一、一种培养细胞切片用于免疫细胞化学染色方法的建立（论文文献综述）
褚新月[1]（2021）在《诱导性心脏祖细胞的生成及其3D水凝胶培养体系的构建》文中指出心脏疾病是造成人类死亡的主要原因之一,其发病率仅次于癌症,特别是由于冠状动脉阻塞而导致的心肌梗死（Myocardial infarction,MI）,常造成心肌细胞（Cardiomyocytes,CMs）的不可逆损伤或死亡。由于出生后CMs的再生能力很差,目前对于MI仍无有效的根治方法。移植外源性CMs治疗MI需要大量的细胞,容易造成免疫排斥反应,且细胞来源受限。胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）和诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,i PSCs）能够分化成为心脏细胞,但由于其体内分化方向难以控制,容易产生异质细胞,甚至引发肿瘤。采用间接谱系转化技术,将体细胞重编程为诱导性心脏祖细胞（Induced cardiac progenitor cells,iCPCs）,因其具有“自我更新”和心脏谱系细胞分化潜能,能够提供大量细胞资源、有效降低致瘤性和分化细胞异质性,具有广阔的应用前景。传统二维（Two-dimension,2D）细胞培养系统因无法精确模拟体内状态,造成大量心脏疾病研究结果无法在实验动物和临床试验中复制重现。运用细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）构建的三维（Three-dimension,3D）培养体系（例如:水凝胶）能够模拟细胞的体内微环境,更有利于开展心脏疾病的研究。壳聚糖是一种由葡萄糖胺和乙酰葡萄糖胺组成的天然多糖,具有无毒、可降解、抗菌和抗真菌等特性,有望降低ECM引入的污染问题,并提升水凝胶的稳定性。因此,本研究通过过表达五种心脏转录因子（Gata4、Nkx2.5、Tbx5、Baf60c和Mesp1）,将人胚肾293T细胞（Human embryonic kidney 293T cells,HEK-293T细胞）重编程成为iCPCs;应用胶原蛋白、壳聚糖和ECM构建出3D水凝胶细胞培养体系,并探讨了iCPCs在该体系中的细胞行为和诱导分化特性,为心脏疾病的机理研究、药物筛选、模型构建和细胞治疗等奠定了基础。试验一iCPCs的生成与鉴定应用间接谱系转化技术,通过Lipofectamine LTX介导心脏转录因子Gata4、Nkx2.5、Tbx5、Baf60c和Mesp1在HEK-293T细胞中过表达,将其重编程成为iCPCs,并通过形态学观察、免疫细胞化学染色、实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,RT-qPCR）和诱导分化等方法对所得细胞进行鉴定。结果表明:（1）HEK-293T细胞经重编程后,所得细胞具有与心脏祖细胞（Cardiac progenitor cells,CPCs）相似的形态学特征,细胞呈圆形或椭圆形,无突起;呈现出CPCs特异性标志蛋白:Gata4、Nkx2.5和Irx4的免疫细胞化学染色阳性反应,且各自的阳性细胞率分别为61.36±1.08%、60.97±1.28%和61.73±1.18%;与HEK-293T细胞相比,iCPCs中Irx4、Tbx20、Mesp1和Nkx2.5基因的相对表达量极显着上调（P<0.01）,而Fsp1和Col5A1基因的相对表达量极显着下调（P<0.01）;（2）iCPCs经心脏谱系诱导分化液处理后,能够生成呈短圆柱形、细胞核位于细胞中央的CMs,呈多边形、细胞边缘不规则的内皮细胞（Endotheliocytes,ECs）,以及呈长梭形、无横纹的平滑肌细胞（Smooth