一、水稻苯丙氨酸氨解酶基因在大肠杆菌BL21 DE3中的表达（论文文献综述）
郑蓓[1]（2021）在《苦荞16 kDa过敏原Fag t 2结构与功能研究》文中研究说明荞麦富含氨基酸均衡的蛋白质和高生物活性的黄酮类物质,是我国西部地区重要的药粮兼用特色作物之一。荞麦是主要的食品过敏源之一,很多国家规定食品标签要强制性标示荞麦成分。荞麦食品中能够引起致敏的物质是籽粒中的过敏蛋白,这些过敏蛋白的存在极大地限制了荞麦作为功能食品原料的添加范围。因此降低荞麦过敏蛋白的含量、培育低过敏性品种,已经成为目前荞麦生产实践中急需解决的问题。现代生物学技术为低过敏性种质的创制奠定了技术基础,但首要前提是必须明确荞麦主要过敏原的生物学功能。目前,国内外有关荞麦过敏原的研究主要包括天然过敏原的分离和鉴定、免疫活性检测、核心表位预测与分析及过敏反应快速检测等方面,缺乏过敏蛋白生物学功能的相关研究。本实验室前期在苦荞中鉴定获得了分子量为16 k Da过敏蛋白（Fag t 2）,证明其是苦荞最主要的过敏原,并对Fag t 2的免疫活性、核心表位等方面进行了探究。本研究在已有的研究结果的基础上,以九江苦荞为材料,通过体内和体外实验对苦荞16 k Da过敏原Fag t 2的结构和功能进行探究,以期为苦荞低过敏性种质创制的可行性提供基础信息。获得的主要研究结果如下:（1）Fag t 2位于苦荞7号染色体,该基因无内含子。Fag t 2的组织特异性表达分析显示Fag t 2在种子中的转录水平显着高于其他组织器官。结构预测分析显示,过敏原Fag t 2含有19个氨基酸的信号肽序列和α-淀粉酶抑制剂结构域。天然的和异源表达（毕赤酵母和大肠杆菌表达系统）的Fag t 2均具有热稳定性和胃蛋白酶耐受性,但对苦荞萌发种子中的α-淀粉酶和猪源胰淀粉酶均无抑制活性。以原核表达的Fag t 2为抗原制备高效价的兔抗Fag t 2多克隆抗体。15N、13C非放射性同位素双标记原核表达的Fag t 2经包涵体复性及核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance,NMR）分析没有获得可以解析的蛋白结构,可能原因是原核表达获得的双标记Fag t 2中10个Cys可能存在不正确二硫键的形成,造成与天然的Fag t 2结构存在差异或者该蛋白存在高度可变的柔性区,原核表达获得Fag t 2不能用于NMR进行结构解析。（2）Fag t 2编码区上游1873 bp启动子元件预测显示其存在JA、ABA、干旱和病原菌胁迫等响应元件,启动子5’端存在5个种子特异性表达元件。融合gus的不同启动子截短体稳定转化拟南芥,GUS染色和活性测定显示,全长启动子Fag t 2-P1（-1873bp-0）具有种子特异启动子的特征。随着启动子5’端的截短,即种子特异性元件的减少,gus在叶片、花和根等组织中的表达逐渐增加。启动子活性分析显示,截短的Fag t 2-P2（-1564 bp-0）活性显着高于Fag t 2-P1、Fag t 2-P3（-1125 bp-0）和Fag t 2-P4（-302 bp-0）启动子截短体,推测Fag t 2-P1截去的片段可能含有抑制启动子活性的元件。各启动子稳定转化拟南芥株系对于激素的响应表现出一定的差异。各启动子在萌发期均响应ABA和Me JA,不响应GA;Fag t 2-P2和Fag t 2-P3对三种激素均有响应（幼苗）。Fag t 2-P1和Fag t 2-P2启动子在萌发期能够响应甘露醇。酵母单杂交筛选获得的转录因子及启动子对非生物胁迫响应结果显示Fag t 2可能在胁迫耐受性等生理过程发挥生物学功能。（3）基于SMART技术构建苦荞酵母双杂交文库;酵母双杂交文库筛选显示Fag t 2可与苯丙氨酸解氨酶（PAL）、E3泛素蛋白连接酶ARI2和丝氨酸蛋白激酶等功能蛋白发生互作。体外条件下,天然的和毕赤酵母表达的Fag t 2均可激活苦荞中的两种苯丙氨酸解氨酶（Ft PALB和Ft PALN）的活性;以原核表达Ft PALB为抗原制备高效价兔抗PAL多克隆抗体。采用DOCKing预测、Pull down、共定位和Bi FC等方法进一步证明Fag t 2与Ft PAL存在物理互作。（4）构建植物双元表达载体并获得稳定遗传的Fag t 2过表达拟南芥（Fag t2-OE）。对野生型、阴性对照（p CAMBIA3301空载体转化株系）和Fag t 2-OE拟南芥进行干旱胁迫分析显示,干旱胁迫后Fag t 2-OE拟南芥存活率、体内的相对含水量、总黄酮含量和CAT活性显着高于野生型和阴性对照株系,MDA、O2-和H2O2含量低于野生型和阴性对照株系,结果表明过表达Fag t 2的拟南芥对干旱胁迫的耐受性增加。干旱胁迫后Fag t 2-OE植株叶片中At PAL1的转录水平显着高于野生型和阴性对照株系;对不同时期叶片中PAL活性测定显示,过表达Fag t 2的拟南芥叶片中的PAL活性显着高于野生型,苗龄超过7天后,PAL活性均呈现整体下降趋势。苗龄≥45天的Fag t 2-OE及野生型植拟南芥片中均未检测到PAL活性。结合Western blotting检测显示PAL存在高度泛素化修饰,PAL的泛素化修饰程度与其活性具有显着负相关性（相关系数r为-0.9392）。成株期叶片中PAL翻译后的泛素化修饰可能是活性丧失的主要原因,PAL翻译后水平的泛素化不仅可能导致后续的降解,也可能直接导致失活。体外泛素化分析显示Fag t 2并不影响PAL的泛素化,Fag t 2提高PAL活性不依赖于对PAL泛素化的抑制。（5）过表达Fag t 2的拟南芥对人参土芽孢杆菌具有抗性。接种人参土芽孢杆菌的Fag t 2-OE拟南芥的种子萌发率和幼苗存活率显着高于野生型,体内细菌数量显着低于野生型。Fag t 2-OE拟南芥中At PAL1基因和SA信号通路的病程相关基因的转录水平均增加但均显着低于野生型,表现出过表达Fag t 2拟南芥植株的SA信号通路受抑制。过表达Fag t 2的拟南芥细菌抗性水平的提高不依赖于SA信号通路。以上研究结果显示苦荞主要过敏蛋白Fag t 2能与PAL互作并激活PAL的活性,其在干旱胁迫耐受及病原抗性中发挥重要的功能。因此通过基因工程方法简单敲除或者突变苦荞Fag t 2极可能导致苦荞基础性抗性的降低或丧失。深入分析Fag t 2功能与过敏原表位之间的关系,对于理性通过基因敲除或突变获得低过敏性苦荞种质有重要意义。同时,研究中发现成株期叶片存在黄酮类产物的累积但无PAL活性的现象很可能与PAL的泛素化有关,结果有望揭示PAL翻译后快速调控的新机制。
杨竣茹[2]（2021）在《基于转录组学银杏黄酮醇合成酶FLS基因的筛选、克隆和表达分析》文中研究说明银杏（Ginkgo biloba L.）是一种出现在二叠纪的古老植物,在地球上已有2.5亿至3亿年的生活历史。银杏叶提取物中含有24%的黄酮类化合物（异鼠李素,槲皮素和山奈酚）,具有良好的药用价值。为了探索利用分子生物学方法提高黄酮产量的方法,本研究中通过对银杏植株不同时期的叶片转录组数据进行分析,从转录组水平筛选出黄酮合成途径中的关键酶黄酮醇合成酶FLS,对筛选出的基因进行克隆和生物信息学分析,构建大肠杆菌原核表达载体,确定重组蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件,并用外源SA和JA喷施的方法探索黄酮醇合成酶FLS对外界激素处理的响应。主要研究结果如下:（1）银杏FLS基因成员的鉴定对银杏叶片的转录组测序数据进行整理分析,利用生物信息学方法,筛选到4个银杏FLS基因,它们的CDS区全长序列范围在1010-1060 bp之间,编码的蛋白长度在330-360 aa之间;蛋白分子量在35-39 kDa之间。4个银杏FLS蛋白成员中都包含有植物黄酮醇合成酶FLS的保守基序。其中Gb32877拥有着与其他三条银杏FLS基因不同的蛋白序列结构和表达模式,确定Gb32877为一条新的GbFLS基因。（2）银杏黄酮醇合成酶FLS基因的克隆分析与原核表达确定Gb32877为银杏FLS基因,以银杏叶片cDNA为模板,克隆得到GbFLS基因的ORF序列大小为1056 bp,编码351个氨基酸,蛋白质分子量大小35295.48,等电点（pI）4.78,分子式为 C1736H2709N473O534S17。构建 pET-28a（+）-GbFLS原核载体,并将其导入大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,筛选出最优蛋白表达条件为 37℃,250 rpm/min,0.3 mmol/LIPTG,诱导时间为 4.5 h。（3）银杏黄酮醇合成酶GbFLS基因对外源水杨酸和茉莉酸的响应设置三个浓度梯度的SA和JA激素喷施银杏叶片,喷施后显示SA和JA对FLS表达和总黄酮积累都有促进作用。经过100 mg/L的SA喷施,GbFLS基因的表达量在处理后3d达到最高峰,银杏叶片总黄酮含量在喷施后3d达到最高2.76 mg/g;经过100 mg/L的JA喷施,GbFLS基因的表达量在处理后12h达到最高峰,总黄酮含量在喷施后24h达到峰值2.65 mg/g。
张国庆[3]（2021）在《O-甲基转移酶的筛选及O-甲基非编码氨基酸的生物合成研究》文中指出以O-甲基-酪氨酸为主的O-甲基化非编码氨基酸在医药和肿瘤检测等领域具有十分广泛的应用,尤其是将O-甲基化非编码氨基酸引入蛋白活性位点,能够使蛋白具有新的结构和催化活性。而O-甲基化非编码氨基酸常用化学合成,在合成过程中常伴随着合成步骤繁琐、分离纯化困难、反应条件苛刻和试剂毒性大的问题。本研究主要针对O-甲基转移酶的筛选和O-甲基-酪氨酸的酶催化及生物合成,以已发现能够催化O-甲基-酪氨酸合成的O-甲基转移酶mfnG为研究基础,通过生物学工具确定了两个与mfnG同源性较高的酶O-methyltransferasefamily2（OMT,源于Streptomyces noursei）和Methyltransferase（MT,源于Streptomyces sp.NBS 14/10）,将三种酶的基因经过密码子优化后分别构建到载体质粒中,以便通过工程菌来表达和发酵目标产物。此外,本研究也对三种O-甲基转移酶针对苏氨酸底物的O-甲基化催化能力进行了验证。在体外酶学实验中,通过纯化后的三种甲基转移酶对其催化酪氨酸合成O-甲基-酪氨酸的效率进行了对比试验。试验结果发现MT酶的体外催化效率最高,O-甲基-酪氨酸的产量在10 h时能够达到105 mg/L。而mfnG酶在体外酶催化体系中未检测到O-甲基-酪氨酸的生成,与体内反应不符。在发酵实验中,含三种重组酶的工程菌的O-甲基-酪氨酸合成能力大体一致,在120小时的发酵过程中O-甲基-酪氨酸的积累量在59 mg/L上下,但远不如体外酶法的合成效率。发酵法制备的O-甲基-酪氨酸的出峰时间与标准品相比略有延迟,可能是发酵液成分复杂所致。在O-甲基-苏氨酸的体外酶法制备研究中,含三种纯化O-甲基转移酶的酶体系均未成功检测到O-甲基-苏氨酸的合成,需要后续研究来筛选可以催化苏氨酸甲基化的O-甲基转移酶。
郑莎[4]（2021）在《桑树褪黑素及其异构体生物合成机制研究》文中研究指明自从1958年耶鲁大学的科学家Lerner从牛的松果体中首次分离出褪黑素以及1995年Dubbels和Hattori等学者率先从高等植物番茄、牵牛花等植物中鉴定到褪黑素以来,褪黑素在动植物中的功能受到了科学家们的广泛关注和研究。大量研究表明:褪黑素能够参与到植物生长发育的各个阶段,参与调控植物的各种生理活动;在动物体内,褪黑素起着重要的时间生物学作用,调节昼夜节律,维持节律稳定,具有改善睡眠、治疗神经衰弱和提高免疫等功效。因此,褪黑素在日常生活中作为睡眠调节药物被广泛使用,常用于调整由飞行时差或其他睡眠失调导致的生物钟紊乱,从而改善人的睡眠觉醒周期和昼夜节律。随着我国经济的全球化和快速发展,人们由于频繁时差切换和高强度轮班工作等无规律生活节奏而导致其体内褪黑素分泌合成失调并引起昼夜节律失调的现象也越来越多。许多研究表明通过经常进食高褪黑素含量的动植物食药材能有效补充人体内褪黑素含量并维持其代谢稳态而改善昼夜节律失调。因此,寻找和研究褪黑素高含量的动植物食药原料,特别是高褪黑素含量的大众植物食药原料具有重要现实价值。桑树（Morus alba L.）原产于中国,一直作为家蚕饲料而被大量种植,自古以来便是中国主要经济作物之一。以往对桑树的研究,主要集中在桑树品种选育、桑树栽培和病虫害防治等方面,其目的是为家蚕提供高产、优质的桑叶饲料。随着对桑树的深入研究,发现桑树不同部位富含多种营养成分和活性物质,使得其营养价值和药用价值也受到人们的关注,因而被国家卫生部列为“药食同源”的植物资源。最近研究表明与其他许多中药材和水果相比,桑叶和桑葚都属于高褪黑素含量植物资源,被认为是补充褪黑素最佳原材料之一。有研究表明同一植物物种内不同栽培品系或种质间褪黑素含量差异巨大,我国是桑树种质资源最丰富的国家,不同桑树种质资源圃收集并保存着大量的种质资源。因此,从大量桑种质资源中筛选出高褪黑素含量的桑品种或种质不但可作为人们日常生活中褪黑素补充合适的植物原料,也能为研究桑树高效褪黑素分子合成机理提供研究材料,具有重要的现实和科学意义。目前为止,为数不多的桑树褪黑素研究报道主要集中在其鉴定和含量测定方面,而桑树种质资源褪黑素及其异构体种类的系统鉴定、含量测定、高含量种质筛选及其生物合成分子机制尚未见报道,极大阻碍了桑树作为高效补充人体褪黑素大众原料的应用及其深度开发和多元利用。综上所述,本研究首先利用UPLC-MS/MS检测技术鉴定不同桑树品种/种质的褪黑素,并对50个不同桑树品种/种质褪黑素含量做定量分析筛选出褪黑素含量最高的桑树品种/种质。其次,利用生物信息学方法,从褪黑素含量最高桑种质—川桑（M.notabilis）全基因组数据库中鉴定出参与褪黑素生物合成相关基因,并开展表达谱分析,筛选参与褪黑素高效合成关键基因并开展体外酶活实验,阐明川桑高效合成褪黑素的分子机制。在桑树褪黑素鉴定实验中意外鉴定到桑树中存在天然褪黑素异构体并对不同品种桑树褪黑素异构体进行了定量分析。为了获得桑叶最佳收获部位和季节,对影响桑树中褪黑素和异构体总含量的非遗传因素也做了初步探究。由于本研究首次在植物组织中鉴定到天然褪黑素异构体,加上有关褪黑素异构体生物合成途径从未见报道过,故选取四个桑树品种不同组织为材料,用UPLC-MS/MS鉴定其不同组织中的褪黑素和异构体。同时利用qRT-PCR分析褪黑素生物合成相关候选基因的表达量,并筛选出可能参与褪黑素异构体生物合成的靶标基因,开展其体外酶活功能的验证分析,拟阐明桑树褪黑素异构体生物合成分子途径,为进一步解析其生物合成分子机理奠定了良好的基础。所获得的结果如下:1.不同桑树品种/种质褪黑素及异构体的鉴定和定量分析以及高含量种质筛选利用UPLC-MS/MS在鉴定不同桑树品种/种质叶片中褪黑素的含量过程中,鉴定到桑树中存在天然褪黑素异构体。在50个不同的桑树品种中,1个桑树品种/种质仅含有褪黑素,42个桑树品种仅含有褪黑素异构体MI-1,而其余7个既含有褪黑素又含有MI-1。为了探究不同桑树品种/种质之间褪黑素含量的差异,分析了50个不同桑树品种/种质叶片中褪黑素的含量。