一、Construction and expression of the bicistronic expression vector with RANTES and SDF-1 genes（论文文献综述）
王艺晓[1]（2021）在《灰飞虱HiPV病毒翻译调控元件IRES功能解析及在昆虫细胞双顺反子表达系统中的利用》文中指出真核细胞大部分蛋白质的生物合成都是依赖5′端“帽子”结构起始翻译,但一些缺少“帽子”结构的RNA病毒,可借助其5′端非翻译区上的翻译调控顺式作用元件,即内部核糖体进入位点（IRES）,起始下游m RNA翻译。重要农业害虫灰飞虱可传播水稻条纹病毒（RSV）危害水稻生产,其体内昆虫病毒Himetobi P virus（HiPV）含有IRES元件。前期发现,HiPV的VP1蛋白可促进灰飞虱体内RSV增殖。因此,研究HiPV-IRES调控蛋白合成机制对于进一步揭示HiPV与RSV互作机制具有重要意义,同时也可为利用昆虫病毒防治灰飞虱提供新思路。为此,本研究以HiPV-IRES为对象,鉴定了其调控蛋白翻译起始关键功能区,并明确其下游天冬酰胺重复序列功能,进一步利用该元件构建适用于昆虫细胞的双顺反子表达系统,实现一个启动子表达两个蛋白。1.分析HiPV-IRES二级结构,确定“假发夹”结构的位置。构建p IE-IRES-YFP表达载体,使IRES位于启动子下游、报告基因YFP上游,转染细胞后,经荧光显微观察、蛋白免疫印迹,证明IRES元件可以在昆虫细胞中起始下游基因的蛋白合成。构建含有针对“假发夹”结构的IRES突变体,检测蛋白合成,证明IRES的150-146位与171-175位核苷酸形成的“假发夹”结构,是IRES起始蛋白合成的关键结构。分析不同HiPV分离物中IRES起始蛋白合成的效率,结果显示,日本分离物IRES（标准型）与江苏分离物IRESJ（变异型）起始下游蛋白表达效率差异不明显。2.不同病毒来源的IRES下游病毒蛋白的氨基酸序列不存在同源性,但HiPV-IRES下游存在一个独特的天冬酰胺重复序列（ANNNNNNNNTN）。为探究其对IRES起始翻译的影响,将含有和不含重复序列的IRESNN和IRESN′插入表达载体,经蛋白检测,发现该天冬酰胺重复序列可提高下游蛋白质合成的效率。将蟋蟀麻痹病毒IRES（Cr PV-IRES）、果蝇C病毒IRES（DCV-IRES）插入表达载体,比较它们与HiPV-IRES起始蛋白合成的效率,结果显示,Cr PV-IRES与HiPV-IRES起始蛋白合成的能力相近,高于DCV-IRES。3.在IRES两端增加酶切位点,构建双顺反子表达骨架载体p IE-IRES。在此基础上,将VP1基因置于IRES上游,YFP基因置于下游,获得载体p IE-VP1-IRES-YFP,经检测验证,该载体可实现两个蛋白同时表达,且两个蛋白的表达互不影响。将上下游基因调换位置,获得p IE-YFP-IRES-VP1载体,两个蛋白同样正常表达。一个启动子引导两个蛋白同时表达的昆虫细胞双顺反子表达系统建立成功,为完善昆虫细胞蛋白表达系统提供重要参考。
哈卓[2]（2020）在《PCV2和PCV3分子流行病学及二联重组腺病毒候选疫苗研究》文中提出猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）分为4种,猪圆环病毒1型（PCV1）,猪圆环病毒2型（PCV2）,猪圆环病毒3型（PCV3）和猪圆环病毒4型（PCV4）。PCV1对猪无致病性;PCV2是威胁世界养猪业重要病原之一,给养猪业造成了巨大经济损失;PCV3作为一种新发病毒,2016年在美国首次报道,被认为与猪的多种临床疾病相关,呈世界范围内流行;2019年PCV4首次在中国发现,其流行情况和致病性目前还不确定。我国是世界养猪业和猪肉消耗量最大的国家,比例占世界一半以上。而我国猪群PCV2和PCV3感染广泛,且已造成危害。本研究旨在对我国猪群中PCV2和PCV3的分子流行病学进行调查,明确目前PCV2和PCV3在猪群中的感染状况,遗传变异和进化规律,对流行毒株进行分离鉴定和致病性研究。同时,针对当前流行毒株开展PCV2和PCV3二联重组腺病毒疫苗研究,通过动物试验对疫苗的免疫效果和对流行毒株的保护效果进行了评估,为防控PCV2和PCV3的感染奠定基础。本研究具体结果如下:（1）为明确PCV2在我国的分子流行病学特征,针对2016-2019年间,我国9省份206个猪场的3201份猪临床样本进行PCV2检测。PCV2在猪群中总阳性率为39.6%（1269/3201）,不同省份阳性率为18.6%-44.7%;在猪场水平阳性率为84.5%（174/206）,表明PCV2在我国猪群中感染率很高。为进一步研究PCV2的遗传变异和进化规律,对部分检测阳性的临床样本进行全基因组和ORF2基因的扩增,共获得了64个PCV2的全基因序列和178个ORF2基因序列。全基因组序列、ORF1和ORF2基因的同源性分别为93.9%-99.9%、96.6%-100%和86.8%-100%;氨基酸比对表明Rep蛋白主要存在12个氨基酸变异位点,Cap蛋白主要存在55个氨基酸变异位点,表明Cap蛋白具有很高的遗传变异特性。重组分析表明,不同的PCV2毒株在猪体内可以发生重组,产生新的毒株。遗传进化分析表明,获得的PCV2毒株序列中,15个为PCV2a基因型,58个为PCV2b基因型,169个为PCV2d基因型,表明目前我国猪群流行的PCV2毒株以PCV2d基因型为主。（2）通过全球毒株序列分析,确定了PCV2毒株进化过程中可视化的基因型漂移规律和氨基酸变异规律,并分析了导致氨基酸变异可能的原因和影响。PCV2毒株进化过程中可视化的基因型漂移规律表明,世界范围内,2001年前,PCV2a为主要基因型,2001-2011年,PCV2b为主要基因型,2011年后,PCV2d为主要基因型;2006年后,PCV2d呈上升趋势,PCV2a和PCV2b呈下降趋势;PCV2进化过程中经历了两次基因型漂移,2001年,PCV2a漂移至PCV2b,2012年,PCV2b漂移至PCV2d。在中国,2002年前,PCV2a为主要基因型,2002-2008年,PCV2b为主要基因型,2008年后,PCV2d为主要基因型;2004年后,PCV2d呈上升趋势,PCV2b呈下降趋势;PCV2进化过程中经历了两次基因型漂移,2002年,PCV2a漂移至PCV2b,2009年,PCV2b漂移至PCV2d。在PCV2毒株的进化过程中,Cap蛋白上14个氨基酸位点发生了明显的变异,发生时间在2007年左右,PCV2商品化疫苗在世界范围内使用时间为2006年,表明疫苗使用和免疫压力可能导致了氨基酸变异。由于2015年前使用的疫苗全部为PCV2a基因型,进一步分析PCV2a、PCV2b和PCV2d基因型的氨基酸组成,发现Cap蛋白氨基酸变异前主要由PCV2a和PCV2b基因型决定,变异后由PCV2d基因型决定,进一步说明疫苗的使用可能导致PCV2在进化过程发生氨基酸变异,而氨基酸变异则导致PCV2d基因型的出现和流行。（3）PCV2的分子流行病学调查结果表明,目前我国猪群流行的PCV2毒株以PCV2d基因型为主。为进一步确定PCV2的流行株,对PCV2d Cap蛋白氨基酸进行比对,发现PCV2/JL/JL19毒株Cap蛋白序列保守,与其它毒株比较没有氨基酸变异,所以将其确定为PCV2优势流行株。为明确PCV2/JL/JL19流行株的致病性,对病毒进行分离,病毒滴度可达106.0 TCID50/m L。猪体攻毒试验中,临床症状主要表现为食欲下降和背毛粗糙,攻毒后28天体重明显下降;临床剖检主要表现为淋巴结肿大和出血,各组织器官中均可检测到高拷贝数PCV2 DNA,产生明显的病毒血症;组织病理学观察腹股沟淋巴结和肺脏产生明显病理变化,这些结果表明目前PCV2流行毒株对猪体有明显的致病性。（4）为了解PCV3在我国的分子流行病学特征,对2016-2019年间,我国10省份278个猪场的4199份猪临床样本进行PCV3检测。PCV3在猪群中总阳性率为29.4%（1235/4199）,不同省份间阳性率为7.3%-37.3%;在猪场水平阳性率为74.8%（208/278）,表明PCV3在我国猪群中普遍存在。统计学分析表明PCV3可能增加PCV2和PRRSV感染率,并与猪的临床疾病相关。为进一步研究PCV3的遗传变异和进化规律,对部分检测阳性的临床样本进行全基因组序列扩增,共获得了70个PCV3全基因序列。同源性分析表明PCV3毒株具有很高的遗传稳定性,与其他圆环病毒有很大区别。通过对NCBI数据库中全部673个PCV3毒株序列分析表明,Cap蛋白主要氨基酸变异位点全部在预测的抗原表位上,并且在PCV3毒株进化过程中发生变异。遗传进化分析表明,PCV3毒株主要分为两个基因型,PCV3a和PCV3b;在PCV3的进化过程中PCV3a逐渐减少,PCV3b逐渐增多。上述结果为理解PCV3的流行,发病机制,进化规律和将来的防控提供理论基础。（5）流行病学调查结果表明,PCV3在猪群中具有很高的阳性率,除了猪之间的传播外,是否还存在其他潜在的传播途径,比如通过蚊等媒介生物传播。为了解PCV3在蚊子中的感染和基因组特征,对黑龙江,吉林和云南省的7个猪场的269份蚊子和80份猪血清样本进行PCV3检测。蚊子中PCV3的总阳性率为32.0%（86/269）,同一猪场的蚊子中PCV3阳性率和猪中PCV3阳性率呈正相关性,表明蚊子可能作为PCV3的传播载体。为了解蚊子中PCV3的起源和基因组特性,从蚊子中获得了6个PCV3全基因组序列,从猪中获得了2个PCV3全基因序列。序列分析表明,同一猪场的蚊子和猪中PCV3同源性为100%,表明蚊子中PCV3起源于猪。遗传进化分析表明,蚊子中PCV3分别属于PCV3a和PCV3b基因型。上述结果表明蚊子可能作为PCV3传播链中潜在的传播媒介。（6）对PCV2疫苗新兽药注册和临床试验分析表明,PCV2基因工程疫苗和以PCV2为基础的多联疫苗是PCV2疫苗的发展趋势。PCV3作为猪新发传染病,与PCV2同为圆环病毒科圆环病毒属成员,与猪的多种临床症状相关,给养猪业带来危害。以分子流行病学研究中获得的PCV2流行株PCV2/JL/JL19和PCV3流行株PCV3/JL/JL32的Cap氨基酸为参考,针对猪物种进行密码子优化,以腺病毒为载体,获得了单独表达PCV2 Cap蛋白和PCV3 Cap蛋白的重组腺病毒r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV3-Cap;和同时表达PCV2 Cap蛋白和PCV3Cap蛋白的重组腺病毒r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap。经过测序表明,基因正确,Western Blot和IFA鉴定蛋白获得表达,稳定性实验表明3株重组腺病毒具有很好的稳定性,表明重组腺病毒构建成功。（7）小鼠免疫试验表明,重组腺病毒r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap疫苗免疫后35天,PCV2特异性抗体效价可达1:2700和1:2100;中和抗体分别为1:43和1:52;淋巴细胞增殖水平均为对照组PBS的1.37倍;均能产生较高水平的细胞因子IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。重组腺病毒r Ad5-PCV3-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap疫苗免疫猪体后35天,PCV3特异性抗体效价可达1:2100和1:1600;淋巴细胞增殖水平均为对照组PBS的1.3倍;均能产生较高水平的细胞因子IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。上述结果表明重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV3-Cap免疫小鼠后能够分别产生较好针对PCV2和PCV3的体液和细胞免疫应答;重组腺病毒r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫小鼠后能够同时产生较好的针对PCV2和PCV3的体液和细胞免疫应答。