一、重组人canstatin的克隆、表达及其活性鉴定（论文文献综述）
张晶晶[1]（2019）在《CSP Ⅰ-plus修饰的内皮抑制素抑制肝细胞癌转移的初步研究》文中研究表明目的:通过体内体外实验验证CSPⅠ-plus修饰的内皮抑制素（rES-CSP）抑制肝细胞癌转移的作用,并初步探讨rES-CSP抑制肝细胞癌转移的可能机制,以期为肝细胞癌转移的治疗提供实验依据与药物开发思路。方法:1、利用大肠杆菌E.col BL21（DE3）原核表达系统表达rES-CSP重组蛋白及可溶性表达条件（诱导温度和时间）的优化。2、利用HisTrapTMHP亲和层析柱进行可溶性重组蛋白的纯化;通过RP-HPLC和BCA试剂盒检测其纯度和浓度。3、以CSPⅠ-plus和Endostar作为对照,通过CCK-8实验检测不同浓度rES-CSP的活性;细胞划痕、Transwell及黏附实验检测各组对高转移肝癌细胞HCCLM3迁移、侵袭及黏附的作用。4、慢病毒转染法将带有荧光素酶（Luc）基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因的质粒转染到HCCLM3细胞株;用嘌呤霉素筛选转染后的HCCLM3细胞,并通过ATP荧光检测仪检测荧光素酶的活性,荧光显微镜观察GFP的表达情况。获得同时表达Luc和GFP的双标高转移肝癌细胞株Luc-GFP/HCCLM3。5、取对数生长期的标记Luc和GFP的HCCLM3细胞肝原位直接注射,建立裸鼠原位肝癌模型。6、实验分为①生理盐水对照组,②Endostar组,③rES-CSP组。尾静脉隔天给药,连续用药50天。每周采用动物活体成像技术实时动态观察各处理组裸鼠肝原位肿瘤生长及肝脏肿瘤转移情况。7、将成像8周后的各组裸鼠安乐死处理,病理解剖观察各处理组对裸鼠肝原位肿瘤生长及转移情况。剥离肝原位瘤块测量肿瘤体积、重量并计算抑瘤率及肺转移率。同时取裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肿瘤做组织切片。8、HE染色观察rES-CSP对肿瘤及转移灶形态学影响和裸鼠各脏器的毒副作用。9、实时荧光定量PCR法检测rES-CSP对HCCLM3细胞血管生成因子和转移相关分子mRNA表达的影响。10、蛋白质免疫印迹法检测rES-CSP对HCCLM3细胞血管生成因子和转移相关分子蛋白表达的影响。11、免疫组织化学法检测rES-CSP对肿瘤组织及转移灶血管生成因子和转移相关分子蛋白表达的影响。结果:1、获得纯度和浓度都较高的rES-CSP可溶性重组蛋白。2、体外实验表明:与空白对照组、CSPⅠ-plus和Endostar相比,rES-CSP具有抑制HCCLM3细胞增殖、迁移、侵袭及黏附的作用。3、通过鉴定显示Luc和GFP标记的高转移肝癌细胞株构建成功。4、裸鼠原位肝癌模型成功建立。利用活体成像系统连续观察原位肝癌模型组裸鼠,随着时间延长,荧光信号逐渐增强。与生理盐水、Endostar组相比、rES-CSP组随着时间延长腹部发光减弱显着,实体观察显示rES-CSP和Endostar组的人肝癌裸鼠荷瘤的抑瘤率分别为42.4.6±5.39%和11.1 ± 1.88%。另外,HE染色表明重组蛋白能促使肿瘤坏死,抑制肿瘤血管的生成。5、组织生物发光表明与生理盐水、Endostar组相比、rES-CSP组肝原位和肺转移灶生物发光信号明显减弱。实体观察显示对照组、Endostar组、rES-CSP组肺转移率分别为71%、50%、42.8%。另外,肺转移灶HE染色结果提示重组蛋白能抑制肿瘤细胞浸润生长。6、HE染色验证了 rES-CSP对裸鼠各重要脏器无明显毒副作用。7、与对照组相比,rES-CSP使肝癌细胞血管生成因子VEGF的蛋白表达下调,CSP I-plus的竞争抑制剂肝素钠作用后VEGF表达上调。另外,rES-CSP使肝癌细胞转移相关分子integrinβ1和MMP2的蛋白表达下调,而E-cadherin蛋白表达没有明显变化。肝素钠作用后MMP2和integrinβ1表达上调。8、与对照组相比,rES-CSP使肿瘤组织血管生成因子VEGF、转移相关分子MMP2和integrinβ1蛋白的阳性表达降低,而E-cadherin蛋白阳性表达没有明显变化。肺转移灶中各处理组转移相关分子E-cadherin、integrinβ1和MMP2蛋白表达没有显着差异。结论:1、体外实验验证rES-CSP可溶性重组蛋白具有抑制高转移肝癌细胞HCCLM3转移的作用;2、建立了双荧光标记的裸鼠原位肝癌模型,体内实验验证rES-CSP可溶性重组蛋白具有抑制肝原位肿瘤生长的作用及抑制肝脏肿瘤的肺部转移能力;3、初步确定了 rES-CSP可能是通过下调血管生成因子VEGF,转移相关分子integrinβ1和MMP2发挥抑制肿瘤生长和转移的作用,也可能通过干扰肝癌细胞表面HSPG介导的肿瘤迁移发挥抑制肝癌转移的作用。
杨志伟[2]（2016）在《角质细胞生长因子-2（KGF-2）研究进展》文中研究指明角质细胞生长因子-2（KGF-2）能够特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移,增强细胞合成的能力,因而在治疗皮肤损伤及溃疡、美容等方面有多重应用,为当前国际细胞因子药物开发的热点。本文对KGF-2的分子结构和性质、生物学功能、受体、表达及纯化条件优化、稳定性等方面进行综述。
何刚[3]（2014）在《人源KGF-2基因的克隆、表达，纯化及其活性的鉴定》文中研究说明皮肤是人机体最重要免疫器官之一，其损伤的修复是一个非常复杂的过程,由多种生长因子及细胞因子介导。人纤维细胞生长因子（FGF）超家族是参与结缔组织生长、皮肤愈合的主要因子，人角质细胞因子-2（KGF-2）是该超家族成员之一。KGF-2对多种因素如急慢性炎症、溃疡、物理化学烧伤等引起的组织器官损伤的修复过程发挥重要作用，并且在整个脊椎动物的胚胎发育过程中起着不可替代的作用，参与并调控多种组织和器官的形成和分化。因此KGF-2有着很好的应用前景，在临床上可以用于治疗多种表皮损伤相关疾病。本文的主要研究内容为成功构建了KGF-2重组高效表达载体；通过初步发酵条件优化，获得了稳定高表达的工程菌株；经过纯化工艺摸索及优化，得到稳定简便且获得高纯度蛋白的纯化工艺，具有极大的应用价值。纯化后的蛋白经过活性检测，具有一定的生物学活性，为以后的科研应用打下了坚实的基础。主要研究结果如下：1.通过优化密码子，成功构建了pET-30a（+）-hKGF2重组表达载体，通过表达条件的优化获得高效、可溶性表达的KGF-2重组蛋白。2.通过确定培养基配方、诱导温度、诱导时间、诱导pH等发酵主要条件进行工艺参数优化，在此基础上进一步确立了高密度发酵条件。3.建立了适合放大的纯化工艺路线，确立了简便快捷可线性放大的纯化工艺，通过高压破菌、Heparin亲和层析、超滤脱盐及DEAE阴离子层析方法，得到了高纯度的目标蛋白。4. rhKGF-2对体外培养角质形成细胞的生长有非常显着的促进作用,在3D气液培养体系中亦可促进组织工程皮肤表皮中角质形成细胞的生长及分化。
杨传定[4]（2013）在《犬表皮细胞生长因子的克隆和表达及活性鉴定》文中研究说明表皮细胞生长因子（epidermal growth factor, EGF）是一种促进细胞增殖、分化和迁移的多肽。EGF能刺激细胞增殖、分化和迁移，参与一系列的生理过程如胚胎发育、组织再生、内分泌系统功能和调节、伤口愈合、胃液分泌等，并且在细胞信号传导过程中起重要做用，EGF及其受体对于肿瘤的发生也有重要的关系。目前人表皮细胞生长因子已经广泛运用于医疗及化妆品等领域中，而犬的表皮细胞生长因子的研究开发，将对犬的医疗保健等方面有着重要的意义。1不同品种犬表皮生长因子基因的克隆与分子特征分析实验目的主要是克隆不同品种犬的表皮生长因子（canine epidermal growthfactor, cEGF）基因，分析不同品种犬EGF基因的分子特征及犬EGF与几种常见物种的EGF差异性比较。收集11个常见的不同品种犬的血样，提取基因组，采用PCR方法分别扩增出编码cEGF基因的N端和C端结构域的犬32号染色体20和21号外显子，插入pMDTM18-T Vector，构建重组质粒，并转化大肠杆菌DH5α感受态，PCR鉴定阳性克隆后送样测序，用20和21号外显子序列拼接出cEGF全长，采用BLAST和DNAStar软件分析序列相互关系特征。结果成功扩增出11种不同品种犬EGF编码基因，全长为156bp，编码52个氨基酸，犬EGF基因序列同源性在97.4%-100%之间。