一、抗丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin b单克隆抗体的制备及应用（论文文献综述）
徐克凡[1]（2018）在《三角梅核糖体失活蛋白（bouganin）多态性组织品种差异研究》文中研究指明核糖体失活蛋白（Ribosome-inactivating protein,RIPs）是一类具有细胞毒性的,特异性催化断裂核糖体大亚基rRNA N-C糖苷键的N-糖苷酶。RIPs具有对肿瘤细胞,动物病毒及多种植物病毒,植物病害真菌及农业害虫的抗性,在医学和农业上应用潜力巨大。RIPs广泛存在于高等植物中,且在同种中多态性丰富。多态性的发现对追踪RIPs的起源及其功能的深入研究有重要意义。本研究以艳紫三角梅为材料,通过克隆同源序列进行体外表达制备抗体,以亲和层析法分离纯化艳紫三角梅（Bougainvillea glabra）和红花三角梅（Bougainvillea spectabilis）中的天然Bouganin,然后通过对亲和层析分离的蛋白进行质谱法分析,确定Bouganin蛋白的多样性。本研究主要结果及结论如下:1.天然Bouganin确实存在多态性。在红花三角梅中发现3种异构体:Uuiprot编号分别为Q09EH2,A0A0D3RWN7和Q8W4U4。而在艳紫三角梅中发现了 4种异构体,除红花三角梅的3种外,另有编号为Q5J7U5的异构体,为艳紫三角梅叶所特有。2.Bouganin在同种三角梅的不同器官中的种类基本相同,但各异构体在不同器官的相对含量存在较大差异。3.实验所发现的4种Bouganin异构体中,Q09EH2、Q5J7U5与Q8W4U4均为305个氨基酸组成,而A0A0D3RWN7仅含238个氨基酸。4.实验所发现的4种Bouganin异构体均具有一定的同源性,其中A0A0D3RWN7、Q5J7U5 与 Q8W4U4 具有高同源性。接下来可首先改进亲和层析技术,提高实验结果的可重复性。之后对Bouganin多态性的研究可结合转录组学和结构生物学,从微观角度了解Bouganin异构体活性差异的结构基础。
魏周玲[2]（2017）在《异源表达几种核糖体失活蛋白及对TMV的抑制作用研究》文中研究说明植物病毒病在世界范围内广泛存在,它是仅次于真菌病害的一大病害,严重危害重要的经济作物。随着基因工程的迅速发展,使得利用抗病育种这一技术防治植物病毒病得到更为广泛的应用。近年的研究表明,将核糖体失活蛋白（ribosome-inactivating proteins,RIPs）基因转化植物,转基因植物获得抗病毒能力。因此,本文克隆获得四种核糖体失活蛋白（无毒缺失突变体PAP-c、α-MC、MAP30、Luffin-a）,将四种RIPs在本氏烟中异源表达,在烟草中观察四个蛋白在细胞中的定位情况。研究RIPs对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）的抑制作用及其引起的抗性防御反应。为解释不同RIPs对植物病毒的抗性作用及对RIPs诱导植物产生抗性抵御病毒侵染的作用提供依据。根据GenBank中已报道的商陆抗病毒蛋白基因、丝瓜核糖体失活蛋白基因和苦瓜素基因全序列,设计并合成扩增PAP-c和α-MC、MAP30、Luffin-a基因全长引物,通过RT-PCR及基因克隆方法,从苦瓜、丝瓜和商陆春叶克隆得到苦瓜α-MC、MAP30、丝瓜Luffin-a和商陆PAP-c;用Wolf PSORT预测蛋白定位,将苦瓜α-MC、MAP30、丝瓜Luffin a和商陆PAP-c融合在GFP的N端,构建融合绿色荧光蛋白的瞬时表达载体,亚细胞定位根据融合标记的GFP来确定,从而验证预测结果;在本氏烟中植物中通过根癌农杆菌介导的方法瞬时表达RIPs,再接种TMV,病毒在接种叶片的蛋白表达量和RNA积累量通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和荧光定量RT-PCR两种方法检测,分析瞬时表达RIPs的抗病毒效果。利用实时荧光定量RT-PCR检测植物防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,探究RIPs的抗病毒机理。克隆得到基因α-MC、MAP30、Luffin-a和PAP-c,分别为861、861、831和711 bp。Wolf PSORT预测显示RIPs主要定位于细胞质膜上。用共聚焦荧光显微镜下观察发现,标记GFP的RIPs均定位在本氏烟叶片表皮细胞质膜上,与Wolf PSORT预测的RIPs定位结果相一致。异源表达四种RIPs的植物细胞无明显毒性,表达部位细胞完整。在本氏烟中异源表达RIPs后,再接种TMV-GFP,在紫外灯下观察发现四种RIPs处理后的本氏烟在接种TMV-GFP 48 h后没有出现绿色荧光,而对照组出现荧光。72 h后处理组出现零星荧光,但对照组的绿色荧光开始扩散,连续观察,处理组几乎没有变化,接种TMV-GFP 6天后,发现处理组的绿色荧光几乎没有扩大的趋势,而对照组的绿色荧光已扩散至心叶;ELISA检测表明,在接种TMV-GFP 6天后的叶片中,对照组与健康植物的OD492比值几乎已达到处理组的10倍以上;实时荧光定量PCR检测TMV RNA的含量,结果显示对照组TMV RNA表达量是处理组的149倍,表明四个RIPs对TMV复制和移动都有明显抑制;实时荧光定量PCR结果分析显示,NPR1基因在只注射TMV、单独分别表达α-MC、MAP30、Luffin-a以及分别表达α-MC、MAP30、Luffin-a后注射TMV的本氏烟中都被诱导表达,但后者的表达量是前两个处理的约1.5-3倍左右,在只分别接种α-MC、MAP30、Luffin-a和分别表达α-MC、MAP30、Luffin-a后注射TMV的本氏烟中都检测到PR1、PR2,但后者的表达量显着高出前者约5-7倍,表明异源表达RIPs对植物病毒的抗性作用可诱导植物中防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,从而引起更强的防御反应。异源表达RIPs显着抑制TMV,能够激活植物防卫反应,且对植物细胞无明显毒性。研究结果为利用异源表达RIPs方法开发控制植物病毒新产品提供了参考依据。
卢小小[3]（2013）在《香樟树种子核糖体失活蛋白稳定性的研究》文中指出核糖体失活蛋白（ribosome-inactivating protein，RIP）是一种具有RNAN-糖苷酶活性的蛋白质，广泛存在于高等植物的根，叶和种子细胞中，在抗肿瘤、抗HIV和抗动植物病毒方面有优秀的表现。香樟树（Cinnamomum camphora）的种子含有大量的核糖体失活蛋白，并且香樟树在我国的分布也很广泛，可是目前对其种子的利用并不是很充分，这既是是对资源材料的浪费，又是对环境的污染。本文以香樟树的种子作为研究对象，用丙酮和硫酸铵对蛋白质沉淀、配位亲和层析的方法对香樟的种子核糖体失活蛋白进行分离纯化。通过与肝癌细胞作用后，对其性质进行研究，用MgCl2和蛋白酶抑制剂对其处理，再用SDS-PAGE电泳对其性质进行分析，以期了解核糖体失活蛋白的性质和香樟种子中两种RIP之间的相互转化关系与条件，主要的研究结果如下：（一）确定了一种较为快速便捷的香樟的种子核糖体失活蛋白的提取工艺，通过电泳鉴定和与癌细胞的作用能肯定本实验所提取的蛋白质为核糖体失活蛋白。（二）在提取过程中的除去油脂和其它杂质方面，用丙酮对蛋白质进行沉淀浓缩要比用硫酸铵进行沉淀浓缩效果要好，而且用时要少，但是弊端是蛋白质失活较明显。所以，在提纯核糖体失活蛋白方面可以用硫酸铵进行沉淀浓缩；而用不同条件进行处理时可以用丙酮进行沉淀浓缩。（三）与自然条件下香樟果实核糖体失活蛋白的降解趋势相比，MaCl2和EDTA-PMSF处理后的降解趋势要明显的不同。其中MgCl2处理过的粗提液表现的是辛纳毒蛋白降解为新丰毒蛋白的量要大于未用任何试剂处理过的粗提液；而用EDTA-PMSF这两种抑制剂处理时，由于蛋白质得到了保护，所以转化生成的新丰毒蛋白要比未加入试剂处理的粗提液要少的多。（四）辛纳毒蛋白（Cinnamomin）与新丰毒蛋白（Camphorin）之间的转化关系是与时间温度等外部条件成正比的，这与果实细胞的衰老进程有一定的一致性，从而能用这二者之间的转化关系来说明果实细胞的衰老进程。