muscle cells,SMCs）;分化细胞呈现出CMs特异性标志蛋白——Cardiac actin、ECs特异性标志蛋白—CD31或SMCs特异性标志蛋白—SM-MHC的免疫细胞化学染色阳性反应,其各自的阳性细胞率分别为49.37±84%、48.61±0.74%和47.57±0.77%;分化细胞中c Tn T和Actinin-α1（CMs标志基因）、PEACAM1（ECs的标志基因）和MYL2（SMCs的标志基因）的相对表达量分别极显着高于iCPCs对照组（P<0.01）。因此,过表达Gata4、Nkx2.5、Tbx5、Baf60c和Mesp1能够将HEK-293T细胞重编程成为CPC样细胞,所得iCPCs具备分化成为CMs、ECs和SMCs的能力。试验二iCPCs的3D水凝胶培养体系构建采用胶原蛋白、壳聚糖和ECM,按照不同体积比:4:0:3（对照组）、4:1:3（壳聚糖处理组1）、4:2:3（壳聚糖处理组2）和4:3:3（壳聚糖处理组3）制备水凝胶,通过检测其形态结构、孔隙率、溶胀度和降解率,筛选细胞回收条件,探讨水凝胶对iCPCs行为和分化的影响,旨在构建iCPCs的3D水凝胶培养体系。结果表明:（1）经扫描电子显微镜观察,不同比例组成的3D水凝胶均显示出立体网络结构。对照组水凝胶显示出较大孔径的结构,胶原蛋白分布较为疏松;壳聚糖处理组1的水凝胶呈现出较为致密的结构,孔径大小均一,表面粗糙,各孔隙相互贯通;壳聚糖处理组2和3的水凝胶表现出更小的孔径结构,胶原纤维分布杂乱无序,有大小不等的隆起;（2）壳聚糖处理组1形成水凝胶的孔隙率（99±0.30%）、溶胀度（97±0.87%）、降解率（44±0.03%）以及iCPCs的增殖倍数（58±0.24）和存活率（73±0.60%）均分别极显着高于对照组、壳聚糖处理组2和3（P<0.01）;（3）0.30%胰蛋白酶和0.25%胶原蛋白酶消化同种3D水凝胶回收的细胞数之间无显着性差异（P>0.05）,但均极显着高于0.45%胃蛋白酶处理组（P<0.01）;经不同浓度的胰蛋白酶、胶原蛋白酶和胃蛋白酶消化3D水凝胶后,壳聚糖处理组1的回收细胞数均分别极显着高于其余比例组成的3D水凝胶处理组（P<0.01）;（4）在3D水凝胶中,iCPCs及其诱导分化细胞的形态学特征与2D培养细胞无明显差异,体积稍小;与2D培养体系相比,在3D水凝胶中,iCPCs来源分化细胞:Cardiac actin+CMs、CD31+ECs和SM-MHC+SMCs的数量均极显着上升（P<0.01）,分化细胞的c Tn T、actininα1、PEACAM1和SMCs基因的相对表达量也极显着上调（P<0.01）。因此,宜采用壳聚糖处理组1的方案制备水凝胶进行iCPCs的3D培养,使用0.25%胶原蛋白酶或0.30%胰蛋白酶消化水凝胶回收细胞,3D水凝胶比2D培养体系更有利于iCPCs体外分化成为CMs、ECs和SMCs。结论:利用Lipofectamine LTX介导五种心脏转录因子（Gata4、Nkx2.5、Tbx5、Baf60c和Mesp1）的过表达,可以将HEK-293T细胞重编程成为iCPCs,所得iCPCs具备分化成为CMs、ECs和SMCs的能力;宜采用胶原蛋白、壳聚糖和ECM,按照4:1:3的比例,构建出机械性能强和稳定性高的3D水凝胶,该细胞培养体系支持iCPCs的存活和增殖行为,0.25%胶原蛋白酶或0.30%胰蛋白酶适宜用于消化水凝胶回收细胞;3D水凝胶比2D培养体系更有利于iCPCs分化成为心脏谱系细胞:CMs、ECs和SMCs。iCPCs的生成和3D水凝胶培养体系的建立为解析心脏发育、损伤和修复机制,构建心脏疾病模型,筛选和开发药物,研发细胞治疗新策略等提供了研究平台。