根据cEGF编码基因推导氨基酸序列同源性为98.1%-100%，除了杜宾犬（Doberman Pinscher）EGF氨基酸在52位点处R→F，其余的氨基酸序列都一致。cEGF氨基酸序列与几种其他动物及人EGF相比较发现：cEGF与家猫EGF（Felis catus EGF）同源性很高，达到94.2%。结论不同品种犬的EGF编码基因同源性很高、非常保守，犬EGF与家猫EGF同源性很高。2犬表皮生长因子的原核表达、纯化、活性鉴定及多抗的制备用DNA重组技术合成犬表皮生长因子（canine epidermal growth factor, cEGF）基因，在大肠杆菌中高效表达，检测重组蛋白的生物活性，制备cEGF兔源多抗血清。设计4条引物，用SOE-PCR合成cEGF基因，将cEGF基因克隆至表达载体pET-24a、pET-28a进行原核表达，对表达得到的重组蛋白纯化，MTT法测定重组蛋白的生物活性，分析标融合签蛋白的大小对重组蛋白生物活性的影响。纯化后的rcEGF免疫日本大耳白兔，制备兔源多抗血清，用间接ELISA法检测所得多克隆抗体的效价。SOE-PCR合成得到cEGF基因，大小为156bp，编码52个氨基酸，构建了3个融合表达质粒，分别编码61、75、95个氨基酸。IPTG诱导表达，大部分表达为包涵体，通过变性、纯化、复性的过程后，每1L菌液得到重组蛋白rcEGF1、rcEGF2、rcEGF3分别为5.2mg、16.1mg、9.3mg，MTT法实验表明rcEGF1、rcEGF2、rcEGF3的生物活性依次降低。用间接ELISA法检测所得多克隆抗体的效价为：兔血清效价1：51200。结果表明，原核表达含一个6×His纯化标签的rcEGF，具有生物活性。标签蛋白的大小影响重组蛋白的生物活性。3犬表皮生长因子的酵母表达。将cEGF基因克隆至酵母表达载体pPICZαA，构建酵母表达质粒pPICZαA-cEGF，将质粒pPICZαA-cEGF电转化至巴斯德毕赤酵母菌X33，经过甲醇诱导表达，SDS-PAGE检测，结果表明cEGF基因片段分泌表达。
徐采云[5]（2013）在《转录因子SP1参与TNF-α介导的肺泡上皮细胞氧化损伤中Nox1基因的表达调控》文中研究指明1研究背景急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）是指心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性进行性呼吸衰竭,其病理特征为由于肺微血管通透性增高、肺泡渗出物富含蛋白质的液体,进而导致肺水肿及透明膜的形成,其病理生理改变时肺容量的减少、肺顺应性的降低和严重的通气血流比例失调,临床表现为呼吸窘迫和严重的低氧血症。暴露于危险因素的患者,发病率极高,早在1995年,Hudson[1]等发表了关于脓毒症和创伤患者7天内发生ARDS的发病率为100%的研究报道。随着诊疗水平的提高,ARDS的发病率及死亡率稍有下降。然而,本病起病急骤,发展迅猛,预后极差,一直是医疗界的难题。炎症反应失控和氧化应激损伤是ARDS重要的发病机制。细菌性和病毒性肺炎是ARDS最常见的原因。其中,革兰氏阴性细菌性肺炎所致的脓毒症休克更易引起ARDS。革兰氏阴性细菌表面的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）通过与体内单核-巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞等细胞膜上的受体结合,启动细胞炎症反应,导致多种细胞因子如肿瘤坏死因子a（tumor necrosis factor-a, TNF-a）、白细胞介素-1β（interleukine-1β, IL-1β）和IL-6等大量生成。这些因子进一步作用到其他细胞,引起炎症反应扩大,最终形成ARDS病人和动物的血清和肺泡灌洗液中TNF-α水平显着升高,TNF-α是启动和放大炎症反应的关键介质。其血清中的表达量与疾病的进展、预后密切相关[6]。ARDS小鼠模型中,炎症和氧化应激水平正相关,肺组织活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）水平高的小鼠,肺部损伤更严重[7]。Syrkina[8]等研究发现,ARDS小鼠早期即出现氧化与抗氧化失衡,抗氧化剂乙酰半胱氨酸能抑制ARDS小鼠肺内还原型谷胱甘肽的下降,减轻中性粒细胞浸润,降低肺泡灌洗液中炎症因子的水平,减少气道结构细胞凋亡。本实验室前期研究和国外报道均发现,抑制TNF-α表达能减轻RDS小鼠的氧化应激损伤。肺上皮细胞,是肺脏结构和功能的基础,尤其是Ⅱ型肺泡上皮细胞,对肺泡内水份的清除能力,损伤后的修复能力,以及对其生长、分化的调节在ARDS的进展和转归中起着重要作用。氧化应激发生后,过量的ROS产生可以损伤肺泡上皮细胞,破坏上皮屏障功能,导致疾病进展。本实验室前期研究表明,用TNF-α刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549,能够在体外模拟ARDS过度炎症反应和氧化应激的病理生理特点。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase, Nox）是催化生成ROS重要的酶,内源性的ROS主要由Nox催化产生,一方面,它的产物ROS能参与正常的生理功能,包括机体免疫、信号转导及生化反应；另一方面,又能与DNA、蛋白质、类脂化合物等生物分子发生化学反应并破坏其结构。小鼠肺泡上皮细胞主要表κNoxK Nox2、Nox4,其中,Nox1在ROS产生及上皮功能破坏中作用最为突出。研究表明TNF-a能通过上调Nox基因的从而增加细胞ROS水平,也有研究显示Nox1基因沉默可以降低TNF-a预处理的平滑肌细胞内的ROS水平。有关于肠道粘膜炎症的研究中,Nox1蛋白表达的增加,催化的ROS生成增多,从而导致炎症因子的表达上调,诱导了肠粘膜细胞凋亡。因此,研究Nox1的表达调控,是研究ROS导致氧化应激损伤的基础。基因转录水平调控是基因表达最关键的步骤。Kuwano [1等分析肠粘膜炎症性疾病发现：TNF-a活化肠上皮细胞中Noxl的亚Noxol,从而使ROS的表达量达对照组的9倍,牛Noxol5’端序列截短后构建萤光素酶表达载体发现,在-585至-452bp之间存在着TNF-α相关的启动子活化区域,该区域的AP1位点对于TNF-α介导的Noxl表达有重要调控作用。Manea等进一步证实了AP1对于Noxl的表达具有转录调控作用。NF-κB是重要的转录因子,抑制转录因子NF-κB能显着下调TNF-α介导的Nox1的表达,并降低ROS水平,这与本实验室前期研究结果相同。然而,本实验室沉默NF-κB,Nox1表达仅部分下调,因此我们大胆猜测还有其他转录因子共同作用于Nox1的表达调控。转录因子SP1是作用广泛的转录因子之一,通过结合于目的基因的启动子序列,SP1能发挥促进细胞生长、胚胎发育和肿瘤发生发展等作用。研究发现SP1参与了TNF-α介导的众多基因表达的转录调控。本研究发现SP1与Nox1在TNF-α介导的肺泡Ⅱ型上皮细胞氧化损伤中表达同时增加。而且,生物信息学分析发现,Nox1基因翻译起始位点上游存在多个SP1转录因子结合位点。因此,我们进一步假设：TNF-α介导的肺泡上皮细胞氧化损伤中,SP1是Noxl的一个重要的转录因子,通过与Nox1启动子结合调控其表达。2研究目的评估TNF-α相关的肺泡上皮细胞氧化损伤中,Nox1与ROS的表达水平及相互关系；探讨转录因子SP1在TNF-α介导的Nox1活化中的表达调控作用及机制。3方法3.1沉默Nox1对A549细胞中TNF-α介导的ROS水平的影响3.1.1TNF-α介导的A549细胞氧化损伤中,Nox1与ROS的表达水平根据TNF-α预处理浓度不同将实验分为Ong/mL、10ng/mL、25ng/mL,50ng/mL4个组（本课题除转染时TNF-α刺激时间为18h,其余所有实验TNF-α刺激时间为24h）。分别用RT-PCR、Western-blot检测检测A549细胞Nox1mRNA和蛋白水平的表达。ROS荧光探针DCFH-DA检测A549细胞ROS表达水平。3.1.2TNF-α介导的A549细胞氧化损伤中,Nox1与ROS的相互关系实验分组为：Nox1沉默组、沉默阴性对照组、Noxl沉默+TNF-α （50ng/mL）组、沉默阴性对照+TNF-α （50ng/mL）组。用RT-PCR检测沉默效率,ROS荧光探针DCFH-DA检测Noxl沉默后A549细胞的ROS表达水平。