刘俐伶[4]（2010）在《重组免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL的体外靶向生物学活性研究》文中研究表明背景皮肤T细胞淋巴瘤（Cutaneous T-cell lymphoma,CTCL）是一组异质性的T细胞来源的恶性肿瘤,以成熟CD4+的记忆性辅助T淋巴细胞在皮肤的恶性克隆性增生为特征,约占皮肤淋巴瘤的2/3以上。目前认为,CTCL在免疫学表型上属Th2或调节性T细胞（Treg）,约50%60%的CTCL表达IL-2R。早期CTCL治疗效果一般较好,但对中晚期CTCL目前尚无有效的治疗方法。随着对抗肿瘤免疫机制和CTCL生物学特性的深入研究,具有特异靶向杀伤肿瘤细胞的免疫毒素可作为其有效治疗方法的选择。免疫毒素是由毒素肽和靶向载体连接的具有靶向杀伤能力的融合蛋白,这种特异性靶向功能使之成为肿瘤靶向性治疗的一种新选择。利用基因工程技术进行克隆重组并在大肠杆菌中高效表达的融合蛋白具有稳定性好、组织渗透性高、免疫原性低、较强的肿瘤导向特异性和易于在细菌中大量制备等特点,使免疫毒素的实际应用成为可能。美国FDA已首次批准由IL-2和白喉毒素融合构建而成的免疫毒素药物DAB389IL-2（denileukin diftitox）用于治疗CD25+的复发性或顽固性CTCL,虽然临床取得一定疗效,但其对肝脏、心血管、造血系统等多系统损伤引起的严重副作用限制了它的广泛应用。分析其原因为:1、以全长IL-2作为靶向载体,特异性不够。IL-2R存在于许多细胞因子和正常细胞上（如静止T细胞、NK细胞等）,且晚期CTCL患者皮损主要表达与IL-2低亲和力的IL-2Rα（CD25）,因此不能高效引导毒素分子特异杀伤CTCL细胞。2、大多数人幼年曾接种白喉杆菌疫苗,或者接触过该病菌,因而体内携带白喉毒素的预存抗体,使该毒素疗效受到影响。因此针对特异性靶点、降低毒素的抗原性可以改进免疫毒素,提高其疗效。核糖体失活蛋白（RIPs）是一类植物来源的通过作用于真核细胞中核糖体和裸露原核的核糖体核糖核酸（rRNA）,从而抑制蛋白质合成的细胞毒蛋白,按其结构不同可分为Ⅰ型和Ⅱ型,其中Ⅰ型RIP可直接用于制备免疫毒素。丝瓜素luffin a是最经典和研究最早的I型RIP,在丝瓜素家族成员中其毒性最强,九十年代初期已有将它与抗黑色素单克隆抗体化学偶联来靶向杀伤黑色素瘤细胞的报道。单链抗体（ScFv）是抗体重链可变区（VH）与轻链可变区（VL）通过一段连接肽（linker）连接而成的一种小分子抗体,具有分子质量小、穿透力强、半衰期短、免疫原性低、制备流程简单等优点,目前已广泛用于基因工程技术制备免疫毒素时靶向载体的选择。CD25单链抗体能特异性与表达CD25的肿瘤细胞结合,目前已有用CD25scFv作为靶向载体构建的重组免疫毒素用于治疗播散性霍杰金淋巴瘤的实验研究。基于以上理论基础,我们设想以丝瓜籽来源的I型核糖体失活蛋白α-luffin-KDEL作为毒素分子,CD25单链抗体（CD25scFv）作为靶向载体利用基因工程技术来构建表达一种新的重组免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL,探讨其体外靶向抗肿瘤活性,以期用于CD25+的皮肤T细胞淋巴瘤的实验研究。目的利用基因重组技术将从丝瓜籽来源的α-luffin-KDEL作为毒素分子,CD25scFv作为靶向载体构建、表达、纯化出重组免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL,以皮肤T细胞淋巴瘤来源的高表达CD25的Hut-78细胞作为主要测试对象,并以具有相似T细胞生物学行为但相对低表达CD25的Jurkat细胞和基本不表达CD25的B细胞来源的Burkitt淋巴瘤Raji细胞作为对照细胞,检测CD25scFv-α-luffin-KDEL对细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响,探讨其体外靶向生物学活性。方法1.依据成熟肽α-luffin的基因序列（GenBank NO:X62371.1）分别设计带有NcoI和XhoI酶切位点的引物,利用RT-PCR从未成熟丝瓜籽中克隆成熟肽α-luffin的cDNA和N端连接内质网滞留信号肽KDEL序列的α-luffin-KDEL基因,分别克隆至表达载体pET28a（+）,经测序正确后,将之分别转化到大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,诱导表达、Ni2+-NTA层析纯化,并用His抗体鉴定后,将获得纯化后的重组蛋白α-luffin和α-luffin-KDEL以不同浓度和不同时相点分别作用于JEG-3、HepG2和MCF-7肿瘤细胞,用CCK-8法检测两种重组蛋白分别对三种不同肿瘤细胞增殖的抑制作用,经SPSS 13.0软件对数据进行析因方差分析,比较重组蛋白α-luffin和α-luffin-KDEL的体外抗肿瘤活性。2.以pET32a-anti-CD25-PE38KDELmutant质粒为模板扩增出带有BglII和NcoI酶切位点的CD25scFv片段,构建到表达载体pET32a（+）,经测序正确后,将pET32a- CD25scFv与已构建好的pET28a-α-luffin-KDEL同时用NcoI和XhoI酶切后连接构建pET32a-CD25scFv-α-luffin-KDEL,经测序正确后,将之转化到大肠杆菌BL21DE3,诱导表达、Ni2+-NTA层析纯化、透析复性,并His抗体鉴定重组蛋白;流式细胞仪检测Hut-78、Jurkat和Raji细胞表面CD25分子的表达情况;将所获得的重组融合蛋白CD25scFv-α-luffin-KDEL用CCK-8法检测其对Hut-78、Jurkat和Raji细胞增殖的影响,用Annexin V-FITC / PI双染法和PI法检测其对凋亡及细胞周期的影响。结果1.（1）成功扩增出成熟肽α-luffin的cDNA,经查对,与GenBank上登录的编码成熟肽α-luffin的cDNA序列有一个碱基的突变,但不影响其编码的氨基酸序列。经比对,该成熟肽α-luffin与luffin a有96%的同源性。（2）成功构建了重组原核表达质粒pET28a-α-luffin及pET28a-α-luffin-KDEL,并在大肠杆菌BL21DE3plysS中获得部分可溶性表达,分子量28kDa左右,经Ni2+-NTA层析纯化,western blot鉴定为所需目的蛋白α-luffin和α-luffin-KDEL。（3）CCK-8法检测结果显示:两种蛋白对三种肿瘤细胞增殖的抑制作用均存在明显的时间及剂量依赖性关系,且对三种肿瘤细胞的抑制作用存在明显差异,即对JEG-3细胞增殖的抑制作用较强,对MCF-7细胞的作用较弱;在不同浓度和不同时相点比较两个蛋白对细胞增殖的抑制作用,结果显示α-luffin-KDEL对三种肿瘤细胞的抑制作用均显着强于α-luffin。2.（1）成功构建重组质粒pET32a-CD25scFv-α-luffin-KDEL,经大肠杆菌BL21DE3诱导表达出包涵体形式的融合蛋白,分子量约80kDa左右,经纯化、复性、western blot鉴定,获得所需目的蛋白CD25scFv-α-luffin-KDEL。（2）流式细胞仪检测Hut-78、Jurkat和Raji细胞表面CD25分子的表达分别为87.5%、26.9%和0.2%。（3）免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL对Hut-78、Jurkat和Raji细胞增殖影响的结果显示:CD25scFv-α-luffin-KDEL对三种细胞增殖的抑制作用具有浓度和时间依赖性;且对Hut-78细胞增殖的抑制作用明显强于对Jurkat和Raji细胞,对Jurkat和Raji细胞的抑制作用未表现出明显差异;CD25scFv-α-luffin-KDEL对Hut-78和Jurkat细胞的抑制作用明显强于α-luffin-KDEL;作为对照的α-luffin-KDEL对三种细胞增殖的抑制作用未表现出明显差异。凋亡和细胞周期检测结果显示:CD25scFv-α-luffin-KDEL对Hut-78和Jurkat细胞表现出明显的促凋亡作用;且明显减少Hut-78及Jurkat细胞的S期细胞数目,使细胞生长阻滞于G0/G1期和G2/M。结论本研究主要结论:1、从丝瓜籽中克隆表达的重组成熟肽α-luffin和在N端添加内质网滞留信号肽的α-luffin-KDEL均具有体外杀伤肿瘤细胞的作用,且α-luffin-KDEL的作用更强。2、利用基因工程技术以α-luffin-KDEL作为毒素分子,CD25scFv作为靶向载体构建表达的重组免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL在体外实验中表现出很好的靶向杀伤表达CD25肿瘤细胞的作用,其机制可能系通过靶向促凋亡作用和作用于间期中DNA的合成,从而抑制了靶向细胞的增殖。