结果表明桑树中褪黑素含量为0.26至0.83 ng/g,相差3倍,最高五个桑种质依次是川桑、西农6071、神农架长穗桑、嘉陵16号和嘉陵20号。褪黑素及其异构体的总含量为0.23至20.58ng/g,相差89倍,最高五个桑种质依次是策沙、神农架长穗桑、小花叶皮桑、印度桑和甘洛6号。根据测定结果表明川桑、西农6071、神农架长穗桑可作为最佳补充褪黑素的原材料。为了探究环境条件对桑树褪黑素及异构体的影响,利用UPLC-MS/MS检测了不同采摘时间和不同成熟度的桑叶中褪黑素及异构体含量。结果表明褪黑素及其异构体总含量随着采摘时间的先增加后降低,随着叶片成熟度的增加逐渐增加。以上研究结果表明,在6月28日,第20叶位采摘策沙、神农架长穗桑、小花叶皮桑、叶片可获得最高褪黑素和异构体含量的桑叶原料。2.川桑（Morus notabilis）褪黑素高效生物合成分子机制解析褪黑素含量最高桑种质为川桑,在川桑基因组数据库中鉴定到37个褪黑素生物合成相关候选基因。以“川桑”为模板成功克隆到37个褪黑素生物合成相关的候选基因,即:一个色氨酸脱羧酶基因（MnTDC）,7个色胺5-羟化酶基因（MnT5H1-7）,6个5-羟色胺N-乙酰基转移酶基因（MnSNAT1-6）基因,20个N-乙酰5-羟色胺甲基转移酶基因（MnASMT1-20）和3个咖啡酸-氧-甲基转移酶基因COMT（MnCOMT1-3）。生物信息学分析表明桑树中褪黑素合成相关候选基因的结构特征与已经报道的褪黑素生物合成相关基因基本一致。结构域预测和多序列比对分析表明这些蛋白质都具有各蛋白家族催化活性所需的结构域和活性位点。利用qRT-PCR技术研究了褪黑素生物合成相关基因在川桑根、茎、叶和皮中的表达情况,结果表明这些基因在各组织中的表达模式不一,同一家族的不同基因表达量差异较大。MnTDC基因在川桑叶中的表达量是最高的。T5H1和T5H2相比较其他5个T5H基因在根、茎、叶和皮中的表达量较高,T5H7在四个组织多种的表达较低。SNAT1-SNAT5这5个基因的表达模式一致,但SNAT5基因在茎中的表达量是SNAT1的在茎中表达量的20倍。而SNAT6在4个组织中几乎不表达。20个ASMT基因中,ASMT12基因的在根和皮中的表达量是最高的,ASMT3基因在4个组织均不表达,除此之外其他的18个ASMT基因在4个组织中的表达量差异较大。MnCOMT1在茎中的表达最高。构建原核表达载体pCold TF-MnTDC、pCold TF-MnT5H2、pCold TF-MnSNAT5、pCold TF-MnASMT12和pCold TF-MnCOMT1,转入大肠杆菌,分别表达这5个重组蛋白并获得相应可溶的重组蛋白。体外酶活表明MnTDC重组蛋白与底物色氨酸在缓冲液中共孵育鉴定到产物色胺。MnT5H2重组蛋白与底物色胺在缓冲液中共孵育鉴定到产物5-羟色胺。MnSNAT5重组蛋白与底物5-羟色胺、乙酰辅酶A在缓冲液中共孵育鉴定到产物N-乙酰5-羟色胺。MnSNAT5重组蛋白与5-甲氧基色氨、乙酰辅酶A在缓冲液中共孵育鉴定到褪黑素。MnASMT12重组蛋白分别与底物5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物5-甲氧基色胺。MnASMT12重组蛋白分别与底物N-乙酰5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物褪黑素。MnCOMT1重组蛋白与底物5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物5-甲氧基色胺。MnCOMT1重组蛋白分别与底物N-乙酰5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物褪黑素。前人关于ASMT蛋白家族的研究表明,ASMT蛋白家族被分为三个亚家族（I,II,III）,但仅有一个亚家族的成员编码的蛋白表现ASMT蛋白酶的活性。在川桑中MnASMT12属于MnASMT蛋白家族的第I亚族,催化N-乙酰5-羟色胺转化为褪黑素,5-羟色胺转化为5-甲氧基色胺。为了探究MnASMT蛋白家族第II亚家族和第III亚家族成员的功能,我们根据MnASMT各亚家族基因的表达量,选择MnASMT第II亚家族的MnASMT16和第III亚家族的MnASMT20进行进一步研究。将重组的载体pCold TF-MnASMT16和pCold TF-MnASMT20在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,分别获得MnASMT16和MnASMT20重组蛋白。将N-乙酰5-羟色胺和S-腺苷-L-甲硫氨酸与分别含有MnASMT16和MnASMT20重组蛋白的反应缓冲液混合和孵育,用UPLC-MS/MS对产物进行分析,结果表明MnASMT16和MnASMT20都具有将N-乙酰5-羟色胺转化为褪黑素的能力。此外,将5-羟色胺和S-腺苷-L-甲硫氨酸与分别含有MnASMT16和MnASMT20重组蛋白的反应缓冲液进行共孵育,并使用UPLC-MS/MS对产物进行分析,结果表明只有MnASMT20重组蛋白将5-羟色胺转化为5-甲氧基色胺。总而言之,酶动力学和体外偶联测定结果表明桑树的褪黑素生物合成不但有多条不同途径,而且所有条途径都能有效地催化色氨酸转化为终产物褪黑素。此外,ASMT基因家族中三个亚家族基因编码的蛋白都有ASMT蛋白酶活性。以上结果表明,川桑可通过多途径、多基因能高效地催化色氨酸向褪黑素转化,可能是其保持丰富褪黑素含量的关键分子机制。3.桑树褪黑素异构体生物合成分子途径解析我们使用相同的桑树品种的不同的组织为实验材料,并利用相同提取和检测方法开展了褪黑素及其异构体的鉴定和定量分析。研究结果表明4个桑树品种褪黑素异构体的种类也有差异。4个桑树品种叶片中都含有褪黑素和两种褪黑素异构体（MI-2和MI-3）,果中仅含有褪黑素和异构体（MI-2）,其中“大十”叶和果中褪黑素及其异构体总含量都是最高的。利用qRT-PCR分析了褪黑素合成相关基因在两个桑树品种“大十”和“白玉皇”的叶、果中的表达情况。结果表明,除MaASMT4和MaASMT20都具有桑叶特异性高表达的模式外,其他参与褪黑素生物合成的基因在两个品种和两个器官的表达模式均不一致。为了进一步确认MaASMT4和MaASMT20两个基因桑叶特异高表达的模式,利用qRT-PCR分析结果表明MaASMT4和MaASMT20在“嘉陵30陵和“中桑5801MT都具有桑叶特异性高表达的模式,这种表达模式与MI-3特异存在叶中的模式一致。因此,将MaASMT4和MaASMT20两个基因作为合成褪黑素异构体MI-3的关键基因进行进一步的分析。以“大十”为模板克隆了MaASMT4和MaASMT20基因并构建原核表达载体pCold TFMaASMT4和pCold TF-MaASMT20,转入大肠杆菌表达其蛋白。外源表达的MaASMT4和MaASMT20重组蛋白体外酶活分析结果表明:属于ASMT基因家族第III亚家族的MaASMT4和MaASMT20在体外都能催化底物N-乙酰5-羟色胺转化成褪黑素异构体MI-3。为了探究MaASMT蛋白家族第I和第II亚家族成员的功能,基于其他两个亚家族不同基因的表达量,以“大十”员为模板克隆了ASMT基因家族第I和第II亚家族的MaASMT9和MaASMT16基因。构建原核表达载体的pCold TF-MaASMT9和pCold TF-MaASMT16转入大肠杆菌表达其重组蛋白。体外酶活结果表明ASMT蛋白家族第I亚家族的MaASMT9和第II亚家族的MaASMT16两个重组蛋白都能催化N-乙酰5-羟色胺转化成褪黑素。这些结果表明褪黑素异构体生物合成分子途径与褪黑素相似,白桑能用特定亚群的ASTM成员实现其体内褪黑素异构体的合成,为进一步植物褪黑素异构体生物合成分子机理解析打下了良好的基础。
李国四[5]（2020）在《生物催化级联反应制备丙酮酸及L-酪氨酸衍生物》文中研究指明丙酮酸作为重要的原料和中间体,广泛应用于化工、医药、农业等领域。传统的酒石酸脱水脱羧法生产工艺操作简单,但存在污染严重、产率低、原料消耗大等问题,导致丙酮酸及其衍生产品价格较高。近年来,丙酮酸的生物法制造技术由于原料成本低、反应条件温和、产品安全可靠等优点,引起产业界的广泛关注。生物法包括糖质原料发酵法和乳酸的酶催化氧化法两类。由于细胞内与丙酮酸相关的代谢途径活跃,限制了丙酮酸发酵水平的提高,而且由于丙酮酸在水溶液中溶解度大,从成分复杂的发酵液中分离丙酮酸成本较高,发酵法生产丙酮酸一直难以大规模工业化。以短链L-2-羟基酸氧化酶为基础的生物催化法由于无需添加昂贵的辅酶、催化体系简单且产品分离纯化方便,具有较好的工业应用前景。但是,催化的过程中产生的副产物过氧化氢容易将丙酮酸氧化成乙酸和二氧化碳,导致产率的降低。光学纯L-酪氨酸及其衍生物常被用于合成一些重要的药物,例如帕金森药L-多巴和抗肿瘤药物沙弗拉霉素A等。化学从头合成酪氨酸衍生物需要多个步骤,最终产物也是外消旋体,需要进行后期的拆分。酪氨酸酚裂解酶可直接催化丙酮酸、苯酚衍生物和氨生成L-酪氨酸衍生物,是一种极具前景的L-酪氨酸衍生物绿色合成途径。但是由于供体底物丙酮酸成本较高且不稳定,该方法和化学法相比竞争性仍不显着。生物催化级联反应因为具有克服中间产物的毒性和不稳定性、降低中间底物和产物分离纯化成本以及提高催化效率等优点,已经被广泛应用于高附加值化学品的合成。针对上述问题,本论文开发了两种催化级联反应体系:1)将短链L-2-羟基酸氧化酶催化的乳酸氧化脱氢反应和过氧化氢酶催化的过氧化氢分解反应相偶联,构建了能够将廉价的生物基原料L-乳酸氧化成丙酮酸的大肠杆菌全细胞催化剂。2)将上述体系进一步与酪氨酸酚裂解酶催化的C-C耦合反应相偶联,构建了一种包含L-2-羟基酸氧化酶、过氧化氢酶以及酪氨酸酚裂解酶的三酶级联反应体系,以L-乳酸和苯酚衍生物为出发底物,一锅法制备L-酪氨酸衍生物。首先,通过文献调研以及基因挖掘克隆了6种短链L-2-羟基酸氧化酶以及10种单功能过氧化氢酶,并分别从中筛选出催化活力高且稳定性好的来源于Aerococcus viridans 的乳酸氧化酶 AvLOX 以及来源于 Ureibacillus thermospAhaericus的过氧化氢酶UtCAT。其中,AvLOX在大肠杆菌中表达时包涵体比例较高,为了提高酶活,采用降低表达温度和诱导剂浓度、RBS序列定向进化和共表达分子伴侣的策略增强其可溶性表达。通过降低表达温度和诱导剂浓度,可溶性提高了3.4倍,酶活提高了48.9%;通过对RBS序列定向进化,成功获得了有利于AvLOX可溶性表达的RBS突变序列GGGGGC,携有该突变序列的重组菌E coli-pET28a-T7rbsAvLOX中目标酶的可溶性提高了 1.7倍,酶活提高了62.7%;在此基础上,进一步共表达分子伴侣GroES-GroEL,可溶性提高了 1.8倍,酶活提高了43.1%,最终AvLOX可溶性由8.5%提高到89.2%,酶活由4.5 U/mL提高到15.6 U/mL。然后,采用UtCAT与AvLOX粗酶液构建了胞外的双酶级联反应体系,确定了 UtCAT与AvLOX的酶活最优配比为300:1,以500 mM L-乳酸为底物收率能够达到92.3%,是不添加过氧化氢酶时（7.3%）时的12.6倍。为了简化工艺、提高偶联效率和降低成本,将AvLOX与UtCAT在E.coli BL21（DE3）内进行共表达,以pET28a-T7rbsAvLOX为质粒骨架构建了胞内双酶级联的全细胞催化剂。采用三种不同的单质粒共表达策略,其中共表达菌株五.coli-pET28a-T7rbsAvLOX-rbsUtCAT双酶表达效果最好。为了进一步提高过氧化氢酶酶活,利用RBS计算软件对UtCAT基因前的RBS序列进行重新设计,获得了翻译起始速率显着增强的序列RBS3,可使UtCAT酶活提高了 1.8倍,最终共表达菌株E.coli-pET-28a-T7rbsAvLOX-rbsUtCAT 中 UtCAT 和 AvLOX 的酶活分别达到4127.3 U/mL 和 12.6 U/ml（酶活比 328:1）。对 E.coli-pET-28a-T7rbsAvLOX-rbs3UtCAT的催化工艺进行了优化,获得的最佳的工艺条件为:反应温度37℃C,体系pH7.0,菌体添加量20 g/L以及0.7 Mpa氧气压力,其中氧气浓度是L-乳酸氧化反应的限制因素。在该条件下,500mML-乳酸仅需要1.5h即可被转化,收率达到92.2%。同时,考虑到维持氧气压力对设备有一定要求,在常压条件下建立了底物分批补料催化工艺,在L-乳酸总浓度为600 mM的反应中丙酮酸收率能够达到90.8%。然后,表达了来源于Symbiobacterium toebii的热稳定型酪氨酸酚裂解酶（Thermophilic tyrosine-phenol lyase,TTPL）并分析了 底物谱,发现 TTPL 可以催化苯酚、以及邻位时OH和F的2-羟基苯酚和2-氟-苯酚,但是将邻位取代基换成Cl、Br、CH3以及OCH3后TTPL就丧失了对底物的催化能力。为增强TTPL对不同底物的适应性,对其进行理性设计改造。基于同源建模与分子对接模拟分析,通过定点突变将TTPL中对底物特异性起决定作用的口袋进行扩大,构建了10个突变株,从中成功筛选出3个对2-甲基苯酚有较高催化活力的突变株F37V、T126S和M380V。底物特异性研究表明,突变株F37V和M380V表现出更宽的底物谱以及不错的催化活力。最后,以2-氟-苯酚为模式底物,构建了基于AvLOX、UtCAT以及TTPL M380V的三酶级联反应体系,其最佳的工艺条件为:反应温度40℃,体系pH 8.0,E.coli-pET28a-T7rbsAvLOX-rbs3UtCAT 与E.coli-pET28a-TTPLM380V 菌体添加比为1:2,湿菌添加总量为25g/L,底物浓度为46mM,该条件下3-氟-L-酪氨酸的收率由83.1%提高到97.1%,ee值>99%。以此为基础,通过改变热稳定性酪氨酸酚裂解酶突变子种类,还可以催化合成5种其它L-酪氨酸衍生物,收率达到81.1-96.3%,ee值均大于99%。采用底物流加补料催化工艺,在0.5 L规模反应中,上述反应的底物酚转化率分别达到77.4～94.3%,产物浓度达到48.0～60.4g/L,成功解决了底物抑制、催化剂不稳定和收率低等问题,展示出良好的工业应用前景。