（8）猪体免疫试验表明,重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫后35天,PCV2特异性抗体效价均可达1:1300;中和抗体分别为1:85和1:81;淋巴细胞增殖水平分别为对照组PBS的1.46倍和1.4倍;均能够产生较高水平的细胞因子IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。PCV2流行株PCV2/JL/JL19攻毒后,重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫组与对照组相比无明显临床症状,能够减少病毒血症猪数量,肺脏和腹股沟淋巴结无明显病理变化。重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV3-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫猪体后35天,PCV3特异性抗体效价可达分别为1:1600和1:1300;淋巴细胞增殖水平均分别为对照组PBS的1.35倍和1.32倍;均能产生较高水平的细胞因子IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。PCV3组织毒攻毒后,重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV3-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫组与对照组相比,能够减少PCV3病毒血症,肺脏和腹股沟淋巴结无明显病理变化。这些结果表明重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV3-Cap免疫猪体后能够分别产生较好针对PCV2和PCV3的体液和细胞免疫应答,分别抵抗PCV2和PCV3的攻击,为猪体提供很好的保护效果;重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫猪体后能够同时产生较好针对PCV2和PCV3的体液和细胞免疫应答,同时抵抗PCV2和PCV3的攻击,为猪体提供很好的保护效果。
宁龙龙[3]（2020）在《花生AhP5CS基因的克隆与功能分析》文中进行了进一步梳理花生是世界上重要的油料作物和经济作物之一,主要分布在亚洲、美洲和非洲等地区。中国作为亚洲最大的花生生产、消费和出口国,花生对中国的经济发展起着至关重要的作用。然而,有限的耕地灌溉条件以及全球变暖导致的极端气候事件特别是水旱灾害频发,严重影响着我国花生生产。在干旱条件下,植物主要通过大量富集渗透调节物质来抵抗逆境,脯氨酸（Proline,Pro）是分布最广的植物内源性渗透调节物质之一。?1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrroline-5-carboxylic acid synthase,P5CS）是脯氨酸合成途径中的限速酶,对植物体内脯氨酸含量起重要的调节作用。为了研究P5CS基因在花生抵抗逆境中发挥的作用,以期为抗逆育种提供理论基础,本研究从花生中克隆了三个P5CS基因,分析渗透胁迫下P5CS基因在花生根和叶中的表达情况,构建真核表达载体并转化酿酒酵母,构建植物过表达载体,通过花浸法转化拟南芥,为进一步探究P5CS基因的功能奠定基础。主要研究结果如下:（1）利用同源序列法,通过RT-PCR技术,成功克隆到三个花生P5CS基因,分别命名为Ah P5CSA02、Ah P5CSA03和Ah P5CSA04。三个基因的编码区c DNA片段长度分别为2259、2151和2268 bp,推测编码的氨基酸个数分别为752、716、755个。跨膜结构分析显示三个蛋白均不含有跨膜结构,都不是跨膜蛋白;亚细胞定位分析发现三个P5CS基因都定位于线粒体中。（2）通过多序列比对和保守结构域分析,发现植物中的P5CS基因具有高度的保守性,编码蛋白均含有谷氨酸激酶（glutamate kinase,GK）结构域、谷氨酰磷酸还原酶（glutamyl phosphate reductase,GPR）结构域、ATP结合位点、NADPH结合位点和亮氨酸结构域。系统进化分析表明,Ah P5CSA02、Ah P5CSA04与同属豆科的鹰嘴豆、蒺藜苜蓿亲缘关系最近,而Ah P5CSA03与同属豆科的紫花苜蓿亲缘关系最近。（3）利用实时荧光定量PCR技术分析三个基因的时空表达模式和在室内模拟干旱胁迫下基因的表达模式。结果表明,三个基因在花生中均为组成型表达,其中Ah P5CSA02基因在根中高表达,Ah P5CSA03基因主要在茎中表达,Ah P5CSA04的表达量在叶片中最高。Ah P5CSA02和Ah P5CSA04基因的表达明显受渗透胁迫诱导,为胁迫诱导型基因;Ah P5CSA03基因不受渗透胁迫诱导,胁迫处理前后基因的表达量没有显着差异。（4）分别构建三个基因的真核表达载体p YES2-Ah P5CSA02、p YES2-Ah P5CSA03和p YES2-Ah P5CSA04,并将重组质粒导入到酿酒酵母细胞中,分析在渗透胁迫下酵母细胞的生长情况。结果表明,过表达Ah P5CSA02基因提高了酵母对盐胁迫和渗透胁迫的抗性;转Ah P5CSA03基因的酵母没有表现出明显的抗逆性变化;对转Ah P5CSA04基因的酵母研究表明,该基因可以增强酵母细胞的渗透性,但对酵母细胞的盐胁迫适应能力并没有明显的提高。（5）分别构建三个基因的植物过表达载体,分别在拟南芥中进行组成型表达,通过浸花法转化拟南芥并对T3代纯合转基因植株进行渗透胁迫实验。结果表明,渗透胁迫下,转Ah P5CSA02基因的拟南芥萌发率为55%,是野生型的2倍,平均根长为野生型的2.5倍,说明转Ah P5CSA02基因可提高转基因植株的抗逆性。野生型和转Ah P5CSA03基因的拟南芥阳性株系萌发率均为25%左右,转Ah P5CSA03基因拟南芥平均根长与野生型没有显着差异,说明Ah P5CSA03基因对植株的抗逆性没有影响。转Ah P5CSA04基因的拟南芥阳性株系平均萌发率为48%,为野生型的1.9倍,平均根长为野生型的1.7倍,表明转Ah P5CSA04基因可以提高转基因拟南芥的胁迫抗性。
张伟[4]（2019）在《谷氨酸棒杆菌外源蛋白分泌表达系统的开发及其应用研究》文中研究指明谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是一种高GC含量的革兰氏阳性菌,属于GRAS。除作为氨基酸和有机酸等的生产菌株之外,C.glutamicum也是一种很有潜力的外源蛋白表达宿主。该宿主具有较好的分泌系统,能够将表达出的外源蛋白分泌到胞外,简化下游的分离纯化过程。目前,利用C.glutamicum为表达宿主,在表达元件的开发上取得了一些进展并表达了部分外源蛋白,但相对于常用的以大肠杆菌（Escherichia coli）为宿主的外源蛋白表达系统,尚有不足之处。主要表现在,可用的表达元件较少,表达水平较低等。因此,有必要开发更多可用的表达元件以适应外源蛋白表达的需要,同时对宿主进行改造以使蛋白产量进一步提高。本论文以C.glutamicum CGMCC1.15647高效分泌表达外源蛋白为目的,筛选了高效的PcspB2启动子和cspB2信号肽等表达元件,并对宿主进行改造,包括基因组整合目的基因、敲除蛋白酶和细胞表面蛋白组分等,结合双质粒表达,构建了高效的C.glutamicum分泌表达系统。主要研究结果如下:（1）发现高效表达自身蛋白的Paph启动子,通过构建单顺反子和双顺反子表达载体,分析了不同的RBS序列对报告蛋白EGFP的影响,得到双顺反子结构结合RBS序列RM3表达的EGFP荧光强度最高。对Paph启动子的-10区进行突变之后,EGFP、α-淀粉酶和单域抗体（variable domain of the heavy-chain antibody,VHH）表达量分别提高至1.1、1.5和1.1倍。选取12个来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis 168）中高表达蛋白的启动子,结合筛选到的RBS序列RM3构建双顺反子表达载体,以EGFP为报告蛋白,筛选到表达组件BSB4,用此组件表达单链抗体（single chain antibody fragment,ScFv）产量超过100 mg/L。（2）对C.glutamicum分泌蛋白进行质谱分析,筛选到高效的CspB2信号肽,结合C.glutamicum强内源启动子PAH6和RBS序列RM3构建双顺反子表达载体,成功分泌表达了木聚糖酶和VHH,表达出的木聚糖酶在摇瓶产量为486.2U/mL,在5 L发酵罐水平为1648.7 U/mL;分泌表达VHH产量是利用RM3V’启动子的2.4倍。当利用PcspB2启动子和cspB2信号肽分泌表达木聚糖酶时,木聚糖酶在摇瓶水平的产量为596.7 U/mL,经过培养基优化（单因素筛选、PB实验、最陡爬坡试验和中心组合实验）,木聚糖酶的分泌表达量达到1849.03 U/mL。对木糖酶的部分酶学性质进行研究,发现该酶的最适催化温度和pH值分别为45℃和pH4.5,在pH4-11范围内较为稳定和50℃之前较为稳定,Cu2+和SDS等抑制木聚糖酶活性,Co2+和Mn2+等能激活木聚糖酶活性。（3）对宿主进行改造,提高外源蛋白表达量。利用PcspB2启动子和cspB2信号肽表达木聚糖酶时,发现其在C.glutamicum CGMCC1.15647中的分泌表达量能发挥较高水平,在C.glutamicum ATCC13032中的表达水平为来源菌的28.61%。敲除宿主的S层蛋白CspB2和蛋白酶ClpS,木聚糖酶的分泌表达量分别提高了107.56和195.96 U/mL;木聚糖酶基因整合到敲除了cspB2和clpS的宿主基因组并且双质粒表达木聚糖酶得到重组菌ΔcspB2ΔclpSInX+P19-X+pEC-X,木聚糖酶在24孔板水平的分泌表达量达到2492.88 U/mL,相对于基因组整合表达和带有pXMJ19-xynA质粒的野生型菌株表达分别提高了10.43和0.35倍。重组菌ΔcspB2ΔclpSInX+P19-X+pEC-X在5 L发酵罐水平达到3537.24 U/mL（1768.62mg/L）。此外,我们在C.glutamicum中分泌表达了普鲁兰酶,密码子优化和宿主优化提高了普鲁兰酶的分泌表达量,普鲁兰酶在5 L发酵罐水平最高达108.13U/mL。