刘树雷,何威,王儒鹏,吴军,胡小红[5]（2010）在《Luffin P1-KDEL的构建、表达、纯化及鉴定》文中进行了进一步梳理目的构建植物毒素Luffin P1的原核表达质粒PET32a（+）-Luffin P1,并对其进行诱导表达,以及表达蛋白的纯化及鉴定。方法采用基因工程技术将重组基因片段Luffin P1克隆到表达载体pET32a（+）中,经酶切及DNA序列分析正确后,转化至表达宿主菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达Luffin P1融合蛋白,并用His标签抗体对该融合蛋白进行Western blot鉴定,对鉴定正确的融合蛋白进行纯化,肠激酶酶切及再纯化。结果成功的构建了原核表达载体pET32a（+）-Luffin P1,获得了纯度较高的Luffin P1蛋白。结论通过基因工程合成Luffin P1蛋白是成功的,并为进一步对Luffin P1功能研究及制备免疫毒素的弹头鉴定了实验基础。
阙文忠,许云禄,谢捷明[6]（2009）在《Ⅰ型核糖体失活蛋白（RIPs）抗肿瘤作用的研究进展》文中指出目的介绍Ⅰ型核糖体失活蛋白抗肿瘤作用的研究概况及展望。方法总结核糖体失活蛋白抗肿瘤作用及机制。结果Ⅰ型核糖体失活蛋白具有明显的抗肿瘤作用。结论Ⅰ型核糖体失活蛋白是很有发展前景的抗肿瘤植物药。
阙文忠[7]（2009）在《南瓜蛋白诱导人肝癌Hep-G2细胞凋亡的实验研究》文中提出目的:观察南瓜蛋白（Cucurmosin,Cus）对人肝癌Hep-G2细胞的体外增殖抑制和诱导凋亡作用;用NOD-SCID小鼠建立人肝癌Hep G2细胞的肝原位移植瘤模型,评价Cus在体抗肝癌的有效性;并初步探讨其诱导凋亡作用的可能机制,为南瓜蛋白的抗肝癌机制提供理论基础。方法:1 MTT法测定Cus （以TCS为对照）对体外培养人肝癌Hep G2细胞和人胚肝L-02细胞增殖的影响,评价其对人肝癌细胞作用选择性;2利用NOD/SCID小鼠建立人肝癌原位移植模型,体内观察南瓜蛋白对人肝癌小鼠原位移植瘤的抑瘤率。3电子显微镜观察南瓜蛋白作用后PANC-1细胞超微结构的改变。4流式细胞仪检测南瓜蛋白对Hep G2细胞细胞周期和凋亡发生率的影响。5 Annexin V/PI双染流式细胞术检测Hep G2细胞凋亡6 DNA断裂琼脂糖凝胶电泳观察是否有凋亡片段7 ELISA检测南瓜蛋白作用后Hep G2细胞的caspase-3和caspase-9活性的变化。8 western blot法检测南瓜蛋白作用后caspase-3、bcl-2、bax蛋白表达的变化。结果: MTT比色法结果显示, Cus对正常人胚肝（L-02）细胞的毒性作用（IC50为20.85μg/ml）远小于对人肝癌（HepG2）细胞的毒性（IC50为4.96μg/ml）,Cus对人肝癌Hep G2细胞的具有一定的选择性。电子显微镜下见对照组细胞形态正常,细胞膜结构完整,常染色质丰富,可见多个核仁。治疗组而细胞密度增高,染色质凝集固宿,染色质边集,核固宿,核碎裂及凋亡小体的形成等细胞凋亡的表现;流式细胞仪DNA倍体分析检出典型的亚二倍体（sub-G1）凋亡峰,并且10 ug /mlCucurmosin分别作用24、48、72h,凋亡率分别为11.88%、23.47%、36.24%,呈明显的时间依赖性。Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡结果显示Cucurmosin作用的剂量依赖性,随着作用浓度的升高细胞凋亡率也随之增加。DNA断裂琼脂糖凝胶电泳分析出现“阶梯状”DNA条带,呈约180-220bp整数倍递增分布,提示DNA在核小体部位被切断,细胞发生凋亡。所有上述结果充分说明,Cucurmosin具有诱导Hep-G2细胞凋亡的作用。在动物体内,人肝癌HepG2细胞/NOD-SCID小鼠原位移植瘤模型治疗实验结果显示:Cus对人肝癌移植瘤生长具有显着抑制作用,1、0.5、0.25mg/kg的Cus对人肝癌原位移植瘤的瘤重抑制率分别为71.11%,64.85%和51.19%。Western blot分析结果表明:经2.5、5、10、20、40μg/ml的Cus处理72h后, Bcl-2蛋白表达下调、Bax表达上调,Caspase 3的活性片段被不同程度的激活,呈浓度依赖性;用Caspase 3、Caspase-9活性检测试剂盒测定,结果显示:Caspase 3、Caspase-9均被激活,并且呈浓度依赖性。结论:1、Cus对人肝癌Hep-G2细胞具有很强的增殖抑制作用（IC50为4.96ug/ml）,比TCS对该肿瘤细胞的作用（IC50约20.15 ug /ml）强4倍多,并且对人胚肝细胞系L-02细胞毒性（IC50约为20.85ug/ml）小,其细胞毒作用具有相对选择性。2、Cus能有效诱导人肝癌HepG2细胞凋亡。3、Cus对人肝癌HepG2细胞小鼠原位移植瘤具有显着的增殖抑制作用,呈剂量依赖性。4、Cus诱导HepG2细胞凋亡作用可能与其上调Bax,下调Bcl-2蛋白表达水平,然后激活caspase-9,并最终激活下游caspase-3有关。
刘艳华[8]（2008）在《小分子重组免疫毒素GnRH-luffinS的制备及其靶向治疗肿瘤的实验研究》文中指出重组免疫毒素是由靶向区和细胞毒性区组成、可以识别并选择性杀伤特定细胞的融合蛋白,是一类重要的肿瘤靶向性治疗药物。靶向区为能与肿瘤细胞表面抗原特异结合的抗体、细胞因子或激素,毒性区为细菌毒素,如铜绿假单胞菌外毒素（PE）和白喉毒素（DT）,或植物毒素,如蓖麻毒素（RT）、美洲商陆抗病毒蛋白（PAP）和皂草素等。重组免疫毒素用于恶性肿瘤的导向治疗已取得很大成功,如以人IL-2为导向分子,以DT为毒性部分的免疫毒素制剂（商品名ONTKA）已获得美国FDA批准,用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）,另有多种重组免疫毒素在临床试验研究中也显示出良好的抗肿瘤效果。尽管重组免疫毒素具有广阔的应用前景,但是在临床应用中仍面临许多挑战,如免疫原性强和穿透性差,解决方法之一就是构建小分子的重组免疫毒素。丝瓜毒素（luffin）LuffinP1和luffinS2是从丝瓜籽中分离到的两种只有5kDa和8kDa的小分子量I型核糖体失活蛋白（RIP）,具有N-糖苷酶活性,能特异性水解真核细胞核糖体28s rRNA 4324位的腺嘌呤,使真核细胞核糖体60s大亚基失活,从而抑制蛋白质合成,对兔网织红细胞裂解液的IC50分别为10-9和10-10M左右,可作为潜在的免疫毒素弹头分子。人Ⅰ型促性腺激素释放激素（ gonadotropin-releasing hormone, GnRH或luteinizing hormone-releasing hormone, LHRH）是下丘脑分泌的一种十肽类激素,用于调控脑垂体促黄体生成素（LH）和促卵泡激素（FSH）的分泌。GnRH受体通常分布于脑垂体、性腺的细胞膜上,但研究发现,GnRH受体也高表达于某些癌细胞表面,如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌及肝癌细胞等。因此GnRH和相关肽已经应用于妇科学和肿瘤学领域的研究,如用于性腺机能减退、不育症和性腺依赖性肿瘤的治疗。