3.2转录因子SP1参与TNF-α介导的肺泡上皮细胞氧化损伤中Noxl的转录调控3.2.1TNF-a介导的A549细胞氧化损伤中,SP1的表达水平根据TNF-a预处理浓度不同将实验分为Ong/mL、10ng/mL、50ng/mL4组。RT-PCR、Western-blot分别检测检测A549细胞的SPlmRNA和蛋白水平表达。3.2.2TNF-a介导的A549细胞氧化损伤中,SP1对Noxl的转录调控将实验分为SP1沉默组、沉默阴性对照组、SP1沉默+TNF-α （50ng/mL）组、沉默阴性对照+TNF-α （50ng/mL）组。RT-PCR检测SP1沉默效率及沉默后A549细胞的Nox1mRNA水平。3.3Noxl启动子重要调控区域的鉴定3.3.1Noxl启动子萤光素酶表达载体的构建以正常人全血基因组DNA为模板,PCR扩增Noxl翻译起始位点上游1415bp片段,并设计引物,继续扩增1415bp内,以翻译起始位点上游第1位碱基开始逐渐延长的5个启动子片段,连接到pGL3-Basic表达载体,进行酶切和测序验证。3.3.2Noxl启动子截短片段萤光素酶表达载体的活性鉴定质粒转染分为TNF-a刺激（50ng/mL）和未刺激两组,每组按照启动子的长短分为pGL3-Basic、pGL3-143/ATG、pGL3-192/ATG、pGL3-401/ATG、 pGL3-534/ATG、pGL3-947/ATG、pGL3-1415/ATG共7个亚组（整个实验中DNA片段长短未包括保护性碱基和酶切位点的长度,以翻译起始位点为+1,翻译起始位点上游的序列为其负值,如-500是翻译起始位点的前第500位碱基）。与海肾内对照质粒pRL-TK共同瞬时转染真核细胞,双萤光素酶报告系统检测相对萤光素酶活性。3.4SP1参与Nox1转录调控的机制研究3.4.1缺失SP1结合位点的Nox1启动子萤光素酶表达载体的构建根据启动子截短片段的活性,翻译起始位点上游-534～-401范围内存在Nox1启动子的重要调控区域。其内存在2个SP1结合位点,利用重叠PCR缺失2个SP1位点所在的38bp,连接到pGL3-Basic,命名为pGL3-1377/ATG,进行酶切和测序验证。3.4.2缺失SP1结合位点的Noxl启动子萤光素酶活性检测实验分为pGL3-1377/ATG.pGL3-1415/ATG、pGL3-1377/ATG+TNF-α （50ng/mL）.pGL3.1415/ATG+TNF-α（50ng/mL）.pGL3-1377/ATCr+TNF-α （50ng/mL）+SPlsiRNA、pGL3-1415/ATG+TNF-a（50ng/mL）+SPlsiRNA6组,瞬时转染A549细胞,双萤光素酶报告系统检测相对萤光素酶活性。3.4.3EMSA检测SP1位点的蛋白结合能力38bp包括2个SPl（-439--430bp；-427---418bp）.1个GATA-1（-443--434bp）.1个Oct-1（-418--409bp）.因此需要设计凝胶电泳迁移实验（EMSA）明确SPl结合位点的结合能力。实验分组为1：阴性对照组,2：样品反应组,3：探针冷竞争反应组,4：突变探针的冷竞争反应组,5：SP1-1组,6：SPl-2组,7：GATA-1,8：Oct-1组。其中,1-4组EMSA反应中加入的为缺失片段（38bp）探针,5-8组的探针分别为缺失片段上截取的的转录因子结合位点序列。3.5统计学方法采用spss13.0软件包进行统计学分析,计量资料数据以均数士标准差（X±s）表示。不同浓度TNF-α刺激A549细胞后的Nox1和SPlmRNA、蛋白表达及ROS水平用单因素方差分析。首先进行方差齐性和总体组间差异检验,总体有差异后,进行多重比较,方差齐用LSD,方差不齐用Tamhane检验。涉及转染siRNA或DNA质粒及TNF-α刺激等多个处理因素的实验中,统计学方法采用析因分析,P<0.05有统计学差异。4结果4.1沉默Nox1对A549细胞中TNF-α介导的ROS水平的影响4.1.1TNF-α介导的A549细胞氧化损伤中,Nox1与ROS的表达水平单因素方差分析结果显示,不同浓度TNF-α刺激的A549细胞, NoxlmRNA,Nox1蛋白、ROS表达水平有统计学差异（F=742.2, P<0.000;F=596.398,P<0.000;F=374.945,P<0.000）。多重比较结果提示,每两组之间均有统计学差异（所有P值均小于0.000）,从均值看,Ong/mL组低于10ng/mL组,10ng/mL组低于25ng/mL组,25ng/mL组低于5Ong/mL组,随着TNF-α浓度增高,NoxlmRNA,Nox1蛋白、ROS表达水平随之增高。4.1.2Nox1沉默效率检测及Nox1沉默对ROS水平的影响Nox1沉默组Nox1表达下降73%,提示沉默效率可用于后续实验。析因分析结果提示：TNF-α刺激后,NoxlmRNA表达水平有显着差异（F=346.966,P<0.000）,TNF-α刺激的A549细胞ROS水平有显着差异（F=286.485,P<0.000）,刺激组ROS水平（493.000±7.722）显着高于对照组（308.167±7.722）,Nox1沉默和沉默对照组,TNF-α刺激均能导致ROS的显着性差异（t=-6.117,P=0.005；t=-17.361,P<0.000）。4.2转录因子SP1参与TNF-α介导的肺泡上皮细胞氧化损伤中Nox1的转录调控4.2.1SP1mRNA, SP1蛋白水平检测单因素方差分析结果显示,各组A549细胞SP1mRNA和蛋白表达水平有统计学差异（F=516.52, P<0.000; F=520.333, P＜0.000）.多重比较结果提示,每两组之间均有统计学差异（所有P值均小于0.000）)。从均值看,Ong/mL低于10ng/mL组,10ng/mL低于25ng/mL组,25ng/mL低于50ng/mL组,随着TNF-α浓度增高,SP1蛋白水平相应增高。4.2.2SP1沉默验证SP1siRNA瞬时转染A549细胞,提取RNA进行沉默效率验证。在TNF-a（50ng/mL）处理组与未处理组,SP1siRNA均能下调SP1%的表达70%,沉默效率可用于后续实验。析因分析结果显示TNF-a能显着上调SPlmlRNA水平（F=1962.083,P<0.000）, TNF-a组SP1mRNA表达（均数为0.924±0.665）显着高于对照组（均数为0.547±0.037）。4.2.3SP1沉默对NoxlmRNA表达的影响析因分析结果显示：SP1沉默与沉默对照之间NoxlmRNA水平有显着差异（F=12.401,P=0.008）,在TNF-a未刺激组和刺激组,SP1沉默与沉默对照比较均有统计学差异t-8.349, P=0.00h;=-2.999, P=0.04)。TNF-α （50ng/mL）处理细胞后,NoxlmRNA水平有显着差异（F=5228.510,P<0.000）,在SP1沉默与沉默阴性对照组,TNF-a （50ng/mL）均能显着上调NoxlmRNA的表达（t=-41.237P=0.001, t=-70.298P<0.000）。4.3Noxl启动子重要调控区域的鉴定4.3.1通过酶切及测序验证,截短启动子片段的萤光素酶表达载体pGL3-Noxl构建成功；4.3.2pGL3-401/ATG与pGL3-534/ATG比较萤光素酶活性增加有统计学差异,TNF-a后同样有统计学差异；4.3.3转染pGL3-Noxl后,TNF-a刺激能增强pGL3-534/ATG，pGL3-947/ATG, pGL3-1415/ATG组萤光素酶活性。4.4SPl参与Noxl转录调控的机制研究4.4.1构建缺失SP1位点的重组质粒pGL3-1377/ATG通过酶切和测序验证,上部分实验中Noxl启动子重要调控区域SP1结合位点缺失的重组质粒pGL3-1377/ATG构建成功,相比pGL3-1415/ATG,缺失了预计的38bp。4.4.2缺失SP1位点对萤光素酶活性的影响析因分析结果提示：缺失38bp片段对Nox1启动子活性影响有统计学差异（F=84.459,P<0.000）,pGL3-1377/ATG组萤光素酶活性（均数为35.857±2.537）低于pGL3-1415/ATG（均数45.357±3.629）,提示38bp内存在较重要的启动子调控区域。加入TNF-a刺激后,pGL3-1377/ATG和pGL3-1415/ATG萤光素酶活性增加均有统计学差异（P<0.000）。转染SPlSiRNA对pGL3-1377/ATG组萤光素酶活性影响无统计学差异（F=0.617,P=0.0549）,pGL3-1415/ATG组转染SPlsiRNA萤光素酶活性变化有统计学差异（F=4.565,P=0.001）。4.4.3SP1位点的蛋白结合能力按照生物信息学分析,Noxl启动子重要调控区域的38bp存在包括SP1在内的4个转录因子结合位点,构建了该4个结合位点的EMSA探针,结果提示,-427--418bp的SP1结合位点能结合转录因子,其余3个位点不具有生物学活性。5结论Noxl是TNF-α介导的肺泡上皮细胞氧化损伤中内源性ROS的重要催化酶；SP1是TNF-α介导的氧化损伤中Nox1活化的一个重要转录因子；SP1对Nox1转录调控机制的阐明为ARDS过程中炎症继发氧化应激损伤的机制研究奠定基础。