王宗杰[6]（2020）在《海洋滑动细菌天然产物的挖掘、disorazoles的异源表达及肿瘤靶向递送》文中认为癌症已经成为困扰人类的重大公共健康问题之一,目前依然缺乏理想的治疗手段。现阶段,化疗依然是治疗癌症的主要手段。由于很多化疗药物直接或间接的来源于天然产物,且结构新颖的天然产物也常被用来寻找新的抗肿瘤靶点,因此积极寻找结构新颖的天然产物是抗肿瘤工作中重要的一部分。然而,近些年来中重复发现的问题日益突出,导致发现有价值的天然产物越来越困难。这可能与研究人员将过多的研究精力集中在经典的天然产物产生菌类群上有关。生物信息学研究发现,除了放线菌、芽孢杆菌等传统天然产物产生菌,海洋滑动细菌也具有巨大的天然产物合成潜力。因此,本研究将天然产物挖掘的目标转向了研究较少的海洋滑动细菌。除了积极寻找具有新颖结构的天然产物,充分利用现有化合物也是一项重要的工作。Disorazoles是从纤维堆囊菌中发现的一类大环内酯类化合物,其细胞毒性比埃博霉素强100倍。但由于靶向性较差,毒副作用严重,极大地限制了其应用。而随着靶向技术的不断发展,特别是对肿瘤靶向细菌研究的深入,使得利用特定的载体将高毒性的化合物靶向递送至肿瘤内部成为可能。利用这一策略不仅可以有效发挥化合物对肿瘤细胞的杀伤作用,同时还能避免其对正常组织的损伤,是一个有潜力的研究方向。本研究以肿瘤问题为出发点,分别从天然产物挖掘及靶向递送两个方面进行探索。主要研究内容及结论如下:（1）海洋滑动细菌新物种的分离及其天然产物合成潜力评价。本研究通过诱捕法从海洋来源的样品中分离得到了 100余株细菌,通过16s rRNA基因序列比对发现其中有1 1株潜在的新物种,且绝大部分属于海洋滑动细菌。这些菌株的分离纯化为研究其次级代谢产物奠定了基础。之后对分离得到的新物种进行了多种培养条件的发酵,并对其发酵产物进行了生物活性评价及液相色谱质谱联用（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS）检测。对其中一株生物活性较好的海洋拟杆菌Fulviviga sp.W222进行了全基因组测序,发现其中包含多个新颖的次级代谢产物合成基因簇,说明其具有天然产物合成潜力。（2）新型铁载体fulvivirgamide的挖掘及其生物合成途径的确定。菌株W222中含有一个去铁胺类（Desferrioxamine,DFO）铁载体的生物合成基因簇（Biosynthesis Gene Cluster,BGC）。与已知基因簇相比,其中还包含两个未知功能的基因（fulE及fulF）,且这两个基因在拟杆菌类群中相对比较保守的。说明它们具有比较重要的生物学功能,可能负责合成一类新的DFO类铁载体。结合Chrome azurol S（CAS）实验与铁离子添加实验,利用LC-MS对菌株W222的发酵产物进行检测,确定了其中可能的铁载体的吸收峰及分子量。进一步地高分辨质谱（High Resolution Mass Spectrometry,HRMS）检测确定了它们的精确分子量及可能的分子式,推测其可能是Desferrioxamine Gi（DFOGi）伯胺氮原子酰基化的产物,并将其命名为灰黄杆菌胺（fulvivirgamide,FVM）。为了确定FVM的结构,我们利用色谱分离的方法对其中产量较高的化合物（1-4）进行了分离纯化,并通过NMR结合HRMS及MS/MS确定了其化学机构。化合物1-4分别是DFOG1伯胺氮原子被苯乙酰基、乙酰基、丙酰基及异丁酰基修饰的产物。通过解析出的化学结构结合HRMS及MS/MS,推测出了另外一些铁载体的大致结构,均为DFOG1伯胺氮原子被不同脂肪酸或芳香族脂肪酸酰基化的产物。为了确定FVM的生物合成途径,我们将其基因簇中可能的功能基因克隆到了共表达质粒上,并转入大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）进行异源表达。通过比较不同转化子的发酵产物,证明了 FulF为一个全新的酰基转移酶,负责DFOG1伯胺氮原子的酰基化。为了明确FulF的底物,我们向BL21（DE3）:;fwlF的发酵培养基中添加了DFOG1及肉豆蔻酸,并在其产物中发现了目标产物FVMB14,说明FulF可以催化DFOGi的酰基化过程。对分离到的化合物（1-3）进行了细胞毒性实验检测,发现其对三种人源肿瘤细胞都具有抑制所用,IC50介于9到19μM之间。（3）Disorazoles异源表达宿主的构建。异源表达不仅可以促进disorazoles的相关研究,同时也是靶向递送的前提。泰国伯克氏菌（Burkholderia thailandensis）E264是一株分离自泰国水稻田里的革兰氏阴性细菌,与其它肿瘤靶向细菌相比,菌株E264次级代谢产物丰富,可以为异源基因簇的表达提供丰富的前体物质,具有成为异源表达宿主的潜力。但由于其可用的筛选标记较少,因此在一定程度上限制了其应用。本研究利用两步单交换结合反向筛选的方法对B.thailandensis E264基因组上的3个多重耐药外排泵（MDR pumps）进行了无痕敲除,得到了一株对常用抗生素普遍敏感的突变株。除了耐药性的变化,敲除耐药泵的突变株生长速度没有明显的变化,保留了其生长速度快的优势。之后,我们将disorazole A1的生物合成基因簇通过E.coli WM3064介导的结合转移转至突变株E264ABAC中,并在其M8培养基的发酵产物中检测到三个特异的吸收峰。经NMR确证保留时间为16.8min的质谱峰峰是disorazole A1的衍生物disorazole F2。对比二者的结构发现这可能是由于B.thailandensis E264中缺乏相应的甲基转移酶和细胞色素P450导致的。通过突变株E264ABAC异源表达得到的产物排除了后修饰酶的影响,大大方便了其生物合成途径的解析。而在表达disorazole Z生物合成基因簇的过程中也出现了同样的情况,只检测到了其酯基缺失的衍生物。经生物合成分析推测,这也可能是由位于其生物合成基因簇外的细胞色素P450和羧酸酯酶催化的。（4）B.thailandensis E264肿瘤定植特性及disorazole的靶向递送。Disorazoles在B.thailandensis E264中的成功表达,为其肿瘤靶向递送提供了基础。但由于野生型E264毒性较大,因此我们首先依据沙门氏菌的减毒策略构建了两株减毒株E264ΔwaaN及E264ΔrelAΔspoT,并对野生型E264及其减毒株的毒性进行了评价,发现E264AwaaN的毒性有了明显的降低,同时低剂量的野生型E264的致死率也较低。之后的肿瘤定植实验结果显示,虽然E264ΔwaaN的毒性较低,但其肿瘤定植的能力也受到了一定程度的影响,而低剂量注射的野生型E264不仅安全性有保障,且其最终在肿瘤内部定植的密度也没有受到影响。结合毒性及肿瘤定植能力的实验结果,最终我们选择以低剂量的野生型E264作为递送载体,将disorazole直接递送至肿瘤内部,以达到更为理想的抗肿瘤效果。但最终的实验结果显示,相较于野生型菌株E264,转化子E264::disA的抗肿瘤效果并没有明显的提高。推测可能是由于肿瘤内部的生长环境较为严苛,E264在其中的生长受到抑制,并不能有效地表达外源基因簇导致的。本研究从非经典的天然产物产生菌——海洋滑动细菌中发现了一类新型的去铁胺类铁载体;构建了一个新的表达宿主E264ABAC,并利用其实现了disorazoles化合物的异源表达;最后,对B.thailandensis E264作为高毒性化合物靶向递送载体的可能性及局限性进行了初步探索。
占杨杨[7]（2020）在《代谢工程改造地衣芽胞杆菌高效合成苯乙醇》文中研究指明因其独特的玫瑰花香味,苯乙醇（2-PE）作为香精和香料被广泛应用于食品、化妆品和日化领域。目前苯乙醇的生产方法主要是化学合成法和植物提取法,但是当前方法无法满足人们对“天然”苯乙醇日益增长的需求。由于微生物发酵法具有反应条件温和、环境友好、可持续性和产物天然性等特点,微生物发酵生产苯乙醇已成为一种颇具吸引力的方法。然而,当前微生物合成苯乙醇方案普遍存在菌株对苯乙醇耐受性差和产量低等问题,无法实现苯乙醇的工业化发酵生产。本论文以公认生物安全（Generally Regarded As Safe）的菌株地衣芽胞杆菌DW2（Bacillus licheniformis DW2）作为出发菌株,建立了高效的整合型CRISPRi体系;建立了一个高效转化苯丙氨酸为苯乙醇的细胞催化体系,并构建了一株从头高效合成苯乙醇的重组菌株。本论文主要研究内容如下:1、在地衣芽胞杆菌中建立了高效整合型CRISPRi体系。首先将dcas9整合至B.licheniformis DW2基因组中,以内源性基因yvm C、cyp X和必需基因rps C为靶标基因,测试了CRISPRi系统对单基因、操纵子基因和必需基因的抑制效果。结果表明,该系统对单基因、操纵子基因和必需基因均具有较好的抑制效率（在45.02%至94.00%之间）。拓展的Multiplexed CRISPRi体系能够同时高效抑制多个基因的转录,并利用构建的Multiplexed CRISPRi系统抑制副产物乙偶姻、2,3-丁二醇、乙酸和乳酸合成关键基因和缬氨酸降解途径相关基因。结果表明,分别抑制乙偶姻合成关键基因乙酰乳酸脱羧酶基因als D和缬氨酸降解途径中亮氨酸脱氢酶基因bcd使得工程菌株缬氨酸产量分别提高了90.48%和80.09%;通过组合抑制als D和bcd,重组菌株在摇瓶和3-L发酵罐水平缬氨酸产量分别比对照菌株提高了1.27和2.89倍。2、筛选高耐受苯乙醇的宿主菌株,并构建了高效转化苯丙氨酸为苯乙醇的细胞工厂。首先通过比较不同菌株对苯乙醇的耐受性来筛选苯乙醇合成的宿主,研究发现,相比于所选用的大肠杆菌、解淀粉芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌,地衣芽胞杆菌DW2对苯乙醇耐受性最好。以DW2为宿主,通过筛选不同来源的苯丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶和芳香族氨基酸转氨酶来构建高效的艾利希途径;结果表明,来源于乳酸乳球菌的酮酸脱羧酶Kiv D和大肠杆菌的醇脱氢酶Yqh D分别是最适宜的酮酸脱羧酶和醇脱氢酶;结合利用CRISPRi系统证明了在地衣芽胞杆菌中His C是主要负责苯丙氨酸和苯丙酮酸相互转化的转氨酶;并获得最佳重组菌株DE4（组合表达Kiv D和Yqh D）,该菌株能够将5.00 g/L苯丙氨酸转化生成3.04 g/L苯乙醇。为降低菌株DE4合成苯乙醇的发酵原料成本,优化了以糖蜜为碳源的发酵工艺,在最佳发酵培养条件下,苯乙醇产量达到4.41 g/L;最后在3-L发酵罐的补料分批发酵中,苯乙醇最高产量达到5.16 g/L,苯丙氨酸转化率为0.65 g/g和转化效率为0.12 g/（L.h）。3、通过基因组挖掘和基因功能分析筛选获得地衣芽胞杆菌自身的苯乙醇脱氢酶。首先通过生物信息分析,将地衣芽胞杆菌DW2中19种醇脱氢酶分为I、II和III型。随后以DW2衍生菌株DWc9n为出发菌株,分别将DWc9n中的19种醇脱氢酶进行单基因敲除,以此筛选转化苯乙醛为苯乙醇的醇脱氢酶,研究发现yug J缺失对苯乙醇的合成影响最大,该缺失株的苯乙醇产量下降了95%;通过yug J的回补和过表达,菌株恢复和增强了转化苯乙醛为苯乙醇的能力。酶动力学分析进一步证实了YugJ转化苯乙醛为苯乙醇的能力,以苯乙醛为底物的酶动力学参数为Vmax=3.69μM/min,Km=6.49 m M,Kcat=2.64 min-1和Kcat/Km=0.41 min-1m M-1。4、利用模块化途径工程和理性的“开源-节流”策略,对艾利希、中心代谢途径和苯丙酮酸合成模块进行系统改造,强化地衣芽胞杆菌DWc9n苯乙醇从头合成的能力。（1）通过共表达kivD和yugJ构建杂合型艾利希模块:研究发现kiv D游离表达和yug J整合表达是最佳的组合方式,相应重组菌株PE4苯乙醇产量达到0.28 g/L。（2）改造中心代谢途径提高前体物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）供应:考察了分别敲除丙酮酸激酶基因pyk、葡萄糖转运蛋白基因pts G和强化表达PEP合成酶基因（pps1、pps2和pps3）对苯乙醇合成的影响,结果表明敲除pyk是提高PEP供应,促进苯乙醇合成最有效方式,相应重组菌株PE10（pykΔkiv D↑yug J↑）产生0.50 g/L苯乙醇。（3）在此基础上,系统考察了分别强化表达苯丙酮酸合成途径关键基因(aro A、Ecaro F、Ecaro Gfbr、phe A、Ecphe Afbr、aro K和aro D)对苯乙醇合成的影响,结果表明,过表达aro A、EcaroGfbr、pheA和EcpheAfbr显着提高了苯乙醇的产量,分别比对照菌株PE10提高了182%、99%、131%和261%。因此,通过模块化代谢工程获得较佳菌株PE12(pykΔkiv D↑yug J↑phe Afbr↑),该菌株苯乙醇产量达到1.81 g/L,比出发菌株PE1（0.22 g/L）提高了7.23倍。（4）去除副产物的积累可提高苯乙醇产量:重组菌株PE12积累了乙偶姻、2,3-丁二醇、莽草酸、3-脱氢莽草酸和苯丙氨酸等副产物。为了增强莽草酸利用,解除莽草酸和3-脱氢莽草酸的积累,以强启动子Pbac A置换重组菌株PE12中aroK基因的启动子,构建了重组菌株PE27(pykΔkiv D↑yug J↑phe Afbr↑Pbac A-aro K),该菌株苯乙醇产量达到3.61g/L;随后在PE27基础上强化表达aro D和Ecaro Gfbr,使得苯乙醇产量提高至4.25 g/L。为了降低苯丙氨酸的积累,进一步敲除his C,构建了重组菌株PE33(pykΔhis CΔkiv D↑yug J↑phe Afbr↑aro D↑aro Gfbr↑Pbac A-aro K),PE33菌株苯乙醇产量达到5.35 g/L,比PE12菌株提高了1.96倍;PE33菌株乙偶姻/2,3-丁二醇、莽草酸、3-脱氢莽草酸和苯丙氨酸含量分别比PE12菌株下降了19.37%、79.85%、85.70%和61.32%。（5）发酵工艺优化提高了苯乙醇合成:对最优组合菌株PE33的苯乙醇从头发酵摇瓶工艺进行了优化,在最佳发酵培养条件下,PE33菌株苯乙醇产量最高可达5.38 g/L,比出发菌株PE1苯乙醇产量提高了23.45倍,是目前苯乙醇从头合成报道的最高发酵水平。