张亚菲[5]（2019）在《毕赤酵母启动子及内部核糖体进入位点（IRES）的研究》文中认为毕赤酵母（pichia pastoris）由于具有生长快速、可高密度发酵、遗传操作简单和能进行翻译后修饰等特点,现已成为重要的工业微生物。毕赤酵母全基因组测序完成后,使得其应用不仅仅局限于作为外源蛋白的表达系统上,开始逐渐应用于合成生物学和代谢工程上。无论是用于外源蛋白表达还是合成生物学或代谢工程,基因表达元件的开发对于毕赤酵母系统的发展至关重要。基于这些,本研究从启动子和内部核糖体（IRES）元件入手,在毕赤酵母中筛选有功能的启动子和IRES元件。根据毕赤酵母转录组测序数据,分析在毕赤酵母中高转录基因,确定了18个候选基因,分别是ACO1、ALD4、ATO2、ATP1、ATP2、CIT1、CTA1、FDH1、HSP12、ICL1、OLE1、PCK1、POR1、QCR7、RGI2、SSA4、TDH3、TMA10。设计引物扩增这18个基因的拟启动子区,克隆到去除AOX1启动子的毕赤酵母pPICZA表达载体中。以Lac Z基因作为报告基因,分析了18个基因的拟启动子区的转录活性。结果显示,扩增的ALD4、ATP1、OLE1、PCK1、RGI2、SSA4、TDH3、TMA10基因拟启动子区具有较高的转录活性。与商用GAP启动子相比,扩增的ALD4、ATP1、OLE1、POR1、RGI2、SSA4、TDH3、TMA10基因拟启动子区转录活性分别高出311.7%、104.0%、187.0%、177.4%、266.3%、329.7%、218.2%、169.4%。对于微生物而言,碳源对代谢有很大影响。因此,分析了甘油、葡萄糖、甲醇、山梨醇四种碳源下ALD4、ATP1、ATP2、FDH1、OLE1、PCK1、POR1、RGI2、SSA4、TDH3、TMA10基因启动子的转录活性。结果显示ATP1在甘油碳源上转录水平最高,ALD4、RGI2、SSA4和TMA10在葡萄糖碳源上转录水平最高,ATP2、FDH1和TDH3在甲醇碳源上转录水平最高,OLE1、PCK1和POR1基因启动子在山梨醇碳源上转录水平最高。以EGFP为报告蛋白,分析了具有高转录活性的ALD4、ATP1、ATP2、FDH1、OLE1、PCK1、POR1、RGI2、SSA4、TMA10基因启动子的胞外表达情况,结果表明,ATP1、ATP2、FDH1、OLE1、RGI2、SSA4、TMA10基因启动子具有较高的表达水平,其中ATP1、ATP2、FDH1、RGI2、SSA4、TMA10基因的表达水平比商用GAP启动子分别高出303.3%、283.7%、250.0%、145.7%、233.3%、115.3%。以四种碳源分析显示,FDH1启动子与商用启动子AOX1相似,能被甲醇诱导。比较了FDH1与AOX1启动子在胞内和胞外的表达水平,结果表明,无论是用于胞内和胞外表达,FDH1启动子优于AOX1启动子,并且FDH1启动子不受甘油的抑制。不足的是FDH1在没有诱导之前有较高的本底表达。在IRES研究中,根据已有的研究,选取34个在哺乳动物、昆虫、植物或酿酒酵母中有功能的IRES序列。分别以EGFP和LacZ为报告基因,构建双顺反子报告载体对这34个IRES进行分析。研究发现,LacZ基因在无启动子的毕赤酵母表达载体中可进行转录,原因可能是载体骨架或LacZ基因含有隐含启动子。为了使LacZ基因可以用于本研究,利用β-半乳糖苷酶具有α互补特性,在毕赤酵母中建立了LacZ基因的α互补体系。将编码β-半乳糖苷酶N端1-92氨基酸序列放在双顺反子报告载体中表达,编码β-半乳糖苷酶C端整合到毕赤酵母GS115基因组中。经筛选,并排除隐含剪接位点、通读的可能,共得到7个在毕赤酵母中有功能的IRES序列,分别是TEV、PVY、RhPV、TRV-IGR、KSHV、crTMV病毒的IRES序列和酿酒酵母YPA1基因5’UTR序列。其中TEV和TRV-IGR的IRES活性最高。本研究所开发的启动子和IRES序列,进一步丰富了毕赤酵母系统基因表达元件,为多基因在毕赤酵母中的表达提供了更多的表达元件选择,有利于推动毕赤酵母系统的发展和完善。
曹灵博[6]（2018）在《miR-92a-3p靶向Itga6调控C2C12细胞迁移及机理初探》文中研究表明骨骼肌卫星细胞是位于肌纤维膜和基底膜之间具有增殖分化潜力的肌源性干细胞。脊柱动物出生后,骨骼肌卫星细胞对骨骼肌的生长发育以及损伤修复具有重要作用。C2C12细胞是小鼠成肌细胞系,被广泛用于成肌过程的研究。miRNA是短链非编码RNA,可通过调控其靶基因发挥重要功能。大量研究表明miR-92a-3p能够调控细胞增殖、迁移和粘附,而miR-92a-3p在成肌细胞中的功能尚未见报道。因此,本研究将对miR-92a-3p在C2C12细胞成肌分化中的作用及机理做初步探究。为明确miR-92a-3p在成肌过程中的功能,本研究通过过表达和干扰miR-92a-3p,研究其对C2C12细胞增殖、分化、迁移、粘附和扩散的作用,使用生物信息学方法预测其靶基因,验证靶向关系后,构建靶基因过表达载体,在C2C12细胞中过表达靶基因,研究靶基因功能并在C2C12细胞中完成功能回复验证。主要研究结果如下:1、miR-92a-3p对C2C12细胞增殖的影响过表达miR-92a-3p后24 h和48 h,通过Ed U和流式细胞技术检测C2C12细胞增殖。结果显示,miR-92a-3p不影响C2C12细胞增殖。2、miR-92a-3p对C2C12细胞分化的影响过表达miR-92a-3p后待C2C12细胞长至汇合,诱导分化,分别于诱导分化3 d、5 d、7 d、9 d进行Myosin免疫荧光,q RT-PCR检测Myogenin和Myosin的相对mRNA水平。结果显示,miR-92a-3p不影响C2C12细胞分化。3、miR-92a-3p对C2C12细胞迁移及相关基因的影响分别过表达和干扰miR-92a-3p后24 h,通过划痕试验和活细胞工作站检测C2C12细胞迁移,粘附试验和扩散试验检测C2C12粘附和扩散,q RT-PCR和Western blot检测相关基因mRNA和蛋白水平。结果显示,miR-92a-3p抑制C2C12细胞迁移、粘附和扩散,抑制Rac1和Cdc42的相对mRNA水平和RAC1的蛋白水平,抑制FAK和Paxillin的磷酸化水平。4、miR-92a-3p靶基因预测和验证使用生物信息学方法预测靶基因,通过双荧光素酶报告系统、q RT-PCR和Western blot验证靶向关系。结果显示miR-92a-3p能够直接靶向Itga6。5、Itga6对C2C12细胞迁移、粘附、扩散及相关基因的影响成功构建了Itga6过表达载体pcDNA3.1-Itga6,在C2C12细胞上成功过表达Itga6,划痕试验、活细胞工作站、粘附试验和扩散试验结果显示,Itga6促进C2C12细胞迁移、粘附和扩散。qRT-PCR和Western结果显示,Itga6促进Rac1、Cdc42的相对mRNA水平和RAC1的蛋白水平,促进FAK和Paxillin的磷酸化水平。6、miR-92a-3p通过靶向Itga6调控C2C12细胞迁移、粘附和扩散及相关基因与共转NC mimics和pcDNA3.1相比,共转miR-92a-3p和pcDNA3.1-EV抑制C2C12细胞迁移、粘附、扩散以及Rac1和Cdc42的相对mRNA水平、RAC1的蛋白水平、FAK和Paxillin的磷酸化水平,而共转miR-92a-3p和pcDNA3.1-Itga6则会将上述结果逆转,逆转程度不会超过共转NC mimics和pcDNA3.1-Itga6所获得的效果,证明miR-92a-3p通过靶向Itga6抑制C2C12细胞的粘附和扩散,抑制Rac1、Cdc42的相对mRNA水平和RAC1蛋白水平,抑制FAK和Paxillin的磷酸化水平从而抑制C2C12细胞迁移。
黄子豪[7]（2018）在《利用基因工程改造的大肠杆菌合成蒎烯》文中指出蒎烯（Pinene）是一种重要的天然单萜类平台化合物,被广泛应用于合成高密度可再生燃料、药理活性物、香料和芳香醇等产品,在军事、医药、农业和工业等领域均有重要的应用前景。目前,在工业上大批量获得蒎烯的途径是利用高效精馏塔从脂松节油或粗硫酸盐松节油中进行分离提取。这种传统的获取蒎烯的方法存在效率低、操作复杂繁琐、能源消耗大和设备技术要求高等缺点,与此同时破坏了环境、消耗了大量自然资源。以系统生物学的研究为基础,合成生物学借助工程学的标准化、模块化和系统化的设计理论,以人工合成的脱氧核糖核苷酸为基础,设计并创造器件（devices）、元件（parts）以及模块（motifs）,然后利用这些人工合成的“生物零件”对现有自然生物系统（systems）进行改造和优化,或者完全重新合成具有预定功能的全新的人工生物系统,来实现对天然产物、功能材料及新能源的大规模工业化生产和应用。本文以大肠杆菌为底盘细胞,导入外源杂合的蒎烯合成代谢途径,构建了合成蒎烯的“微生物工厂”。研究内容主要分为以下四个部分:（1）通过GenBank获取蒎烯合成代谢途径中最后两个酶:牻牛儿基焦磷酸合成酶（GPPS）、蒎烯合成酶（PS）的基因序列,优化后进行人工全基因合成,合成的目的基因连入载体后命名为pTOPO-GPPS和pTOPO-PS。分别以pETDuet-1和pET-24a载体为基础构建GPPS、PS的共表达载体和融合表达载体,并分别将其转化到大肠杆菌中获得工程菌E.hzh01和E.hzh02。（2）基于GC-MS技术建立了蒎烯的检测方法,利用工程菌E.hzh01和E.hzh02验证GPPS、PS融合表达和共表达产蒎烯的效率及外源蛋白的表达对大肠杆菌生长的影响。结果表明,相较于共表达,蛋白融合表达可以提高蒎烯的产量且更有利于大肠杆菌的生长。（3）通过GenBank获取MVA代谢途径相关酶（mvaE:、mvaS、ERGl2、ERG8、ERG19、IDI）的基因序列,设计引物克隆出目的基因。利用BioBrick原理方法和多顺反子模型的原理方法构建两种不同方案的MVA下游代谢途径。将MVA代谢途径和GPPS、PS融合表达基因共同转化到大肠杆菌中构建完整蒎烯合成代谢工程菌株E.hzh03、E.hzh05。摇瓶培养工程菌并检测蒎烯产量,E.hzh03和E.hzh05蒎烯产量分别为6.32 mg/L和19.26 mg/L。结果表明,将MVA代谢途径导入到大肠杆菌中可以显着提高蒎烯的产率;相比较于BioBrick原理方法构建的MVA代谢途径产蒎烯工程菌株,利用多顺反子模型构建的MVA代谢途径工程菌株的合成蒎烯能力更强。（4）对基因mvaS进行点突变可以提高MVA途径的效率,在E.hzh03、E.hzh05的基础上构建了 mvaS突变菌株E.hzh04和E.hzh06。摇瓶培养工程菌并检测蒎烯产量,mvaS突变菌株的产蒎烯能力较突变前并没有明显提高。结果表明:基因mvaS点突变并对蒎烯产量的提高并没有显着的意义。（5）利用CRISPR/Cas9技术将来源于酵母和粪肠球菌的外源杂合MVA代谢途径的基因分两次定点整合到大肠杆菌基因组中,成功构建了 MVA代谢途径组成型表达的大肠杆菌。本文利用合成生物学的思想理念,将来源于酵母和粪肠球菌的异源杂合MVA代谢途径和来源于北美巨冷杉（Abies grandis）的牻牛儿焦磷酸合成酶和蒎烯合成酶基因共同导入大肠杆菌中并诱导表达,构建含完整的蒎烯代谢途径的大肠杆菌工程菌,评价了不同表达模式下大肠杆菌工程菌产蒎烯的能力,为工业生物合成蒎烯奠定了基础。再将优化好的MVA代谢途径通过CRISPR/Cas9技术定点整合到大肠杆菌基因组中,使其能在大肠杆菌中组成型表达,降低了外源基因在大肠杆菌中的表达压力。此外,成功构建的组成型表达MVA代谢途径的工程菌,可作为一种底盘细胞,广泛用于合成萜类化合物。
吕云斌[8]（2017）在《乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶在乳酸菌中共表达及其对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用》文中认为乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase,ADH）和乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase,ALDH）是酒精代谢的两大关键酶,以NAD+或NADP+作为辅酶,将酒精催化氧化成乙酸。东亚人群在乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶基因上存在缺陷,对酒精代谢能力差,饮酒后极易发生醉酒并更进一步引发各种酒精性疾病,因此外源的补充ADH及ALDH,在消化道内代谢酒精,具有重大研究意义及应用前景。但是ADH及ALDH对酸性环境不耐受性以及大肠杆菌表达系统的安全隐患,制约了大肠杆菌表达ADH及ALDH在人体酒精降解的应用。与大肠杆菌表达系统比较,运用乳酸菌表达系统进行外源蛋白表达具有食品级、乳酸菌益生作用以及耐受消化道极端环境的优势。然而,国内外未见有报道利用乳酸菌表达系统进行ADH及ALDH表达研究,因此利用乳酸菌系统共表达ADH和ALDH,并以全细胞催化的方式在消化道内进行酒精催化氧化,具有重要的研究价值。以前期对陆生伊萨酵母乙醛脱氢酶（IstALDH）克隆表达研究为基础,本研究在食品级乳酸乳球菌NZ3900中活性表达该乙醛脱氢酶,研究低pH条件对全细胞催化乙醛降解活性的影响;进一步探索该酶与酿酒酵母来源乙醇脱氢酶（ScADH）的共表达策略,构建ScADH与IstALDH共表达活性乳酸菌;制备活性乳酸菌冻干粉,探讨其在小鼠急性酒精性肝损伤中的保护作用;探究surfactin及其免疫相关swrC基因作为替换抗生素筛选的新型乳酸菌食品级筛选标记的应用潜力,构建基于swrC基因筛选的IstALDH表达载体。研究结果分述如下:1、IstALDH在NZ3900表达及活性乳酸菌全细胞催化乙醛降解构建重组乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8148-istALDH,优化nisin诱导条件,在20℃下以50 ng/mL浓度nisin诱导2h,乙醛脱氢酶活力为36.4 U/mL,结果表明在乳酸乳球菌NZ3900成功活性表达IstALDH。