左小虎[6]（2012）在《毕赤酵母表达甘露糖化人溶菌酶研究》文中认为胞内菌的治疗是目前临床医疗的难题之一。如结核分枝杆菌、沙门伤寒菌、嗜肺军团菌等胞内菌,它们通常寄生在人体吞噬细胞内,往往会对人体造成慢性持续性感染。当这些病菌侵染人体后会被吞噬细胞吞噬,但吞噬细胞不能像裂解大肠杆菌等非胞内菌那样将其杀死。例如胞内菌中的结核分枝杆菌已演化出了逃逸吞噬细胞裂解的机制,它通过阻止其所在吞噬泡的酸化进程,来阻止吞噬泡与溶酶体的融合。这样结核分枝杆菌就能长期寄生在胞内,并在人体免疫能力下降时侵染周围细胞。胞内菌的治疗主要是用抗生素等抗菌药长期疗法,大多数的抗生素等抗菌药治疗胞外菌疗效好,但它们很难进入细胞内或入胞浓度低难以杀死胞内寄生菌,并且长期用药也容易产生耐药菌。为探索解决胞内菌的治疗难题,本研究利用毕赤酵母表达甘露糖化人溶菌酶,并利用该酶具有的甘露糖残基是巨噬细胞表面甘露糖受体的配体这一特点,研究利用巨噬细胞受体与配体之间的相互作用介导甘露糖化人溶菌酶内吞,以达到杀死寄生在巨噬细胞内病菌的目的。巨噬细胞等吞噬细胞是人体的固有免疫细胞,它们构成人体的第二道防线。巨噬细胞能通过细胞表面受体来识别入侵机体的病原体,在众多的表面受体中,甘露糖受体是重要的病原体模式识别受体之一。巨噬细胞能通过甘露糖受体的介导作用,将带有甘露糖糖链修饰的病原体内吞到胞内。因此利用甘露糖残基修饰的药物靶向巨噬细胞是一条值得探索的药物递送途径。巴斯德毕赤酵母表达系统是成功的蛋白分泌表达系统之一,该系统能对蛋白进行多种翻译后加工修饰,如能特异性在NXS/T（X为除脯氨酸以外的所有氨基酸）位点的天冬酰胺上进行外侧链为甘露糖残基的糖基化修饰。利用毕赤酵母的这一特性,可以使具有N-糖基化位点的蛋白进行甘露糖化修饰。人溶菌酶具有水解细菌肽聚糖层中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡糖胺之间的β-1.4糖苷键能力,它能杀死革兰氏阳性菌,在体内的补体的帮助下对革兰氏阴性菌也有一定的抑杀作用,因此具有潜在的药用价值。但是天然的人溶菌酶没有N-糖基化位点,理论上用毕赤酵母表达该蛋白也不会产生N-糖基化修饰。为获得甘露糖化修饰的人溶菌酶及对其相关特性的研究,本实验从以下几个方面进行：1、利用毕赤酵母表达甘露糖化修饰的人溶菌酶突变体本研究得到C-端融合2个N-糖基化位点序列的人溶菌酶突变体的融合基因,并以此构建了pPICZaA-hLYZ-myc-His载体,将该载体转化毕赤酵母GS115菌株。得到重组菌分泌表达的蛋白通过SDS-PAGE分析显示为一弥散的条带,弥散蛋白相对分子质量（Mr）位于20-45kDa之间。取其中Mr最小的带做肽指纹图谱分析,结果该重组蛋白的氨基酸序列与人源溶菌酶lysozyme precursor（EC3.2.1.17）的氨基酸重合率达36%；Western印迹表明弥散的重组蛋白均能与鼠抗人溶菌酶单克隆抗体特异性结合；重组蛋白经过PNGase F酶切分析,SDS-PAGE显示弥散条带消失,在理论Mr附近出现一条分子量均一的条带；用伴刀豆蛋白A（ConA）对该重组蛋白进行检测,结果表明该重组蛋白可以与ConA特异性结合。以上结果表明得到的重组蛋白为甘露糖化修饰的人溶菌酶。2、甘露糖化修饰的人溶菌酶可以被巨噬细胞内化通过构建人溶菌酶与增强型绿色荧光蛋白融合蛋白的融合基因载体pPICZaA-hLYZ/eGFP,电转GS115构建重组菌GS115/pPICZaA-hLYZ/eGFP,该重组菌诱导表达重组融合蛋白,通过硫酸铵沉淀、G25柱脱盐、镍亲和层析纯化获得目的重组融合蛋白,脱去咪唑与盐后冻干浓缩,将该重组融合蛋白与Raw264.7细胞共孵育,用激光共聚焦显微镜观察,发现有绿色荧光物质进入Raw264.7,而在有甘露糖竞争性配体甘露聚糖存在时,观察不到有绿色荧光物质进入Raw264.7细胞。此现象说明甘露糖化人溶菌酶能进入巨噬细胞且这一过程是由甘露糖受体介导的。3、低甘露糖化糖基酵母工程菌GJK05表达人溶菌酶及其活性鉴定通过构建pPICZaA-hLYZ载体及用作对照的载体pPICZaA-hLYZ（N/Q）,电转化低糖基化酵母工程菌及GS115菌株,分别构建重组菌表达重组蛋白hLYZ及hLYZ（N/Q）。用伴刀豆蛋白A（ConA）检测重组蛋白的甘露糖化修饰；平板抑菌圈法比较重组人溶菌酶的活性,发现GS115表达高甘露糖化的重组人溶菌酶影响了其抑菌的活性。低糖基化酵母工程菌GJK05表达的重组人溶菌酶与Raw264.7进行免疫荧光实验,激光共聚焦显微镜可观察到Raw264.7细胞内有荧光物质。综上述：本研究获得了具有活性的甘露糖化的重组人溶菌酶,该重组蛋白具有体外抑菌活性,并且能够在巨噬细胞表面的甘露糖受体的介导下进入巨噬细胞,为进一步研究甘露糖化人溶菌酶的胞内抑菌活性奠定基础。
赵雯[7]（2011）在《鸡IL-17 cDNA的克隆与表达及其单克隆抗体的制备》文中指出Interleukin-17（IL-17）是由效应T细胞产生的一种前炎性细胞因子。IL-17与多种细胞活动有关,如刺激破骨细胞生成、粒细胞生成、在适当浓度的植物凝集素刺激下的T细胞增殖。目前对哺乳动物IL-17的免疫学功能研究相对成熟,而对家禽的IL-17研究相对较少。为探讨鸡IL-17（ChIL-17）的免疫学性质,本研究构建了原核表达鸡IL-17基因的重组大肠杆菌,获得相应的融合蛋白,并制备其特异性单克隆抗体。针对CWIL17的特异性单克隆抗体（McAb）可用于建立简单、快速、敏感性高的ChIL-17检测方法,同时为IL-17在禽类免疫系统中的免疫生物学研究提供有用的工具。1.ChIL-17基因的克隆、序列分析与原核表达根据GenBank上公布的ChIL-17基因序列设计引物,应用RT-PCR技术,以ConA刺激的SPF鸡脾脏淋巴细胞总RNA为模板反转录后扩增ChIL-17基因。将扩增产物构建到pMD18-T载体上经测序鉴定后,分别将目的基因插入原核表达质粒pGEX-6P-1和pET30（a）中,构建出重组菌BL21（pGEX-6P-1-ChIL17）和BL21（DE3）（pET-ChIL17）。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白His-ChIL17、GST-ChIL17与预期大小一致,两种融合蛋白均主要以包涵体形式存在。Western blotting试验结果表明融合蛋白具有良好的免疫生物学活性。本研究还扩增了麻鸭、青脚鸡、AA肉鸡、安卡鸡、雪山草鸡、狼山鸡、石岐杂鸡、龙溪麻鸡、青壳鸡、三黄鸡、乌骨鸡、仙居鸡、隐性白羽鸡等13个品种鸡和鸭的IL-17基因,其中SPF鸡与隐性白羽、AA肉鸡、三黄鸡、青脚麻鸡IL-17基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列完全一致；龙溪麻鸡、石岐杂鸡、雪山草鸡IL-17基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列完全一致。分析了它们之间的核苷酸和氨基酸的进化距离,结果表明各品系鸡IL-17基因核苷酸同源性在98%-100%之间,氨基酸同源性在95%-100%之间。SPF鸡IL-17与其他品系鸡的IL-17序列有0-8个核苷酸的差异,而氨基酸之间的差异最多只有3个。以上结果可以看出IL-17基因在不同种之间有着较高的种属特异性,但在同种不同属之间却高度保守,甚至在同属家禽的鸡鸭之间也相对保守。2.鸡IL-17单克隆抗体的制备与鉴定本研究以纯化的原核表达融合蛋白GST-CHIL17作为免疫原,并以纯化的融合蛋白His-ChIL17为筛选抗原,应用淋巴细胞杂交瘤技术,研制出2株稳定分泌抗Ch-IL17McAb的细胞株,命名为3E6.3E9。McAb免疫球蛋白亚类鉴定均为IgG1,3E6腹水效价为102,400, Western blotting分析显示,3E6单抗能特异性结合26kDa的His-ChIL17和46kDa的GST-ChIL17, Dot-ELISA试验表明,单抗3E6只与融合蛋白His-ChIL17和GST-CHIL17反应,而不与空载体蛋白反应,表明单抗是针对ChIL17的特异性单抗。本研究为进一步研究IL-17在禽类免疫系统中的免疫生物学研究提供有用的工具。
