36.7℃。在最佳条件下进行1,3-PD的分批发酵,得到1,3-PD的最终产量为37.20 g/L,产率为0.51 g/g,生产强度为1.71 g/（L·h）,比原始菌株分别提高了29.48%、18%和29%。（3）对C.butyricum XYB11进行了全基因组的测序,预测并注释了基因结构与功能;将C.butyricum XYB11原始株和突变株进行组学分析,结合全基因组测序结果,由转录组学数据获得了差异表达的基因,由蛋白组学数据得到了差异表达的蛋白,通过转录组学和蛋白组学的联合分析,开展了差异基因和差异蛋白的GO类别、KEGG代谢通路等富集分析与比较,并从功能的角度分析关键基因和蛋白与C.butyricum的1,3-PD耐受性关系,初步筛选得到7个可能与C.butyricum的1,3-PD耐受性相关的关键基因,从而用于后续基因功能的初步验证。（4）从C.butyricum XYB11中克隆得到上述的7个关键基因,利用无缝克隆技术成功构建了7个重组质粒pET-gene,转化各个重组质粒,在E.coli中成功表达了这些蛋白,对各个重组菌1,3-PD的耐受性进行了检测,初步验证了这些关键蛋白的功能,得知组氨酸激酶、ABC转运器、异柠檬酸脱氢酶和甲基接受化学趋向性蛋白可能与C.butyricum的1,3-PD耐受性相关。结合多组学结果,分析了筛选出的关键蛋白与耐受性相关的可能分子机制。
沈俊涛[7]（2019）在《基于CRISPR-Cas的肺炎克雷伯杆菌的噬菌体抗性：生物信息学分析和工程菌构建》文中认为噬菌体感染是微生物发酵工业面临的一个棘手问题,至今仍无良策。本研究致力于探索基于CRISPR-Cas技术的噬菌体感染问题的解决方案。本文以肺炎克雷伯杆菌为例,从噬菌体的分离与分析开始,探究了天然CRISPR-Cas系统与（前）噬菌体之间的相互作用关系,建立了基于CRISPR-Cas9的噬菌体基因组编辑技术,探索了增强CRISPR-Cas9的噬菌体抗性水平的方法。本文的研究既包括利用公共数据库中的资源从生物信息学的角度进行的理论分析,也有从实验的角度对相关问题进行的探索论证。主要研究结果如下:首先,对感染肺炎克雷伯杆菌工业发酵菌株的噬菌体进行了分离、生理特性和基因组分析,并考察了噬菌体感染对1,3-丙二醇发酵过程的影响。系统进化树的分析结果显示,噬菌体phiKpS2属于Kp34属肺炎克雷伯杆菌噬菌体,是一类在自然界分布广泛的克雷伯杆菌噬菌体。发酵实验表明,噬菌体感染会导致发酵长时间停滞,发酵周期延长,生产效率降低。此外,发现噬菌体感染对细胞生长和代谢的影响与感染时细胞所处生长阶段有密切关系。其次,对肺炎克雷伯杆菌的CRISPR-Cas系统和前噬菌体进行了系统的生物信息学分析。鉴定出了一种新的Ⅰ型CRISPR亚型,命名为I-E*,并对其基本特征包括在染色体上的位置、基因的组织结构、Cas蛋白、tracrRNA的结构、PAM位点和进化来源等进行了确定;CRISPR间隔序列主要来源于噬菌体、前噬菌体和质粒,提示其主要功能是防止外来遗传元件入侵。揭示了前噬菌体是肺炎克雷伯杆菌基因组可塑性的重要原因之一;在全球范围内流行的CG258型菌株含有较多高度保守的前噬菌体,包括其特有的两个P2-P4噬菌体系统;肺炎克雷伯杆菌染色体上的获得型抗生素抗性基因（aARGs）集中存在于CG258型和CRISPR 阳性菌株中,其中CG258型菌株的aARGs有60%位于前噬菌体区域,而CRISPR 阳性菌株的aARGs仅有10%位于前噬菌体区域,显示CRISPR-Cas系统和CG258的前噬菌体可能分别独立地参与了ARG在染色体上的整合。发现CRISPR-Cas系统和前噬菌体的分布都依赖与菌株的MLST分型,且CRISPR中存在高比例的自我靶向的间隔序列:这些可能是在肺炎克雷伯杆菌中CRISPR-Cas系统对前噬菌体的存在影响有限的原因。接着,对5株潜在肺炎克雷伯杆菌工业菌株的前噬菌体诱导性进行了检测,对其中一株菌的前噬菌体诱导过程进行了定量分析,并对诱导出的两个前噬菌体进行了全基因组分析。实验结果显示,肺炎克雷伯杆菌在丝裂霉素C（MMC）诱导下易发生前噬菌体大量增殖,细胞裂解死亡。其中,肺炎克雷伯杆菌W3的基因组中有2个可诱导的前噬菌体,且存在自发诱导现象。诱导出的噬菌体PKPW3.1和PKPW3.3在NCBI phage数据库中没有同源噬菌体,说明是新的噬菌体类型。对前噬菌体携带的tRNA分析显示,PKPW3.1和PKPW3.3中含有三种tRNA（tRNA-Arg,tRNA-Asn,tRNA-Thr）,是肺炎克雷伯杆菌前噬菌体中最常见的tRNA类型。前噬菌体在基因组中的高丰度、可诱导性及自发诱导性,说明在以肺炎克雷伯杆菌为基础的发酵工业中前噬菌体是导致噬菌体感染的风险因素之一。然后,建立了一种基于CRISPR-Cas9的肺炎克雷伯杆菌噬菌体基因组编辑技术。揭示了30-60 bp的短同源臂可以高效地实现包括点突变、基因删除和插入、移码突变在内的多种遗传操作,从而大大简化了基于CRISPR-Cas的噬菌体基因组编辑中繁琐的模板构建过程。通过对177个sgRNA的预测活性与实际测定活性的相关性分析,证实来源于真核生物的sgRNA预测模型不能用来预测针对噬菌体的sgRNA活性。揭示了低活性的sgRNA也可以用来进行基于同源重组的噬菌体基因组编辑,通过移码突变可以快速的判断噬菌体基因的必需性;并以噬菌体phiKpS2为例,通过移码突变和基因删除等,对其17%的基因的必需性进行了初步验证。最后,分析了针对噬菌体的sgRNA的活性分布,考察了噬菌体从单一靶标和多靶标CRISPR-Cas系统中逃逸的机制,发现通过表达Mu Gam干扰噬菌体DNA双链断裂修复可显着增强CRISPR-Cas系统噬菌体抗性。在针对噬菌体的sgRNA中,活性低的sgRNA数量较多。在177个sgRNA中,活性最低的那部分,即EOP>0.1的sgRNA约占49.7%,而EOP<10-4,即活性最高的那部分sgRNA仅占4.5%。噬菌体有多种逃逸CRISPR-Cas系统的方式,包括非同源末端接合、同源重组和靶向区域的大片度删除。5个sgRNAs串联的多靶标CRISPR-Cas系统可促进靶向区域的大片段删除,但没有显着增强菌株的噬菌体抗性。发现Mu Gam蛋白可显着增强CRISPR-Cas系统噬菌体抗性,且这种增强效应对不同活性的sgRNA均适用。表达Mu Gam后噬菌体逃逸的方式发生了改变,逃逸噬菌体中野生型和发生靶向区域大片段删除的突变体都增加了。未来在对肺炎克雷伯杆菌发酵菌株选育的过程中需要进行前噬菌体的诱导性检测,或考虑开发基于CRISPR-Cas系统的前噬菌体清除技术;另外,通过对噬菌体双链断裂修复机制的深入研究,未来可以设计更好的干扰策略来防止噬菌体逃逸。
张洁[8]（2019）在《利用醛缩酶合成β-羟基-α-氨基酸催化体系的构建及优化》文中研究指明β-羟基-α-氨基酸是一类重要的氨基酸,它和相应的氨基醇不仅本身具有重要的生物活性,还是很多合成生物活性分子的潜在手性结构单元,如抗生素、免疫抑制剂等。目前,工业上主要是通过一系列繁琐的化学方法催化合成β-羟基-α-氨基酸,化学方法不仅立体选择性不足、需要昂贵的前体或手性助剂,而且其反应污染环境。与化学法相比,酶法具有过程简单、条件温和、反应高效、选择性高等优点。在酶法合成β-羟基-α-氨基酸中,D-苏氨酸醛缩酶是重要的生物催化剂,其在合成上的应用研究多集中在化学产生的dl-syn混合物的动力学拆分而不是羟醛缩合反应。因此,从简单的前手性前体甘氨酸和醛开始的一步合成β-羟基-α-氨基酸具有重要意义。本文主要研究内容包括D-苏氨酸醛缩酶催化羟醛缩合反应体系的构建及优化、D-苏氨酸醛缩酶的固定化体系优化和双酶催化合成氨基醇方法的探索。对重组表达D-苏氨酸醛缩酶的基因工程菌进行筛选,获得催化表现相对较好的菌株E.coli BL21（DE3）/pET 28b-AcDTA进行后续实验。利用它的诱导培养物制备冻干菌粉作为生物催化剂,进行全细胞催化羟醛缩合反应,经优化后的全细胞催化工艺如下:以1%-2%添加量的干菌粉为生物催化剂,以50 mM对甲砜基苯甲醛为底物,以500 mM甘氨酸为另一底物,以100μL 5-磷酸吡哆醛为辅酶,以350μL MnCl2为金属离子,以10%的二甲基亚砜作为反应介质构成转化体系,在pH 9.5,30℃,800 rpm条件下进行反应。在优化的条件下,产物得率达到了69.84%,是未优化前的2倍。在工业应用中,廉价稳定的固定化细胞比游离细胞更有价值,因此,利用筛选出来的基因工程菌E.coli BL21（DE3）/pET 28b-AcDTA的诱导培养物制备的冻干菌粉进行聚乙烯亚胺/戊二醛（PEI/GA）交联固定化,经优化后的PEI/GA交联法体系如下:32.5 g/L冻干菌粉,6 g/L硅藻土,2%（v/v）的浓度为5%的聚乙烯亚胺先交联1 h,0.5%（v/v）的25%的戊二醛再交联30 min,在45℃,pH 8.0 0.2M磷酸钠缓冲液中进行固定化。考察固定化细胞的操作稳定性,结果表明在15批次之后其催化活力还能保持在初始的80%左右。此外,还探索了氨基醇的合成新方法——利用醛缩酶和脱羧酶双酶级联催化合成氨基醇。成功构建了表达醛缩酶的重组E.coli BL21（DE3）/pET 28b-PsDTA菌株和表达脱羧酶的E.coli BL21（DE3）/pET 28b-DAPDC菌株。两步酶法催化反应液中产物峰与标样的保留时间一致,初步证明所设想的新方法是可行的。