研究温度及pH值对IstALDH活性乳酸菌的影响,结果表明活性乳酸菌最适反应pH值为9.0,且在pH 3.0-5.0,有15%的活力剩余;活性乳酸菌最适反应温度45℃,且在25℃和30℃具有良好的温度稳定性,60 min内酶活力无变化。通过气相色谱法研究活性乳酸菌全细胞催化乙醛降解,结果表明在pH 2.0条件下,IstALDH活性乳酸菌60 min内乙醛降解速率为2.89±0.22μmol/h,并且在90 min内保持有催化活力,证明IstALDH活性乳酸菌具有良好低pH耐受性,在酸性环境下具有催化乙醛降解活性。2、ScADH在NZ3900表达及分离纯化构建重组乙醇脱氢酶表达菌株NZ3900/PNZ8148-scADH,经nisin诱导,乙醇脱氢酶活力为75.09 U/mL,结果表明在乳酸乳球菌NZ3900成功活性表达ScADH。应用Blue Sepharose 6FF亲和层析和QFF离子交换层析两步纯化法纯化ScADH,获得电泳纯酶,总纯化倍数19.2,回收率14.3%。对乙醇脱氢酶性质研究表明,该酶最适反应温度为40℃,最适反应pH为8.5,在pH 6.0-9.0及25-37℃具有良好的稳定性,证明酿酒酵母来源的乙醇脱氢酶与陆生伊萨酵母来源乙醛脱氢酶性质相似,适合作为共表达联用酶。3、ScADH 与 IstALDH 在 NZ3900 中共表达以融合表达、双顺反子共表达以及双启动子共表达三种策略进行乳酸乳球菌异源共表达ScADH及IstALDH研究,以双启动子策略成功构建共表达菌株NZ3900/pNZ8148-GBD,经 nisin诱导 ScADH 酶活为 6.6 U/mL,IstALDH 酶活为 1.4 U/mL,结果表明在乳酸乳球菌中成功活性共表达ScADH与IstALDH。对活性ScADH与IstALDH共表达乳酸乳球菌冻干条件进行研究,结果表明以10%脱脂乳、4%甘油及4%谷氨酸钠作为冻干保护剂,以10s CFU/mL菌体浓度于液氮速冻并转移-80℃预冻16 h,再进行真空冷冻干燥,具有90.8%的菌体存活率、82.4%乙醇脱氢酶活力保留及81.3%的乙醛脱氢酶活力保留。4、活性乳酸菌冻干粉对小鼠急性酒精性肝损伤保护作用构建酒精性肝损伤小鼠模型,对模型小鼠进行连续大剂量酒精灌胃处理（15 d,5.6 g/kg/d BW）,与对照组小鼠相比,其ALT、AST及AKP活力显着升高了 93.0%、200.0%及36.1%,血脂指标、肝组织抗氧化指标异常,结果表明急性酒精性肝损伤小鼠模型构建成功。并通过灌胃不同酶活力的活性乳酸菌冻干粉,探究其对小鼠急性酒精性肝损伤的作用,结果表明高酶活力活性乳酸菌冻干粉（ScADH 2000 U/kg BW,IstALDH 1000 U/kg BW）混合灌胃处理,显着降低酒精组小鼠ALT活力38.1%,AST活力54.8%,AKP活力23.2%,并且高活力乳酸菌冻干粉处理组小鼠与对照组相比,血脂指标、肝组织抗氧化指标差异不显着,肝细胞形态接近,cyp2e1、mcp1、tlr4及tlr5基因表达维持正常水平,研究证明高酶活力共表达活性乳酸菌冻干粉对小鼠急性酒精性肝损伤具有显着保护作用。5、基于surfactin抗性筛选的乙醛脱氢酶乳酸菌表达载体构建从枯草芽胞杆菌基因组克隆surfactin免疫相关swrC基因,并利用pMG36e载体在乳酸乳球菌NZ3900中表达,结果表明swrC基因的表达增强NZ3900对surfactin的免疫能力,并且surfactin筛选压力为100 μg/mL。以PpepN启动子替换pMG36e的P32启动子,构建植物乳杆菌LP163表达载体pFMB4191,在LP163中表达swrC基因,结果表明swrC基因编码的蛋白也增强LP163对surfactin的免疫能力,证明surfactin及swrC基因能作为乳酸菌广宿主筛选标记。构建具有红霉素和surfactin双筛选压力的乙醛脱氢酶表达载体PFMB4197,在NZ3900中验证质粒稳定性及酶活力表达,结果表明在100 μg/mL的surfactin压力下,培养18 h,有95%的质粒传代稳定性,最终培养物检测到2.6 U/mL乙醛脱氢酶活力。
于田田,李敬达,刘庆平,王仁军,乔辉,陈玉华,李明英,于柯楠,迟彦[9]（2017）在《人血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1双顺反子表达载体的构建及其在293T细胞中的表达》文中进行了进一步梳理目的尝试构建人血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1（LOX-1）基因双顺反子表达载体并检测其在293T细胞中的表达情况和生物学活性,为深入探讨LOX-1在动脉粥样硬化中的作用和以LOX-1为靶点建立干预机制治疗动脉粥样硬化奠定基础。方法首先根据Primer5.0软件设计引物,采用聚合酶链反应法以LOX-1 c DNA片段为模板扩增LOX-1基因完整编码区,克隆至T载体,经测序成功后亚克隆到双顺反子真核表达载体p IRES2-Ac GFP1-Nuc。利用脂质体转染法将双顺反子重组表达质粒转染至293T细胞,倒置荧光显微镜检测质粒转染情况。采用逆转录聚合酶链反应和免疫印迹法鉴定LOX-1基因在核酸和蛋白水平的表达,采用激光共聚焦检测LOX-1基因在293T细胞膜上的表达,激光共聚焦和流式细胞术检测表达在293T细胞膜上的LOX-1结合氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）的生物学活性。结果成功构建p IRES2-LOX-1双顺反子重组表达载体,将其转染293T细胞后,观察到绿色荧光蛋白基因的表达,初步表明LOX-1基因转染至293T细胞。进一步分子水平鉴定结果表明LOX-1基因在293T细胞核酸和蛋白水平均得到表达,激光共聚焦结果证明LOX-1基因在293T细胞膜上表达。最后激光共聚焦和流式细胞术结果证实表达在293T细胞膜上的人LOX-1基因可以结合氧化型低密度脂蛋白。结论成功构建人LOX-1基因双顺反子表达载体,在此基础上证明其在293T细胞膜上得到表达,并且具有结合ox-LDL的生物学活性,为后续体外研究其在动脉粥样硬化中的作用以及以此为靶点建立干预机制奠定了基础。
戴红林[10]（2016）在《莱茵衣藻叶绿体内多顺反子高效表达体系的建立》文中研究说明莱茵衣藻因叶绿体表达系统相较于大肠杆菌、酵母等表达系统具有很多优势,一直被认为是理想的生物反应器,然而衣藻叶绿体中多基因操纵子表达量较低一直是束缚衣藻商业化生产重组蛋白的限制条件。在这项研究中我们致力于寻找一种基因问表达调控元件（IEE,intercistronic expression element）,其为一段短的序列,通常在基因间隔区,转录后可形成RNA茎环二级结构,增强mRNA稳定性,将多顺反子高效地处理成稳定的单顺反子,从而赋予下游顺反子的可翻译性。它同时提供了一个新的通用工具,用于叶绿体中多个外源基因堆叠,实现多种蛋白同时表达,提高质体转基因表达的成功率,有助于扩大叶绿体转化技术的应用。本论文的主要内容及结果如下：（1）提取莱茵衣藻总DNA,从总DNA中克隆出衣藻内源性启动子PpsbA,终止子,同源序列,构建了莱茵衣藻"aadA表达盒”,作为后续实验的对照质粒。（2）以莱茵衣藻总DNA为模板,扩增出了两个潜在的基因间表达处理元件（IEE, intercistronic expression element）,与本试验前期克隆的表达壮观霉素抗性基因aadA和表达卡那霉素抗性基因nptⅡ-起成功地构建了两个衣藻叶绿体双顺反子测试表达载体。（3）通过玻璃珠法、电击法及基因枪法将载体转入到莱茵衣藻叶绿体中,优化电击转化的电场强度,及筛选转化子的最佳抗生素浓度,发现最佳电场强度为1000V,最低壮观霉素浓度为100μg/mL,卡那霉素浓度为50μg/mL。（4）通过壮观霉素筛选及反复继代培养,获得转基因藻株,并经过卡那霉素抗生素筛选,初步表明IEE已发挥作用,但在PCR分子水平检测上还存在些问题,质粒在叶绿体中的存在方式等确切结论还有待进一步研究。
二、Construction and expression of the bicistronic expression vector with RANTES and SDF-1 genes（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Construction and expression of the bicistronic expression vector with RANTES and SDF-1 genes（论文提纲范文）
（1）灰飞虱HiPV病毒翻译调控元件IRES功能解析及在昆虫细胞双顺反子表达系统中的利用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 内部核糖体进入位点(IRES) |
| 1.1.1 内部核糖体进入位点(IRES)简介 |
| 1.1.2 IRES结构和功能分类 |
| 1.1.3 IRES起始蛋白合成作用机理 |
| 1.2 灰飞虱及内生病毒HiPV研究概况 |
| 1.2.1 重要水稻害虫灰飞虱 |
| 1.2.2 灰飞虱内生病毒HiPV |
| 1.3 昆虫细胞表达系统的应用概况 |
| 1.3.1 昆虫细胞表达系统的应用 |
| 1.3.2 IRES的应用 |
| 1.4 目的及意义 |
| 2 HiPV-IRES起始蛋白合成关键结构域解析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IRES二级结构预测 |
| 2.2.2 IRES克隆及p IE-IRES表达载体构建 |
| 2.2.3 IRES在昆虫细胞中启动蛋白合成及分析 |
| 2.2.4 IRES突变体构建及功能验证 |
| 2.2.5 IRES江苏分离物与日本分离物功能活性比较 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 IRES表达载体构建及胞内蛋白表达分析 |
| 2.3.2 突变IRES表达载体构建及胞内蛋白表达分析 |
| 2.3.3 变异IRES表达载体构建及蛋白结果分析 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 3 HiPV-IRES下游天冬酰胺重复序列(IRES_(NN))对蛋白合成的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 昆虫病毒IRES下游氨基酸序列分析 |
| 3.2.2 HiPV-IRES_(NN)对蛋白合成的影响 |
| 3.2.3 HiPV、DCV、Cr PV IRES功能活性比较分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 IRES_(NN) IRES_(N’)表达载体构建及胞内蛋白表达分析 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 4 利用IRES构建昆虫细胞双顺反子表达系统及应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 基于IRES双顺反子表达载体构建 |
| 4.2.2 双顺反子表达载体的功能验证 |
| 4.2.3 利用p IE-IRES实现两个蛋白表达 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 双顺反子表达载体构建及胞内蛋白表达分析 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A 常用缓冲液及试剂配制方法 |
| 攻读博/硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（2）PCV2和PCV3分子流行病学及二联重组腺病毒候选疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 猪圆环病毒特性 |
| 1.1.1 猪圆环病毒2型 |