王成昆[8]（2010）在《重组血管基膜衍生多功能肽（rVBMDMP）抗非小细胞肺癌的作用及机制研究》文中研究表明背景与目的肿瘤抑素（tumstatin）是一种由胶原Ⅳ分子α3链的中间三股螺旋区域共244个氨基酸组成的具有抑制血管生成和抗肿瘤细胞增殖作用的蛋白质,其活性区域位于N端的74-98氨基酸功能肽（抗血管生成作用）和197-215氨基酸功能肽（抗肿瘤作用）。但完整的tumstatin蛋白立体结构中,197-215氨基酸功能肽被其他肽段遮盖而不能发挥直接的抗肿瘤作用。因此本课题组在前期研究中,将来源于tumstatin N端74-98氨基酸功能肽通过人IgG3上游铰链区序列与Tumstatin N端197-215氨基酸功能肽连接获得了一种融合肽,命名为重组血管基膜衍生多功能肽（Recombinant Vascular Basement-derived Multifunctional Peptide, rVBMDMP）,并初步证实其具有抑制人脐静脉内皮细胞和结肠癌细胞的双重作用。本研究将在此基础上进一步系统观察rVBMDMP抑制肺癌细胞生长作用和可能机制,为开发这一新型抗肿瘤蛋白药物提供理论依据。方法（1）MTS法检测rVBMDMP对体外培养人肺腺癌（A549）细胞系,大细胞肺癌（H460）细胞系,小细胞肺癌（H446）细胞系、肺鳞状细胞癌（H520）和人胚肺二倍体细胞（KMB-17）细胞系增殖活性的影响以及对化疗药物顺铂（DDP）抗肺癌细胞的增敏作用；平皿克隆法测定rVBMDMP对A549细胞克隆形成率的影响；DNA琼脂糖凝胶电泳、AO/EB双染及Hoechst染色等方法观察rVBMDMP对A549细胞凋亡的影响；划痕法及transwell小室法测定rVBMDMP对A549细胞体外迁移及侵袭转移能力的影响；（2）采用功能分类基因芯片—癌通路发现者芯片检测rVBMDMP作用肺癌细胞后凋亡与侵袭转移相关基因的改变；并应用real-time PCR和western bloting技术验证芯片结果；（3）应用免疫共沉淀技术检测rVBMDMP与整合素（integrin）αVβ3的相互作用；Western blotting检测rVBMDMP作用A549细胞后FAK/PI3K信号通路和Fas/caspase-8信号通路相关分子表达情况；免疫组织化学检测rVBMDMP作用后裸鼠移植瘤内FAK/PI3K信号通路和Fas/caspase-8信号通路相关分子表达情况；TUNEL法检测rVBMDMP作用后裸鼠移植瘤细胞凋亡情况；Western blotting检测rVBMDMP作用A549/DDP细胞后磷酸化PI3K/Akt,耐药相关蛋白MRP,抗凋亡蛋白bcl-2和caspase-3的表达情况。结果（1） rVBMDMP能不同程度选择性抑制肺癌细胞的增殖活性,其中对A549的抑制作用最强；（2） rVBMDMP促进A549细胞发生时间依赖型DNA非随机性剪切和剂量依赖型凋亡形态学改变；显着抑制A549细胞体外迁移和侵袭能力；（3）当与DDP合用时,10.0μM的rVBMDMP使DDP对A549细胞的IC50由4.614μg/mL下降为1.320μg/mL （P<0.05）,对A549/DDP细胞（DDP耐受细胞）的IC50由31.19μg/mL下降为11.82μg／mL（P<0.05）；（4）10.0μMrVBMDMP作用后,A549细胞中p27基因（CDKN1B）,粒酶A（GZMA）,转移抑制基因KISS-1,信号转导和转录因子（RAF1,RASA1,SRC）,细胞周期蛋白D1（CCND1）、整合素受体IntegrinαⅤ、α1、α2、α6等16个基因表达上调,信号转导和转录因子（CTNNB1, JUN, MYC, MAP2K1）,凋亡蛋白酶激活因子（APAF1）,调控血管发生的基因（FGF2,IGF1,THBS1）,侵袭和转移相关基因（SERPINB2, SERPINE1, SERPINB5, uPA, uPAR）等21个基因表达下调；其中CDC25A、uPA、uPAR、IntegrinαⅤ、KISS1等基因的验证结果与芯片结果一致；（5） rVBMDMP能与A549细胞中integrinαⅤ/β3相互结合,抑制integrinαⅤβ3和下游的FAK、PI3K和Akt等蛋白的磷酸化,rVBMDMP干预后的裸鼠移植瘤内的免疫组化验证结果与细胞检测结果一致；（6） rVBMDMP作用早期（12h）能致A549细胞Fas表达上调,caspase-8活化；24h后,能使bcl-2、MRP表达下调caspase-3活化,rVBMDMP处理的裸鼠移植瘤免疫组化和TUNEL检测结果与细胞结果一致。结论（1） rVBMDMP能显着抑制人肺腺癌A549细胞体外生长增殖和侵袭转移能力,诱导其凋亡；（2）建立了rVBMDMP作用A549细胞的差异基因表达谱,共获得37个差异表达基因；（3） rVBMDMP抑制A549细胞生长、诱导其凋亡作用可能与其结合integrin aVβ3,抑制integrin aVβ3/FAK/PI3K/Akt的蛋白磷酸化有关；（4） rVBMDMP诱导凋亡作用可能与上调Fas表达、抑制bcl-2表达有关；（5） rVBMDMP可能通过上调KISS-1的表达,下调uPA和uPAR的表达来抑制人肺癌细胞的侵袭和转移；（6） rVBMDMP能增加A549和A549/DDP细胞对DDP的敏感性,其作用可能与上述机制及抑制MRP表达有关。
王力,马艳,焦东晓,王淑芬[9]（2009）在《Canstatin蛋白在结肠癌中的表达及其重组蛋白抗结肠癌作用》文中研究指明目的观察Canstatin基因在结肠癌组织中的表达及其重组蛋白抗结肠癌作用。方法采用RT-PCR检测40例结肠癌癌组织、相应的癌旁组织和远癌组织中Canstatin mRNA的表达情况。PCR产物经凝胶电泳,通过各组织中Canstatin与GAPDH条带的灰度值之比,半定量分析Canstatin mRNA的表达水平。建立结肠癌SW480裸鼠异种移植瘤模型,绘制移植瘤生长曲线,计算经重组Canstatin蛋白治疗后的肿瘤抑制率。结果癌组织中Canstatin mRNA表达水平（0.44±0.17）低于癌旁组织（0.59±0.14）和远癌组织（0.64±0.21）。随着肿瘤分化程度的升高,Canstatin mRNA在癌组织中的表达也增加（P<0.05）,而在临床病理分期（Dukes）,随着分期升高,Canstatin mRNA在结肠癌组织中表达明显减少（P<0.05）,但与淋巴结转移和病理类型均无统计学差异（P>0.05）;试验组肿瘤的生长明显受到抑制,瘤质量明显低于对照组（P<0.01）。低、中、高浓度Canstatin治疗组抑瘤作用较对照组明显增强（P<0.05）,其瘤重抑制率分别为30.02%、52.98%和58.00%。结论Canstatin mRNA在结肠癌组织中低表达,重组人Canstatin蛋白能有效抑制人结肠癌生长,无明显毒副作用,为结肠癌治疗提供了新的有效治疗方法。
马艳,王力,焦东晓,王淑芬[10]（2008）在《重组Canstatin蛋白联合氟尿嘧啶治疗裸鼠结肠癌移植瘤的实验研究》文中认为目的探讨血管生成抑制剂Canstatin与细胞毒药物氟尿嘧啶（5-FU）联合应用治疗结肠癌的效果,以期探索结肠癌治疗新途径。方法结肠癌SW-480细胞（1×107/只）注射到30只裸鼠皮下,建立结肠癌皮下移植瘤模型。当肿瘤长至23 mm时,随机分6组。给药途径均为腹腔注射给药。治疗期间,定期用圆规和游标卡尺测量皮下移植瘤大小。疗程结束时,取下瘤体,常规病理切片,观察药物毒性反应,CD31免疫组化染色,检测肿瘤内微血管密度（MVD）。结果①各试验组肿瘤的生长明显受到抑制,瘤体质量明显低于对照组（P<0.01）。5-FU+Canstatin组低、高浓度联合治疗组抑瘤作用较对照组明显增强（P<0.05）,其瘤重抑制率分别为74.76%和82.04%。②免疫组化:5-FU+Canstatin组低浓度组（22.6±3.6）和5-FU+Canstatin组高浓度组（15.0±2.8）治疗小鼠肿瘤组织内MVD显着低于对照组（36.4±5.6）和5-FU治疗组（31.2±4.0）（P<0.05）,而5-FU治疗组与对照组间差异无统计学意义;③不良反应:各实验组未观察到明显毒性反应。结论重组人Canstatin蛋白能有效抑制人结肠癌生长,无明显毒副作用,为结肠癌治疗提供了新的有力的治疗方法。