刘树威[2]（2021）在《聚合物基复合纳米梭的制备及肿瘤诊疗应用》文中进行了进一步梳理在肿瘤诊疗研究中,聚合物纳米粒子因其高生物相容性、低生物毒性、高胶体稳定性和结构稳定性,受到了研究者们的广泛关注。同时,聚合物纳米粒子中丰富的官能团能够为更多功能基元的负载、掺杂或修饰提供可能,有利于构筑多功能纳米复合材料,这正是聚合物基纳米诊疗试剂的发展方向。提高纳米材料的诊疗性能,一是要提高纳米粒子向肿瘤中的富集,二是要增强纳米粒子在肿瘤中的滞留和细胞内化,三是要充分利用肿瘤自身特性,利用纳米粒子在某些特殊理化性质下的特殊作用或特殊变化,提高诊疗效果。在本论文中,我们构筑了聚苯胺复合纳米梭和聚氨基酸复合纳米梭,利用类一维的梭形形貌在肿瘤富集上的优势,提高了肿瘤部位纳米材料的含量。并在此基础上,通过合理设计,充分利用了肿瘤组织和肿瘤微环境的各种特性,实现了较好的肿瘤诊疗性能。在第二章中,我们利用了肿瘤细胞耐药后细胞膜上唾液酸过表达引起的表面负电的增强实现了对耐药肿瘤更好的诊疗效果。我们制备的聚乙二醇（PEG）包覆的、载长春新碱（VCR）的、铜铁离子共掺杂的聚苯胺复合纳米梭（PEG-VCR-CuFePani NSs）兼具磁共振成像（MRI）、化疗和光热治疗功能。在人口腔上皮癌（KB）及长春新碱耐药的人口腔上皮癌（KBV）双肿瘤模型中,由于PEG的修饰,PEG-VCR-CuFePani NSs展现出更好的隐身效应,表现为血液循环半衰期的延长和肿瘤滞留率的增加。因为KBV细胞更强的表面负电,静电作用下,表面正电的PEG-VCR-CuFePani NSs在KBV肿瘤中的富集明显高于KB肿瘤。因此,MRI下,KBV肿瘤的信号更强、成像分辨率更高、肿瘤边界更明显。同样因为KBV肿瘤中更高的复合纳米梭含量,光热治疗时需要施加的光照时间可以更短,激光功率可以更低,对提升治疗手段的安全性有重要的意义。在第三章中,我们利用纳米材料的表面电荷在肿瘤微环境pH下的响应性转变构筑了分级靶向诊疗平台,实现了对肿瘤的定位和热化疗消除。我们制备的柠檬酸根修饰的、载长春新碱的、铜铁离子共掺杂的聚苯胺复合纳米梭（SC-VCR-CuFePani NSs）具有肿瘤微环境响应性,兼具MRI、化疗和光热治疗功能。在KB肿瘤模型中,由于柠檬酸根的修饰,SC-VCR-CuFePani NSs表面带负电,展现出更好的隐身效应,表现为血液循环半衰期的延长和肿瘤滞留率的增加。酸性的肿瘤微环境下,柠檬酸根质子化并脱落,复合纳米梭恢复正电表面,细胞内化能力明显增强。相较于柠檬酸根修饰前,分级靶向作用使得肿瘤中复合纳米梭的量显着提升,生物利用率提高。因此,MRI下肿瘤的信号更强,边界更明显,光热治疗时升温更快,治疗效果更好。并且,热刺激的化疗药物释放,可以发挥术后化疗的作用。在光热治疗和化疗的协同作用下,肿瘤被完全消除且没有复发。在第四章中,我们利用纳米材料在肿瘤微环境刺激下解体释放出的金属离子与肿瘤微环境组分间的化学反应,实现了对肿瘤的定位和治疗。我们选用了对生物体很安全的两种物质,Fe3+和酪氨酸,通过pH调控的一维组装,成功制备了毒性极低并且有利于细胞摄取的聚酪氨酸复合纳米梭。其表面正电和类一维的梭形形貌使其更容易被肿瘤细胞摄取。同时,复合纳米梭中Fe3+与聚酪氨酸的配位使得复合纳米梭可以作为T1加权的MRI造影剂,β-FeOOH的存在使得复合纳米梭可以作为T2加权的MRI造影剂。此外,复合纳米梭在肿瘤微环境过表达的谷胱甘肽（GSH）的作用下,解体释放出Fe3+。Fe3+可以清除GSH,降低谷胱甘肽过氧化物酶4的活性,造成脂质过氧化物的堆积。反应生成的Fe2+还可以通过Fenton反应产生大量活性氧,二者都可以导致铁死亡。所以,我们制备的聚酪氨酸复合纳米梭具有很好的MRI成像功能和铁死亡治疗肿瘤效果,能够对膀胱肿瘤进行定位,并实现对膀胱肿瘤的治疗。