胡新玲[8]（2020）在《红豆杉紫杉烷7-木糖基转移酶基因鉴定及功能研究》文中认为紫杉醇（Paclitaxel）是从红豆杉的树皮中分离得到的一种二萜类化合物,其抗癌活性广谱而高效。7-木糖基紫杉烷类的木糖基化代谢处于紫杉醇等7-羟基紫杉烷生物合成的分支途径,是影响红豆杉紫杉醇含量的重要步骤,其关键酶为紫杉烷7-木糖基转移酶（Taxane 7-xylosyltransferase）。鉴定并实现编码基因的定向调控,对显着提高紫杉醇的含量、降低紫杉醇的生产成本具有重大意义和应用价值。目前,关于紫杉烷7-木糖基转移酶的功能及其编码基因的研究目前尚未见有报道。为了充分挖掘紫杉烷7-木糖基转移酶,以拟南芥木糖基转移酶和糖基转移酶为检索序列,对红豆杉糖基转移酶进行了大范围的鉴定和分析,并对筛选出的候选基因进行了蛋白表达及功能验证,同时分析了可能参与其表达调控的转录因子。期望为进一步研究红豆杉中紫杉醇合成和代谢的调控机制以及提高紫杉醇产量提供理论依据。主要研究结果如下:（1）基于红豆杉转录组测序数据,以拟南芥等植物木糖基转移酶为检索序列筛选出12个木糖基转移酶候选基因,分别命名为TcXT1～TcXT12。生物学特性分析发现它们多为膜蛋白,且富含稀有密码子。利用qRT-PCR技术分析了这12个候选基因的表达模式,结果显示它们的表达具有一定时空特异性,其中TcXT3、TcXT4、TcXT10和TcXT11在根和茎中相对表达量较高。（2）为了研究候选蛋白是否具有目标酶活,利用原核表达系统对12个候选基因进行蛋白表达,采用MBP、SUMO等标签和大肠杆菌Rosetta（DE3）表达菌株得到TcXT4、TcXT10和TcXT12可溶性目的蛋白,体外酶活反应后未检测到目标产物。为了获得有活性的目标蛋白,成功构建了真核表达系统毕赤酵母pPIC9k载体/GS115菌株,但未能获得目的蛋白,表明该表达系统不利于这些候选基因的表达。利用农杆菌介导的叶盘法获得了TcXT1、TcXT2、TcXT4、TcXT5、TcXT6和TcXT10等6个基因的84K杨（Populus alba×Populus glandulosa）转基因植株,并且进行了TcXT4和TcXT5在烟草中的瞬时表达,结果表明这些候选基因在异源植物中的蛋白表达量均较低。（3）由于前期筛选的木糖基转移酶未能验证到目标活性,因此,扩大筛选范围,以拟南芥的糖基转移酶为检索序列,进一步挖掘候选基因。用目标底物10-去乙酰基紫杉醇（10-Deacetyltaxol,DAT）或目标产物7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇（7-Xylosyl-10-deacetyltaxol,7-XDT）分别处理红豆杉悬浮细胞,进行转录组测序筛选目标糖基转移酶。首次从红豆杉中鉴定出65个尿苷二磷酸糖基转移酶,将其与拟南芥的同家族成员聚类分为15个亚类,其中包括共有红豆杉和拟南芥家族成员的9个亚类和6个物种特异性的亚类。筛选到在目标底物DAT处理条件下体内表达量显着上调,而在目标产物7-XDT处理条件下显着下调的5个糖基转移酶全长基因:TmUGT34、TmUGT9、Tm GT1、Tm GT2和Tm GT3,其中TmUGT34（属于K亚类）差异最大。（4）为了进一步鉴定筛选出的糖基转移酶是否具有目标活性,在大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株和84K杨中进行了目的蛋白的表达。84K杨中目的基因在转录水平高表达,仅在大肠杆菌获得可溶性目的蛋白,体外酶活反应未能检测到目标活性。而利用农杆菌介导的真空抽滤—瞬时转化红豆杉小苗的体内酶活检测发现,过表达TmUGT34基因能够显着提高植株体内目标化合物7-木糖基紫杉醇（7-Xylosyltaxol,7-XT）和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的含量,7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇C（7-Xylosyl-10-deacetyltaxol C,7-XDTc）及其它底物含量在两组中无显着变化,这表明TmUGT34具有紫杉烷7-木糖基转移酶的活性。这是首次在红豆杉中鉴定出紫杉烷7-木糖基转移酶。（5）对已鉴定的紫杉烷7-木糖基转移酶基因TmUGT34的启动子分析表明,MYB转录因子能够与其启动子区域序列结合。基于此,首次在红豆杉中鉴定了R2R3-MYB基因家族,最终获得了72个Tc MYB基因。系统发育分析表明这些R2R3-MYB蛋白序列与拟南芥中的R2R3-MYB转录因子聚类分为36个亚类。通过q RT-PCR检测发现Tc MYBs在红豆杉叶片、韧皮部、木质部和根部有不同程度的表达。对miRNA介导的Tc MYB基因转录后调控分析发现,有18个Tc MYB基因被miR858、miR159和miR828靶向。这些研究结果为进一步研究R2R3-MYB转录因子对7-木糖基紫杉烷类化合物生物合成的调控机制奠定了基础。综上,本课题研究结果为深入解析紫杉烷7-木糖基转移酶调控紫杉醇代谢的分子机制奠定了基础,为提高红豆杉中紫杉醇产量提供了新思路。
张悦[9]（2020）在《茉莉酸甲酯对甘遂黄酮积累的影响及EkFLS（黄酮醇合成酶）基因功能验证与表达调控研究》文中进行了进一步梳理甘遂（Euphorbia kansui Liou）为大戟科大戟属（Euphorbia）的多年生草本植物,为我国特有药用植物。在临床上多用于胸腔积液、肝硬化腹水、咳喘、水肿、肿瘤等病症,其主要药用成分包括萜类（二萜类、三萜类化合物）、甾体类和黄酮类化合物。黄酮类化合物合成途径是植物体内重要的代谢途径之一,对于植物自身生长发育及抵抗外界非生物胁迫具有重要意义。此外,临床研究证明多种植物中的黄酮类化合物具有抑菌、抗肿瘤活性、防治糖尿病肾病及调节血脂等作用,被广泛应用于工业生产及医药健康领域,具有重要的科研价值与商业价值。植物的次生代谢产物合成受到环境因素和信号激素的影响,茉莉酸类化合物是一种典型的信号调控分子,作为一种新型植物内源激素,被发现可以调控植物黄酮类物质的合成代谢。许多文献报道大戟科植物中黄酮类物质主要是黄酮醇,黄酮醇是黄烷酮的衍生物,由黄酮醇合成酶（FLS）催化形成,FLS是合成植物黄酮类化合物的关键酶之一。然而,茉莉酸类化合物对甘遂黄酮类化合物积累及相关酶基因表达的影响,Ek FLS基因在黄酮类化合物合成途径中的功能以及对植物在非生物胁迫耐受中的调控机制尚未展开系统的研究。为此,本研究以甘遂作为研究对象,分析茉莉酸甲酯（Me JA）对甘遂黄酮类化合物积累及相关酶表达的影响,克隆Ek FLS基因并进行信息学分析和原核表达,然后将Ek FLS基因转入拟南芥（Arabidopsis thaliana）,通过过表达Ek FLS基因以及相应的胁迫处理分析,阐明其基因功能,为深入研究FLS基因的分子调控机制以及植物抗逆的分子机理,提高植物黄酮类化合物含量及增强植物抗逆性提供理论基础。研究结果如下:1. 使用100μmol/L的Me JA处理甘遂,通过紫外分光光度计法测量处理组和对照组根、茎、叶不同部位的总黄酮含量。结果表明,不同组织的总黄酮含量存在显着差异,其中叶片中总黄酮含量最高,平均为2.286 mg/g,其次是茎（平均含量为0.428 mg/g）和根（平均含量为0.184 mg/g）。Me JA诱导后,叶片总黄酮含量增加2.4%-23.8%,处理后36 h达到最大值;根中总黄酮含量增加24.4%-73.3%,处理后12 h达到最大值;茎中总黄酮含量变化不明显。此外本研究提取了甘遂中的黄酮醇,通过薄层分析法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC）分析发现甘遂内含有槲皮素和山奈酚两种黄酮醇产物,含量分别为0.128 mg/g和2.165 mg/g。2. 通过甘遂转录组数据库（NCBI Sequence Read Archive database:SRP126436）筛选出黄酮合成途径中的五个关键酶基因:查尔酮合成酶（CHS）、花青素合成酶（ANS）、二氢黄酮醇还原酶（DFR）、查尔酮异构酶（CHI）和黄酮醇合成酶（FLS）,采用RT-q PCR技术分析Me JA处理不同时间后的表达水平,结果表明Ek CHS（unigene 045546）、Ek CHS（unigene 052162）、Ek DFR（unigene080108）、Ek DFR（unigene 080109）、Ek FLS（unigene 078670）、Ek ANS（unigene075390）等均显着上调,于处理后12 h-36 h表达量最高;Ek ANS（unigene 075388）在处理后3 h表达量显着下降,然后逐渐恢复正常;Ek CHI（unigene 040233）没有明显的趋势变化。3. 从甘遂转录组（NCBI Sequence Read Archive database:SRP126436）序列中找到FLS的编码序列（CDS）,利用RT-PCR和基因特异性引物克隆了大戟甘遂的Ek FLS全长基因。随后成功进行了载体构建:p DE1:T7-His-FLS（用于原核表达）;p CAMBIA1300:35S-FLS（用于转基因过表达）。4. 为了进一步了解Ek FLS的作用机制及其编码蛋白的信息,对Ek FLS进行了生物信息学分析:该基因CDS区全长1023 bp,编码的FLS蛋白包含340个氨基酸,分子量为38.67 k Da,等电点（p I）为6.19。该蛋白属于黄酮醇合成酶超家族,是以α-螺旋和不规则卷曲为主要结构元件,定位在细胞质中的酸性非跨膜蛋白。进化树分析表明Ek FLS与来自柑橘属的FLS蛋白质同源关系较近,且进化程度高于这些植物;原核表达SDS-PAGE分析结果表明,Ek FLS蛋白分子量约为38.5 k Da,与预测值一致,该蛋白原核表达的最优条件为:培养基占锥形瓶容积10%,菌体生长至OD600=0.9,加入终浓度0.6 mmol/L的IPTG,37℃诱导6 h。5. 将Ek FLS的编码区在35S启动子的控制下克隆到载体中,通过农杆菌转化拟南芥,获得转基因植株。为了进一步证明Me JA对植物类黄酮调控的作用,本研究采用100μM Me JA处理转基因拟南芥,结果表明Me JA有效上调了拟南芥中黄酮合成通路相关基因的表达及类黄酮的积累。此外,利用Me JA处理,并用Na Cl和PEG模拟外界高盐、干旱环境,转基因型拟南芥黄酮合成通路相关基因的表达量、POD和SOD基因的表达量以及POD和SOD的酶活性都被显着上调,类黄酮的含量也明显升高。说明过表达Ek FLS拟南芥通过提高类黄酮合成及ROS清除通路的关键酶转录表达水平,增加总黄酮及黄酮醇含量的积累,增强抗氧化酶活性以增强植物的抗氧化性,从而提高了植物的Me JA的耐受性以及耐盐耐旱性。
蓝星[10]（2019）在《米曲霉脂肪酶的基因表达、酶学性质及分子改造研究》文中指出脂肪酶（lipase,EC3.1.1.3）属于羧基酯水解酶类,用于催化水解三酰甘油,广泛存在于自然界中,其中微生物是脂肪酶的重要来源。目前对酵母、曲霉、假单胞菌、青霉、根霉等产脂肪酶的微生物研究较多。本课题主要研究的对象是米曲霉来源的脂肪酶,我们从NCBI数据库（Genbank）中选择了8种米曲霉脂肪酶基因,进行目标基因的人工合成并在大肠杆菌中实现异源表达。论文对脂肪酶酶活最高的脂肪酶基因进行分子改造,进一步提升其酶活性,并对获得的脂肪酶突变体的酶学性质进行了研究,研究结果如下:1、首先成功在大肠杆菌中表达了8种米曲霉脂肪酶基因,并对其基本酶学性质进行了研究。对根据大肠杆菌密码子偏好性优化的8种米曲霉脂肪酶基因进行人工合成,连接在质粒pET-28a（+）中,并在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中实现表达,成功构建8株重组脂肪酶工程菌。将这8株工程菌进行摇瓶发酵,离心获得菌体,经超声破碎后得到8种重组脂肪酶的粗酶液,并测定其水解活性,发现经过实验室前期挖掘和研究的AOL-3的酶活力最高,为521.12 U/g。实验对8种脂肪酶的最适温度、pH以及底物特异性进行了初步研究,发现米曲霉脂肪酶的反应最适温度在30℃-40℃之间,最适pH在6.5-7.5之间,且每一种脂肪酶都有不同的催化底物偏好性。2、实验对米曲霉脂肪酶AOL-3进行分子改造。利用易错PCR技术,结合定点饱和突变,用以三丁酸甘油酯为底物的平板来进行高效快速的筛选。第一轮随机突变后,筛到一株编号为AOL-3（38/93）的突变菌株,是AOL-3第38位的苯丙氨酸（F）突变为天冬酰胺（N）,其脂肪酶突变体命名为AOL-3F38N。脂肪酶突变体AOL-3F38N酶液的比酶活为1770.9 U/g,原始酶AOL-3酶液酶活521.12 U/g的3.6倍。在第一轮突变筛到的突变子基础上进行了第二轮随机突变,筛选到一株突变株编号为AOL-3（38/93-230/6）,是脂肪酶AOL-3F38N第230位的缬氨酸（V）突变为精氨酸（R）,其脂肪酶突变体命名为AOL-3F38N/V230R,酶液的比酶活为2094.48 U/g,是原始酶AOL-3的4.0倍。3、对脂肪酶突变体AOL-3F38N/V230R和原始AOL-3酶进行了纯化,并对AOL-3F38N/V230R的酶学性质进行了研究。AOL-3F38N/V230R和原始酶AOL-3经镍离子亲和层析后的比酶活是分别是186.81 U/mg和46.64 U/mg。脂肪酶突变体AOL-3F38N/V230R最适温度和pH分别为40℃和7.5,与原始酶AOL-3相同。在35℃-65℃的温度范围都有较好的温度稳定性,当pH大于8.0时,AOL-3F38N/V230R的酶活较低,且稳定性较差。AOL-3F38N/V230R对不同碳链长度乙酯的水解特异性发生了变化,优先水解的碳链长度从C4变为C6-C10,对中长链乙酯的水解活性有所提高,底物特异性范围变宽。在低浓度（1 mM）的金属离子环境下,实验组的金属离子对脂肪酶突变体AOL-3F38N/V230R都没有明显的抑制作用,其中Mn2+等有激活作用。在较高浓度（5 mM）的金属离子条件下,金属离子对AOL-3F38N/V230的活性具有较大的影响,Zn2+、Fe3+、Ni+完全抑制AOL-3F38N/V230的活性,Mg2+、Mn2+金属离子则有较明显的激活作用。原始酶AOL-3的Km为2.40 mM和Vmax为7.89 mM/min,脂肪酶突变体AOL-3F38N/V230R的Km为1.92 mM和Vmax为12.22mM/min。
二、水稻苯丙氨酸氨解酶基因在大肠杆菌BL21 DE3中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、水稻苯丙氨酸氨解酶基因在大肠杆菌BL21 DE3中的表达（论文提纲范文）
（1）苦荞16 kDa过敏原Fag t 2结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物源过敏研究进展 |
| 1.1.1 过敏反应 |
| 1.1.2 植物性过敏原分类 |
| 1.1.3 植物性过敏原特征 |
| 1.1.4 植物性过敏原的低敏化研究 |
| 1.2 荞麦及其过敏原研究进展 |
| 1.2.1 荞麦的种植与育种 |
| 1.2.2 荞麦过敏原研究 |
| 1.2.3 苦荞过敏原研究 |
| 1.3 植物启动子的研究进展 |
| 1.4 苯丙氨酸解氨酶在植物抗逆中的研究进展 |
| 1.5 SA与植物抗病性研究进展 |
| 1.6 选题依据及研究内容 |
| 1.6.1 选题依据 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第二章 过敏原Fag t2 稳定性、活性和结构分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 菌株和质粒 |
| 2.2.3 酶与主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 过敏原Fag t2 的进化分析及结构预测 |
| 2.3.2 过敏原基因Fag t2 组织表达特异性分析 |
| 2.3.3 过敏原Fag t2 及其突变过敏原的表达与纯化 |
| 2.3.4 过敏原Fag t2 的稳定性和活性测定 |
| 2.3.5 过敏原Fag t2 结构测定 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 过敏原Fag t2 系统进化及结构预测分析 |
| 2.4.2 过敏原基因Fag t2 组织表达特异性分析 |