王闯[9]（2019）在《在重组大肠杆菌中构建丙酮酸依赖的一碳代谢途径用于甲醇和甲醛合成1,3-丙二醇》文中研究指明甲醛（Formaldehyde）是重要的一碳化合物（one-carbon compound,C1）代谢中间体,例如:甲醇（Methanol）,甲烷（Methane）和甲酸（Formate）。这些一碳化合物都可以被转化为甲醛,然后通过中心代谢途径转化为细胞生长所需的物质和能量。目前,甲醇和甲醛的吸收利用主要通过核酮糖单磷酸（RuMP）途径。但是,在合成甲基营养菌中,由于RuMP途径中的甲醛受体（Ru5P）的再生效率低,从而制约了甲醇和甲醛的吸收利用。为了实现甲醇和甲醛一碳化合物的利用以及避免利用RuMP途径,本论文通过筛选高活力的2-氧代-4-羟基丁酸醛缩酶,用于甲醛的固定,并通过结合另外三个酶构建了丙酮酸依赖的一碳代谢途径用于生产1,3-丙二醇（1,3-PDO）。此途径相较于其它1,3-PDO合成途径,具有以下优势:1)一碳化合物直接转化为1,3-PDO的前体,开辟了一条新的一碳生物代谢途径,具有更高的底物利用效率;2)丙酮酸作为甲醛的受体,不需要依赖于甘油,从而避免了外源添加辅酶B12作为甘油脱水的辅助因子;3)途径相比较高丝氨酸依赖的1,3-PDO合成途径,更简短,也更简单,从而避免了复杂的调控。并通过对代谢途径的体内外的研究和途径的优化,使得1,3-PDO产量得到提高。本论文具体研究结果如下:1.挖掘潜在应用价值的醛缩酶用于甲醛的固定:为了避免甲醇和甲醛一碳化合物的利用过于依赖RuMP途径,以及Ru5P再生的问题。通过挖掘潜在应用价值的醛缩酶,我们筛选到了高活性的2-氧代-4-羟基丁酸醛缩酶（KHB）,此酶可以催化甲醛和丙酮酸生成2-氧代-4-羟基丁酸,用于甲醛的固定。并将其应用到新的1,3-丙二醇生物合成途径中。2.甲醛和丙酮酸体外合成1,3-PDO:为验证新提出的代谢途径能否用于1,3-PDO生成。我们首先对此进行体外试验,证实了此代谢途径可以利用甲醛和丙酮酸为底物用于生产1,3-PDO,得到35.3±0.4 mg/L1,3-PDO（无优化）。此外,根据支链-α-酮酸脱羧酶（KDC）对丙酮酸的酶活测定和体外数据的分析,表明KDC与副产物乙酸和乙醇的生成关。3.在重组大肠杆菌中构建新1,3-PDO生物合成途径:为实现甲醇和甲醛在大肠杆菌中合成1,3-PDO,通过利用多基因共表达的策略在重组大肠杆菌中构建了一种丙酮酸依赖的一碳代谢途径用于1,3-PDO合成。通过对蛋白的表达分析,发现途径中的蛋白表达量都比较好,为后续的研究提供了材料基础。4.甲酵或甲醛和葡萄糖体内合成1,3-PDO:通过利用菌株BP3进行批次发酵和补料批次发酵,以甲醛和葡萄糖作为共底物,分别得到35.0±1.5 mg/L 和 298.3±11.4 mg/L 1,3-PDO。通过利用菌株 BP4 进行补料批次发酵,以甲醇和葡萄糖作为共底物,得到3.8mg/L1,3-PDO。证实了此代谢途径可以利用甲醇或甲醛和葡萄糖体内合成1,3-PDO。5.代谢途径的优化:为了对胞内竞争消耗甲醛的途径进行弱化,降低甲酸副产物的生产量。通过利用CRISPR-Cas9技术敲除野生型大肠杆菌中的甲醛脱氢酶A基因（frmA）,构建了菌株BP3AfrmA和BP4△frmA。并对菌株采用补料批次发酵,1,3-PDO的产量分别提高了70.4%（508.3±9.1 mg/L vs 298.3±11.4 mg/L）和 760%（32.7±0.8 mg/L vs 3.8 mg/L）。证实了通过敲除frmA基因可以提高1,3-PDO的产量。
员君华[10]（2018）在《基于酪酸梭菌1,3-丙二醇脱氢酶的基因工程菌构建与1,3-丙二醇的全细胞法生物合成》文中指出1,3-丙二醇（1,3-propanediol,1,3-PD）是一种重要的平台化学品,作为溶剂、抗冻剂,添加剂等广泛应用于食品、医药、化妆品、化工等领域。目前,1,3-PD可以通过化学和生物法合成,由于生物法在经济上具有潜在竞争性并且对环境友好而受到更多的关注。Clostridium butyricum作为益生菌并且含有不需要辅酶B12的甘油脱水酶（glycerol dehydratase,GDHt）,是非常具有吸引力的1,3-PD生产菌株。微生物代谢甘油生物转化成1,3-PD时,1,3-丙二醇脱氢酶（1,3-propanediol dehydrogenase,PDOR）是合成途径中的关键酶,在生物法生产1,3-PD过程中起着重要的作用。有鉴于此,本研究在筛选并鉴定的一株C.butyricum的基础上,克隆其PDOR编码基因,构建PDOR的E.coli基因工程菌,并利用全细胞法研究C.butyricum和基因工程菌的混菌转化甘油生产1,3-PD情况。取得的研究结果如下:（1）通过形态学、生理生化特征,初步筛选鉴定了2株C.butyricum,分别为YJH-09和YJH-12。通过TA克隆获得16S rDNA片段序列,经分子生物学鉴定及构建系统发育树,确定了YJH-09和YJH-12的分类学地位。（2）从筛选的C.butyricum中克隆了编码PDOR的dhaT基因,测序结果显示该基因序列全长为1158bp;利用无缝克隆技术构建了重组质粒pET-dhaT,在E.coli BL21（DE3）中成功表达了dhaT基因,重组PDOR经镍柱亲和层析与超滤纯化,获得清晰特征条带,分子量大小约为46kDa。重组PDOR酶学性质测定结果显示:以丙醛为底物,还原反应的最适温度为37℃,最适pH为9.0,比活力为25.7U/mg,对丙醛的Km为0.36 mM,Vmax为34.59 U/mg,对NADH的Km为0.019mM,Vmax为21.47 U/mg;以1,3-PD为底物,氧化反应最适温度为30℃,最适pH为11.0,比活力为7.9 U/mg,对1,3-PD的Km为2.78 mM,Vmax为9.68 U/mg,对NAD+的Km为0.107 mM,Vmax为7.36 U/mg;不同的底物下,PDOR对一些醛、酮、醇类具有催化能力,其中PDOR对丙醛的还原活力最高,对1,3-PD的氧化活力最高。（3）通过单因素实验优化了全细胞转化实验中影响1,3-PD产量的关键因素,得到最佳转化条件:底物甘油浓度为50g/L、C.butyricumYJH-09和BL21-pET-dhaT菌体比例为1:1、外源NADH的浓度为0.5mM。在以上优化条件下进行C.butyricumYJH-09和BL21-pET-dhaT的全细胞混合转化,30h得到1,3-PD最高产量为25.88g/L,产率为0.54g/g。与原始菌C.butyricum YJH-09相比,1,3-PD产量提高了2倍多。
二、构建基因工程菌生产1,3-丙二醇的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、构建基因工程菌生产1,3-丙二醇的研究进展（论文提纲范文）
（1）高效转化甘油产1，3-丙二醇工程菌的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 1,3-丙二醇研究概况 |
| 1.2 1,3-丙二醇的生产方法 |
| 1.2.1 化学合成法 |
| 1.2.2 生物转化法 |
| 1.3 1,3-丙二醇的生产及市场情况 |
| 1.4 微生物法生产1,3-丙二醇的菌株 |
| 1.5 生产1,3-丙二醇的代谢途径 |
| 1.6 1,3-丙二醇代谢途径的关键酶 |
| 1.6.1 甘油脱水酶的结构及性质 |
| 1.6.2 1,3-丙二醇氧化还原酶的结构及性质 |
| 1.7 1,3-丙二醇代谢途径的外源酶 |