另外,肿瘤细胞表面的GnRH受体与GnRH有较高的亲和力,因此GnRH可以作为肿瘤靶向治疗中的导向分子。如制备的LHRH-PE40重组免疫毒素对人多种肿瘤细胞系有明显的杀伤作用,目前已进入临床试验阶段。因此,以GnRH为导向分子、以luffinP1或luffinS2为毒性部分构建的重组免疫毒素是一种潜在的免疫原性低、穿透力强的小分子抗肿瘤药物。本文首先克隆并原核表达了luffinP1和luffinS2蛋白,测定其蛋白合成抑制作用,筛选活性较高的蛋白作为重组免疫毒素的毒性部分;随后将GnRH与luffinS2进行基因融合,原核表达并纯化GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH融合毒素,测定其体外细胞毒作用;因为铜绿假单胞菌外毒素转膜区（PEⅡ区）具有蛋白酶识别位点和转膜功能,能提高重组免疫毒素的转膜效率,并能使重组免疫毒素的毒性部分和导向部分在胞内分离,从而提高重组免疫毒素的细胞毒作用,所以将其插入到GnRH和luffinS2之间,构建GnRH-PEⅡ-luffinS重组免疫毒素,表达纯化后测定其体内外抑肿瘤活性。具体的实验内容和结果如下:1. luffinP1和luffinS2全长基因的克隆、表达和活性研究（1）利用Codon软件,设计luffinP1和luffinS2的重叠PCR引物,通过对重叠PCR反应体系和条件的优化,扩增得到了luffinP1和luffinS2的全长基因。（2）luffinP1和luffinS2分别与表达载体pET-His、pET32a、pQE30和pBV220连接,构建pET-His/luffinP1、pET-His/luffinS2、pET32a/luffinP1、pET32a/luffinS2、pQE30/luffinP1、pQE30/luffinS2、pBV220/luffinP1和pBV220/luffinS2表达载体,转化宿主菌,并诱导表达。结果只有pET32a/luffinP1和pET32a/luffinS2转化BL21（DE3）大肠埃希杆菌后获得表达,且均为可溶性表达。经亲和层析纯化后,获得Trx-luffinP1和Trx-luffinS2融合蛋白。随后,利用重组肠激酶（rEK）将Trx-luffinP1和Trx-luffinS2融合蛋白切割,获得rluffinP1和rluffinS2。（3）测定rluffinP1和rluffinS2对兔网织红细胞裂解液的蛋白合成抑制作用。结果表明,rluffinP1和rluffinS2的IC50分别为9.51μg/ml和1.58μg/ml,因此选择luffinS2作为重组免疫毒素的毒性部分。2. GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH融合蛋白的克隆、表达和活性研究（1）因为无法确定GnRH和luffinS2的连接顺序对GnRH和luffinS2的活性是否有影响,因此设计了GnRH-luffinS2（GnRH在N端）和luffinS2-GnRH（GnRH在C端）融合蛋白,并对其二级进行预测。（2）利用Codon软件,设计了GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH的重叠PCR引物,通过对重叠PCR反应体系和条件的优化,扩增得到了GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH的全长基因。（3）GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH分别与pET-His、pET32a、pQE30和pBV220连接,构建pET-His/GnRH-luffinS2、pET-His/luffinS2-GnRH、pET32a/GnRH-luffinS2、pET32a/luffinS2-GnRH、pQE30/GnRH-luffinS2、pQE30/luffinS2-GnRH、pBV220/GnRH-luffinS2和pBV220/luffinS2-GnRH原核表达载体,转化宿主菌,并诱导表达。结果只有pET32a/GnRH-luffinS2和pET32a/luffinS2-GnRH转化BL21（DE3）后获得表达,且均为可溶性表达。经亲和层析纯化后,获得了Trx-GnRH-luffinS2和Trx-luffinS2-GnRH。随后,利用rEK将Trx-GnRH-luffinS2和Trx-luffinS2-GnRH融合蛋白切割,获得rGnRH-luffinS2和rluffinS2-GnRH。（4）采用XTT法测定rGnRH-luffinS2和rluffinS2-GnRH对体外肿瘤细胞Hela、A549、HepG-2、SP2/0和CEF细胞毒性作用。结果表明,rGnRH-luffinS2对上述细胞的IC50分别为67.19μg/ml、70.42μg/ml、84.44μg/ml和106.25μg/ml,rluffinS2-GnRH对上述细胞的IC50分别79.5μg/ml、76.7μg/ml、96.2μg/ml和137μg/ml,两种融合毒素对CEF均无毒性,表明rGnRH-luffinS2和rluffinS2-GnRH具有一定的抗肿瘤作用,但活性不高。3. GnRH-PEⅡ-luffinS2融合蛋白的克隆、表达和抗肿瘤活性研究（ 1 ）利用PEⅡ具有转膜区和蛋白酶识别位点的特性,设计GnRH-PEⅡ-luffinS重组毒素并对其二级进行预测。（2）利用Codon软件,设计了GnRH-PEⅡ-luffinS的重叠PCR引物,通过对重叠PCR反应体系和条件的优化,扩增得到了GnRH-PEⅡ-luffinS的全长基因。（3）选择pET32a为表达载体,构建pET32a/GnRH-PEⅡ-luffinS表达载体,转化BL21（DE3）大肠埃希杆菌后获得表达,蛋白以包涵体形式存在。经亲和层析纯化后,获得了Trx-GnRH-PEⅡ-luffinS融合蛋白,蛋白经透析复性和超滤浓缩后,利用rEK将Trx-GnRH-PEⅡ-luffinS融合蛋白切割为Trx和rGnRH-PEⅡ-luffinS。（4）采用XTT法测定rGnRH-PEⅡ-luffinS在体外对Hela、A549、HepG-2、SP2/0和CEF细胞毒性作用。结果表明,rGnRH-PEⅡ-luffinS对上述细胞的IC50分别为13.50μg/ml、13.74μg/ml、16.79μg/ml和26.07μg/ml,对CEF无作用,表明具有较强的抗肿瘤作用。（5）建立BALB/c小鼠的SP2/0实体瘤模型,检测rGnRH-PEⅡ-luffinS体内抗肿瘤活性。结果表明,剂量为100μg/只,瘤区内穿刺注射,连续10d给药时,rGnRH-PEⅡ-luffinS对SP2/0实体瘤的抑瘤率为50.3%,显示rGnRH-PEⅡ-luffinS具有一定的抗肿瘤作用。综上所述,本研究原核表达了luffinP1和luffinS2蛋白,利用兔网织红细胞裂解液证实luffinS2具有较高的蛋白合成抑制作用;然后构建了以GnRH为导向分子,以luffinS2为毒性分子的小分子重组免疫毒素GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH,体外对Hela、A549、HepG-2、SP2/0细胞毒实验表明,GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH的细胞毒性较低;为提高重组免疫毒素的细胞毒性,将PEⅡ插入到GnRH和luffinS之间,构建了GnRH-PEⅡ-luffinS重组免疫毒素。体外细胞毒实验表明,其细胞毒性获得明显提高,体内抑瘤实验表明,GnRH-PEⅡ-luffinS具有一定抗肿瘤活性,为进一步探讨其作为抗肿瘤药物的临床应用奠定了基础。