南苗苗[3]（2021）在《慢性淋巴细胞白血病小鼠模型的制备及生姜挥发油抑癌作用的初步探究》文中进行了进一步梳理慢性淋巴细胞白血病（CLL）是CD5+的B淋巴细胞在各免疫器官中进行恶性克隆增殖的一种血液系统疾病。到目前为止,该病仍然是一种无法彻底根治的疑难病症。生姜挥发油是一种能够通过蒸馏得到的、具有挥发性的油状液体。研究报道,生姜挥发油具有镇痛、抗菌、抗肿瘤等作用。为了探索生姜挥发油对CLL的作用,以ICR品系、WT小鼠为实验对象,首先通过给小鼠注射免疫抑制剂环磷酰胺（CTX）,制备免疫抑制小鼠模型,在此模型的基础上制备CLL小鼠模型。其次,利用含生姜挥发油的培养基培养CLL细胞系MEC-1,旨在细胞水平上测试生姜挥发油对CLL的作用。最后将生姜挥发油通过灌胃的方式饲喂于CLL小鼠,进一步试验生姜挥发油对CLL小鼠个体的影响。本研究旨在探究生姜挥发油是否能够抑制CLL疾病进展,分别在细胞水平及个体水平对生姜挥发油的功能进行了初步的验证。1.免疫抑制小鼠模型制备本研究分别以40mg/kg注射10天,100mg/kg注射3天、5天,150mg/kg注射4天,以及200mg/kg注射24h的方式将CTX注射到WT小鼠腹腔中,检测小鼠体重及免疫细胞数量,结合脾脏,胸腺,骨髓HE染色结果,确定CTX注射最佳剂量为150mg/kg注射4天。2.慢性淋巴细胞白血病小鼠模型制备在免疫抑制小鼠模型基础上,通过灌胃的方式连续3天给小鼠服用7,12-二甲基苯并蒽（7,12-dimethylbenzoanthracene,7,12-DMBA）,以及将1×107个MEC-1细胞分别通过腹腔及尾静脉注射到小鼠体内。实验期间每十天记录小鼠体重,外周血白细胞及B淋巴细胞数量,最终处死小鼠。实验结果显示,随着实验时间延长,利用两种方法制备的小鼠模型小鼠体重均减轻;肝脏及脾脏均肿大;外周血白细胞及B淋巴细胞数量均不同程度增多;小鼠外周血中检测到CD19+CD5+B淋巴细胞;小鼠骨髓细胞出现增殖;经q RT-PCR及Western blot检测,确定小鼠骨髓细胞Bcl-2表达量增加,Caspase3,Bax表达量减少。利用组织免疫荧光染色及流式细胞术,检测到MEC-1细胞浸润小鼠血液,肝脏,脾脏,胸腺,肺,淋巴,及骨髓中。因此,本研究说明,制备的小鼠模型均能表现CLL基本特征。对比两种建模方法,化学物质诱导法制备的CLL小鼠模型效果更好。3.生姜挥发油抑癌作用的初步探究利用0.0125%、0.025%、0.01%、0.05%、0.1%的生姜挥发油分别培养MEC-1细胞24h、48h、72h、96h。通过CCK8检测发现,细胞的增殖活性在24h后开始下降,并且MEC-1细胞在0.025%的生姜挥发油下的增殖活性最低;通过Annexin V-FITC/PI检测能够看到,利用0.025%的生姜挥发油培养MEC-1细胞48h、72h、96h,细胞凋亡率显着增加,分别为23.655±0.465%（P<0.001）,30.620±0.510%（P<0.001）,32.815±0.335%（P<0.001）;q RT-PCR及Western blot结果显示,0.025%的生姜挥发油培养细胞48h后,细胞Bcl-2表达量显着减少,Caspase3,Bax表达量显着增加。说明生姜挥发油能够有效抑制MEC-1细胞增殖,促进其凋亡。将生姜挥发油以50mg/kg/只通过灌胃的方式饲喂于CLL小鼠。