| 1.1.2 猪圆环病毒3型 |
| 1.2 猪圆环病毒的流行病学 |
| 1.2.1 猪圆环病毒2型的流行病学 |
| 1.2.2 猪圆环病毒3型的流行病学 |
| 1.3 猪圆环病毒的致病机制 |
| 1.3.1 猪圆环病毒2型的致病机制 |
| 1.3.2 猪圆环病毒3型的致病机制 |
| 1.4 猪圆环病毒疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 PCV2疫苗的种类 |
| 1.4.2 PCV2疫苗临床试验 |
| 1.4.3 PCV2疫苗的展望 |
| 1.4.4 PCV3疫苗的研究进展 |
| 1.5 腺病毒载体疫苗 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.2 细胞和毒株 |
| 2.1.3 试验动物 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器和设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 猪圆环病毒2型的分子流行病学调查 |
| 2.2.2 PCV2全球毒株的进化规律分析 |
| 2.2.3 PCV2流行株的分离及致病性研究 |
| 2.2.4 猪圆环病毒3型的分子流行病学调查 |
| 2.2.5 PCV3潜在的传播途径监测 |
| 2.2.6 PCV3 Cap蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 2.2.7 PCV2 Cap和 PCV3 Cap二联重组腺病毒疫苗构建及鉴定 |
| 2.2.8 PCV2 Cap和 PCV3 Cap二联重组腺病毒疫苗免疫小鼠试验 |
| 2.2.9 PCV2 Cap和 PCV3 Cap二联重组腺病毒疫苗猪体免疫试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪圆环病毒2型的分子流行病学调查 |
| 3.1.1 PCV2在中国9省份的流行状况 |
| 3.1.2 PCV2 全基因组序列和ORF2 基因的扩增 |
| 3.1.3 同源性分析 |
| 3.1.4 氨基酸比对 |
| 3.1.5 重组分析 |
| 3.1.6 遗传进化分析 |
| 3.1.7 PCV2流行毒株的选择 |
| 3.2 全球PCV2毒株的进化规律分析 |
| 3.2.1 PCV2毒株进化过程中世界范围内的基因型漂移 |
| 3.2.2 PCV2毒株进化过程中在中国的基因型漂移 |
| 3.2.3 全球PCV2毒株进化过程中氨基酸变异 |
| 3.2.4 中国的PCV2毒株进化过程中氨基酸变异 |
| 3.2.5 PCV2毒株进化过程中氨基酸变异产生的可能原因 |
| 3.3 PCV2流行株的分离及致病性研究 |
| 3.3.1 PCV2的分离与鉴定 |
| 3.3.2 PCV2分离株的纯净性检测和全基因组测序 |
| 3.3.3 PCV2分离株的滴度测定 |
| 3.3.4 PCV2流行株攻毒试验 |
| 3.4 猪圆环病毒3型的分子流行病学调查 |
| 3.4.1 PCV3在中国10个省份的流行状况 |
| 3.4.2 PCV3与猪临床疾病潜在的相关性 |
| 3.4.3 PCV3全基因组序列扩增 |
| 3.4.4 同源性分析 |
| 3.4.5 PCV3的遗传变异 |
| 3.4.6 全基因组序列的比对 |
| 3.4.7 遗传进化分析 |
| 3.4.8 PCV3基因型的进化规律 |
| 3.4.9 PCV3流行毒株的选择 |
| 3.5 PCV3潜在的传播途径 |
| 3.5.1 PCV3在蚊子和猪场中的检测 |
| 3.5.2 PCV3可能的传播圈 |
| 3.5.3 蚊子中PCV3全基因组序列扩增 |
| 3.5.4 氨基酸比对 |
| 3.5.5 蚊子中PCV3的起源 |
| 3.5.6 蚊PCV3遗传进化分析 |
| 3.6 PCV3 Cap蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 3.6.1 PCV3 Cap原核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.6.2 PCV3 Cap蛋白原核表达与鉴定 |
| 3.6.3 PCV3 Cap蛋白的纯化与鉴定 |
| 3.6.4 PCV3 Cap蛋白多克隆抗体制备与鉴定 |
| 3.7 PCV2 Cap和 PCV3 Cap二联重组腺病毒疫苗构建及鉴定 |
| 3.7.1 PCV2 ORF2和PCV3 ORF2 基因的优化 |
| 3.7.2 PCV2 Cap和 PCV3 Cap二联重组腺病毒穿梭质粒的构建 |
| 3.7.3 包装重组腺病毒 |
| 3.7.4 重组腺病毒IFA鉴定 |
| 3.7.5 重组腺病毒Western Blot鉴定目的蛋白 |
| 3.7.6 稳定性鉴定 |
| 3.8 PCV2 Cap和 PCV3 Cap单独及二联重组腺病毒疫苗免疫小鼠试验结果 |
| 3.8.1 特异性抗体检测 |
| 3.8.2 PCV2中和抗体检测 |
| 3.8.3 淋巴细胞增殖反应 |
| 3.8.4 细胞因子检测 |
| 3.8.5 PCV2攻毒保护试验 |
| 3.9 PCV2 Cap和 PCV3 Cap单独及二联重组腺病毒疫苗免疫猪体试验 |
| 3.9.1 特异性抗体检测 |
| 3.9.2 PCV2中和抗体检测 |
| 3.9.3 淋巴细胞增殖反应 |
| 3.9.4 细胞因子检测 |
| 3.9.5 PCV2攻毒保护试验 |
| 3.9.6 PCV3攻毒保护试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PCV2的分子流行病学特征 |
| 4.2 通过全球毒株序列分析PCV2的进化规律 |
| 4.3 PCV3在中国的分子流行病学特征 |
| 4.4 PCV3潜在的传播途径 |
| 4.5 重组腺病毒疫苗的设计和构建 |
| 4.6 重组腺病毒疫苗的免疫效果的评价 |
| 4.7 重组腺病毒疫苗免疫后攻毒保护试验 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）花生AhP5CS基因的克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物渗透胁迫研究进展 |
| 1.1.1 渗透胁迫对植物的影响 |
| 1.1.1.1 渗透胁迫对植物生长指标的影响 |
| 1.1.1.2 渗透胁迫对植物细胞膜系统的影响 |
| 1.1.1.3 渗透胁迫对植物抗氧化系统的影响 |
| 1.1.1.4 渗透胁迫对植物植物激素的影响 |
| 1.1.2 植物应对渗透胁迫的途径 |
| 1.1.3 植物渗透调节物质的种类 |
| 1.2 脯氨酸的研究进展 |
| 1.2.1 脯氨酸的合成与降解 |
| 1.2.2 脯氨酸的生理功能 |
| 1.2.3 渗透胁迫下植物体内积累脯氨酸的生物学意义 |
| 1.3 P5CS基因的研究现状 |
| 1.3.1 植物P5CS基因的基本结构特点和功能 |
| 1.3.2 植物P5CS基因的克隆与表达特性分析 |
| 1.3.3 转P5CS基因植物研究进展 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 三个花生AhP5CS基因的克隆与分子特性分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 菌株与质粒 |
| 2.1.3 试剂耗材 |
| 2.1.4 仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 花生总RNA提取 |
| 2.2.2 RNA质量检测 |
| 2.2.3 反转录合成cDNA |
| 2.2.4 引物设计与合成 |
| 2.2.5 花生Ah P5CS的编码序列的PCR扩增 |
| 2.2.6 目的片段的纯化回收 |
| 2.2.7 目的片段与PMD19-T载体的连接 |
| 2.2.8 目的基因转化大肠杆菌DH5α |
| 2.2.9 阳性菌落的检测 |
| 2.2.10 花生AhP5CS的生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 花生叶片RNA的提取 |
| 2.3.2 三个AhP5CS基因的扩增 |
| 2.3.3 菌液PCR检测及阳性克隆测序 |
| 2.3.4 三个AhP5CS基因的序列特征分析 |
| 2.3.5 三个AhP5CS基因的保守结构域分析 |
| 2.3.6 三个AhP5CS蛋白进化分析 |
| 2.4 结论与讨论 |
| 第三章 花生AhP5CS基因的表达分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试材料 |
| 3.1.2 试剂耗材 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 花生材料的培养 |
| 3.2.2 组织表达分析 |
| 3.2.3 非生物胁迫分析 |
| 3.2.4 实时荧光定量PCR引物设计 |
| 3.2.5 实时荧光定量PCR反应体系和反应程序 |
| 3.2.6 花生叶片和根中脯氨酸含量的测定 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 不同组织中三个AhP5CS基因的表达分析 |
| 3.3.2 渗透胁迫下花生幼苗的表型变化 |
| 3.3.3 渗透胁迫下花生叶片中AhP5CS基因表达量的变化与游离脯氨酸含量的变化 |
| 3.3.4 渗透胁迫下花生根系中AhP5CS基因表达量的变化与游离脯氨酸含量的变化 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 第四章 花生AhP5CS基因的真核表达分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 载体与菌株 |
| 4.1.2 试剂耗材 |
| 4.1.2.1 酶及试剂盒 |
| 4.1.2.2 培养基 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 载体pYES2的转化,提取和验证 |
| 4.2.2 酵母表达载体的构建 |
| 4.2.2.1 带同源序列的目的片段的获得 |
| 4.2.2.2 pYES2载体的双酶切 |
| 4.2.2.3 重组载体的构建 |
| 4.2.3 重组质粒与pYES2质粒的酵母转化与鉴定 |
| 4.2.4 重组酵母的胁迫实验 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 载体pYES2的转化及验证 |
| 4.3.2 载体pYES2的双酶切及带有同源臂片段的扩增。 |
| 4.3.3 重组质粒的构建及验证 |
| 4.3.4 酵母转化子的鉴定 |
| 4.3.5 转基因酵母对逆境胁迫的抗性分析 |
| 4.3.5.1 转Ah P5CSA02基因酵母的抗逆性分析 |
| 4.3.5.2 转Ah P5CSA03基因酵母的抗逆性分析 |
| 4.3.5.3 转Ah P5CSA04基因酵母的抗逆性分析 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 第五章 花生AhP5CS基因转化拟南芥的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 拟南芥材料 |
| 5.1.2 载体与菌株 |
| 5.1.3 试剂耗材 |
| 5.1.3.1 酶及试剂盒 |
| 5.1.3.2 培养基 |
| 5.1.3.3 SLS提取液的配制 |
| 5.1.4 仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 载体pFGC5941的转化,提取和验证 |
| 5.2.2 植物过表达载体的构建 |
| 5.2.2.1 带酶切位点的引物设计 |
| 5.2.2.2 目的片段和载体质粒的双酶切和纯化 |