| 1.7.1 1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的结构及性质 |
| 1.7.2 甲酸脱氢酶的结构及性质 |
| 1.8 课题背景及意义 |
| 1.8.1 课题背景 |
| 1.8.2 课题意义 |
| 1.9 课题研究内容 |
| 第2章 重组肺炎克雷伯氏菌的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 仪器与设备 |
| 2.2.3 工具酶与试剂 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.2.5 工程菌的构建 |
| 2.2.6 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE分析 |
| 2.2.7 酶活力测定方法 |
| 2.2.8 重组肺炎克雷伯氏菌发酵方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 重组质粒的构建 |
| 2.3.2 1,3-丙二醇氧化还原酶及其同工酶的核酸序列分析 |
| 2.3.3 甲酸脱氢酶的核酸序列分析 |
| 2.3.4 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE电泳分析 |
| 2.3.5 摇瓶发酵酶活力分析 |
| 2.3.6 厌氧培养瓶发酵 |
| 2.3.7 K.pneumoniae/pET28a-dhat-yqhD-FdhD发酵特性研究 |
| 2.3.8 发酵罐分批补料发酵 |
| 2.3.9 分批补料发酵酶活力分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 重组大肠杆菌的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 工具酶和试剂 |
| 3.2.4 培养基 |
| 3.2.5 分子克隆技术 |
| 3.2.6 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE分析 |
| 3.2.7 酶活力测定方法 |
| 3.2.8 重组菌发酵实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 重组质粒的构建 |
| 3.3.2 甘油脱水酶编码基因的核酸序列分析 |
| 3.3.3 甘油脱水酶及其激活因子的核酸序列分析 |
| 3.3.4 重组菌发酵实验 |
| 3.3.5 酶活力分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 重组大肠杆菌发酵特性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 仪器与设备 |
| 4.2.3 主要溶液的配制 |
| 4.2.4 发酵方法 |
| 4.2.5 生物量测定方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 甘油浓度对重组菌发酵的影响 |
| 4.3.2 酵母浸粉浓度对重组菌发酵的影响 |
| 4.3.3 磷酸二氢钾浓度对重组菌发酵的影响 |
| 4.3.4 维生素B12浓度对重组菌发酵的影响 |
| 4.3.5 诱导条件对重组菌发酵的影响 |
| 4.3.6 重组菌分批补料发酵 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间主要科研成果 |
| 一、发表学术论文 |
| 二、发明专利 |
（2）Klebsiella pneumoniae 2e甘油脱水酶活因子的表达及其催化性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 生物柴油生产副产物-粗甘油 |
| 1.2 1,3-PDO的研究概述 |
| 1.2.1 PTT的研究进展 |
| 1.2.2 1,3-PDO的主要生产菌株 |
| 1.2.3 1,3-PDO的代谢途径 |
| 1.2.4 dha操纵子 |
| 1.3 甘油脱水酶 |
| 1.3.1 甘油脱水酶的种类与结构 |
| 1.3.2 甘油脱水酶的催化机理 |
| 1.4 甘油脱水酶再激活因子 |
| 1.4.1 甘油脱水酶激活酶主要编码基因 |
| 1.4.2 甘油脱水酶的再激活机制 |
| 1.4.3 甘油脱水酶的再激活研究进展 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 酶与试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法与步骤 |
| 2.3.1 orfW和orfY生物信息学分析 |
| 2.3.2 Klebsiella pneumoniae 2e的培养 |
| 2.3.3 甘油脱水酶的提取 |
| 2.3.4 甘油脱水酶活性的测定 |
| 2.3.5 目的基因的克隆与表达纯化 |
| 2.4 甘油脱水酶激活因子酶活检测 |
| 2.5 蛋白质浓度的测定 |
| 2.6 丙醛标准曲线的测定 |
| 2.7 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.9 重组蛋白的理化性质研究 |
| 2.9.1 重组纯化的蛋白浓度测定 |
| 2.9.2 时间对GDHt再激活酶活性的影响 |
| 2.9.3 pH对GDHt再激活酶活性的影响 |
| 2.9.4 温度对GDHt再激活酶活性的影响 |
| 2.9.5 金属离子对GDHt再激活酶活性的影响 |
| 2.10 GDHt再激活因子实时定量PCR(RT-PCR) |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 orfW与orfY基因的生物信息学分析 |
| 3.1.1 orfW的生物信息学分析 |
| 3.1.2 orfY蛋白生物信息学分析 |
| 3.1.3 蛋白质的进化树构建 |
| 3.2 目的基因的克隆与表达纯化 |
| 3.2.1 BCA蛋白质标准曲线 |
| 3.2.2 丙醛标准曲线 |
| 3.3 重组甘油脱水酶激活的理化性质 |
| 3.3.1 orfW基因表达产物的酶功能测定 |
| 3.3.2 orfY基因表达产物的酶功能测定 |
| 3.3.3 orfW和orfY基因表达产物的功能测定 |
| 3.3.4 pH对表达蛋白的影响 |
| 3.3.5 温度对表达蛋白的影响 |
| 3.3.6 不同金属离子对orfW和orfY对甘油脱水酶激活反应的影响 |
| 3.4 实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 粗甘油对微生物代谢生成1,3-PDO的影响 |
| 4.2 甘油脱水酶的再激活机制 |
| 4.3 甘油脱水酶激活因子基因的表达 |
| 5 结论与创新 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 未来展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的主要学术成果 |
| 致谢 |
（3）代谢工程改造微生物生产1,3-丙二醇和2-苯乙醇的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 醇 |
| 1.1.1 常见的醇及其衍生物 |
| 1.2 1,3-丙二醇 |
| 1.2.1 1,3-丙二醇及其应用 |
| 1.2.2 1,3-丙二醇的化学合成方法 |
| 1.2.3 1,3-丙二醇微生物合成方法 |
| 1.2.4 代谢工程在1,3-丙二醇生产中的应用 |
| 1.3 2-苯乙醇 |
| 1.3.1 2-苯乙醇及其应用 |
| 1.3.2 苯乙醇的天然合成途径 |
| 1.3.3 2-苯乙醇的物理提取法 |
| 1.3.4 苯乙醇的化学合成法 |
| 1.3.5 微生物合成方法 |
| 1.4 本课题的研究目的和意义 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 代谢工程改造产酸克雷伯氏菌提高1,3-丙二醇的生产 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 菌株与质粒 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.2.5 K.oxytoca突变株的构建 |