经生姜挥发油治疗30天,小鼠外周血白细胞数量减少,但是与未治疗组小鼠相比,差异性不显着;q RT-PCR及Western blot结果显示,治疗组小鼠骨髓细胞Bcl-2表达量减少,Caspase3,Bax表达量增加,但是与未治疗组小鼠相比,差异性同样不显着。说明在个体水平上生姜挥发油并没有明显减缓小鼠CLL症状。本研究确定CTX注射剂量为150mg/kg注射4天能够显着降低小鼠免疫系统功能;给小鼠服用7,12-DMBA及移植MEC-1细胞均能使小鼠表现CLL特征。本研究还确定生姜挥发油能够显着抑制MEC-1细胞增殖,促进细胞凋亡;但是给CLL小鼠服用生姜挥发油,并没有显着减缓小鼠CLL症状。上述研究结果表明:生姜挥发油有一定的抑癌作用,具有潜在药用价值。
闵颖俊[4]（2021）在《新生儿缺氧缺血性脑损伤后脑内髓系细胞吞噬—炎症失衡参与突触损伤的机制研究》文中进行了进一步梳理[目的]缺氧缺血性脑损伤（HIBD）是新生儿致死致残的首要原因,30%的幸存患儿会遗留神经系统后遗症,但发病机制不清。突触是信息传递的核心,突触损伤为HIBD患儿行为异常的关键机制。髓系细胞是指由髓系前阶段幼稚细胞分化的所有髓细胞,在广义上包括粒系细胞、红系细胞、巨核系细胞以及单核系细胞,在脑内主要为小胶质细胞（MGs）及外周入侵的单核细胞（MDMs）。由髓系细胞活跃带来的神经炎症是HIBD发生的核心机制之一。吞噬和炎症是髓系细胞（MGs及MDMs）的主要功能,并籍此调控突触可塑性。生理情况下,发育脑内吞噬与炎症维持在一定的水平,“吞噬-炎症”平衡将帮助形成稳定的神经环路。病理情况下,“吞噬”和/或“炎症”功能失去原有稳态,出现激活或抑制,不再保有平衡状态,此为“吞噬-炎症”失衡。除了吞噬和炎症功能,目前的研究认为MGs和MDMs作为脑内最重要的免疫细胞,生理情况下可通过吞噬及炎症功能参与调控突触修剪,从而参与神经环路形成;病理情况下,它启动脑内炎症反应,还可通过吞噬作用对微环境稳态的损伤及修复发挥作用。HIBD后脑内“吞噬-炎症”出现失衡,它在HIBD所致突触损伤中的发病机制,及其分子机理尤其是可能的调控还有待进一步研究。我室的前期研究证实,HIBD后除MGs活化外,MDMs亦入侵脑实质,MGs炎症及吞噬功能活跃,但二者与突触损伤修复的关系尚不清楚。据此本课题拟从髓系细胞（MGs及MDMs）在HIBD所致“吞噬-炎症”失衡的角度入手,重点研究它们在突触损伤、修复中的作用,试揭示HIBD后两种髓系细胞“吞噬-炎症”失衡在HIBD后突触损伤中的作用机制及其可能的调控。[方法]1.采用CX3CR1GFP/+CCR2RFP/+双转基因小鼠及C57BL/6J小鼠通过改良的Rice-Vannucci法建立新生鼠HIBD模型,以进一步确认两种不同髓系细胞的功能。随机将动物分为假手术组（Sham）及缺氧缺血组（HI）,其中缺氧缺血组依据前期研究又进一步分为缺氧缺血轻度损伤组（HIM）、缺氧缺血重度损伤组（HIS）。2.行为学实验明确HIBD后6 w小鼠的行为学改变。3.TTC染色确认HIBD后3 d小鼠脑梗死范围。4.HE染色揭示HIBD后3 d及6 w小鼠的脑组织形态学改变。5.尼氏染色评估HIBD后3d及6 w的小鼠脑神经元损伤。6.Tunel染色评估HIBD后3 d的小鼠脑细胞的凋亡。7.FJB染色评估HIBD后1 d及3 d脑组织神经元的损伤。8.Western Blotting 检测 HIBD 后 3 d 突触相关蛋白（PSD95 及 SYP）、TREM2 的表达,以及OGD前后MGs细胞系BV2突触后膜蛋白表达的改变。9.免疫荧光技术检测HIBD后3 d脑内两种髓系细胞在脑皮层及海马的活跃情况,及其与突触相关蛋白间的关系。10.