| 5.2.2.3 目的片段和载体质粒的连接及转化 |
| 5.2.3 重组质粒转化根癌农杆菌LBA4404 |
| 5.2.4 拟南芥转化 |
| 5.2.4.1 拟南芥培养 |
| 5.2.4.2 拟南芥转化 |
| 5.2.5 拟南芥筛选 |
| 5.2.5.1 除草剂筛选T_1代阳性株系 |
| 5.2.5.2 转基因拟南芥T_1代阳性株系的分子鉴定 |
| 5.2.5.3 高转录水平的转基因株系的获得 |
| 5.2.6 拟南芥抗逆性鉴定 |
| 5.2.6.1 种子萌发期抗逆性鉴定 |
| 5.2.6.2 渗透胁迫处理对植株根系的影响分析 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 载体pFGC5941的转化、验证和双酶切 |
| 5.3.2 含有酶切位点的目的基因的双酶切 |
| 5.3.3 重组质粒的构建及验证 |
| 5.3.4 农杆菌转化的验证 |
| 5.3.5 转基因拟南芥的除草剂筛选与分子鉴定 |
| 5.3.6 转基因阳性苗的表达量分析 |
| 5.3.7 Ah P5CSA02 转基因拟南芥耐逆性分析 |
| 5.3.7.1 转基因拟南芥种子在渗透胁迫下的发芽率 |
| 5.3.7.2 渗透胁迫对拟南芥根长的影响 |
| 5.3.8 Ah P5CSA03 转基因拟南芥耐逆性分析 |
| 5.3.8.1 转基因拟南芥种子在渗透胁迫下的发芽率 |
| 5.3.8.2 渗透胁迫对拟南芥根长的影响 |
| 5.3.9 Ah P5CSA04 转基因拟南芥耐逆性分析 |
| 5.3.9.1 转基因拟南芥种子在渗透胁迫下的发芽率 |
| 5.3.9.2 渗透胁迫对拟南芥根长的影响 |
| 5.4 结论与讨论 |
| 5.4.1 渗透胁迫对野生型和转基因拟南芥萌发率的影响 |
| 5.4.2 渗透胁迫对野生型和转基因拟南芥根长的影响 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
（4）谷氨酸棒杆菌外源蛋白分泌表达系统的开发及其应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 原核蛋白表达系统概述 |
| 1.1.1 E.coli表达系统 |
| 1.1.2 B.subtilis表达系统 |
| 1.1.3 Corynebacterium glutamicum表达系统 |
| 1.2 C.glutamicum表达系统特点 |
| 1.2.1 C.glutamicum的简介 |
| 1.2.2 C.glutamicum中蛋白分泌系统 |
| 1.2.3 C.glutamicum表达外源蛋白概况 |
| 1.3 C.glutamicum表达系统的组成 |
| 1.3.1 表达系统元件 |
| 1.3.2 表达载体 |
| 1.3.3 启动子和SD序列 |
| 1.3.4 信号肽 |
| 1.3.5 其他表达元件结构 |
| 1.4 C.glutamicum表达系统优化策略 |
| 1.4.1 表达载体的优化策略 |
| 1.4.2 宿主优化策略 |
| 1.4.3 其他提高表达量的方法 |
| 1.5 本研究中涉及外源蛋白的介绍 |
| 1.5.1 α-淀粉酶的介绍 |
| 1.5.2 VHH的介绍 |
| 1.5.3 木聚糖酶的介绍 |
| 1.5.4 普鲁兰酶的介绍 |
| 1.6 本课题的立题依据与研究内容 |
| 1.6.1 立项依据与研究意义 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 第二章 外源表达组件的筛选及其在C.glutamicum中的应用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株、质粒 |
| 2.2.2 主要试剂和溶液 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 |
| 2.2.4 遗传操作方法 |
| 2.2.5 载体构建 |
| 2.2.6 QRT-PCR测定egfp的转录水平 |
| 2.2.7 egfp荧光强度的测定 |
| 2.2.8 蛋白的纯化和酶活的测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 pDXW-8 载体在C.glutamicum CGMCC1.15647 表达egfp水平的检测 |
| 2.3.2 Paph启动子的发现和验证 |
| 2.3.3 Paph启动子的活性分析 |
| 2.3.4 Paph启动子的优化 |
| 2.3.5 Paph启动子的应用(α-淀粉酶和VHH的表达) |
| 2.3.6 来源于B.subtilis蛋白组的启动子筛选及其应用 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 C.glutamicum CGMCC1.15647 内源元件用于蛋白的分泌表达 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 主要试剂、培养基和仪器 |
| 3.2.3 C.glutamicum内源信号肽的筛选和鉴定 |
| 3.2.4 内源信号肽的应用 |
| 3.2.5 木聚糖酶在5 L发酵罐中的分泌表达 |
| 3.2.6 木聚糖酶活性的检测 |
| 3.2.7 营养要素对产木聚糖酶的影响 |
| 3.2.8 培养基的优化 |
| 3.2.9 木聚糖酶的纯化、SDS-PAGE和 Western blot |
| 3.2.10 木聚糖酶酶学性质的研究 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 C.glutamicum信号肽的识别与鉴定 |
| 3.3.2 CspB2 信号肽应用于外源蛋白的分泌 |
| 3.3.3 木聚糖酶在5 L发酵罐的分泌表达 |
| 3.3.4 利用内源PcspB2启动子和cspB2 信号肽进行木聚糖酶的分泌表达 |
| 3.3.5 培养基优化 |
| 3.3.6 木聚糖酶的部分酶学性质的研究 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 基于表达元件与宿主的适配性在C.glutamicum中分泌表达外源蛋白 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株、质粒 |
| 4.2.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 载体及重组菌株的构建所需引物 |
| 4.2.5 表达木聚糖酶重组菌的构建 |
| 4.2.6 普鲁兰酶表达载体的构建 |
| 4.2.7 5L发酵罐扩大培养重组菌产外源蛋白 |
| 4.2.8 酶活性的测定 |
| 4.2.9 还原糖的测定 |
| 4.2.10 SDS-PAGE |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 木聚糖酶的分泌表达 |
| 4.3.2 普鲁兰酶的分泌表达 |
| 4.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（5）毕赤酵母启动子及内部核糖体进入位点（IRES）的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 毕赤酵母概述 |
| 2 毕赤酵母用于代谢工程和合成生物学中应用研究进展 |
| 3 毕赤酵母启动子研究进展 |
| 4 内部核糖体进入位点(IRES)的研究进展 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第一章 实验材料和方法 |
| 第一节 实验材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 常用培养基和缓冲液 |
| 1.1.5 寡聚核苷酸引物 |
| 第二节 实验方法 |
| 1.2.1 质粒的提取 |
| 1.2.2 液氮研磨法手提基因组 |
| 1.2.3 PCR反应 |
| 1.2.4 质粒酶切反应 |
| 1.2.5 载体和PCR产物纯化 |
| 1.2.6 连接反应 |
| 1.2.7 转化反应 |
| 1.2.8 山梨醇-电转化酵母细胞 |
| 1.2.9 毕赤酵母总RNA的提取 |
| 1.2.10 逆转录PCR |
| 1.2.11 点突变 |
| 1.2.12 比色法测定β-半乳糖苷酶的活性 |
| 1.2.13 发酵产物的Western-blot检测 |
| 1.2.14 Real-time PCR检测 |
| 1.2.15 载体的构建 |
| 第二章 实验结果 |
| 第一节 毕赤酵母高表达启动子的筛选与功能研究 |
| 2.1.1 毕赤酵母候选基因的选择 |
| 2.1.2 候选基因启动子区克隆 |
| 2.1.3 用于启动子活性检测载体的构建和报告蛋白的选择 |
| 2.1.4 候选基因启动子功能验证 |
| 2.1.5 启动子在不同碳源中的活性 |
| 2.1.6 启动子胞外分泌表达水平 |
| 2.1.7 AOX1和FDH1 启动子胞内表达水平的比较 |
| 2.1.8 AOX1和FDH1 启动子胞外表达水平的比较 |
| 第二节 毕赤酵母中有功能IRES的筛选及研究 |
| 2.2.1 LacZ基因在毕赤酵母中可以驱动自身表达 |
| 2.2.2 β-半乳糖苷酶α互补体系在毕赤酵母中的建立 |
| 2.2.3 在毕赤酵母中具有功能IRES的筛选 |
| 2.2.4 双顺反子mRNA翻译中通读情况的排除 |
| 2.2.5 双顺反子mRNA中剪接情况的排除 |
| 第三章 分析与讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）miR-92a-3p靶向Itga6调控C2C12细胞迁移及机理初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词或符号表 |
| 1 前言 |
| 1.1 成肌细胞的迁移 |
| 1.2 成肌细胞的增殖 |
| 1.3 成肌细胞的分化 |
| 1.4 miR-92a研究进展 |
| 1.4.1 miR-92a在癌症中的研究进展 |
| 1.4.2 miR-92a在血管平滑肌中的研究进展 |
| 1.5 Itga6基因研究进展 |
| 1.5.1 Itga6基因在癌症中的研究进展 |
| 1.5.2 Itga6基因在其它组织中的研究进展 |
| 1.5.3 miRNA与Itga6 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.2 主要试验方法 |
| 2.2.1 C2C12细胞复苏 |
| 2.2.2 C2C12细胞传代培养 |
| 2.2.3 C2C12细胞冻存 |
| 2.2.4 C2C12细胞转染 |
| 2.2.5 EdU和流式细胞技术检测C2C12细胞增殖 |
| 2.2.6 Myosin免疫荧光检测C2C12细胞分化 |
| 2.2.7 C2C12细胞迁移检测 |
| 2.2.8 C2C12细胞粘附和扩散检测 |
| 2.2.9 C2C12细胞总RNA的抽提 |
| 2.2.10 C2C12细胞总RNA的质量检测 |
| 2.2.11 cDNA制备 |
| 2.2.12 qRT-PCR检测C2C12细胞中相关基因和miRNA相对表达量 |
| 2.2.13 PCR扩增Itga6的CDS区全长和目的片段胶回收 |
| 2.2.14 重组载体pcDNA3.1-Itga6的构建、菌种保藏和无内毒素质粒抽提 |
| 2.2.15 生物信息学方法预测靶基因 |
| 2.2.16 构建靶基因双荧光素酶报告载体 |
| 2.2.17 双荧光素酶活性检测 |
| 2.2.18 C2C12细胞蛋白样品的收集 |
| 2.2.19 蛋白含量的测定 |
| 2.2.20 相关基因蛋白水平的检测 |
| 2.2.21 数据统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 miR-92a-3p对C2C12成肌的影响 |