| 2.2.6 质粒的构建 |
| 2.2.7 产酸克雷伯氏菌突变株的构建 |
| 2.2.8 K.oxytoca发酵条件 |
| 2.2.9 分析方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 K.oxytoca PDL-0 的底物/产物耐受及发酵产物分析 |
| 2.3.2 乳酸途径失活突变株的构建 |
| 2.3.3 乳酸途径失活对1,3-丙二醇生产的影响 |
| 2.3.4 乙醇途径失活突变株的构建 |
| 2.3.5 乙醇途径失活对1,3-丙二醇生产的影响 |
| 2.3.6 2,3-丁二醇合成途径失活突变株的构建 |
| 2.3.7 2,3-丁二醇途径失活对1,3-丙二醇生产的影响 |
| 2.3.8 乙酸合成途径失活突变株的构建 |
| 2.3.9 乙酸途径失活对1,3-丙二醇生产的影响 |
| 2.3.10 琥珀酸途径失活突变株PD-6 的构建 |
| 2.3.11 琥珀酸途径失活对1,3-丙二醇生产的影响 |
| 2.3.12 甲酸脱氢酶表达对1,3-丙二醇生产的影响 |
| 2.3.13 表达透明颤菌血红蛋白vgb对1,3-丙二醇生产的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 利用异形胞加强1,3-丙二醇的光驱动生产 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器与材料 |
| 3.2.1 主要仪器 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 菌株和质粒 |
| 3.2.4 培养基与培养条件 |
| 3.2.5 重组质粒的构建 |
| 3.2.6 S.elongatus PCC7942 重组菌株的构建 |
| 3.2.7 Anabaena PCC7120 重组菌株的构建 |
| 3.2.8 qRT-PCR分析合成途径中基因表达情况 |
| 3.2.9 分析方法 |
| 3.2.10 产物及中间产物对Anabaena PCC7120 的毒性检测 |
| 3.2.11 异型胞染色及观测计数 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 1,3-丙二醇光合生产基因模块的构建及验证 |
| 3.3.2 异型胞分隔加强1,3-丙二醇生产 |
| 3.3.3 Anabaena PCC7120 光合生产1,3-丙二醇的优化 |
| 3.3.4 异型胞中严格厌氧酶的活性 |
| 3.3.5 Anabaena PCC7120 对中间产物和产物的耐受性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 利用光合平台转化CO2合成2-苯乙醇 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 仪器与材料 |
| 4.2.1 主要仪器 |
| 4.3.2 主要试剂 |
| 4.2.3 菌株和质粒 |
| 4.2.4 培养基与培养条件 |
| 4.2.5 重组质粒的构建 |
| 4.2.6 重组菌株的构建 |
| 4.2.7 分析方法 |
| 4.2.8 2-苯乙醇对S.elongatus PCC7942 的毒性检测 |
| 4.2.9 碳固定效率和分配的分析 |
| 4.2.10 光合色素测定 |
| 4.2.11 光合放氧的测定 |
| 4.2.12 转录组测定及分析 |
| 4.2.13 质体醌(plastoquinone,PQ)的测定及分析 |
| 4.2.14 KDC和 PAAS的表达和纯化 |
| 4.2.15 酶活的测定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 2-苯乙醇光合生产途径的构建及验证 |
| 4.3.2 用解反馈抑制模块将碳流定向至莽草酸路径 |
| 4.3.3 FBR模块引入在碳同化和芳烃生物合成方面的影响 |
| 4.3.4 电子传递链的重塑和光合速率的提高 |
| 4.3.5 内源和外源乙醇脱氢酶对2-苯乙醇合成的提高 |
| 4.3.6 S.elongatus PCC7942对2-苯乙醇的耐受性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 总结 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文情况 |
（4）克雷伯氏杆菌发酵甘油生产1，3-丙二醇过程的代谢分析与优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 1,3-丙二醇的生产 |
| 1.2.1 化学法 |
| 1.2.2 生物法 |
| 1.2.3 发酵策略 |
| 1.3 甘油代谢动力学 |
| 1.3.1 系统生物学概述 |
| 1.3.2 甘油代谢工程 |
| 1.3.3 发酵过程建模 |
| 1.4 模型分析与优化控制 |
| 1.4.1 代谢通量分析 |
| 1.4.2 通量平衡分析 |
| 1.4.3 动态通量平衡分析 |
| 1.4.4 整体建模 |
| 1.4.5 分支分析 |
| 1.4.6 优化控制 |
| 1.5 研究思路 |
| 2 克雷伯氏杆菌发酵甘油过程的动态通量平衡分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 代谢途径拓展总览 |
| 2.3.1 底物过量条件下的动态通量分布 |
| 2.3.2 底物限制条件下的动态通量分布 |
| 2.4 关键节点通量对代谢的影响 |
| 2.4.1 二羟基丙酮(DHA)节点通量对代谢的影响 |
| 2.4.2 3-磷酸甘油酸(3PG)节点通量对代谢的影响 |
| 2.4.3 三羧酸循环(TCA)通量对代谢的影响 |
| 2.5 TCA中耦合途径对代谢的影响 |
| 2.5.1 α-酮戊二酸(Akg)的耦合途径 |
| 2.5.2 半胱氨酸(Cys)的耦合途径 |
| 2.6 节点分支通量分配对代谢的影响 |
| 2.7 本章小结 |
| 3 克雷伯氏杆菌发酵甘油产1,3-丙二醇过程的整体建模优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 模型的来源 |
| 3.2.2 整体建模等效参数的筛选 |
| 3.2.3 优化方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 参考参数的来源及特性 |
| 3.3.2 等效参数集合的筛选 |
| 3.3.3 等效参数的特性及预测性能分析 |
| 3.3.4 发酵过程的优化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 双反应器串联发酵过程的多稳态分析与优化控制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 模型的来源 |
| 4.2.2 稳态参数分支分析 |
| 4.2.3 操作条件优化 |
| 4.2.4 优化控制 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 单罐发酵过程的多稳态特性 |
| 4.3.2 单罐发酵过程的优化控制 |
| 4.3.3 双罐串联发酵过程的多稳态特性 |
| 4.3.4 双罐串联发酵过程的操作条件优化 |
| 4.3.5 双罐串联发酵过程的优化控制 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录代谢网络反应 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（5）缺失D-ldhA的短乳杆菌工程菌的构建及其产1,3-丙二醇发酵优化研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 1,3-丙二醇的理化性质和生产现状 |
| 1.2 1,3-丙二醇的用途 |