刘树雷[9]（2008）在《免疫毒素hIL-2-Luffin P1联合芳维A酸乙酯对Hut-78细胞和Jurkat细胞杀伤作用的实验研究》文中研究表明背景:皮肤T细胞淋巴瘤（cutaneous T cell lymphomas, CTCL）和急性T细胞白血病（acute T cell leukemia, ATCL）均为来源于T细胞的恶性肿瘤,其发生率和病死率均呈上升趋势,严重威胁人类的健康。通常采用的治疗方法是放疗或化疗,但这些治疗措施抗肿瘤能力低并有明显的毒副作用。长期使用非特异免疫抑制剂可使患者免疫功能严重受损,导致许多并发症。免疫毒素被称为“生物导弹”,它是由具有靶向能力的分子（载体）和具有细胞毒性的分子组合而成的具有特异性杀伤能力的杂合分子。它通过载体的靶向作用,使其所携带的毒素分子到达靶细胞,发挥特异性杀伤作用。免疫毒素作为一种新型的治疗手段主要有两个特性优于其它治疗方案:其一是免疫毒素对肿瘤细胞的杀伤作用不依赖于宿主的免疫系统,而是依赖靶向载体所携带的毒素起作用;其二是免疫毒素对正常细胞无杀伤作用,但能被有效地内吞入靶细胞,具有特异性杀伤靶细胞的特性。因此,采用免疫毒素治疗肿瘤具有突出的优势。美国FDA首次批准免疫毒素药物DAB389IL-2,也称为地尼白介素2（denileukin diftitox）治疗皮肤T细胞淋巴瘤的临床研究,虽已进入Ⅲ期临床试验但仍存在一些问题。目前免疫毒素存在的主要问题是:一方面,是由于现有的免疫毒素多是由异源性的抗体为靶向载体,免疫原性强;另一方面,由于通常的毒素分子量较大,对组织的渗透性差。要想提高免疫毒素对靶细胞的杀伤作用,主要通过以下途径改善:①寻找靶细胞上特异的靶点以及通过调节细胞表面靶点的表达促进免疫毒素的作用。②降低免疫毒素的抗原性,包括对载体及毒素的改造,降低它们的分子量,以及选择人源化的载体及毒素分子。因此,免疫毒素分子的小型化和人源化是免疫毒素研究的发展趋势。T淋巴细胞相关的肿瘤及部分B淋巴细胞相关的肿瘤高表达CD25分子,CD25是IL-2受体（IL-2R）的α链,它与IL-2Rβ、IL-2Rγ链共同构成高亲和力的IL-2受体。在理论上可利用低浓度的人IL-2融合蛋白选择性作用于这些淋巴瘤细胞,介导对瘤细胞的抑制或杀伤作用。用人IL-2作为载体具有靶向性好、免疫原性低,半衰期长、可在动物中应用的优势。植物来源的核糖体灭活蛋白（RIP）是一类作用很强的毒素,它们直接作用于核糖体,灭活其60S大亚基,具有很强的抑制蛋白质合成的活性以及诱导细胞凋亡的作用。Luffin家族是一类从丝瓜种子中提取的RIP,而Luffin P1是新近发现的Luffin家族成员,是迄今已发现的活性最强、分子量最小（5.2 kD）单链核糖体失活蛋白。由于它具有分子量小的特点,不仅便于靶向载体携带进入靶细胞,还有利于降低免疫毒素的免疫原性,减少毒副作用,提高疗效。维A酸类药物具有调节上皮细胞分化与生长、维持上皮组织正常角化过程、抗肿瘤等作用,已用于多种肿瘤的诱导分化治疗。维A酸类药物还可以上调IL-2R的α、β链的表达,通过调节细胞表面靶点的表达而促进免疫毒素的作用。在初步临床试验中免疫毒素与维A酸联合应用治疗CTCL,使病情缓解率提高,并且没有出现毒副作用的增加。基于以上理由,我们设想利用基因工程方法构建一种新的免疫毒素hIL-2-Luffin P1,使其hIL-2片段特异性识别表达IL-2受体的肿瘤靶细胞,从而把毒素分子带入靶细胞内,发挥抗肿瘤的作用。另一方面,希望凭借芳维A酸乙酯能上调IL-2受体的表达而与上述免疫毒素联合使用,以提高免疫毒素的靶向结合能力,增强hIL-2-Luffin P1对靶细胞的杀伤作用。目的:构建、表达及纯化能特异性杀伤皮肤T细胞淋巴瘤和急性T细胞白血病的重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1及作为对照的毒素分子蛋白Luffin P1。观察hIL2-Luffin P1、芳维A酸乙酯、hIL2-Luffin P1联合芳维A酸乙酯、Luffin P1对Hut-78细胞和Jurkat细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法:（1）应用PCR扩增目的基因（hIL2-Luffin P1、Luffin P1）片段,然后将它们分别克隆到表达载体pET32a（+）中,并对重组质粒进行酶切鉴定及基因测序。测序正确的重组质粒转化到表达菌BL21中,进行诱导表达。分别用鼠抗人的His单克隆抗体、兔抗人IL-2多克隆抗体进行Western blot鉴定。蛋白大量诱导表达后经过蛋白的纯化、复性、脱盐、肠激酶酶切、再纯化,最后用兔抗人IL-2多克隆抗体进行Western blotting鉴定目的蛋白hIL2-Luffin P1中IL-2成分的表达。（2）应用免疫细胞化学技术检测Hut-78细胞、Jurkat细胞表面CD25分子的表达。然后分为hIL-2-Luffin P1组、芳维A酸乙酯组、hIL-2-Luffin P1联合芳维A酸乙酯组、Luffin P1组,分别于不同浓度和不同时相点分别作用于Hut-78细胞和Jurkat细胞。应用MTT法观察细胞的生长抑制率,流式细胞仪检测细胞的早期凋亡及细胞周期。结果:（1）成功构建了带有KDEL结构的原核表达质粒PET32a（+）-hIL-2-Luffin P1和PET32a（+）-Luffin P1。（2）经过蛋白的诱导表达,超声破菌后,分离结果显示,hIL-2-Luffin P1蛋白以包涵体的形式存在,而Luffin P1蛋白为部分可溶性表达。经过蛋白的纯化、肠激酶酶切及鉴定,最后得到了具有较好活性的hIL2-Luffin P1蛋白及作为对照的毒素分子蛋白Luffin P1（。3）免疫细胞化学结果显示:IL-2受体α链（CD25）在Hut-78细胞和Jurkat细胞表面高表达,其表达阳性细胞比例分别为79.32%和54.47%。（4）MTT结果显示:hIL-2-Luffin P1组、芳维A酸乙酯组、hIL-2-Luffin P1联合芳维A酸乙酯组均可抑制Hut-78细胞和Jurkat细胞增殖,且呈剂量和时间依赖性效应。其中联合组的作用明显强于单一用药组,而Luffin P1组对两种细胞增殖均没有明显的抑制作用。hIL-2-Luffin P1组和hIL-2-Luffin P1联合芳维A酸乙酯组对Hut-78细胞的抑制率明显高于Jurkat细胞。hIL-2-Luffin P1对Hut-78细胞和Jurkat细胞的IC50分别为27.361μg/ml和39.634μg/ml。芳维A酸乙酯组对Hut-78细胞和Jurkat细胞均有明显的抑制作用,但对两种细胞抑制率的差异不明显。（5）Annexin V/PI双标法流式细胞术检测显示,hIL-2-Luffin P1、芳维A酸乙酯、hIL-2-Luffin P1联合芳维A酸乙酯均可以诱导Hut-78细胞和Jurkat细胞发生早期凋亡,其中联合组的作用明显强于单一用药组。而Luffin P1无明显诱导细胞凋亡的作用。（6）流试细胞术检测细胞周期显示:hIL-2-Luffin P1组及hIL-2-Luffin P1联合芳维A酸乙酯组均可使Hut-78和Jurkat细胞停滞在G1期,提示hIL-2-Luffin P1或hIL-2-Luffin P1联合芳维A酸乙酯均能阻止两种细胞由G1期向S期转化。结论:用基因工程方法成功构建、表达、纯化了免疫毒素hIL-2-Luffin P1蛋白及毒素分子Luffin P1蛋白。hIL-2-Luffin P1能够抑制Hut-78细胞和Jurkat细胞增殖,促进Hut-78细胞和Jurkat细胞凋亡,使细胞周期停滞在G1期,并且其抑制增殖和诱导凋亡的作用呈剂量和时间依赖性效应。而毒素Luffin P1蛋白对上述两种细胞的增殖、凋亡及细胞周期均无明显作用。这提示免疫毒素hIL-2-Luffin P1能够针对表达IL-2R的Hut-78细胞和Jurkat细胞产生定向杀伤作用。hIL-2-Luffin P1联合芳维A酸乙酯也能抑制Hut-78细胞和Jurkat细胞的增殖,促进Hut-78细胞和Jurkat细胞凋亡,并可使细胞周期停滞在G1期,二者合用时抑制增殖和诱导凋亡的作用也呈剂量和时间依赖性效应。hIL-2-Luffin P1联合芳维A酸乙酯的作用明显比单用hIL-2-Luffin P1或单用芳维A酸乙酯时强。由此提示免疫毒素hIL-2-Luffin P1联合芳维A酸乙酯对Hut-78细胞和Jurkat细胞具有协同作用。本课题的研究结果对皮肤T细胞淋巴瘤和急性T细胞白血病的治疗具有探索、启示和借鉴意义。