二、重组人canstatin的克隆、表达及其活性鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组人canstatin的克隆、表达及其活性鉴定（论文提纲范文）
（1）CSP Ⅰ-plus修饰的内皮抑制素抑制肝细胞癌转移的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 原发性肝细胞癌的研究进展 |
| 1.1.2 重组人内皮抑制素 |
| 1.1.3 肝癌的分子靶向治疗研究 |
| 1.1.4 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 |
| 1.1.5 疟原虫环子孢子蛋白 |
| 1.1.6 前期研究结果及本课题研究思路 |
| 1.2 研究目的 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.4 研究思路 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞来源 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 rES-CSP可溶性重组蛋白诱导表达条件的优化 |
| 2.2.2 rES-CSP可溶性重组蛋白的表达纯化 |
| 2.2.3 rES-CSP可溶性重组蛋白纯度及浓度测定 |
| 2.2.4 CCK-8 检测rES-CSP对 HCCLM3 细胞增殖的影响 |
| 2.2.5 划痕和Transwell检测rES-CSP对 HCCLM3 细胞迁移的影响 |
| 2.2.6 Transwell检测rES-CSP对 HCCLM3 细胞侵袭的影响 |
| 2.2.7 MTT法检测rES-CSP对 HCCLM3 细胞黏附的影响 |
| 2.2.8 慢病毒转染法构建Luc-GFP标记的人肝癌细胞株 |
| 2.2.9 细胞悬液肝原位直接注射法构建裸鼠原位肝癌模型 |
| 2.2.10 实验动物分组及给药 |
| 2.2.11 小动物活体成像系统观察裸鼠肝原位肿瘤生长情况 |
| 2.2.12 病理解剖观察裸鼠肝原位肿瘤生长及肺转移情况 |
| 2.2.13 苏木精-依红染色法 |
| 2.2.14 免疫组织化学法 |
| 2.2.15 实时荧光定量PCR法 |
| 2.2.16 蛋白免疫印迹法 |
| 2.2.17 统计 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 rES-CSP可溶性重组蛋白的表达和制备 |
| 3.1.1 rES-CSP可溶性重组蛋白诱导表达条件的优化 |
| 3.1.2 rES-CSP可溶性重组蛋白的表达纯化及鉴定 |
| 3.2 体外实验检测rES-CSP对肝癌细胞HCCLM3 转移的影响 |
| 3.2.1 rES-CSP重组蛋白对HCCLM3 细胞增殖的影响 |
| 3.2.2 rES-CSP重组蛋白对HCCLM3 细胞迁移的影响 |
| 3.2.3 rES-CSP重组蛋白对HCCLM3 细胞侵袭的影响 |
| 3.2.4 rES-CSP重组蛋白对HCCLM3 细胞黏附的影响 |
| 3.3 裸鼠原位肝癌模型的构建 |
| 3.3.1 扩增luciferase(Luc)基因 |
| 3.3.2 重组表达载体的鉴定 |
| 3.3.3 肝癌细胞转染后的GFP荧光鉴定 |
| 3.3.4 阳性克隆细胞株荧光素酶活性分析 |
| 3.3.5 HCCLM3-Luc-GFP细胞株接种至肝原位 |
| 3.4 rES-CSP抑制裸鼠肝原位肿瘤生长的作用 |
| 3.4.1 裸鼠肝原位肿瘤Luc发光情况观察 |
| 3.4.2 解剖观察 |
| 3.4.3 肿瘤组织HE染色观察 |
| 3.5 rES-CSP抑制裸鼠肝原位肿瘤转移的作用 |
| 3.5.1 裸鼠主要脏器生物发光观察 |
| 3.5.2 解剖观察 |
| 3.5.3 转移灶HE染色观察 |
| 3.6 rES-CSP对裸鼠体重和主要脏器的影响 |
| 3.6.1 裸鼠的体重变化 |
| 3.6.2 裸鼠主要脏器的病理变化 |
| 3.7 初步研究rES-CSP抑制肝细胞癌生长及转移的可能机制 |
| 3.7.1 rES-CSP对 HCCLM3 细胞血管生成相关因子基因及蛋白表达的影响 |
| 3.7.2 rES-CSP对 HCCLM3 细胞转移相关分子基因及蛋白表达的影响 |
| 3.7.3 rES-CSP对肝原位肿瘤血管生成因子及转移相关分子蛋白表达的影响 |
| 3.7.4 rES-CSP对肺转移灶中转移相关分子蛋白表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 rES-CSP可溶性重组蛋白的表达 |
| 4.2 rES-CSP体外抑制肝癌细胞转移的作用 |
| 4.3 rES-CSP体内抑制裸鼠肝原位肿瘤转移的作用 |
| 4.4 rES-CSP抑制肝细胞癌转移的可能机制 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（3）人源KGF-2基因的克隆、表达，纯化及其活性的鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 前言 |
| 第二部分 重组人角质细胞生长因子-2 的克隆和表达 |
| 1. 材料与设备 |
| 1.1 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 KGF-2 基因的获得 |
| 2.2 克隆载体的构建 |
| 2.3 重组质粒的鉴定 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分 重组人角质细胞生长因子-2 的表达及纯化 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 层析柱、填料及超滤膜包 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 1.5 发酵用培养基 |
| 1.6 纯化用缓冲液 |
| 1.7 方法 |
| 2. 结果与讨论 |
| 2.1 发酵条件优化 |
| 2.2 纯化条件摸索 |
| 2.3 讨论 |
| 第四部分 rhKGF-2 对三维气液培养中组织工程皮肤表皮生长的作用 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要药品试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 2. 结果与讨论 |
| 2.1 人 KC 及人成纤维细胞体外培养 |
| 2.2 rhKGF-2 对体外培养 KC 的促增殖作用 |
| 2.3 rhKGF-2 对 3D 气液培养组织工程皮肤表皮的作用 |
| 3. 讨论 |
| 本文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）犬表皮细胞生长因子的克隆和表达及活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 EGF 研究进展 |
| 1.1.1 EGF 的编码基因、合成、分泌 |
| 1.1.2 EGF 的生理功能及其应用 |
| 1.1.3 动物 EGF 的研究 |
| 1.1.4 EGF 的制备 |
| 1.1.5 EGF 与中药 |
| 1.2 实验研究目的与意义 |
| 第2章 不同品种犬表皮细胞生长因子的分子克隆及其分子特征分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌种与质粒、犬全血 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 主要仪器及生物学软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 犬全血全基因组提取 |