| 1.3 1,3-丙二醇的生产方法 |
| 1.4 甘油的应用及生产状况 |
| 1.5 短乳杆菌 |
| 1.6 发酵工艺的优化 |
| 1.7 研究目的、意义和内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 结果和分析 |
| 3.1 D-ldhA敲除 |
| 3.2 CICC6239-dldhA发酵培养基优化 |
| 3.3 优化条件下的分批发酵和补料分批发酵 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 D-ldhA基因敲除及敲除后对短乳杆菌发酵的影响 |
| 4.2 优化CICC6238-dldhA菌株产1,3-丙二醇的发酵培养基 |
| 4.3 优化培养的分批发酵和分批补料发酵 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 引物序列 |
| 附录二 基因序列 |
| 附录三 英文缩写 |
| 在校期间发表论文 |
| 致谢 |
（6）酪酸梭菌的诱变育种及其1,3-丙二醇的发酵与耐受机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 底物和产物概述 |
| 1.1.1 甘油 |
| 1.1.2 1.3 -丙二醇 |
| 1.2 甘油到1,3-丙二醇的生物合成 |
| 1.2.1 合成代谢途径 |
| 1.2.2 合成中的代谢局限 |
| 1.2.3 代谢局限的解决方案 |
| 1.3 常压室温等离子体诱变法 |
| 1.3.1 等离子体简介及诱变机理 |
| 1.3.2 ARTP在生物领域的应用 |
| 1.4 组学的运用 |
| 1.4.1 基于核酸测序的基因组和转录组学技术 |
| 1.4.2 基于iTRAQ定量的蛋白组学技术 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 1.6 主要研究内容 |
| 第二章 酪酸梭菌的诱变及1,3-丙二醇高耐受菌株的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.2.3 培养基的配制 |
| 2.2.4 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 酪酸梭菌对1,3-丙二醇耐受性的检测 |
| 2.3.2 酪酸梭菌的化学诱变方法 |
| 2.3.3 常压室温等离子体诱变致死曲线的绘制 |
| 2.3.4 酪酸梭菌的常压室温等离子体诱变方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 酪酸梭菌原始株的1,3-丙二醇耐受性 |
| 2.4.2 酪酸梭菌的化学诱变结果与突变株的筛选 |
| 2.4.3 常压室温等离子体诱变参数优化 |
| 2.4.4 酪酸梭菌的复合诱变结果与突变株的筛选 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 酪酸梭菌突变株1,3-PD发酵条件优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 培养基的配制 |
| 3.2.4 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 单因素法优化1,3-丙二醇发酵的实验设计 |
| 3.3.2 响应面法优化1,3-丙二醇发酵的实验设计 |
| 3.3.3 分批发酵方法 |
| 3.3.4 发酵液成分分析方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 标准样品的液相结果及标准曲线 |
| 3.4.2 单因素法优化1,3-丙二醇分批发酵结果 |
| 3.4.3 响应面法优化1,3-丙二醇分批发酵结果 |
| 3.4.4 优化结果的验证试验 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 酪酸梭菌突变株耐受机制的多组学研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 试剂与仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 测序样品制备方法 |
| 4.3.2 组学实验流程与步骤 |
| 4.3.3 多组学数据联合分析方法 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 全基因组测序结果 |
| 4.4.2 转录组测序结果 |
| 4.4.3 蛋白组测定结果 |
| 4.4.4 联合组学数据生物信息学分析结果 |
| 4.4.5 初步筛选出的关键基因 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 酪酸梭菌组学分析的初步验证 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌株及质粒 |
| 5.2.2 酶及试剂 |
| 5.2.3 培养基的配制 |
| 5.2.4 仪器设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 关键基因的克隆 |
| 5.3.2 重组质粒的构建与转化 |
| 5.3.3 关键基因的表达与检测 |
| 5.3.4 重组菌株的1,3-丙二醇耐受性验证 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 关键基因的扩增结果 |
| 5.4.2 重组质粒的验证 |
| 5.4.3 表达产物蛋白检测 |
| 5.4.4 工程菌的1,3-丙二醇的耐受性 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 主要创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的学术论文及其他科研成果 |
（7）基于CRISPR-Cas的肺炎克雷伯杆菌的噬菌体抗性：生物信息学分析和工程菌构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩写表 |
| 主要符号表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 噬菌体 |
| 1.1.1 噬菌体研究简史 |
| 1.1.2 噬菌体的感染和繁殖机制 |
| 1.1.3 噬菌体与宿主之间的相互作用 |
| 1.1.3.1 宿主的噬菌体抗性机制 |
| 1.1.3.2 噬菌体的适应机制 |
| 1.1.4 噬菌体的宿主谱 |
| 1.2 前噬菌体 |
| 1.3 CRISPR-Cas系统 |
| 1.4 肺炎克雷伯杆菌 |
| 1.4.1 肺炎克雷伯杆菌感染与防治 |
| 1.4.2 肺炎克雷伯杆菌生产生物基化学品的研究进展 |
| 1.4.3 肺炎克雷伯杆菌的噬菌体、前噬菌体及CRISPR-Cas系统 |
| 1.5 工业发酵过程中的噬菌体感染与防治 |
| 1.5.1 噬菌体感染及危害 |
| 1.5.2 噬菌体感染防治现状 |
| 1.5.2.1 污染源的控制 |
| 1.5.2.2 菌株轮换使用 |
| 1.5.2.3 传统的基因工程策略 |
| 1.5.3 基于CRISPR-Cas系统的噬菌体抗性策略 |
| 1.6 论文选题及设计思想 |
| 2 一株感染产1,3-丙二醇克雷伯杆菌的噬菌体的分离与分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验使用的菌株、噬菌体及实验条件 |
| 2.2.2 噬菌体的分离与纯化 |
| 2.2.3 噬菌体形态的透射电镜测定 |
| 2.2.4 噬菌体基因组提取和限制性内切酶分析 |
| 2.2.5 噬菌体最佳感染复数的测定 |
| 2.2.6 噬菌体吸附速率的测定 |
| 2.2.7 噬菌体一步生长曲线的测定 |
| 2.2.8 噬菌体的温度、pH、紫外照射敏感性测定 |
| 2.2.9 噬菌体效价及发酵产物的分析方法 |
| 2.2.10 噬菌体phiKpS2全基因组测序及基因注释 |