胡俊[10]（2007）在《新疆滨藜（Atriplex patens）核糖体失活蛋白的基因克隆和表达》文中研究表明自从第一个蓖麻毒蛋白Ricin得到分离纯化以来,人们已在多种高等植物中发现了核糖体失活蛋白（Ribosome-inactivating protein,RIP）,在真菌和细菌中也有发现。核糖体失活蛋白是一类从高等植物中分离获得的具有抑制核糖体翻译功能的毒蛋白,具有RNA N-糖苷酶活性,可以专一地水解核糖体28S rRNA第A4324位上的腺嘌呤碱基与核糖之间的N-糖苷键,对其产生水解作用,脱去这个腺嘌呤,从而阻遏了延长因子EF-2与核糖体的结合,抑制蛋白质的生物合成。RIPs按结构可分为两种类型:Ⅰ型为单链蛋白,具有RNA N-糖苷酶活性;Ⅱ型RIPs是两条多肽链（A链和B链）通过二硫键结合而成,A链具有RNA N-糖苷酶活性,B链是一个对半乳糖专一的凝集素,可与真核细胞表面的糖蛋白或糖脂的半乳糖部分结合,帮助A链进入细胞内行使功能。随着人们对核糖体失活蛋白的理论研究的深入,它的实际应用也受到了广泛的关注。目前在此方面的研究已涉及到抗病毒、抗真菌、抗昆虫、抗肿瘤及艾滋病的治疗等方面。基于已有的文献研究基础,本研究针对新疆滨藜（Atriplex patens）核糖体失活蛋白基因开展了以下四个方面的工作:首先,采用同源序列克隆基因的方法从新疆滨藜中克隆出核糖体失活蛋白基因（GenBank登录号为GI: DQ991968）。根据GenBank上已发表的各种物种的核糖体失活蛋白基因（rip）序列,分析其保守性并根据保守区设计了六条引物（四条上游引物,两条下游引物）,分别组合经RT-PCR扩增出新疆滨藜核糖体失活蛋白基因（我们将其命名为:Aprip）的核心片段,连接于pMD18-T载体,经DNA序列测定后,结果与GenBank中rip序列进行同源性比较,确定已克隆出的核心片段为Aprip的核心片段,然后通过3′RACE技术获得3′非翻译区序列,再用5′端的保守引物与3′端的特异性引物扩出全长序列。通过序列分析可以发现,ApRIP属Ⅰ型核糖体失活蛋白。通过对Aprip读码框基因序列进行比对,发现Aprip与藜科植物藜的核糖体失活蛋白基因序列的同源性为84%,同源性比较高。但与其它科植物的rip基因相比同源性较低,与葫芦科的天花粉蛋白（TCS）和商陆科的美洲商陆蛋白（PAP）的同源性分别为41%和55%。其次,为了获得基因产物,将Aprip构建到带有麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein,MBP）的原核表达载体pMAL-p2x上,进行融合表达,通过SDS-PAGE检测到目的蛋白的表达,通过麦芽糖亲和层析柱纯化到了带有目的蛋白的麦芽糖融合蛋白,我们将其命名为:MBP-ApRIP。第三,将Aprip构建到真核表达载体pcDNA3.1上形成重组质粒pcDNA3.1-Aprip,然后用这个质粒作为核酸疫苗做小鼠的尾静脉注射,结果在小鼠的肝脏中检测到了目的基因在mRNA水平的转录。之后又通过注射小鼠的肌肉细胞制备ApRIP多克隆抗体,经过一次MBP-ApRIP融合蛋白加强后,通过ELASA反应和Western-blot分析,结果证明了真核表达载体pcDNA3.1-Aprip可在小鼠体内有效表达,并成功制备了抗血清。第四,对Ap-RIP进行活性检测。为消除麦芽糖融合蛋白MBP-ApRIP中标签蛋白MBP对目的蛋白的影响,我们将Aprip重新构建到只带6个His标签的pET30a原核表达载体中,通过RT-PCR检测可以发现,加入IPTG后,目的基因可以在pET30a载体中有效转录,而且菌的生长速度与对照组相比,受到了抑制,但通过SDS-PAGE检测不到相应的条带,可能是蛋白表达量太低的缘故。另外,我们将Aprip制成不带融合序列的核酸疫苗注射到小鼠肌肉细胞中,经过4次注射后可以观察到小鼠颈部的毛发开始脱落,进食也比对照组有所减少。
二、抗丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin b单克隆抗体的制备及应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin b单克隆抗体的制备及应用（论文提纲范文）
（1）三角梅核糖体失活蛋白（bouganin）多态性组织品种差异研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 核糖体失活蛋白的研究概况 |
| 1.1.1 RIPs的研究历史 |
| 1.1.2 RIPs的分类与分布 |
| 1.1.3 RIPs的结构与功能 |
| 1.1.4 RIPS的酶活性 |
| 1.1.5 RIPs的生理功能与应用 |
| 1.1.6 三角梅和Bouganin简介 |
| 1.2 RIPs的异源表达 |
| 1.2.1 大肠杆菌发酵 |
| 1.2.2 酵母发酵 |
| 1.2.3 转基因植物 |
| 1.2.4 昆虫生物反应器 |
| 1.3 植物蛋白纯化技术 |
| 1.3.1 常见的植物蛋白纯化技术 |
| 1.3.2 免疫亲和色谱 |
| 1.3.3 RIPs的分离纯化 |
| 1.4 酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法简介 |
| 1.5 质谱法(mass spectrometry MS)简介 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第二章 材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 溶液配制 |
| 2.5 实验设备 |
| 2.6 方法 |
| 2.6.1 重组蛋白制备 |
| 2.6.2 抗Bouganin抗体制备 |
| 2.6.3 多克隆抗体效价检测 |
| 2.6.4 植物组织蛋白制备 |
| 2.6.5 免疫亲和层析柱制备 |
| 2.6.6 免疫亲和层析过程 |
| 2.6.7 质谱分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 重组Bouganin体外表达 |
| 3.2 兔血清多克隆抗体效价检测及层析柱制备 |
| 3.2.1 兔抗血清效价检测 |
| 3.2.2 兔抗血清多克隆抗体纯化 |
| 3.3 植物组织蛋白制备 |
| 3.4 样品分析结果 |
| 3.4.1 样品1 |
| 3.4.2 样品2 |
| 3.4.3 样品3 |
| 3.4.4 样品4 |
| 3.4.5 样品5 |
| 第四章 总结讨论 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 多态性序列的差异性分析 |
| 4.2.2 三角梅不同种的Bouganin多态性差异及表现 |
| 4.2.3 蛋白的抗原决定簇分析 |
| 4.2.4 亲和层析杂质成因分析 |
| 4.2.5 艳紫三角梅叶样三次重复的洗脱液电泳结果不一致的原因分析 |
| 4.2.6 关于红花三角梅苞片Bouganin |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）异源表达几种核糖体失活蛋白及对TMV的抑制作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 普通烟草花叶病毒病 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 症状 |
| 1.1.3 综合防治进展 |
| 1.2 植物抗病毒基因工程研究进展 |
| 1.2.1 病毒来源的基因介导的抗性 |
| 1.2.2 寄主基因介导的抗性 |
| 1.2.3 其他来源基因介导的抗性 |
| 1.3 核糖体失活蛋白概述 |
| 1.3.1 核糖体失活蛋白的分布 |
| 1.3.2 核糖体失活蛋白的分类与结构特点 |
| 1.3.3 核糖体失活蛋白的酶活性 |
| 1.3.4 核糖体失活蛋白的功能研究进展 |
| 1.4 几种核糖体失活蛋白及其抗病毒研究进展 |
| 1.4.1 商陆抗病毒蛋白及其无毒突变体 |
| 1.4.2 苦瓜素（Alpha-momorcharin，а-MC） |