免疫荧光技术检测HIBD后3 d脑内CD11b+细胞LAMP1、PSD95的表达。11.利用两种髓系细胞系（MGs细胞系-BV2,单核巨噬细胞系-Raw264.7）进行吞噬刺激实验,检测两种髓系细胞在糖氧剥夺（OGD）前后吞噬能力的变化。12.磁珠分选结合的流式细胞学实验检测HIBD后3 d脑内两种髓系细胞TREM2及CD200R的表达。13.免疫荧光技术检测HIBD后3 d脑内两种髓系细胞TREM2及其衔接子DAP12和促炎因子IL-1β、IL-6的表达。14.免疫荧光技术检测炎症因子（IL-1β、IL-6）刺激后,原代MGs分泌PSD95蛋白的情况。[结果]1.验证HIBD后脑损伤情况（1）HIBD后行为学改变a.旷场实验结果证实HIBD后6 w各组小鼠的运动功能未受到明显损害,但HIM组小鼠在旷场实验检测的10-15 min时间段以及20-25 min时间段内,其在中间区域停留时间较Sham组小鼠增加。b.黑白箱实验结果证实HIBD后6 w,HIM及HIS组小鼠在黑箱与白箱之间的穿梭次数减少。（2）HIBD后脑组织病理学异常a.HIBD后3 d,HIS组小鼠脑组织出现明显梗死灶,Sham组及HIM组均未见到明显梗死灶。b.HIBD后3d,HIS组小鼠脑皮层及海马区域质地疏松、染色变浅、可见噬元现象,可见局灶性巨噬细胞、MGs和少量中性粒细胞浸润,部分细胞出现典型坏死,HIM组小鼠脑组织形态学未见明显改变;HIBD后6w,HIS组海马CAI、CA2、CA3区均可见组织结构破坏、细胞数量减少、神经元丢失;HIM组小鼠海马CAI区域细胞变少,部分神经元丢失。（3）HIBD后神经元受损a.HIBD后3d,HIS组小鼠脑皮层及海马区域尼氏小体数量减少、染色变浅;HIM组小鼠脑内尼氏小体数量及颜色深浅未见明显改变;HIBD后6 w,HIS组小鼠海马CAI、CA2、CA3区均可见尼氏小体数量减少、染色变浅;HIM组小鼠脑组织海马CAI区域尼氏小体数量减少,染色变浅。b.HIBD后3d,HIS组小鼠脑皮层及海马CA1、CA2、CA3区域出现大量凋亡细胞,且以皮层及CA2区域最为严重,海马齿状回未见凋亡细胞。c.HIBD后1 d及3 d小鼠脑皮层及海马CA2区域有大量急性坏死的神经元。2.验证HIBD后突触受损情况（1）突触的丢失及清除:HIBD后突触丢失增多,MGs为吞噬突触的髓系细胞a.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马部位神经元标记物-NeuN的表达下降,突触素蛋白SYP的表达未见明显变化,突触后膜蛋白PSD95表达增高。b.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马CA2区域梗死灶中心及边缘区域突触后膜蛋白PSD95表达增高并与MGs共定位;HIM组皮层及海马CA2区域突触后膜蛋白PSD95的表达未见明显变化。c.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马CA2区域突触素蛋白SYP的表达在梗死灶中心区域出现下降,在梗死灶的边缘区域均出现增高,且主要与MGs共定位;HIM组皮层及海马CA2区域突触素蛋白SYP的表达出现增加。（2）MGs表达突触蛋白a.HIBD后3 d,Sham及HIM组PSD95散在分布在MGs周围,未观察到脑实质内存在MDMs,MGs胞体较小,突起较长,分支较多,分支及胞体内部分可见PSD95。HIS组皮层及海马PSD95表达增多,MGs胞体变圆,突起缩短,胞体内存在有大量PSD95,部分可沿着胞膜分布,MDMs主要存在于梗死的中心区域,但不与PSD95接触。