| 3.1.1 C2C12细胞过表达和干扰miR-92a-3p效果检测 |
| 3.1.2 miR-92a-3p对C2C12细胞增殖的影响 |
| 3.1.2.1 EdU检测C2C12细胞增殖 |
| 3.1.2.2 流式细胞技术检测C2C12细胞增殖 |
| 3.1.3 miR-92a-3p对C2C12细胞分化的影响 |
| 3.1.3.1 Myosin免疫荧光检测C2C12细胞分化 |
| 3.1.3.2 qRT-PCR检测C2C12细胞分化相关基因 |
| 3.1.4 miR-92a-3p对C2C12细胞迁移、粘附和扩散的影响 |
| 3.1.4.1 miR-92a-3p对C2C12细胞迁移的影响 |
| 3.1.4.2 miR-92a-3p对C2C12细胞粘附和扩散的影响 |
| 3.1.5 miR-92a-3p对细胞迁移相关基因的影响 |
| 3.2 miR-92a-3p靶基因预测与验证 |
| 3.2.1 生物信息学预测靶基因 |
| 3.2.2 构建靶基因双荧光素酶报告载体 |
| 3.2.3 双荧光素酶报告系统验证靶基因 |
| 3.2.4 C2C12 细胞中验证Itga6是miR-92a-3p的靶基因 |
| 3.3 miR-92a-3p靶基因Itga6对C2C12细胞迁移、粘附和扩散的作用 |
| 3.3.1 pcDNA3.1-Itga6真核表达载体的构建 |
| 3.3.2 C2C12细胞过表达Itga6效果检测 |
| 3.3.3 Itga6对C2C12细胞迁移、粘附和扩散的影响 |
| 3.3.3.1 Itga6对C2C12细胞迁移的影响 |
| 3.3.3.2 Itga6对C2C12细胞粘附和扩散的影响 |
| 3.3.4 Itga6对细胞迁移相关基因的影响 |
| 3.4 miR-92a-3p与Itga6在C2C12细胞的功能回复试验 |
| 3.4.1 过表达Itga6逆转miR-92a-3p对Itga6的抑制 |
| 3.4.2 过表达Itga6逆转miR-92a-3p对C2C12细胞迁移的抑制 |
| 3.4.3 过表达Itga6逆转miR-92a-3p对C2C12细胞粘附和扩散的抑制 |
| 3.4.4 过表达Itga6逆转miR-92a-3p对C2C12细胞迁移相关基因的抑制 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 miR-92a-3p不影响C2C12细胞增殖和分化 |
| 4.2 miR-92a-3p抑制C2C12细胞迁移 |
| 4.3 Itga6促进C2C12细胞迁移 |
| 4.4 miR-92a-3p通过靶向Itga6调控迁移相关基因抑制迁移 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A:pmir GLO-Itga6 3’UTR插入片段Blast |
| 附录 B:pmir GLO-Itga6 3’UTR-Mut插入片段Blast |
| 附录 C:pmir GLO载体图谱 |
| 附录 D:pcDNA3.1-Itga6插入片段Blast |
| 附录 E:pcDNA3.1(+)载体图谱 |
（7）利用基因工程改造的大肠杆菌合成蒎烯（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1 蒎烯 |
| 1.1 简介 |
| 1.2 用途 |
| 1.2.1 高能燃料 |
| 1.2.2 药理活性物 |
| 1.2.3 高分子材料 |
| 1.2.4 合成香料 |
| 2 合成生物学简介 |
| 2.1 合成生物学概述 |
| 2.2 基因(组)编辑技术在合成生物学中的应用 |
| 2.3 合成生物学在生物制造方面的应用 |
| 2.3.1 合成天然药物 |
| 2.3.2 合成替代能源 |
| 3 萜类化合物的生物合成研究进展 |
| 3.1 萜类化合物分类及应用 |
| 3.2 萜类的代谢途径 |
| 3.3 萜类化合物的合成生物学研究进展 |
| 3.4 蒎烯的微生物代谢合成研究进展 |
| 4 研究思路及研究意义 |
| 4.1 研究思路 |
| 4.2 研究意义 |
| 第二章 GPPS和PS共表达及融合表达载体的构建 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 培养基及主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 目的基因的获取 |
| 2.2 共表达载体的构建 |
| 2.2.1 目的基因的转化 |
| 2.2.2 质粒提取 |
| 2.2.3 目的基因PCR扩增并引入酶切位点 |
| 2.2.4 PCR产物凝胶电泳及胶回收 |
| 2.2.5 TA克隆 |
| 2.2.6 连接产物的转化 |
| 2.2.7 目的重组质粒的筛选与鉴定 |
| 2.2.8 目的片段的双酶切与胶回收 |
| 2.2.9 构建中间载体pETDuet1-GPPS |
| 2.2.10 中间载体pETDuet1-GPPS的酶切鉴定 |
| 2.2.11 构建共表达载体pETDuet1-GPPS-PS |
| 2.3 融合表达载体的构建 |
| 2.3.1 融合PCR构建GPPS-PS融合表达基因 |
| 2.3.2 目的基因双酶切 |
| 2.3.3 酶切产物清洁回收 |
| 2.3.4 构建融合表达载体 |
| 2.3.5 融合表达载体酶切鉴定 |
| 2.3.6 GPPS和PS共表达及融合表达菌株的构建 |
| 2.3.7 SDS-PAGE验证基因的表达 |
| 2.4 评价外源基因表达对菌生长的影响 |
| 2.5 检测蒎烯产量 |
| 2.5.1 菌液培养 |
| 2.5.2 确定检测方法 |
| 2.5.3 GC-MS检测蒎烯 |
| 3 结果 |
| 3.1 人工合成目的基因 |
| 3.2 共表达载体的构建与基因表达 |
| 3.3 融合表达载体的构建与基因表达 |
| 3.4 外源基因表达对工程菌生长的影响 |
| 3.5 GC-MS检测蒎烯 |
| 3.5.1 蒎烯的定性检测 |
| 3.5.2 制作蒎烯浓度标准曲线 |
| 3.5.3 蒎烯检测方法的重复性考察 |
| 3.5.4 融合表达及共表达菌株产蒎烯能力的检测 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 MVA代谢途径产蒎烯工程菌的构建 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 培养基及主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 MVA上游途径表达载体的构建 |
| 2.1.1 mvaE、mvaS基因的获取 |
| 2.1.2 目的基因及载体双酶切 |
| 2.1.3 酶连目的基因及表达载体 |
| 2.1.4 MVA上游途径表达载体的鉴定 |
| 2.1.5 SDS-PAGE检测基因表达 |
| 2.1.6 mvaS基因点突变 |
| 2.2 MVA下游途径表达载体的构建 |
| 2.2.1 酿酒酵母基因组的提取 |
| 2.2.2 目的基因的克隆 |
| 2.2.3 将目的基因连接到pMD18-T载体上 |
| 2.2.4 目的基因的改造 |
| 2.2.5 BioBrick单基因表达载体的构建 |
| 2.2.6 BioBrick方法构建多基因共表达载体 |
| 2.2.7 SDS-PAGE验证目的基因的表达 |
| 2.2.8 构建多基因串联共表达载体 |
| 2.2.9 SDS-PAGE验证目的基因的表达 |
| 2.3 构建表达载体pACYCDuet-mvaE/S-GPPS-PS |
| 2.3.1 GPPS-PS融合基因PCR |
| 2.3.2 DNA片段双酶切 |
| 2.3.3 酶连目的基因及载体 |
| 2.3.4 酶切鉴定 |
| 2.3.5 SDS-PAGE验证目的基因的表达 |
| 2.4 构建表达载体pACYCDuet-mvaE/S_(G110)-GPPS-PS |
| 2.5 含MVA代谢途径产蒎烯工程菌的构建 |
| 2.6 工程菌产蒎烯能力的检测 |
| 2.6.1 工程菌的摇床培养 |
| 2.6.2 GC-MS检测蒎烯 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 载体pACYCDuet-mvaE/S及蛋白表达验证 |
| 3.2 mvaS点突变 |
| 3.3 点突变消除Xba Ⅰ酶切位点 |
| 3.4 BioBrick单基因表达载体的构建及基因表达验证 |
| 3.5 BioBrick方法构建MVA途径共表达载体 |
| 3.6 多顺反子模型原理构建MVA下游途径共表达载体 |
| 3.7 pACYCDuet-mvaE/S-GPPS-PS载体的构建与鉴定 |
| 3.8 pACYCDuet-mvaE/S_(G110)-GPPS-PS载体的构建与鉴定 |
| 3.9 工程菌产蒎烯能力的检测 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 CRISPR/Cas9技术改造大肠杆菌基因组 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 质粒和菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 培养基及主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 sgRNA的设计与鉴定 |
| 2.1.1 sgRNA设计 |
| 2.1.2 sgRNA体外转录 |
| 2.1.3 PCR扩增底物DNA |
| 2.1.4 sgRNA体外切割效率验证 |
| 2.2 MVA上游途径基因敲入 |
| 2.2.1 pFG-sgRNA(ES)载体的构建 |
| 2.2.2 启动子替换 |
| 2.2.3 pFG-sgRNA(ES)-mvaE/S质粒载体的构建 |
| 2.2.4 含质粒pFG-sgRNA(ES)-mvaE/S的大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.5 pFN-Cas9-A转化含质粒pFG-sgRNA(ES)-mvaE/S的大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.2.6 基因敲入 |
| 2.2.7 基因敲入鉴定 |
| 2.2.8 质粒的清除 |
| 2.3 MVA下游途径基因敲入 |
| 2.3.1 pFG-sgRNA(EI)载体的构建 |
| 2.3.2 启动子替换 |
| 2.3.3 pFG-sgRNA(EI)-ERG-IDI质粒载体的构建 |
| 2.3.4 MVA下游基因敲入 |
| 2.3.5 基因敲入鉴定 |
| 2.3.6 质粒的清除 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Cas9体外酶切验证sgRNA效率 |
| 3.2 pFG-sgRNA(ES)-mvaE/S载体的鉴定 |
| 3.3 pFG-sgRNA(EI)-ERG-IDI载体的鉴定 |
| 3.4 MVA上游基因敲入鉴定结果 |
| 3.5 MVA下游基因敲入鉴定结果 |
| 4 本章小结 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文及申请专利 |
（8）乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶在乳酸菌中共表达及其对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 酒精及其代谢研究进展 |
| 1.1 酒精体内代谢研究进展 |
| 1.2 酒精性肝损伤保护研究 |
| 2 乙醇脱氢酶及乙醛脱氢酶研究进展 |
| 2.1 定义与分类 |
| 2.2 酵母来源ADH及ALDH |
| 2.3 ADH及ALDH应用研究 |
| 3 乳酸菌表达研究进展 |
| 3.1 乳酸菌及其表达系统研究 |
| 3.2 NICE高效诱导表达系统研究进展 |