| 1.4.3 苦瓜毒蛋白MAP30（Momordica anti-HIV protein of 30kDa） |
| 1.4.4 丝瓜核糖体失活蛋白 |
| 1.5 植物系统性获得抗性及其病程相关蛋白基因 |
| 1.6 本文研究思路 |
| 第二章 核糖体失活蛋白基因的克隆、表达和亚细胞定位 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验时间与地点 |
| 2.1.2 试验材料 |
| 2.1.3 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RNA的提取 |
| 2.2.2 RT-PCR扩增 |
| 2.2.3 测序结果分析 |
| 2.2.4 构建表达载体 |
| 2.2.5 Western Blot验证蛋白在本氏烟中的表达 |
| 2.2.6 异源表达四种核糖体失活蛋白在本氏烟中的亚细胞定位 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 异源表达核糖体失活蛋白对TMV的抑制作用 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植株和菌液 |
| 3.1.2 试剂和引物 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 菌液活化 |
| 3.2.2 土壤根癌农杆菌渗入法浸润本实验 |
| 3.2.3 观察RIPs对TMV的抑制 |
| 3.2.4 ELISA检测TMV的含量 |
| 3.2.5 实时荧光定量PCR检测TMV RNA含量 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 表达RIPs的本氏烟中TMV的侵染移动情况 |
| 3.3.2 ELISA检测TMV含量 |
| 3.3.3 实时荧光定量PCR检测TMV RNA的表达量 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 异源表达核糖体失活蛋白诱导植物系统性抗性 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 供试植株 |
| 4.1.2 试剂和引物 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 DAB染色法检测细胞中H2O2 |
| 4.2.2 NBT染色法检测细胞中的超氧化物 |
| 4.2.3 实时荧光定量PCR检测防卫相关基因的表达 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 DAB染色法检测细胞中H2O2 |
| 4.3.2 NBT染色法检测超氧化物 |
| 4.3.3 RT-qPCR检测防卫相关基因的表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表文章及参加科研项目情况 |
（3）香樟树种子核糖体失活蛋白稳定性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 综述 |
| 1.1 核糖体失活蛋白的国内外研究现状 |
| 1.1.1 核糖体失活蛋白在自然界中的分布和定位 |
| 1.1.2 RIP 的作用机制 |
| 1.1.3 影响 RIP 和核糖体相互作用的因素 |
| 1.1.4 RIP 的分子结构及其分子量 |
| 1.1.5 RIP 的生理功能及其应用 |
| 1.2 亲和层析 |
| 1.2.1 亲和层析的作用机理 |
| 1.2.2 亲和层析的优点与缺点 |
| 1.2.3 亲和层析的分类及其应用 |
| 1.3 论文选题的目的意义和研究内容 |
| 1.3.1 论文选题的目的和意义 |
| 1.3.2 本课题的研究内容 |
| 2 香樟树种子 RIP 的分离与纯化 |
| 2.1 材料、仪器及试剂 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验仪器 |
| 2.1.3 试验试剂 |
| 2.1.4 缓冲液的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 实验材料的前处理 |
| 2.2.2 香樟树种仁 RIP 的粗提取 |
| 2.2.3 无机溶液沉淀蛋白质 |
| 2.2.4 透析 |
| 2.2.5 层析 |
| 2.3 香樟树种子 RIP 的 Native-PAGE 电泳纯度鉴定 |
| 2.3.1 试剂配制 |
| 2.3.2 试验步骤 |
| 2.4 蛋白质硝酸银染色 |
| 2.5 结果分析 |
| 2.5.1 香樟树种子 RIP Sephrose 4B 柱层析 |
| 2.5.2 香樟树种子 RIP 的 SDS-PAGE 电泳分析 |
| 2.5.3 纯化后的 RIP 与肝癌细胞保温处理 |
| 2.6 小结 |
| 3 香樟树种子 RIP 不同条件处理的研究 |
| 3.1 材料、试剂及仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验材料的前处理与香樟树种仁 RIP 的粗提取 |
| 3.2.2 香樟种子 RIP 的保温处理 |
| 3.2.3 不同处理香樟树种子 RIP 的 SDS-PAGE 电泳纯度鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 不同条件处理条件下香樟种子粗提液的比对 |
| 3.3.2 MgCl2 对香樟种子 RIP 的影响 |
| 3.3.3 EDTA-PMSF 对香樟种子 RIP 的影响 |
| 3.3.4 香樟种子 RIP 在 37℃下保温的变化趋势 |
| 3.4 小结 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）重组免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL的体外靶向生物学活性研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一部分 重组成熟肽α-luffin及α-luffin-KDEL的构建、表达及体外抗肿瘤活性比较研究 |
| 前言 |
| 实验一 成熟肽α-luffin及α-luffin-KDEL的克隆及表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 重组蛋白α-luffin及α-luffin-KDEL的体外抗肿瘤活性比较 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 重组免疫毒素CD255cFv-α-luffin-KDEL的构建、表达及体外生物学活性研究 |
| 前言 |
| 实验一 重组免疫毒素CD255cFv-α-luffin-KDEL的构建和表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 重组免疫毒素CD255cFv-α-luffin-KDEL的体外生物学活性研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 文献综述一 丝瓜素核糖体失活蛋白的研究概况 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 基因重组免疫毒素的抗肿瘤研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文 |
（5）Luffin P1-KDEL的构建、表达、纯化及鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物设计 |
| 1.3 Luffin P1的PCR扩增 |
| 1.4 重组表达载体pET32a(+)Luffin P1的构建及鉴定 |
| 1.5 Luffin P1的诱导表达及鉴定 |
| 1.6 Luffin P1的纯化、脱盐 |