| 2.2.11 生物信息学分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 噬菌体的分离及形态 |
| 2.3.2 噬菌体的限制性内切酶分析 |
| 2.3.3 噬菌体感染动力学 |
| 2.3.4 噬菌体的稳定性 |
| 2.3.5 噬菌体感染对肺炎克雷伯杆菌生长的影响 |
| 2.3.6 噬菌体感染对肺炎克雷伯杆菌发酵产1,3-丙二醇的影响 |
| 2.3.7 噬菌体phiKpS2的基因组注释与分析 |
| 2.3.8 噬菌体phiKpS2的比较基因组分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 肺炎克雷伯杆菌中CRISPR-Cas系统和前噬菌体的生物信息学分析及诱导性前噬菌体的检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验所用菌种及其分型方法 |
| 3.2.2 CRISPR-Cas系统、前噬菌体和抗生素抗性基因的鉴定 |
| 3.2.3 CRISPR-Cas间隔序列来源与系统特征分析 |
| 3.2.4 前噬菌体的诱导 |
| 3.2.5 透射电镜分析 |
| 3.2.6 细菌及噬菌体基因组提取 |
| 3.2.7 基因组测序与注释 |
| 3.2.8 RT-PCR分析 |
| 3.2.9 基因组比对与可视化方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 克雷伯杆菌中CRISPR-Cas系统的多样性和组织结构 |
| 3.3.2 肺炎克雷伯杆菌中CRISPR-Cas新亚型I-E~*的来源分析 |
| 3.3.3 CRISPR间隔序列与克雷伯杆菌MLST型 |
| 3.3.4 CRISPR间隔序列的来源 |
| 3.3.5 肺炎克雷伯杆菌CRISPR系统中存在的自我靶向的间隔序列 |
| 3.3.6 前噬菌体在肺炎克雷伯杆菌中的分布 |
| 3.3.7 肺炎克雷伯杆菌及前噬菌体的比较基因组分析 |
| 3.3.8 CG258型肺炎克雷伯杆菌中几个特征性前噬菌体 |
| 3.3.9 前噬菌体与CRISPR-Cas系统的相互作用 |
| 3.3.10 前噬菌体与染色体编码的抗生素基因的关系 |
| 3.3.11 肺炎克雷伯杆菌前噬菌体可诱导性检测 |
| 3.3.12 前噬菌体诱导性的定量分析 |
| 3.3.13 可诱导前噬菌体的基因组分析 |
| 3.3.14 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 基于CRISPR-Cas9的噬菌体基因组编辑 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细菌、噬菌体和培养条件 |
| 4.2.2 质粒构建方法 |
| 4.2.3 sgRNA活性的评估 |
| 4.2.4 重组噬菌体的分离与分析方法 |
| 4.2.5 数据分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 构建适用于肺炎克雷伯杆菌的SpCas9-sgRNA系统 |
| 4.3.2 评估sgRNA在基于CRISPR-Cas9的噬菌体抗性中的活性 |
| 4.3.3 不同CRISPR靶点的噬菌体突变模式比较 |
| 4.3.4 噬菌体phiKpS2的基因组编辑 |
| 4.3.4.1 通过短同源臂进行噬菌体点突变 |
| 4.3.4.2 通过短同源臂进行噬菌体基因的删除和交换 |
| 4.3.4.3 噬菌体基因的移码突变 |
| 4.3.4.4 弱sgRNA用于噬菌体基因组删除及可能的机制 |
| 4.3.5 通过基因编辑对phiKpS2中几个基因必要性的初步确定 |
| 4.3.6 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 基于CRISPR-Cas9增强细菌噬菌体抗性的策略 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 细菌、噬菌体和培养条件 |
| 5.2.2 sgRNA活性的评估 |
| 5.2.3 质粒构建方法 |
| 5.2.4 重组噬菌体的分离与分析方法 |
| 5.2.5 数据分析方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 sgRNA在噬菌体抗性中的活性分布 |
| 5.3.2 单靶标CRISPR-Cas9系统的噬菌体抗性 |
| 5.3.3 多靶标CRISPR-Cas9系统的噬菌体抗性 |
| 5.3.4 Mu Gam可显着增强CRISPR-Cas9系统的噬菌体抗性 |
| 5.3.5 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（8）利用醛缩酶合成β-羟基-α-氨基酸催化体系的构建及优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 羟醛缩合反应 |
| 1.2 β-羟基-α-氨基酸 |
| 1.2.1 β-羟基-α-氨基酸简介 |
| 1.2.2 羟基-α-氨基酸的合成 |
| 1.3 苏氨酸醛缩酶 |
| 1.3.1 醛缩酶的简介 |
| 1.3.2 苏氨酸醛缩酶 |
| 1.4 固定化 |
| 1.4.1 固定化的概念 |
| 1.4.2 固定化方法 |
| 1.4.3 固定化细胞载体 |
| 1.5 氨基酸脱羧酶 |
| 1.5.1 氨基酸脱羧酶的简介 |
| 1.5.2 二氨基庚二酸脱羧酶 |
| 1.6 本文研究背景、内容及意义 |
| 1.6.1 研究背景及意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 研究目标 |
| 第二章 D-苏氨酸醛缩酶催化不对称合成D-对甲砜基苯基丝氨酸 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 质粒 |
| 2.2.2 试剂与材料 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 缓冲液 |
| 2.2.5 主要仪器及设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 基因挖掘 |
| 2.3.2 重组E.coli BL21(DE3)/pET28b-DTA菌株构建 |
| 2.3.3 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-DTA的诱导表达与纯化 |
| 2.3.4 高效液相色谱检测方法 |
| 2.3.5 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-DTA的筛选 |
| 2.3.6 标准曲线绘制 |
| 2.3.7 游离酶催化不对称合成D-对甲砜基苯基丝氨酸 |
| 2.3.8 底物对甲砜基苯甲醛溶解度的探索 |
| 2.3.9 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-AcDTA催化不对称合成D-对甲砜基苯基丝氨酸 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 重组E.coli BL21(DE3)/pET28b-DTA菌株构建 |
| 2.4.2 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-DTA的诱导表达与纯化 |
| 2.4.3 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-DTA的筛选 |
| 2.4.4 标准曲线测定 |
| 2.4.5 游离酶催化不对称合成D-对甲砜基苯基丝氨酸 |
| 2.4.6 底物对甲砜基苯甲醛溶解度的探索 |
| 2.4.7 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-AcDTA催化不对称合成D-对甲砜基苯基丝氨酸 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 聚乙烯亚胺/戊二醛交联法固定化重组表达醛缩酶的大肠杆菌细胞 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 固定化菌体 |