| 2.2.2 编码 cEGF 的 N 端和 C 端结构域的犬 32 号染色体 20 和 21 号外显子扩增 |
| 2.2.3 PCR 产物的胶回收 |
| 2.2.4 胶回收产物的连接、转化 |
| 2.2.5 阳性菌的鉴定、测序 |
| 2.2.6 cEGF 的基因序列及氨基酸序列分析 |
| 2.2.7 分析 cEGF 与其他 EGF 的同源性 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 犬的全基因组提取、cEGF 的克隆、鉴定及测序 |
| 2.3.2 cEGF 基因序列同源性分析 |
| 2.3.3 cEGF 氨基酸序列同源性分析 |
| 2.3.4 cEGF 与其他 EGF 氨基酸序列同源性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 犬表皮细胞生长因子的原核表达和纯化及其活性鉴定和多克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 载体、菌株、引物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 cEGF 基因的合成 |
| 3.2.2 含不同酶切位点 cEGF 基因的构建:设计两对引物 |
| 3.2.3 原核表达重组质粒的构建 |
| 3.2.4 目的蛋白 rcEGF 的诱导表达 |
| 3.2.5 cEGF 包涵体的制备及纯化 |
| 3.2.6 rcEGF 蛋白复性 |
| 3.2.7 纯化后 cEGF 融合蛋白的 SDS-PAGE 及 Western blot 检测 |
| 3.2.8 BCA 法测定蛋白浓度 |
| 3.2.9 rcEGF 的生物活性鉴定 |
| 3.2.10 rcEGF 多抗血清的制备 |
| 3.2.11 以重组蛋白 rcEGF1 为包被抗原做 ELIAS 检测多抗血清 |
| 3.2.12 用 rcEGF 多抗血清做 Western blot 检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 rcEGF 基因合成、重组质粒构建 |
| 3.3.2 目的蛋白 rcEGF 的诱导表达、表达产物 SDS-PAGE 电泳检测 |
| 3.3.3 rcEGF 纯化、复性 |
| 3.3.4 cEGF 纯化产物 SDS-PAGE 电泳分析、Western-blot 鉴定 |
| 3.3.5 cEGF 的活性鉴定 |
| 3.3.6 多克隆抗体的效价测定 |
| 3.3.7 多克隆抗体 Western-blot 鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 犬表皮细胞生长因子的酵母表达 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 载体、菌株、引物 |
| 4.1.2 主要实验试剂和实验仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 酵母表达质粒 pPICZαA-cEGF 的构建 |
| 4.2.2 pPICZαA-cEGF 质粒的大量提取及线性化 |
| 4.2.3 pPICZαA-cEGF 质粒转化酵母菌株 |
| 4.2.4 阳性菌株的筛选与鉴定 |
| 4.2.5 目的蛋白的诱导表达、SDS-PAGE 检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 阳性质粒 pPICZαA-cEGF 质粒的双酶切鉴定结果 |
| 4.3.2 阳性质粒测序结果 |
| 4.3.3 重组质粒线性化结果 |
| 4.3.4 PCR cEGF 基因与酵母基因组的整合 |
| 4.3.5 目的蛋白的诱导表达、表达产物 SDS-PAGE 电泳检测 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文和科研成果 |
（5）转录因子SP1参与TNF-α介导的肺泡上皮细胞氧化损伤中Nox1基因的表达调控（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 沉默NOX1对A549细胞中TNF-A介导的ROS水平的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 转录因子SP1参与TNF-A介导的肺泡上皮细胞氧化损伤中NoX1的转录调控 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 NOX1启动子重要调控区域的鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 SP1参与NOX1转录调控的机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
| 统计审稿证明 |
（6）毕赤酵母表达甘露糖化人溶菌酶研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 一、溶菌酶简介 |
| 二、胞内菌及其逃逸机制简介 |
| 三、甘露糖受体(mannose receptor,MR)简介 |
| 四、毕赤酵母表达系统简介 |
| 第一部分 人溶菌酶突变体的表达纯化及鉴定 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌株、质粒、细胞 |
| 1.1.2 限制性内切酶、工具酶、核酸及蛋白分子量标准 |
| 1.1.3 试剂盒 |
| 1.1.4 主要培养基 |
| 1.1.5 主要溶液 |
| 1.1.6 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 HepG2(人肝癌细胞株)总RNA的提取及第一链cDNA的反转录 |
| 1.2.3 目的基因的拼接 |
| 1.2.4 pPICZαA-hLYZ-myc-His载体构建 |
| 1.2.5 重组菌GS115/pPICZαA-hLYZ-myc-His的构建 |
| 1.2.6 重组菌的诱导表达及重组蛋白的纯化 |
| 1.2.7 重组蛋白的鉴定 |
| 1.2.8 重组蛋白PNGaseF的糖型分析 |
| 1.2.9 重组蛋白甘露糖化ConA检测 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 人溶菌酶基因的钓取 |
| 1.3.2 pPICZαA/hLYZ-myc-His载体构建 |
| 1.3.3 重组酵母基因组中整合目的基因PCR鉴定 |
| 1.3.4 重组蛋白TCA沉淀的SDS-PAGE分析 |
| 1.3.5 重组蛋白Sephadex-G25柱脱盐及镍亲和层析纯化 |
| 1.3.6 重组蛋白肽指纹图谱鉴定 |
| 1.3.7 重组蛋白Western印迹鉴定 |
| 1.3.8 重组蛋白的PNGaseF的糖型分析 |
| 1.3.9 重组蛋白甘露糖化ConA检测 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 hLYZ/eGFP的表达纯化及靶向定位 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒、细胞 |
| 2.1.2 工具酶、抗体及分子量标准 |
| 2.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 主要仪器及配件 |
| 2.1.5 主要培养液和溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 pPICZaA-hLYZ/eGFP载体构建 |
| 2.2.2 目的基因的转化 |
| 2.2.3 酵母基因组鉴定 |
| 2.2.4 重组菌的诱导表达 |
| 2.2.5 融合蛋白的纯化及浓缩 |
| 2.2.6 融合蛋白糖基化分析 |
| 2.2.7 细胞培养 |
| 2.2.8 融合蛋白在巨噬细胞RAW264.7中的荧光检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 hLYZ、eGFP基因的克隆及质粒pPICZαA-hLYZ/eGFP的构建 |
| 2.3.2 重组酵母工程菌目的基因的鉴定及蛋白表达 |
| 2.3.3 融合蛋白的纯化及糖基化分析 |