| 1.7 Luffin P1的肠激酶切、纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增目的基因片段Luffin P1 |
| 2.2 重组质粒pET32a(+)-Luffin P1的酶切鉴定 |
| 2.3 Luffin P1的诱导表达及鉴定 |
| 2.4 Luffin P1蛋白表达形式的鉴定 |
| 2.5 毒素分子蛋白Luffin P1的纯化、酶切及再纯化 |
| 3 讨论 |
（6）Ⅰ型核糖体失活蛋白（RIPs）抗肿瘤作用的研究进展（论文提纲范文）
| 1 常见Ⅰ型RIP及其相应免疫毒素的抗肿瘤活性 |
| 1.1 天花粉蛋白 |
| 1.2 丝瓜核糖体失活蛋白 |
| 1.3 苦瓜核糖体失活蛋白 |
| 1.4 细胞毒素Gelonin |
| 1.5 美洲商陆蛋白 (PAP) |
| 1.6 其他核糖体失活蛋白 (curcin) |
| 2.核糖体失活蛋白 (RIP) 的抗肿瘤作用机理 |
| 2.1 RNA N-糖苷酶活性及其它酶活性 |
| 2.2 RIP诱导肿瘤细胞凋亡及相关分子机制 |
| 2.3 RIP诱导肿瘤细胞分化 |
| 3 结语 |
（7）南瓜蛋白诱导人肝癌Hep-G2细胞凋亡的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写字表 |
| 一、中文摘要 |
| 二、英文摘要 |
| 三、前言 |
| 四、材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 体外测定 CUS 对 Hep-G2 细胞和 L-02 细胞的增殖抑制作用 |
| 2.2 南瓜蛋白对人肝癌Hep-G2 细胞的小鼠原位移植瘤增殖的影响 |
| 2.2.1 皮下传代方法 |
| 2.2.2 原位移植瘤模型的建立方法 |
| 2.2.3 动物分组及用药 |
| 2.2.4 抑瘤率观察 |
| 2.3 流式细胞仪检测 CUS 对 Hep-G2 细胞周期的影响 |
| 2.4 Annexin V/PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.5 电子显微镜观察凋亡细胞的形态变化 |
| 2.6 DNA 断裂琼脂糖凝胶电泳分析 |
| 2.7 诱导Hep-G2 细胞凋亡的分子机理 |
| 2.8 统计学处理 |
| 附有关溶液的配制 |
| 五、结果 |
| 六、讨论 |
| 七、结论 |
| 八、参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
（8）小分子重组免疫毒素GnRH-luffinS的制备及其靶向治疗肿瘤的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 一、国内外研究现状 |
| 二、研究方法和思路 |
| 第一部分 luffin 原核表达质粒的构建、表达及活性检测 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第二部分 重组毒素 GnRH-luffinS2 的构建、表达及活性 检测 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第三部分 GnRH-PEⅡ-luffinS 的构建、表达及其活性检测 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 讨论 |
| 1. 重组毒素的构建 |
| 2. 重组毒素的表达 |
| 3. 重组毒素包涵体的复性 |
| 4. 重组毒素的蛋白酶切割 |
| 5. 重组毒素的生物学活性 |
| 6. 荷瘤动物模型的建立与体内抑肿瘤实验 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述：免疫毒素治疗肿瘤的研究进展 |
| 发表文章：小分子GnRH-luffinS 重组嵌合毒素的制备与其细胞毒性检测 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）免疫毒素hIL-2-Luffin P1联合芳维A酸乙酯对Hut-78细胞和Jurkat细胞杀伤作用的实验研究（论文提纲范文）
| Abstract |
| 摘要 |
| 正文 免疫毒素hIL-2-Luffin P1 联合芳维A 酸乙酯对Hut-78 细胞和Jurkat 细胞杀伤作用的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 免疫毒素hIL-2-Luffin P1 的诱导表达、纯化及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 免疫毒素hIL2-Luffin P1 生物学活性的检测 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 免疫毒素hIL2-Luffin P1 联合芳维A 酸乙酯对Hut-78 细胞和Jurkat 细胞的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 免疫毒素构建的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 皮肤T 细胞淋巴瘤的免疫治疗 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文情况 |
| 英文论着 |
（10）新疆滨藜（Atriplex patens）核糖体失活蛋白的基因克隆和表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英文缩写符号 |
| 实验室主要仪器名称 |
| 第一部分 引言 |
| 1 植物核糖体失活蛋白的研究进展 |
| 2 新疆滨藜RIP 的研究意义 |
| 第二部分 常用试剂及配制 |
| 第三部分 实验与结果 |
| 第一章 新疆滨藜核糖体失活蛋白基因克隆及序列分析 |
| 第二章 新疆滨藜核糖体失活蛋白基因的原核与真核表达 |
| 第三章 新疆滨藜核糖体失活蛋白的活性研究 |
| 总结 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、抗丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin b单克隆抗体的制备及应用（论文参考文献）
- [1]三角梅核糖体失活蛋白（bouganin）多态性组织品种差异研究[D]. 徐克凡. 厦门大学, 2018(07)
- [2]异源表达几种核糖体失活蛋白及对TMV的抑制作用研究[D]. 魏周玲. 西南大学, 2017(02)
- [3]香樟树种子核糖体失活蛋白稳定性的研究[D]. 卢小小. 河南大学, 2013(02)
- [4]重组免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL的体外靶向生物学活性研究[D]. 刘俐伶. 第三军医大学, 2010(06)
- [5]Luffin P1-KDEL的构建、表达、纯化及鉴定[J]. 刘树雷,何威,王儒鹏,吴军,胡小红. 免疫学杂志, 2010(01)
- [6]Ⅰ型核糖体失活蛋白（RIPs）抗肿瘤作用的研究进展[J]. 阙文忠,许云禄,谢捷明. 海峡药学, 2009(05)
- [7]南瓜蛋白诱导人肝癌Hep-G2细胞凋亡的实验研究[D]. 阙文忠. 福建医科大学, 2009(S2)
- [8]小分子重组免疫毒素GnRH-luffinS的制备及其靶向治疗肿瘤的实验研究[D]. 刘艳华. 中国人民解放军军事医学科学院, 2008(11)
- [9]免疫毒素hIL-2-Luffin P1联合芳维A酸乙酯对Hut-78细胞和Jurkat细胞杀伤作用的实验研究[D]. 刘树雷. 第三军医大学, 2008(03)
- [10]新疆滨藜（Atriplex patens）核糖体失活蛋白的基因克隆和表达[D]. 胡俊. 新疆大学, 2007(06)