| 3.2.2 试剂与材料 |
| 3.2.3 培养基 |
| 3.2.4 缓冲溶液 |
| 3.2.5 主要仪器及设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 工程菌的发酵培养 |
| 3.3.2 固定化细胞的反应体系 |
| 3.3.3 固定化体系优化 |
| 3.3.4 固定化菌体的催化体系 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 冻干菌粉除水率 |
| 3.4.2 固定化体系优化 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 双酶催化合成2-氨基-1-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1,3-丙二醇新方法的探索 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 质粒 |
| 4.2.2 试剂与材料 |
| 4.2.3 培养基和缓冲溶液 |
| 4.2.4 主要仪器及设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 基因挖掘 |
| 4.3.2 重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET28b-Ps DTA和 E.coli BL21(DE3)/pET28b-DAPDC的构建 |
| 4.3.3 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-Ps DTA和 E.coli BL21(DE3)/pET28b-DAPDC 的诱导表达 |
| 4.3.4 重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-Ps DTA催化不对称合成2-氨基-2-羧基-1-[4-(甲砜基)苯基]-1,3-丙二醇 |
| 4.3.5 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-DAPDC催化不对称合成2-氨基-1-[4-(甲砜基)苯基]-1,3-丙二醇 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET28b-Ps DTA和 E.coli BL21(DE3)/pET28b-DAPDC的构建 |
| 4.4.2 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-Ps DTA和 E.coli BL21(DE3)/pET |
| 4.4.3 重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-Ps DTA催化不对称合成2-氨基-2-羧基-1-[4-(甲砜基)苯基]-1,3-丙二醇 |
| 4.4.4 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-DAPDC催化不对称合成2-氨基-1-[4-(甲砜基)苯基]-1,3-丙二醇 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 1 作者简历 |
| 2 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 3 参与的科研项目及获奖情况 |
| 学位论文数据集 |
（9）在重组大肠杆菌中构建丙酮酸依赖的一碳代谢途径用于甲醇和甲醛合成1,3-丙二醇（论文提纲范文）
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 甲醇一碳化合物潜在的生物利用价值 |
| 1.2 甲醇生物利用的研究 |
| 1.3 甲醛代谢途径的研究 |
| 1.3.1 甲醛异化途径—谷胱甘肽(GSH)依赖的甲醛脱毒途径 |
| 1.3.2 甲醛同化途径—核酮糖单磷酸途径(RuMP)及其应用 |
| 1.4 醛缩酶的研究进展及其潜在的生物应用价值 |
| 1.5 1,3-丙二醇简介及其合成方法 |
| 1.6 生物法合成1,3-丙二醇的研究进展 |
| 1.7 本论文研究思路及研究意义 |
| 第二章 挖掘具有潜在应用价值的醛缩酶用于甲醛固定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂的配制 |
| 2.2.2 实验菌株与质粒 |
| 2.2.3 实验引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 数据库及分析软件 |
| 2.3.2 大肠杆菌TOP10和BL21(DE3)感受态细胞的制备 |
| 2.3.3 胶回收 |
| 2.3.4 质粒提取 |
| 2.3.5 目的基因的获取 |
| 2.3.6 重组质粒的构建 |
| 2.3.7 alac基因的定点突变 |
| 2.3.8 表达和克隆菌株的构建 |
| 2.3.9 菌株培养条件及基因的诱导表达 |
| 2.3.10 2-氧代-4-羟基丁酸的定性和定量 |
| 2.3.11 分析方法 |
| 2.3.12 醛缩酶的酶活测定 |
| 2.3.13 蛋白纯化及其步骤 |
| 2.3.14 分析方法 |
| 2.3.15 KHB的Km值测定方法 |
| 2.3.16 KHB的甲醛耐受性研究 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 2-氧代-4-羟基丁酸的制备,定性和定量 |
| 2.4.2 重组质粒的构建 |
| 2.4.3 醛缩酶的蛋白表达及酶活力的测定 |
| 2.4.4 KHB的纯化 |
| 2.4.5 KHB的Km值测定 |
| 2.4.6 KHB的甲醛耐受性 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 甲醛和丙酮酸体外合成1,3-丙二醇 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验菌株和质粒 |
| 3.2.2 实验引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 目的基因的获取 |
| 3.3.2 重组质粒的构建 |
| 3.3.3 菌株培养条件及基因的诱导表达 |
| 3.3.4 由甲醛和丙酮酸体外生产1,3-PDO |
| 3.3.5 KDC的酶活测定 |
| 3.3.6 分析方法 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 重组质粒的构建 |
| 3.4.2 菌株E.coli-KDC和E.coli-DhaT的蛋白表达 |
| 3.4.3 由甲醛和丙酮酸体外合成1,3-PDO |
| 3.4.4 KDC的酶活测定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 构建丙酮酸依赖的—碳代谢途径用于体内生产1,3-丙二醇 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 代谢途径的分析 |
| 4.3 实验材料与仪器 |
| 4.3.1 实验菌株与质粒 |
| 4.3.2 实验引物 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 目的基因的获取 |
| 4.4.2 新1,3-PDO生物合成途径的构建 |
| 4.4.3 菌株培养条件及基因的诱导表达 |
| 4.5 实验结果与讨论 |
| 4.5.1 重组质粒的构建 |
| 4.5.2 重组菌株BP3和BP4的蛋白表达 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 甲醇或甲醛和葡萄糖体内合成1,3-丙二醇 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.3 实验菌株和质粒 |
| 5.4 实验方法 |
| 5.4.1 批次发酵和补料批次发酵方法 |
| 5.5 实验结果与讨论 |
| 5.5.1 BP3批次发酵和补料批次发酵合成1,3-PDO |