| 2.4.3 过敏原Fag t2 及其突变过敏原的表达与纯化 |
| 2.4.4 过敏原Fag t2 多克隆抗体制备 |
| 2.4.5 过敏原Fag t2 结构初步探究 |
| 2.4.6 过敏原Fag t2 的稳定性和活性分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 Fag t2 启动子功能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 植物材料 |
| 3.2.2 菌株和质粒 |
| 3.2.3 酶与主要试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Fag t2 启动子元件预测与分析 |
| 3.3.2 Fag t2 启动子的截短及载体构建 |
| 3.3.3 Fag t2 启动子稳定转化拟南芥的获得及处理 |
| 3.3.4 Fag t2 启动子稳定转化拟南芥GUS染色及活性测定 |
| 3.3.5 Fag t2 启动子酵母单杂交载体的构建及其转录因子的筛选 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Fag t2 启动子生物信息学分析 |
| 3.4.2 Fag t2 启动子的截短及植物转化载体构建 |
| 3.4.3 Fag t2 启动子稳定转化拟南芥的获得与活性分析 |
| 3.4.4 酵母单杂交筛选获得 Fag t 2 启动子互作的转录因子 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 苦荞酵母双杂交文库的构建及Fag t2 互作蛋白的筛选与验证 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 菌株和质粒 |
| 4.2.3 酶和主要试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 苦荞酵母双杂交文库的构建 |
| 4.3.2 诱饵质粒的构建及文库筛选 |
| 4.3.3 Ft PALB和 Ft PALN与 Fag t2 的分子对接 |
| 4.3.4 PAL多克隆抗体制备 |
| 4.3.5 Ft PALB和 Ft PALN与 Fag t2 的互作验证 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 苦荞酵母双杂交文库的评价 |
| 4.4.2 文库筛选及比对分析 |
| 4.4.3 Fag t2与Ft PALB和 Ft PALN分子对接 |
| 4.4.4 Fag t2对Ft PALB和 Ft PALN活力的影响 |
| 4.4.5 Pull down验证Fag t2与Ft PALB和 Ft PALN互相作用 |
| 4.4.6 Fag t2与Ft PALB和 Ft PALN的亚细胞定位及共定位 |
| 4.4.7 Bi FC验证Fag t2与Ft PALB和 Ft PALN的互相作用 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 Fag t2 过表达拟南芥的干旱耐受性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 植物材料 |
| 5.2.2 菌株和质粒 |
| 5.2.3 酶和主要试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 拟南芥种植和培养条件 |
| 5.3.2 植物过表达载体的构建及拟南芥的转化与筛选 |
| 5.3.3 Fag t2-OE拟南芥干旱胁迫处理 |
| 5.3.4 拟南芥生理生化指标的测定 |
| 5.3.5 干旱胁迫后PAL活性和PAL基因的转录水平检测 |
| 5.3.6 Fag t2对PAL的泛素化修饰影响检测 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 Fag t2-OE拟南芥的筛选与鉴定 |
| 5.4.2 Fag t2-OE拟南芥表型分析 |
| 5.4.3 干旱胁迫后相关生理指标变化分析 |
| 5.4.4 干旱胁迫后At PAL活性和At PAL基因的转录水平分析 |
| 5.4.5 Fag t2-OE拟南芥抗性提高的机制分析 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 Fag t2 过表达拟南芥的细菌抗性研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 植物材料 |
| 6.2.2 实验菌株 |
| 6.2.3 酶和主要试剂 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 拟南芥种植和培养条件 |
| 6.3.2 拟南芥对病原微生物抗性检测 |
| 6.3.3 细菌处理后拟南芥中PAL基因和病程相关基因转录水平测定 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 病原微生物的抗性初筛结果 |
| 6.4.2 Fag t2-OE拟南芥对病原细菌的抗性分析 |
| 6.4.3 细菌处理后拟南芥 PAL 和病程相关基因转录水平分析 |
| 6.4.4 Fag t2-OE拟南芥抗性变化的可能机制分析 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）基于转录组学银杏黄酮醇合成酶FLS基因的筛选、克隆和表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 银杏及其黄酮类化合物研究现状 |
| 1.1.1 银杏及其药用价值综述 |
| 1.1.2 银杏黄酮类化合物主要成分 |
| 1.1.3 黄酮类化合物的生物学功能 |
| 1.1.4 黄酮类化合物的生物合成通路 |
| 1.1.5 黄酮类化合物合成途径中的关键酶 |
| 1.2 水杨酸对植物黄酮类化合物的调控 |
| 1.3 茉莉酸对植物黄酮类化合物的调控 |
| 1.4 选题背景及课题的研究意义 |
| 1.4.1 课题来源 |
| 1.4.2 目的和意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 银杏黄酮醇合成酶FLSs基因的筛选及系统进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 转录组测序材料 |
| 2.1.2 银杏FLSs基因的鉴定 |
| 2.1.3 银杏FLSs基因的蛋白结构和保守基序分析 |
| 2.1.4 银杏FLSs基因家族的分类和系统进化分析 |
| 2.1.5 银杏FLSs基因的表达分析 |
| 2.2 实验结果与讨论 |
| 2.2.1 转录组测序数据分析 |
| 2.2.2 银杏FLSs基因的蛋白结构和保守基序分析 |
| 2.2.3 银杏FLSs基因系统进化分析 |
| 2.2.4 银杏FLSs基因组织表达分析 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 银杏黄酮醇合成酶FLS基因的克隆分析与原核表达 |
| 3.1 GbFLS基因的克隆与验证 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 实验结果与分析 |
| 3.2 GbFLS基因的原核载体构建及表达 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 结果与分析 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 外源水杨酸和茉莉酸对银杏黄酮醇合成酶GbFLS基因的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验材料和试剂 |
| 4.1.2 实验设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 外源水杨酸对银杏黄酮醇合成酶FLS基因的影响 |
| 4.2.2 外源茉莉酸对银杏黄酮醇合成酶FLS基因的影响 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 外源水杨酸和茉莉酸喷施处理对银杏叶片黄酮醇合成酶FLS基因表达量的影响 |
| 4.3.2 外源水杨酸和茉莉酸喷施处理对银杏叶片黄酮含量的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 总结、创新点与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 中英文缩写符号对照 |
| 附录B 银杏叶黄酮HPLC图谱 |
| 附录C 攻读学位期间的学术成果 |
| 致谢 |
（3）O-甲基转移酶的筛选及O-甲基非编码氨基酸的生物合成研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 甲基化反应 |
| 1.1.1 化学合成 |
| 1.1.2 生物合成 |
| 1.2 O-甲基转移酶 |
| 1.2.1 O-甲基转移酶的分类 |
| 1.2.2 O-甲基转移酶mfnG |
| 1.3 O-甲基氨基酸 |
| 1.3.1 O-甲基-酪氨酸 |
| 1.3.2 O-甲基-苏氨酸 |
| 1.3.3 O-甲基-丝氨酸 |
| 1.4 代谢工程方法 |
| 1.4.1 传统方法 |
| 1.4.2 基因组编辑技术 |
| 1.4.3 新式基因编辑技术 |
| 1.5 本课题研究设计方案与意义 |
| 1.5.1 本课题研究意义 |
| 1.5.2 本课题研究方案 |
| 2 O-甲基转移酶载体的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 引物 |
| 2.2.3 试剂与设备 |
| 2.2.4 实验相关试剂的配制 |
| 2.3 实验内容 |
| 2.3.1 目的基因的氨基酸序列 |
| 2.3.2 pACYDuet-1-mfnG载体的构建 |
| 2.3.3 pACYDuet-1-OMT载体的构建 |
| 2.3.4 pACYDuet-1-MT载体的构建 |
| 2.4 实验结果及讨论 |
| 2.4.1 pACYDuet-1-mfnG载体的构建 |
| 2.4.2 pACYDuet-1-OMT载体的构建 |
| 2.4.3 pACYDuet-1-MT载体的构建 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 O-甲基转移酶的表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 试剂与仪器 |
| 3.2.3 实验试剂的配制 |
| 3.3 实验内容 |
| 3.3.1 O-甲基转移酶的表达 |
| 3.3.2 O-甲基转移酶的分离纯化 |
| 3.3.3 SDS-PAGE蛋白电泳 |
| 3.3.4 Bradford法测定蛋白溶液的浓度 |
| 3.4 实验结果及讨论 |
| 3.4.1 O-甲基转移酶蛋白电泳的鉴定 |
| 3.4.2 O-甲基转移酶浓度的测定 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 O-甲基转移酶的酶学研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 酶 |
| 4.2.2 试剂与仪器 |
| 4.2.3 实验试剂的配制 |
| 4.3 实验内容 |
| 4.3.1 O-甲基转移酶体外酶催化体系的构建 |
| 4.3.2 O-甲基-酪氨酸含量的测定 |
| 4.3.3 O-甲基-苏氨酸含量的测定 |
| 4.4 实验结果及讨论 |
| 4.4.1 O-甲基-酪氨酸标准曲线的绘制 |
| 4.4.2 O-甲基-苏氨酸标准曲线的绘制 |
| 4.4.3 体外O-甲基转移酶的催化活性 |
| 4.4.4 O-甲基转移酶对O-甲基-苏氨酸的催化活性 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 O-甲基-酪氨酸的生物合成 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 质粒与菌株 |
| 5.2.2 试剂与仪器 |
| 5.2.3 实验试剂的配制 |
| 5.3 实验内容 |
| 5.3.1 O-甲基转移酶载体质粒的转化 |
| 5.3.2 摇瓶发酵 |
| 5.3.3 样品的检测分析 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 摇瓶发酵过程中OD600的变化 |
| 5.4.2 样品中O-甲基-酪氨酸的含量测定 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（4）桑树褪黑素及其异构体生物合成机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 褪黑素及异构体的概述 |
| 1.1.1 褪黑素的概述 |
| 1.1.2 褪黑素异构体的概述 |
| 1.2 褪黑素及异构体的分布 |
| 1.2.1 褪黑素的分布 |
| 1.2.2 褪黑素异构体的分布 |
| 1.3 褪黑素及异构体的生理功能 |
| 1.3.1 褪黑素在动物体中的功能 |
| 1.3.2 褪黑素在植物中中的功能 |
| 1.3.3 褪黑素异构体的功能 |
| 1.4 植物褪黑素及异构体的生物合成 |
| 1.4.1 褪黑素生物合成路径 |
| 1.4.2 色氨酸脱羧酶(TDC) |
| 1.4.3 色胺5-羟化酶(T5H) |
| 1.4.4 5-羟色胺N-乙酰基转移酶(SNAT) |
| 1.4.5 N-乙酰5-羟色胺甲基转移酶(ASMT) |
| 1.4.6 咖啡酸-氧-甲基转移酶(COMT) |
| 1.5 桑树中褪黑素研究进展 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究的目的及意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 不同桑树品种/种质褪黑素及异构体的鉴定和定量分析以及高含量种质筛选 |
| 2.2.2 川桑褪黑素高效生物合成分子机制解析 |
| 2.2.3 桑树褪黑素异构体生物合成分子途径解析 |
| 2.3 研究路线 |
| 第三章 不同桑树品种褪黑素及异构体的鉴定和定量分析 |
| 3.1 材料的数据 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 3.1.3 主要使用仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同桑树品种资源中褪黑素检测与鉴定 |