| 3.3 乳酸菌食品级筛选标记研究 |
| 4 研究目的、意义与内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 乙醛脱氢酶在乳酸菌中克隆表达及全细胞催化乙醛降解研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 乳酸菌表达载体pNZ8148-istALDH构建 |
| 2.2 重组NZ3900/pNZ8148-istALDH生长曲线测定 |
| 2.3 istALDH基因在乳酸乳球菌NZ3900中的诱导表达 |
| 2.4 重组乙醛脱氢酶诱导条件研究 |
| 2.5 pH值和温度对IstALDH活性乳酸菌酶活力的影响 |
| 2.6 全细胞转化催化乙醛降解研究 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 乙醇脱氢酶在乳酸菌中表达及分离纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 酿酒酵母BY4341基因组提取及scADH基因克隆 |
| 2.2 表达载体pNZ8148-scADH的构建 |
| 2.3 scADH在乳酸乳球菌的诱导表达 |
| 2.4 重组乙醇脱氢酶纯化 |
| 2.5 重组ScADH最适反应温度与稳定性 |
| 2.6 重组ScADH最适反应pH与稳定性 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶在乳酸菌中共表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 双启动子共表达载体pNZ8148-GBD构建 |
| 2.2 双顺反子共表达载体pNZ8148-GRBS构建 |
| 2.3 融合共表达载体pNZ8148-RHA/B/C构建 |
| 2.4 ScADH和IstALDH共表达验证 |
| 2.7 菌体浓度对活性乳酸菌冻干的影响 |
| 2.8 预冻温度对重组乳酸菌冻干的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 活性乳酸菌冻干粉对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ICR小鼠体重变化、肝脏指数及一般状态观察 |
| 2.2 小鼠血清ALT、AST及AKP活力比较 |
| 2.3 小鼠血清血脂指标比较 |
| 2.4 小鼠肝组织抗氧化指标比较 |
| 2.5 肝组织病理学观察 |
| 2.6 肝组织Cyp2e1,Mcp1及Tlr系列基因表达分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 基于surfactin抗性筛选的乙醛脱氢酶乳酸菌表达载体构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 NZ3900/swrC构建及swrC基因表达验证 |
| 2.2 NZ3900/swrC生长曲线测定 |
| 2.3 swrC基因增强NZ3900对surfactin免疫作用研究 |
| 2.4 surfactin筛选浓度研究 |
| 2.5 swrC基因在LP163中作为筛选标记研究 |
| 2.6 双筛选标记乙醛脱氢酶表达载体构建 |
| 2.7 Surfactin筛选质粒传代稳定性 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 展望 |
| 攻读博士期间发表论文及专利情况 |
| 附图 |
| 致谢 |
（9）人血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1双顺反子表达载体的构建及其在293T细胞中的表达（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 LOX-1基因的扩增 |
| 1.3 双顺反子重组表达载体的构建及鉴定 |
| 1.4 p IRES2-LOX-1双顺反子表达载体转染293T细胞 |
| 1.5 逆转录聚合酶链反应检测LOX-1在基因水平上的表达情况 |
| 1.6 Western blot检测LOX-1在蛋白水平上的表达情况 |
| 1.7 激光共聚焦检测LOX-1在293T细胞膜上的表达情况 |
| 1.8 激光共聚焦检测293T细胞膜上表达的LOX-1的生物学活性 |
| 1.9 流式细胞术检测293T细胞膜上表达的LOX-1的生物学活性 |
| 2 结果 |
| 2.1 LOX-1基因的扩增 |
| 2.2 双顺反子重组表达载体的构建及鉴定 |
| 2.3 293T细胞转染 |
| 2.4 LOX-1的基因表达水平 |
| 2.5 LOX-1的蛋白表达水平 |
| 2.6 激光共聚焦检测LOX-1在293T细胞膜上的表达情况 |
| 2.7 激光共聚焦检测293T细胞膜上表达的LOX-1的生物学活性 |
| 2.8 流式细胞术检测293T细胞膜上表达的LOX-1的生物学活性 |
| 3 讨论 |
（10）莱茵衣藻叶绿体内多顺反子高效表达体系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 莱茵衣藻的简介 |
| 1.2 莱茵衣藻核基因工程 |
| 1.3 莱茵衣藻叶绿体基因工程 |
| 1.3.1 叶绿体转化原理 |
| 1.3.2 叶绿体转化方法 |
| 1.3.3 叶绿体转化的标记基因和报告基因 |
| 1.3.4 叶绿体表达系统存在的问题 |
| 1.4 莱茵衣藻应用 |
| 1.4.1 生产高价值生物制品 |
| 1.4.2 生物柴油 |
| 1.4.3 生物产氢 |
| 1.5 本实验研究的目的及意义 |
| 2 莱茵衣藻内源性“aadA表达盒”构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器与主要设备 |
| 2.1.2 藻株和质粒 |
| 2.1.3 工具酶与试剂 |
| 2.1.4 主要试剂的配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 莱茵衣藻的培养 |
| 2.2.2 含有莱茵衣藻PpsbA启动子序列的表达载体构建 |
| 2.2.3 PpsbA-aadA表达载体的构建 |
| 2.2.4 PpsbA-aadA-C1表达载体的构建 |
| 2.2.5 pDHL-H21同源序列载体的构建 |
| 2.2.6 pDHL-H22同源序列载体的构建 |
| 2.2.7 H21-PpsbA-aadA-C1-H22对照载体的构建 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 莱茵衣藻的生长曲线 |
| 2.3.2 莱茵衣藻细胞密度与OD_(750)的关系 |
| 2.3.3 PCR扩增PpsbA |
| 2.3.4 PCR和酶切鉴定质粒pDHL-001 |
| 2.3.5 PCR扩增aadA |
| 2.3.6 PCR和酶切鉴定质粒pDHL-002 |
| 2.3.7 PCR扩增C1 |
| 2.3.8 PCR和酶切鉴定质粒pDHL-003 |
| 2.3.9 PCR扩增H21 |
| 2.3.10 PCR和酶切鉴定质粒pDHL-H21 |
| 2.3.11 PCR扩增H22 |
| 2.3.12 PCR和酶切鉴定质粒pDHL-H22 |
| 2.3.13 PCR筛选质粒pDHL-A1 |
| 2.3.14 酶切鉴定质粒pDHL-A1 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 含有IEE功能元件的双顺反子测试系统构建 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 PpsbA-aadA-C11表达载体的构建 |
| 3.2.2 PpsbA-aadA-C11-nptⅡ表达载体的构建 |
| 3.2.3 PpsbA-aadA-C11-nptⅡ-C2表达载体的构建 |
| 3.2.4 H21-PpsbA-aadA-C11-nptⅡ-C2-H22表达载体的构建 |
| 3.2.5 H21-PpsbA-aadA-C11-IEE-nptⅡ-C2-H22表达载体的构建 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 PCR扩增C11 |
| 3.3.2 PCR和酶切鉴定质粒pDHL-003’ |
| 3.3.3 PCR扩增nptⅡ |
| 3.3.4 PCR和酶切鉴定质粒pDHL-004 |
| 3.3.5 PCR扩增C2 |
| 3.3.7 PCR和酶切鉴定质粒pDHL-005 |
| 3.3.8 PCR和酶切鉴定质粒pDHL-006 |
| 3.3.9 PCR扩增IEE |
| 3.3.10 PCR和酶切鉴定质粒pDHL-007 |
| 3.3.11 PCR和酶切鉴定质粒pDHL-008 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 表达载体在莱茵衣藻中的表达与优化 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 仪器与主要设备 |
| 4.1.2 藻株和质粒 |
| 4.1.3 工具酶与试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 莱茵衣藻细胞的准备 |
| 4.2.2 质粒的前期准备 |
| 4.2.3 玻璃珠转化 |
| 4.2.4 基因枪转化 |
| 4.2.5 电击转化 |
| 4.2.6 莱茵衣藻转化子的筛选培养 |
| 4.2.7 莱茵衣藻转化子的抗生素敏感性实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 莱茵衣藻的转化结果 |
| 4.3.2 莱茵衣藻转化子对抗生素的敏感性 |
| 4.3.3 莱茵衣藻转化子的分子水平检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
四、Construction and expression of the bicistronic expression vector with RANTES and SDF-1 genes（论文参考文献）
- [1]灰飞虱HiPV病毒翻译调控元件IRES功能解析及在昆虫细胞双顺反子表达系统中的利用[D]. 王艺晓. 辽宁师范大学, 2021(08)
- [2]PCV2和PCV3分子流行病学及二联重组腺病毒候选疫苗研究[D]. 哈卓. 东北农业大学, 2020(04)
- [3]花生AhP5CS基因的克隆与功能分析[D]. 宁龙龙. 河南农业大学, 2020(04)
- [4]谷氨酸棒杆菌外源蛋白分泌表达系统的开发及其应用研究[D]. 张伟. 江南大学, 2019(05)
- [5]毕赤酵母启动子及内部核糖体进入位点（IRES）的研究[D]. 张亚菲. 福建师范大学, 2019(12)
- [6]miR-92a-3p靶向Itga6调控C2C12细胞迁移及机理初探[D]. 曹灵博. 华南农业大学, 2018
- [7]利用基因工程改造的大肠杆菌合成蒎烯[D]. 黄子豪. 安徽大学, 2018(10)
- [8]乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶在乳酸菌中共表达及其对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用[D]. 吕云斌. 南京农业大学, 2017(07)
- [9]人血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1双顺反子表达载体的构建及其在293T细胞中的表达[J]. 于田田,李敬达,刘庆平,王仁军,乔辉,陈玉华,李明英,于柯楠,迟彦. 中国动脉硬化杂志, 2017(01)
- [10]莱茵衣藻叶绿体内多顺反子高效表达体系的建立[D]. 戴红林. 南京理工大学, 2016(02)