| 5.5.2 BP4补料批次发酵合成1,3-PDO |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 代谢途径的优化 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与仪器 |
| 6.2.1 实验菌株与质粒 |
| 6.2.2 实验引物 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 CRISPR-Cas9技术构建E.coli BL21(DE3)△frmA菌株 |
| 6.3.2 大肠杆菌CRISPR-Cas9操作说明 |
| 6.3.3 pREDCas9转入E.coli BL21(DE3)感受态 |
| 6.3.4 pGRB-sg-frmA质粒构建 |
| 6.3.5 构建donor dsDNA |
| 6.3.6 制备E.coli BL21(DE3)-pREDCas9感受态 |
| 6.3.7 pGRB-sg-frmA质粒和donor dsDNA电转入E.coli BL21(DE3)-pREDCas9 |
| 6.3.8 消除pGRB-sg-frmA质粒 |
| 6.3.9 消除pREDCas9质粒 |
| 6.3.10 制备E.coli BL21(DE3)△frmA感受态 |
| 6.3.11 补料批次发酵方法 |
| 6.3.12 ~(13)C-甲醛同位素标记 |
| 6.4 实验结果与讨论 |
| 6.4.1 构建E.coli BL21 (DE3)△frmA菌株 |
| 6.4.2 补料批次发酵合成1,3-PDO |
| 6.4.3 利用~(13)C-甲醛同位素标记物验证代谢途径的可行性 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 论文主要结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 导师和作者简介 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 附件 |
（10）基于酪酸梭菌1,3-丙二醇脱氢酶的基因工程菌构建与1,3-丙二醇的全细胞法生物合成（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 1 ,3-丙二醇概述 |
| 1.1.1 1 ,3-丙二醇理化特性 |
| 1.1.2 1 ,3-丙二醇的应用 |
| 1.1.3 1 ,3-丙二醇的生产方法 |
| 1.2 生物转化法生产1,3-丙二醇 |
| 1.2.1 1 ,3-PD的天然生产菌 |
| 1.2.2 1 ,3-PD的生物合成途径 |
| 1.2.3 生物合成途径中的关键酶及基因 |
| 1.3 1 ,3-丙二醇脱氢酶 |
| 1.3.1 PDOR的性质特点 |
| 1.3.2 PDOR的克隆表达 |
| 1.3.3 PDOR的晶体结构 |
| 1.4 生物法生产1,3-PD的研究进展 |
| 1.4.1 微生物发酵 |
| 1.4.2 酶法 |
| 1.4.3 全细胞转化法 |
| 1.5 生产1,3-PD微生物菌种资源开发 |
| 1.5.1 天然生产菌及其改良菌生产1,3-PD |
| 1.5.2 大肠杆菌作为异源宿主生产1,3-PD |
| 1.5.3 其他菌种作为异源宿主生产1,3-PD |
| 1.6 本课题研究的目的与意义 |
| 1.7 主要研究内容 |
| 第二章 酪酸梭菌的筛选及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 样品采集及试验试剂 |
| 2.2.2 菌株和质粒 |
| 2.2.3 培养基的配制 |
| 2.2.4 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌种富集及分离纯化 |
| 2.3.2 菌落及显微形态观察 |
| 2.3.3 生理生化鉴定 |
| 2.3.4 16 SrDNA分子生物学鉴定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 菌落形态观察 |
| 2.4.2 生理生化特征 |
| 2.4.3 16 SrDNA分子鉴定及系统发育树的构建 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 酪酸梭菌1,3-丙二醇脱氢酶基因的克隆与表达及酶学性质研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 主要酶和试剂 |
| 3.2.3 培养基的配制 |
| 3.2.4 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 PDOR编码基因的提取及鉴定 |
| 3.3.2 重组质粒的构建及转化 |
| 3.3.3 dhaT的表达 |
| 3.3.4 PDOR的纯化 |
| 3.3.5 PDOR酶活测定 |
| 3.3.6 酶学性质测定 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 重组质粒的构建 |
| 3.4.2 PDOR编码基因的序列分析 |
| 3.4.3 表达产物蛋白电泳分析 |
| 3.4.4 PDOR的纯化及酶活力测定 |
| 3.4.5 PDOR的酶学性质 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 酪酸梭菌及基因工程菌全细胞混合转化甘油生产1,3-PD研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.2.3 培养基、试剂的配制 |
| 4.2.4 仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 种子液的制备 |
| 4.3.2 制备全细胞 |
| 4.3.3 全细胞混合生产1,3-PD的转化条件优化 |
| 4.3.4 全细胞混合转化生产1,3-PD |
| 4.3.5 1 ,3-PD含量测定 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 标准曲线的绘制及HPLC图 |
| 4.4.2 底物浓度对全细胞转化的影响 |
| 4.4.3 C.butyricumYJH-09和BL21-pET-dhaT的混合质量比对全细胞转化的影响 |
| 4.4.4 辅酶NADH的添加量对全细胞转化的影响 |
| 4.4.5 全细胞混合转化 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的学术论文及其他科研成果 |
| 附录 |
四、构建基因工程菌生产1,3-丙二醇的研究进展（论文参考文献）
- [1]高效转化甘油产1，3-丙二醇工程菌的构建[D]. 王艳霞. 齐鲁工业大学, 2021(10)
- [2]Klebsiella pneumoniae 2e甘油脱水酶活因子的表达及其催化性质研究[D]. 蒋欢. 中南林业科技大学, 2020(02)
- [3]代谢工程改造微生物生产1,3-丙二醇和2-苯乙醇的研究[D]. 刘洪玉. 上海交通大学, 2019(06)
- [4]克雷伯氏杆菌发酵甘油生产1，3-丙二醇过程的代谢分析与优化[D]. 潘多涛. 大连理工大学, 2019(06)
- [5]缺失D-ldhA的短乳杆菌工程菌的构建及其产1,3-丙二醇发酵优化研究[D]. 巢美洁. 暨南大学, 2019(02)
- [6]酪酸梭菌的诱变育种及其1,3-丙二醇的发酵与耐受机制的研究[D]. 杨苗苗. 江苏大学, 2019(02)
- [7]基于CRISPR-Cas的肺炎克雷伯杆菌的噬菌体抗性：生物信息学分析和工程菌构建[D]. 沈俊涛. 大连理工大学, 2019(01)
- [8]利用醛缩酶合成β-羟基-α-氨基酸催化体系的构建及优化[D]. 张洁. 浙江工业大学, 2019(02)
- [9]在重组大肠杆菌中构建丙酮酸依赖的一碳代谢途径用于甲醇和甲醛合成1,3-丙二醇[D]. 王闯. 北京化工大学, 2019(06)
- [10]基于酪酸梭菌1,3-丙二醇脱氢酶的基因工程菌构建与1,3-丙二醇的全细胞法生物合成[D]. 员君华. 江苏大学, 2018(02)