| 3.2.2 不同桑树品种资源褪黑素及其异构体总含量变化 |
| 3.2.3 不同采摘季节的桑叶褪黑素及其异构体含量变化 |
| 3.2.4 不同发育程度的桑叶褪黑素及其异构体含量变化 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 3.3.1 本章讨论 |
| 3.3.2 本章小结 |
| 第四章 川桑褪黑素生物合成相关基因的鉴定、克隆与生物信息学分析 |
| 4.1 材料及主要试剂 |
| 4.1.1 生物材料 |
| 4.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 4.1.3 主要使用仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 桑树褪黑素生物合成相关基因的鉴定 |
| 4.2.2 RNA提取及质量检测 |
| 4.2.3 川桑褪黑素生物合成相关基因的克隆 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 川桑中褪黑素生物合成相关基因的的序列鉴定 |
| 4.3.2 MnTDC基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.3.3 MnT5H基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.3.4 MnSNAT基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.3.5 MnASMT基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.3.6 MnCOMT基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 本章讨论 |
| 4.4.2 本章小结 |
| 第五章 川桑褪黑素生物合成相关基因表达分析和亚细胞定位 |
| 5.1 材料及主要试剂 |
| 5.1.1 生物材料 |
| 5.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 5.1.3 主要使用仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 实时荧光定量PCR检测褪黑素合成相关基因在川桑不同组织的表达量 |
| 5.2.2 亚细胞定位引物设计及载体的选择 |
| 5.2.3 亚细胞定位载体的构建 |
| 5.2.4 亚细胞定位载体转化农杆菌 |
| 5.2.5 褪黑素生物合成相关基因的亚细胞定位 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 川桑褪黑素生物合成相关基因在不同组织表达分析 |
| 5.3.2 川桑褪黑素生物合成相关基因的亚细胞定位 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 5.4.1 本章讨论 |
| 5.4.2 本章小结 |
| 第六章 川桑褪黑素生物合成机制研究 |
| 6.1 材料及主要试剂 |
| 6.1.1 生物材料 |
| 6.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 6.1.3 主要使用仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 原核表达载体的构建 |
| 6.2.2 纯化靶标蛋白 |
| 6.2.3 靶标蛋白酶活测定 |
| 6.2.4 影响酶活因素 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 MnTDC重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.3.2 MnT5H2重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.3.3 MnSNAT5重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.3.4 MnASMTs重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.3.5 MnCOMT1重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 6.4.1 本章讨论 |
| 6.4.2 本章小结 |
| 第七章 桑树褪黑素异构体生物合成分子途径解析 |
| 7.1 材料及主要试剂 |
| 7.1.1 生物材料 |
| 7.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 7.1.3 主要使用仪器 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 RNA提取及质量检测 |
| 7.2.2 实时荧光定量PCR检测褪黑素合成相关基因在桑树不同组织的表达量 |
| 7.2.3 桑树MaASMT4、MaASMT9、MaASMT16和MaASMT20基因的克隆 |
| 7.2.4 原核表达载体的构建 |
| 7.2.5 纯化靶标蛋白 |
| 7.2.6 靶标蛋白酶活测定 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 桑树不同组织中褪黑素和异构体的检测与鉴定 |
| 7.3.2 褪黑素生物合成相关基因在桑树组织特异性表达分析 |
| 7.3.3 MaASMT4和MaASMT20在桑树中克隆分析 |
| 7.3.4 MaASMTs重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 7.4 讨论与小结 |
| 7.4.1 本章讨论 |
| 7.4.2 本章小结 |
| 第八章 全文总结 |
| 8.1 不同桑树品种褪黑素及异构体的鉴定和定量分析以及高含量种质筛选 |
| 8.2 川桑褪黑素高效生物合成分子机制 |
| 8.3 桑树褪黑素异构体生物合成分子途径 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的文章及参研的课题 |
| 致谢 |
（5）生物催化级联反应制备丙酮酸及L-酪氨酸衍生物（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 丙酮酸 |
| 1.1.1 丙酮酸及其应用 |
| 1.1.2 丙酮酸的制备 |
| 1.1.2.1 化学合成法 |
| 1.1.2.2 生物法 |
| 1.1.3 丙酮酸的稳定性 |
| 1.2 L-酪氨酸及其衍生物 |
| 1.2.1 L-酪氨酸及其衍生物概论 |
| 1.2.2 L-酪氨酸及其衍生物的制备 |
| 1.2.2.1 化学合成法 |
| 1.2.2.2 酶催化法 |
| 1.3 短链L-2-羟基酸氧化酶 |
| 1.3.1 短链L-2-羟基酸氧化酶简介 |
| 1.3.2 短链L-2-羟基酸氧化酶结构特征与反应机制 |
| 1.4 过氧化氢酶 |
| 1.4.1 过氧化氢酶概述 |
| 1.4.2 过氧化氢酶的分类及结构特征 |
| 1.4.3 过氧化氢酶的催化机理 |
| 1.4.4 过氧化氢酶的来源 |
| 1.4.5 过氧化氢酶的应用 |
| 1.5 酪氨酸酚裂解酶 |
| 1.5.1 酪氨酸酚裂解酶概述 |
| 1.5.2 酪氨酸酚裂解酶的结构特征 |
| 1.5.3 酪氨酸分裂解酶催化机理 |
| 1.5.4 酪氨酸酚裂解酶的改造 |
| 1.5.5 酪氨酸酚裂解酶的应用 |
| 1.6 大肠杆菌表达优化 |
| 1.6.1 表达条件 |
| 1.6.2 宿主的选择 |
| 1.6.3 RBS (Ribosome binding site)序列 |
| 1.6.4 分子伴侣 |
| 1.7 生物催化级联反应 |
| 1.7.1 生物催化级联反应简介 |
| 1.7.2 级联反应在生物催化中的应用 |
| 1.7.2.1 辅酶再生 |
| 1.7.2.2 促进反应平衡 |
| 1.7.2.3 去除有毒副产物 |
| 1.8 本课题的研究思路与主要内容 |
| 第二章 短链L-2-羟基酸氧化酶的筛选及可溶性表达研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 培养基与试剂配置 |
| 2.2.4 菌种和质粒 |
| 2.2.5 基因的扩增 |
| 2.2.6 表达载体与工程菌构建 |
| 2.2.7 重组大肠杆菌诱导产酶 |
| 2.2.8 大肠杆菌超声破碎及SDS-PAGE检测 |
| 2.2.9 蛋白质浓度的测定 |
| 2.2.10 蛋白纯化(重力柱法) |
| 2.2.11 酶活测定 |
| 2.2.12 酶学性质研究 |
| 2.2.13 RBS高通量筛选方法 |
| 2.2.14 分子伴侣与AvLOX共表达 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 短链L-2-羟基酸氧化酶的筛选 |
| 2.3.2 短链L-2-羟基酸氧化酶的热稳定性比较 |
| 2.3.4 乳酸氧化酶AvLOX酶学性质分析 |
| 2.3.4.1 最适温度与温度稳定性 |
| 2.3.4.2 最适pH与pH稳定性 |
| 2.3.5 增强AvLOX可溶性表达 |
| 2.3.5.1 宿主对AvLOX可溶性表达的影响 |
| 2.3.5.2 诱导温度对AvLOX可溶性表达的影响 |
| 2.3.5.3 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对AvLOX可溶性表达的影响 |
| 2.3.5.4 核糖体结合位点(RBS)对表达的影响 |
| 2.3.5.5 分子伴侣对表达的影响 |
| 2.3.5.6 乳酸氧化酶AvLOX可溶性表达前后对比 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 过氧化氢酶的筛选及体外双酶级联体系的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验药品与试剂 |
| 3.2.3 培养基与试剂配制 |
| 3.2.4 菌株和质粒 |
| 3.2.5 过氧化氢酶的克隆 |
| 3.2.6 表达载体与工程菌构建 |
| 3.2.7 重组大肠杆菌诱导产酶 |
| 3.2.8 大肠杆菌超声破碎及SDS-PAGE检测 |
| 3.2.9 蛋白纯化(重力柱法) |
| 3.2.10 酶活测定 |
| 3.2.11 半衰期测定 |
| 3.2.12 酶学性质研究 |
| 3.2.13 丙酮酸稳定性测试 |
| 3.2.14 双酶偶联体系的构建 |
| 3.2.15 分析方法 |
| (1) 液相检测方法 |
| (2) 反应收率计算 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 过氧化氢酶酶库的建立 |
| 3.3.2 过氧化氢酶的筛选 |
| 3.3.3 过氧化氢酶UtCAT的酶学性质分析 |
| 3.3.3.1 过氧化氢酶UtCAT的纯化 |
| 3.3.3.2 最适温度和温度稳定性 |
| 3.3.3.3 最适pH与pH稳定性 |
| 3.3.3.4 过氧化氢浓度对UtCAT酶活的影响 |
| 3.3.4 丙酮酸的稳定性 |
| 3.3.4.1 丙酮酸在过氧化氢溶液中的稳定性 |
| 3.3.4.2 丙酮酸在粗酶液中的稳定性 |
| 3.3.5 体外双酶偶联体系的构建 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 全细胞催化剂的构建及在丙酮酸制备中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验药品与试剂 |
| 4.2.3 培养基与试剂配制 |
| 4.2.4 菌种和质粒 |
| 4.2.5 乳酸氧化酶和过氧化氢酶酶活测定 |
| 4.2.6 液相检测 |
| 4.2.7 共表达重组质粒的构建 |
| 4.2.8 RBS序列设计 |
| 4.2.9 不同共表达菌株的催化效率对比 |
| 4.2.10 全细胞催化制备丙酮酸的优化 |
| 4.2.11 1L规模底物分批补料制备丙酮酸 |
| 4.2.12 丙酮钠的分离纯化 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 AvLOX和UtCAT共表达策略 |
| 4.3.2 不同共表达策略下蛋白表达分析和活力测定 |
| 4.3.3 RBS序列优化后蛋白表达分析和活力测定 |
| 4.3.4 共表达菌株催化效率评估 |
| 4.3.5 全细胞催化制备丙酮酸工艺优化 |
| 4.3.5.5 底物浓度对催化的影响 |
| 4.3.5.6 常压下底物分批补料反应 |
| 4.3.6 丙酮酸的分离提纯 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 酪氨酸酚裂解酶克隆表达及理性改造 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验药品与试剂 |
| 5.2.3 培养基与试剂配制 |
| 5.2.4 菌种和质粒 |
| 5.2.5 重组表达质粒的构建 |
| 5.2.6 定点突变 |
| 5.2.7 重组大肠杆菌诱导产酶 |
| 5.2.8 多序列比对 |
| 5.2.9 同源建模与分子对接 |
| 5.2.10 标准品Rac-4b和d-g化学酶法合成 |
| 5.2.11 底物特异性研究 |
| 5.2.12 HPLC检测方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 酪氨酸酚裂解酶的克隆表达 |
| 5.3.2 酪氨酸酚裂解酶酶学特性研究 |
| 5.3.2.1 最适反应温度和温度稳定性 |
| 5.3.2.2 最适反应pH和pH稳定性 |
| 5.3.2.3 不同铵盐对酶活的影响 |
| 5.3.2.4 丙酮酸浓度对TTPL酶活的影响 |
| 5.3.2.5 酪氨酸酚裂解酶TTPL底物谱 |
| 5.3.3 基于结构-功能关系的TTPL理性设计 |
| 5.3.4 定点突变与活力测定 |
| 5.3.5 不同突变子的底物谱分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 三酶级联反应合成L-酪氨酸衍生物的工艺研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验仪器 |
| 6.2.2 实验药品与试剂 |
| 6.2.3 培养基与试剂配制 |