| 2.3.4 融合蛋白在巨噬细胞Raw264.7中的定位 |
| 2.4 实验小结 |
| 第三部分 低甘露糖化hLYZ表达纯化及活性鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株、质粒、细胞 |
| 3.1.2 限制性内切酶、工具酶、核酸及蛋白分子量标准 |
| 3.1.3 试剂盒、培养基、溶液、抗体 |
| 3.1.4 主要仪器及配件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 pPICZαA-hLYZ载体及pPICZαA-hLYZ(N/Q)载体的构建 |
| 3.2.3 重组菌的构建 |
| 3.2.4 重组蛋白的诱导表达及分离纯化 |
| 3.2.5 毕赤酵母表达重组蛋白甘露糖化修饰的检测 |
| 3.2.6 重组蛋白Western印迹鉴定 |
| 3.2.7 重组蛋白PNGaseF的糖型分析 |
| 3.2.8 重组蛋白抑菌活性的鉴定 |
| 3.2.9 不同糖基化修饰重组hLYZA体外抑菌活性活性的比较 |
| 3.2.10 低糖基化菌GJK05表达重组hLYZ的细胞免疫荧光实验 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 pPICZαA-hLYZ载体构建 |
| 3.3.2 pPICZαA-hLYZ(N/Q)载体的构建 |
| 3.3.3 线化质粒整合酵母基因组的PCR鉴定 |
| 3.3.4 重组蛋白的表达分离纯化 |
| 3.3.5 毕赤酵母表达重组蛋白甘露糖化修饰的检测 |
| 3.3.6 低甘露糖化重组hLYZ肽指纹图谱鉴定 |
| 3.3.7 重组蛋白Western印迹鉴定 |
| 3.3.8 低甘露糖化重组hLYZ PNGaseF酶切的N-糖型分析 |
| 3.3.9 重组hLYZ抑菌活性的鉴定 |
| 3.3.10 不同糖基化修饰hLYZA体外抑菌活性活性的比较 |
| 3.3.11 低糖基化菌GJK05表达重组hLYZ的细胞免疫荧光实验 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（7）鸡IL-17 cDNA的克隆与表达及其单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 第一章 综述白介素-17的生物学功能 |
| 1 IL-17的结构 |
| 2 IL-17的来源 |
| 3 IL-17的生物学作用 |
| 4 IL-17与疾病的相关性 |
| 5 鸡体内的IL-17 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡IL-17基因的克隆、序列分析与原核表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 ChIL-17基因的PCR扩增结果 |
| 2.2 重组质粒pMD18T-ChIL17的构建及鉴定 |
| 2.3 重组原核表达质粒pGEX-6P-1-ChIL17、pET-ChIL17的构建结果 |
| 2.4 不同品系鸡IL-17基因的序列分析 |
| 2.5 重组菌BL21(pGEX-6P-1-ChIL17)、BL21(DE3)(pET-ChIL17)的构建结果 |
| 2.6 重组菌BL21(pGEX-6P-1-ChIL17)在大肠杆菌中的表达 |
| 2.7 重组菌BL21(DE3)(pET-ChIL17)在大肠杆菌中的表达 |
| 2.8 表达产物的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 鸡IL-17单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 变复性GST-IL17蛋白SDS-PAGE鉴定 |
| 2.2 间接ELISA筛选方法的建立 |
| 2.3 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.4 单抗生物学特性 |
| 2.5 单抗特异性分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（8）重组血管基膜衍生多功能肽（rVBMDMP）抗非小细胞肺癌的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 RVBMDMP对肺癌细胞的抑制及化疗增敏作用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 运用癌通路发现者基因芯片筛选RVBMDMP抗癌作用相关基因 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 RVBMDMP抗非小细胞肺癌作用机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 胶原获得性抑癌分子的信号转导网络 |
| 致谢 |
| 研究成果 |
（9）Canstatin蛋白在结肠癌中的表达及其重组蛋白抗结肠癌作用（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试验动物、细胞株、药品及试剂 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 |
| 1.3.2 动物模型与药物处理 |
| 1.3.3 绘制移植瘤生长曲线 |
| 1.3.4 计算瘤重抑制率 |
| 1.4 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-P CR产物的琼脂糖凝胶电泳结果 |
| 2.2 Ca ns ta tin mRNA在各组织中的表达 |
| 2.3 Ca ns ta tin mRNA表达与结肠癌临床病理分期的关系 |
| 2.4 Ca ns ta tin蛋白对荷瘤裸鼠移植瘤生长曲线的影响 |
| 2.5 各组药物对裸小鼠毒性的影响 |
| 2.6 Ca ns ta tin蛋白对荷瘤裸鼠瘤重和抑瘤率的影响 |
| 3 讨论 |
（10）重组Canstatin蛋白联合氟尿嘧啶治疗裸鼠结肠癌移植瘤的实验研究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验动物、细胞株、药品及试剂 |
| 1.2 动物模型的建立 |
| 1.3 试验分组 |
| 1.4 观察指标和方法 |
| 1.5 光镜观察及免疫组化 |
| 1.6 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 裸鼠体内成瘤情况 |
| 2.2 各组药物对裸鼠皮下移植瘤生长的影响 |
| 2.3 各组药物对裸小鼠毒性的影响 |
| 2.4 移植瘤组织的病理形态学观察 |
| 2.5 免疫组化改变 |
| 3 讨论 |
四、重组人canstatin的克隆、表达及其活性鉴定（论文参考文献）
- [1]CSP Ⅰ-plus修饰的内皮抑制素抑制肝细胞癌转移的初步研究[D]. 张晶晶. 广东药科大学, 2019(02)
- [2]角质细胞生长因子-2（KGF-2）研究进展[J]. 杨志伟. 海峡药学, 2016(07)
- [3]人源KGF-2基因的克隆、表达，纯化及其活性的鉴定[D]. 何刚. 苏州大学, 2014(09)
- [4]犬表皮细胞生长因子的克隆和表达及活性鉴定[D]. 杨传定. 河北工程大学, 2013(04)
- [5]转录因子SP1参与TNF-α介导的肺泡上皮细胞氧化损伤中Nox1基因的表达调控[D]. 徐采云. 南方医科大学, 2013(07)
- [6]毕赤酵母表达甘露糖化人溶菌酶研究[D]. 左小虎. 安徽大学, 2012(10)
- [7]鸡IL-17 cDNA的克隆与表达及其单克隆抗体的制备[D]. 赵雯. 扬州大学, 2011(04)
- [8]重组血管基膜衍生多功能肽（rVBMDMP）抗非小细胞肺癌的作用及机制研究[D]. 王成昆. 中南大学, 2010(11)
- [9]Canstatin蛋白在结肠癌中的表达及其重组蛋白抗结肠癌作用[J]. 王力,马艳,焦东晓,王淑芬. 中国现代医学杂志, 2009(20)
- [10]重组Canstatin蛋白联合氟尿嘧啶治疗裸鼠结肠癌移植瘤的实验研究[J]. 马艳,王力,焦东晓,王淑芬. 中国实用医药, 2008(34)