| 6.2.4 菌种和质粒 |
| 6.2.5 大肠杆菌诱导产酶 |
| 6.2.6 多酶体系的反应条件优化 |
| 6.2.7 离子交换色谱法纯化L4a-g |
| 6.2.8 L-4a-g光学纯度测定 |
| 6.2.9 酪氨酸衍生物L-4a-g产品鉴定 |
| 6.2.10 乳酸氧化酶、过氧化氢酶和酪氨酸酚裂解酶在苯酚中的稳定性 |
| 6.2.11 0.5 L规模底物流加补料反应制备酪氨酸 |
| 6.2.12 L-酪氨酸衍生物的纯化 |
| 6.2.13 HPLC检测方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 多酶级联反应催化合成3-氟-L-酪氨酸L4f |
| 6.3.2 AvLOX和TTTLM380V双酶配比对多酶催化3f的影响 |
| 6.3.3 菌体添加量对催化效率的影响 |
| 6.3.4 提高底物3f浓度的研究 |
| 6.3.5 优化前后工艺参数及指标对比 |
| 6.3.6 两步级联反应与一步C-C偶联的比较 |
| 6.3.7 一釜式两步级联反应合成酪氨酸衍生物L-4a-g |
| 6.3.8 0.5 L规模底物流加补料反应 |
| 6.3.9 L-酪氨酸衍生物产品的分离纯化 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 论文的创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（6）海洋滑动细菌天然产物的挖掘、disorazoles的异源表达及肿瘤靶向递送（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症及其目前的治疗方法 |
| 1.1.1 癌症概述 |
| 1.1.2 目前癌症主流的治疗方法 |
| 1.1.3 化疗药物的分类 |
| 1.2 新颖天然产物的挖掘 |
| 1.2.1 基于培养条件优化的天然产物挖掘 |
| 1.2.2 基于基因组序列的天然产物挖掘 |
| 1.2.3 基于新的分类单元的天然产物挖掘 |
| 1.3 抗肿瘤天然产物 |
| 1.3.1 Disorazoles |
| 1.3.2 铁载体 |
| 1.4 肿瘤靶向的细菌及其在抗肿瘤中的应用 |
| 1.4.1 肿瘤靶向细菌的历史 |
| 1.4.2 肿瘤靶向细菌定向改造 |
| 1.4.3 利用肿瘤靶向细菌定向运送抗肿瘤因子 |
| 1.5 立题依据与意义 |
| 第二章 海洋滑动细菌中抗肿瘤化合物的挖掘 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株、质粒与引物 |
| 2.2.2 主要试剂与耗材 |
| 2.2.3 主要培养基与溶液配方 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 样品采集与处理 |
| 2.3.2 海洋滑动细菌的分离、鉴定与保藏 |
| 2.3.3 菌株W222基因组提取、测序及基因簇预测分析 |
| 2.3.4 菌株W222发酵产物分析及铁载体的确定 |
| 2.3.5 菌株W222中铁载体的分离鉴定 |
| 2.3.6 新型铁载体fulvivirgamide的异源表达 |
| 2.3.7 Fulvivirgamides细胞毒性的测定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 分离得到新物种 |
| 2.4.2 菌株W222基因组及基因簇信息 |
| 2.4.3 新型铁载体fulvivirgamide离子峰的确定 |
| 2.4.4 Fulvivirgamide的分离纯化及结构鉴定 |
| 2.4.5 Fulvivirgamide的异源表达及其生物合成途径 |
| 2.4.6 Fulvivirgamide的细胞毒性 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 抗肿瘤化合物disorazoles异源表达宿主的构建 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株、质粒与引物 |
| 3.2.2 主要试剂与耗材 |
| 3.2.3 主要培养基与溶液配方 |
| 3.2.4 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 无痕敲除的原理及敲除质粒的构建 |
| 3.3.2 耐药泵的敲除及验证 |
| 3.3.3 突变株与野生株生理生化特性比较 |
| 3.3.4 Disorazole Z生物合成基因簇的克隆 |
| 3.3.5 结合转移及发酵产物检测 |
| 3.3.6 E264内源启动子的筛选 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 构建敲除质粒 |
| 3.4.2 突变株的构建及验证 |
| 3.4.3 突变株与野生型生理生化特性 |
| 3.4.4 Disorazole Z生物合成基因簇的克隆 |
| 3.4.5 结合转移与异源表达分析 |
| 3.4.6 内源性启动子筛选 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 B.thailandensis E264肿瘤定植效果及其作为药物靶向递送载体初探 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株(细胞系)、质粒与引物 |
| 4.2.2 主要试剂及耗材 |
| 4.2.3 主要培养基与溶液配方 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.2.5 实验动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 质粒及减毒菌株的构建 |
| 4.3.2 荷瘤小鼠模型的构建 |
| 4.3.3 细菌悬液的制备及小鼠尾静脉注射 |
| 4.3.4 瘤内细菌计数及瘤体大小测量 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 构建的质粒及减毒菌株 |
| 4.4.2 野生型与减毒菌株毒性及定植能力对比 |
| 4.4.3 野生型E264与E264::disA抗肿瘤效果比较 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 正在准备的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）代谢工程改造地衣芽胞杆菌高效合成苯乙醇（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 苯乙醇简介 |
| 1.1.1 苯乙醇理化性质 |
| 1.1.2 苯乙醇用途 |
| 1.1.3 苯乙醇的合成方法 |
| 1.2 微生物合成苯乙醇的研究进展 |
| 1.2.1 微生物合成苯乙醇的合成途径 |
| 1.2.2 微生物合成苯乙醇的代谢调控 |
| 1.2.3 转化苯丙氨酸为苯乙醇的研究进展 |
| 1.2.4 从头合成苯乙醇的研究进展 |
| 1.2.5 芽胞杆菌合成芳香族化合物研究进展 |
| 1.3 芽胞杆菌代谢工程改造的“新工具、方法和策略” |
| 1.3.1 基因组编辑工具 |
| 1.3.2 基因表达与调控表达工具 |
| 1.3.3 系统生物学在芽胞杆菌代谢工程中的应用 |
| 1.3.4 底盘细胞的构建及优化在芽胞杆菌代谢工程中的应用 |
| 1.3.5 途径模块化工程在芽胞杆菌代谢工程中的应用 |
| 1.3.6 转运蛋白工程在芽胞杆菌代谢工程中的应用 |
| 1.3.7 辅因子工程在芽胞杆菌代谢工程中的应用 |
| 1.4 论文立题依据与主要内容 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 第2章 地衣芽胞杆菌多重CRISPRi系统的构建及应用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 培养基和培养方式 |
| 2.2.4 分子生物学操作 |
| 2.2.5 基因敲除、整合和启动子置换菌株的构建 |
| 2.2.6 CRISRPi质粒的构建 |
| 2.2.7 基因表达质粒构建 |
| 2.2.8 分析方法 |
| 2.2.9 基因转录水平分析 |
| 2.2.10 数据处理 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 dcas9 整合表达菌株的构建 |
| 2.3.2 CRISPRi体系功能测试 |
| 2.3.3 CRISPRi系统的应用 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 转化法合成苯乙醇的地衣胞杆菌菌株构建及工艺优化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 试剂和设备 |
| 3.2.3 培养基及培养条件 |
| 3.2.4 分子生物学操作 |
| 3.2.5 基因表达质粒的构建 |
| 3.2.6 CRISRPi菌株的构建 |
| 3.2.7 分析方法 |
| 3.2.8 基因转录水平分析 |
| 3.2.9 统计方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 高耐受苯乙醇菌株的选择 |
| 3.3.2 引入艾利希途径构建高效转化苯丙氨酸的地衣芽胞杆菌菌株 |
| 3.3.3 苯丙氨酸生物催化工艺优化 |
| 3.3.4 3-L发酵罐补料发酵 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 地衣芽胞杆菌苯乙醇脱氢酶的筛选与鉴定 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 试剂和仪器 |
| 4.2.3 培养基和培养条件 |
| 4.2.4 序列分析及进化树构建 |
| 4.2.5 分子生物学操作 |
| 4.2.6 基于CRISPR/Cas9n基因编辑技术构建基因缺失菌株 |
| 4.2.7 表达菌株的构建 |
| 4.2.8 YugJ诱导表达与纯化 |
| 4.2.9 YugJ酶学性质分析 |
| 4.2.10 分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 生物信息分析地衣芽胞杆菌醇脱氢酶 |
| 4.3.2 YugJ是地衣芽胞杆菌中关键的苯乙醇脱氢酶 |
| 4.3.3 YugJ多重序列比对 |
| 4.3.4 YugJ体外功能研究 |
| 4.3.5 YugJ是最适宜的苯乙醇脱氢酶 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 代谢工程改造地衣芽胞杆菌从头合成苯乙醇 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 试剂和仪器 |
| 5.2.3 培养基及培养条件 |
| 5.2.4 分子生物学 |
| 5.2.5 基于同源重组原理的基因编辑方法进行基因敲除、整合和置换 |
| 5.2.6 基于CRISPR/Cas9n方法基因敲除菌株构建 |
| 5.2.7 多基因共表达质粒的构建 |
| 5.2.8 分析方法 |
| 5.2.9 基因转录水平分析 |
| 5.2.10 数据处理方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 构建杂合型艾利希途径 |
| 5.3.2 磷酸烯醇式丙酮酸供应是限制苯乙醇合成的关键因子 |
| 5.3.3 强化莽草酸/苯丙酮酸合成途径提高苯乙醇产量 |
| 5.3.4 阻断副产物的合成促进苯乙醇合成 |
| 5.3.5 苯乙醇高产菌株发酵特性和相关基因转录水平分析 |
| 5.3.6 高产工程菌株PE33 苯乙醇发酵工艺优化 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）红豆杉紫杉烷7-木糖基转移酶基因鉴定及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 国内外研究现状及评述 |
| 1.2.1 紫杉醇应用现状 |
| 1.2.2 紫杉醇生物合成及7-木糖基紫杉烷 |
| 1.2.3 糖基化及糖基转移酶研究进展 |
| 1.2.4 MYB转录因子调控机制研究进展 |
| 1.3 研究目标和主要研究内容 |
| 1.3.1 关键的科学问题与研究目标 |
| 1.3.2 主要研究内容 |
| 1.3.3 研究技术路线 |
| 1.4 项目来源与经费支持 |
| 2 红豆杉木糖基转移酶基因鉴定及表达分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 红豆杉木糖基转移酶候选基因筛选及生物学特性分析 |
| 2.3.2 红豆杉木糖基转移酶候选基因蛋白二级结构预测 |
| 2.3.3 红豆杉木糖基转移酶候选基因组织表达模式分析 |
| 2.3.4 红豆杉木糖基转移酶候选基因底物处理条件下表达分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 红豆杉木糖基转移酶基因克隆、蛋白表达及功能研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 红豆杉木糖基转移酶候选基因原核表达菌株筛选 |
| 3.3.2 红豆杉木糖基转移酶候选基因原核表达优化 |
| 3.3.3 红豆杉木糖基转移酶候选基因酵母表达 |
| 3.3.4 农杆菌介导的84K杨转目的基因表达分析 |
| 3.3.5 农杆菌介导的目的基因瞬转烟草表达分析 |
| 3.3.6 红豆杉木糖基转移酶候选蛋白体外酶活实验及产物检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 红豆杉糖基转移酶基因的筛选与鉴定 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 红豆杉细胞底物或产物处理样品转录组测序 |
| 4.3.2 红豆杉细胞转录组测序数据分析 |
| 4.3.3 红豆杉细胞转录组测序差异表达分析 |
| 4.3.4 红豆杉尿苷二磷酸糖基转移酶基因家族成员鉴定 |
| 4.3.5 红豆杉尿苷二磷酸糖基转移酶基因家族系统发育分析 |
| 4.3.6 红豆杉尿苷二磷酸糖基转移酶保守结构域分析 |
| 4.3.7 红豆杉差异表达糖基转移酶基因筛选 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 红豆杉糖基转移酶基因的克隆、蛋白表达及功能研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 红豆杉糖基转移酶原核表达蛋白分析 |
| 5.3.2 红豆杉糖基转移酶原核表达蛋白体外酶活分析 |
| 5.3.3 农杆菌介导红豆杉糖基转移酶基因转84K杨 |
| 5.3.4 84K杨转基因植株Tm UGT34 表达分析 |
| 5.3.5 农杆菌介导瞬时红豆杉小苗Tm UGT34 表达分析 |
| 5.3.6 农杆菌介导瞬转红豆杉小苗次生代谢产物检测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 红豆杉Tm UGT34 基因转录调控因子分析 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 Tm UGT34 基因启动子与MYB转录因子结合序列预测 |
| 6.3.2 红豆杉R2R3-MYB基因家族成员鉴定 |
| 6.3.3 红豆杉R2R3-MYB基因家族系统发育分析 |
| 6.3.4 红豆杉R2R3-MYB蛋白保守结构域分析 |
| 6.3.5 红豆杉R2R3-MYB基因组织特异性表达分析 |
| 6.3.6 红豆杉mi RNA介导的Tc MYBs基因转录后调控 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7 结论和展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 引物列表 |
| 附录B 英文缩略词 |
| 在读期间的学术研究 |
| 致谢 |
（9）茉莉酸甲酯对甘遂黄酮积累的影响及EkFLS（黄酮醇合成酶）基因功能验证与表达调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 中药甘遂及黄酮类化合物研究现状 |
| 1.1.1 甘遂植物形态及药用价值 |
| 1.1.2 甘遂主要化学成分 |
| 1.1.3 黄酮类化合物的生物学功能 |
| 1.1.4 黄酮类化合物生物合成的研究进展 |
| 1.1.4.1 黄酮类化合物的生物合成途径 |
| 1.1.4.2 黄酮类化合物合成途径中的相关酶 |
| 1.1.4.3 黄酮类化合物合成酶间的协同与竞争关系 |
| 1.2 茉莉酸甲酯(MeJA)对植物生长代谢的调控 |
| 1.2.1 MeJA诱导植物基因特异性表达 |
| 1.2.2 MeJA促进植物次生代谢物的合成 |
| 1.2.3 MeJA改变植物形态或生理功能 |
| 1.3 逆境胁迫下黄酮类化合物的抗逆机制 |
| 1.3.1 生物及非生物胁迫 |
| 1.3.2 活性氧(ROS)、过氧化物酶(POD)和超氧物歧化酶(SOD) |
| 1.3.3 逆境胁迫下黄酮类化合物的抗逆机制 |
| 1.4 研究内容、目的和意义 |
| 1.4.1 研究目的和意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 茉莉酸甲酯对甘遂黄酮积累及类黄酮合成通路相关基因表达量的影响 |
| 前言 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 植物材料处理与采集 |
| 2.1.2 主要实验试剂和药品 |
| 2.1.3 主要仪器及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分光光度计法测量甘遂总黄酮含量 |
| 2.2.1.1 甘遂总黄酮提取方法 |
| 2.2.1.2 分光光度计法测甘遂总黄酮含量 |
| 2.2.2 色谱法测量甘遂黄酮醇含量 |
| 2.2.2.1 甘遂黄酮醇提取方法 |
| 2.2.2.2 薄层色谱(TLC)方法 |
| 2.2.2.3 液相色谱(HPLC)方法 |
| 2.2.3 RT-q PCR法分析相关基因表达模式 |
| 2.2.3.1 提取甘遂叶片总RNA |
| 2.2.3.2 RNA反转录及c DNA第一链的合成 |
| 2.2.3.3 Real-time RT-q PCR |
| 2.3 研究结果 |
| 2.3.1 MeJA处理对甘遂各部位的总黄酮含量的影响 |
| 2.3.1.1 芦丁标准曲线的绘制 |
| 2.3.1.2 MeJA处理对甘遂总黄酮含量积累的影响 |
| 2.3.1.3 方法学考察结果 |
| 2.3.2 甘遂中槲皮素和山奈酚的测定 |
| 2.3.3 MeJA处理对甘遂中类黄酮合成通路相关基因表达量的影响 |
| 2.4 总结与讨论 |
| 第三章 甘遂黄酮醇合成酶基因(EkFLS)的克隆分析与原核表达 |
| 前言 |
| 3.1 EkFLS基因的克隆与验证 |
| 3.1.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 研究结果 |
| 3.1.4.1 EkFLS基因的克隆与验证 |
| 3.1.4.2 Ek FLS基因c DNA全长的获得 |
| 3.2 EkFLS基因的生物信息学分析 |
| 3.2.1 实验方法 |
| 3.2.2 研究结果 |
| 3.2.2.1 EkFLS基因蛋白质的理化性质分析 |
| 3.2.2.2 EkFLS蛋白质功能结构域分析 |
| 3.2.2.3 EkFLS蛋白质的疏水性与跨膜区 |
| 3.2.2.4 EkFLS蛋白质的磷酸化位点预测 |
| 3.2.2.5 EkFLS蛋白质的信号肽及亚细胞定位预测 |
| 3.2.2.6 EkFLS蛋白质同源性比对及系统进化树的构建 |
| 3.2.2.7 EkFLS蛋白质的二级结构预测 |
| 3.2.2.8 EkFLS蛋白质的三级结构同源建模 |
| 3.3 甘遂黄酮醇合成酶基因(EkFLS)原核表达及表达条件的优化 |
| 3.3.1 实验材料与试剂 |
| 3.3.1.1 实验材料 |
| 3.3.1.2 各种试剂及培养基配制 |
| 3.3.1.3 实验仪器及设备 |
| 3.3.2 试验方法 |
| 3.3.2.1 原核表达载体PDE1:T7-FLS构建 |
| 3.3.2.2 感受态DH5α转化 |
| 3.3.2.3 感受态BL21(DE3)转化 |
| 3.3.2.4 原核表达最优表达条件的筛选 |
| 3.3.2.5 SDS-PAGE |
| 3.3.3 研究结果 |
| 3.3.3.1 质粒PDE1:T7-FLS的构建 |
| 3.3.3.2 p DE1:T7-FLS( BL21)表达菌的构建及表达 |
| 3.3.3.3 EkFLS原核表达条件优化 |
| 3.4 总结与讨论 |
| 第四章 甘遂黄酮醇合成酶基因(EkFLS)的功能验证与表达调控研究 |
| 前言 |
| 4.1 过表达EkFLS拟南芥株系的获得与验证 |
| 4.1.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.1.1 实验材料 |
| 4.1.1.2 各种试剂及培养基、抗生素配制 |
| 4.1.1.3 实验仪器及设备 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.2.1 甘遂Ek FLS基因c DNA全长的克隆 |
| 4.1.2.2 构建过表达p CAMBIA1300:35s-FLS载体 |
| 4.1.2.3 农杆菌介导的拟南芥侵染实验 |
| 4.1.2.4 Hyg平板筛选阳性植株 |
| 4.1.2.5 转基因拟南芥阳性植株鉴定 |
| 4.1.3 研究结果 |
| 4.1.3.1 EkFLS基因克隆 |
| 4.1.3.2 克隆载体TOPO-FLS菌检结果 |
| 4.1.3.3 过表达p CAMBIA1300:35s-FLS载体菌检及测序结果 |
| 4.1.3.4 质粒p CAMBIA1300:35s-FLS转化GV3101 农杆菌 |
| 4.1.3.5 阳性植株鉴定 |
| 4.2 EkFLS调控拟南芥在非生物胁迫应答中的功能研究 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.1.1 实验材料 |
| 4.2.1.2 各种试剂及培养基配制 |
| 4.2.1.3 实验仪器及设备 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 试剂处理 |
| 4.2.2.2 拟南芥形态学比较方法 |
| 4.2.2.3 拟南芥总黄酮、黄酮醇测量方法 |
| 4.2.2.4 拟南芥相关基因表达量测量方法 |
| 4.2.2.5 SOD、POD酶活性测量方法 |
| 4.2.3 研究结果 |
| 4.2.3.1 野生型与转基因型拟南芥形态学比较 |
| 4.2.3.2 野生型与转基因型拟南芥总黄酮及黄酮醇含量 |
| 4.2.3.3 野生型与转基因型拟南芥相关基因表达模式 |
| 4.2.3.4 野生型与转基因型拟南芥SOD、POD的酶活性 |
| 4.3 总结与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）米曲霉脂肪酶的基因表达、酶学性质及分子改造研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脂肪酶的概述 |
| 1.1.1 脂肪酶的来源、分类 |
| 1.1.2 脂肪酶的结构及催化机理 |
| 1.1.3 脂肪酶的应用 |
| 1.2 米曲霉及其脂肪酶简介 |
| 1.2.1 米曲霉的简介 |
| 1.2.2 米曲霉脂肪酶的研究进展 |
| 1.3 酶的分子改造概述 |
| 1.3.1 酶的分子改造技术简介 |
| 1.3.2 高通量筛选方法简介 |
| 1.4 本研究的意义与内容 |
| 第二章 米曲霉脂肪酶基因的表达及其酶学性质的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 培养基与相关溶液 |
| 2.2.3 试剂与材料 |
| 2.2.4 主要器材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 米曲霉脂肪酶基因的获得 |
| 2.3.2 米曲霉脂肪酶的表达 |
| 2.3.3 酶活测定方法 |
| 2.3.4 蛋白含量测定 |
| 2.3.5 SDS-PAGE分析 |
| 2.3.6 米曲霉脂肪酶的酶学性质研究 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 米曲霉脂肪酶的基因人工合成和分析 |
| 2.4.2 米曲霉脂肪酶基因在大肠杆菌中表达 |
| 2.4.3 米曲霉脂肪酶的酶学性质研究 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 米曲霉脂肪酶AOL-3的分子改造 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 培养基与缓冲溶液 |
| 3.2.3 试剂与材料 |
| 3.2.4 主要器材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 米曲霉脂肪酶AOL-3基因的引物设计及合成 |
| 3.3.2 易错PCR模板的制备 |
| 3.3.3 易错PCR扩增脂肪酶AOL-3基因 |
| 3.3.4 载体的双酶切及纯化 |
| 3.3.5 扩增的目的基因与载体连接 |
| 3.3.6 E.coli BL21(DE3)感受态的准备及转化 |
| 3.3.7 重组质粒的验证及突变率的测定 |
| 3.3.8 突变文库的筛选 |
| 3.3.9 定点饱和突变 |
| 3.3.10 第二轮随机突变及定点饱和突变 |
| 3.3.11 脂肪酶的酶活测定方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 米曲霉脂肪酶突变文库的构建 |
| 3.4.2 突变文库的初筛 |
| 3.4.3 阳性转化子的复筛 |
| 3.4.4 突变子基因的序列测序 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 脂肪酶突变体的结构分析及酶学性质的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 培养基与缓冲溶液 |
| 4.2.3 试剂与材料 |
| 4.2.4 主要器材 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 镍离子亲和层析方法 |
| 4.3.2 SDS-PAGE分析方法 |
| 4.3.3 脂肪酶的酶活测定方法 |
| 4.3.4 蛋白含量的测定方法 |
| 4.3.5 脂肪酶突变体的酶学性质研究 |
| 4.3.6 米曲霉脂肪酶AOL-3的同源建模及突变位点分析 |
| 4.3.7 米曲霉脂肪酶AOL-3及脂肪酶突变体的分子对接分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 蛋白纯化后SDS-PAGE分析 |
| 4.4.2 脂肪酶突变体的酶学性质研究 |
| 4.4.3 原始脂肪酶AOL-3和脂肪酶突变体的结构差异分析 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 总结和展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 1 作者简历 |
| 2 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 3 参与的科研项目及获奖情况 |
| 学位论文数据集 |
四、水稻苯丙氨酸氨解酶基因在大肠杆菌BL21 DE3中的表达（论文参考文献）
- [1]苦荞16 kDa过敏原Fag t 2结构与功能研究[D]. 郑蓓. 西北农林科技大学, 2021
- [2]基于转录组学银杏黄酮醇合成酶FLS基因的筛选、克隆和表达分析[D]. 杨竣茹. 中南林业科技大学, 2021
- [3]O-甲基转移酶的筛选及O-甲基非编码氨基酸的生物合成研究[D]. 张国庆. 青岛科技大学, 2021(02)
- [4]桑树褪黑素及其异构体生物合成机制研究[D]. 郑莎. 西南大学, 2021(01)
- [5]生物催化级联反应制备丙酮酸及L-酪氨酸衍生物[D]. 李国四. 浙江大学, 2020(05)
- [6]海洋滑动细菌天然产物的挖掘、disorazoles的异源表达及肿瘤靶向递送[D]. 王宗杰. 山东大学, 2020(08)
- [7]代谢工程改造地衣芽胞杆菌高效合成苯乙醇[D]. 占杨杨. 湖北大学, 2020(01)
- [8]红豆杉紫杉烷7-木糖基转移酶基因鉴定及功能研究[D]. 胡新玲. 中国林业科学研究院, 2020
- [9]茉莉酸甲酯对甘遂黄酮积累的影响及EkFLS（黄酮醇合成酶）基因功能验证与表达调控研究[D]. 张悦. 西北大学, 2020(02)
- [10]米曲霉脂肪酶的基因表达、酶学性质及分子改造研究[D]. 蓝星. 浙江工业大学, 2019(03)