b.HIBD后3d,Sham及HIM组SYP呈现厚厚一层,铺在MGs胞体一端,未观察到脑实质内存在MDMs,MGs胞体较小,突起较长,分支较多,分支及胞体内部分可见SYP。HIS组皮层及海马SYP依旧是厚厚一层,但并不是铺在MGs胞体一端,而是横贯铺在MGs胞体中间,MGs胞体变圆,突起缩短,部分细胞的突起几乎不可见,胞体内存在有少量突触素蛋白SYP,MDMs主要存在于梗死灶的中心区域,但几乎不与突触素蛋白SYP接触。c.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马区域,CD11b+细胞内部分突触后膜蛋白PSD95与溶酶体蛋白1 LAMP 1共定位,部分未与LAMP 1共定位。d.OGD后0 h,MGs细胞系PSD95的表达明显增加,OGD后24 h恢复到OGD前水平。e.OGD后0h,原代MGs其PSD95的表达出现增多,仅炎症因子IL-6刺激后,在正常培养条件下,MGs分泌PSD95较未加炎症因子刺激组出现增多,OGD后MGs分泌PSD95蛋白的水平进一步增高,均高于炎症刺激后的正常培养组。3.HIBD后脑内“吞噬-炎症”失衡（1）HIBD后吞噬活跃,MGs主要执行吞噬突触的功能a.HIBD后3d,HIS组皮层及海马部位TREM2表达增加。b.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马实质均可见到外周血单核细胞（MDMs）浸润。c.正常培养条件及糖氧剥夺（OGD）后,小鼠MGs细胞系-BV2的吞噬能力始终强于单核巨噬细胞系-Raw264.7;OGD后BV2细胞始终保持很强的吞噬能力,但Raw264.7细胞系的吞噬能力下降。（2）HIBD后炎症反应活跃,MGs与MDMs均表达炎症介质,但仅MDMs表达 IL-6a.HIBD后3 d,HIS组皮层梗死灶边缘区MGs与MDMs促炎因子IL-1β水平增高;HIM组皮层IL-1β水平未见明显变化;HIS组海马CA2区梗死灶边缘及中心区MGs与MDMs促炎因子IL-1β水平增高;HIM组海马MGs与MDMs促炎因子IL-1β水平下降。b.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马CA2区域梗死灶中心区MDMs促炎因子IL-6水平增高,梗死灶边缘区MDMs促炎因子IL-6水平出现下降;HIM组皮层MDMs促炎因子IL-6水平未见明显变化,但HIM组海马MDMs促炎因子IL-6水平出现下降。各组别未见MGs表达IL-6。4.HIBD后脑内“吞噬-炎症”失衡可能的调控机制a.HIBD后3 d,HIS组脑皮层内MGs表达TREM2及CD200R均增加,但MDMs上二者的表达未见明显变化;HIM组中仅MDMs表达CD200R出现增加。b.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马CA2区域梗死灶中心及边缘区MGs表达TREM2增高;HIM组皮层及海马CA2区域MGs表达TREM2未见明显变化;各组别MDMs未见TREM2表达。HIS组皮层及海马CA2区梗死灶中心及边缘区的MGs、MDMs表达TREM2衔接子DAP12增高;HIM组皮层及海马CA2区MGs、MDMs表达TREM2衔接子DAP 12未见明显变化。c.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马CA2区梗死灶中心区PSD95、TREM2、DAP12表达出现增加,放大到600X后,可见有部分细胞可以共表达TREM2、PSD95以及DAP12,但具体细胞类型还有待进一步研究。[结论]1.HIBD后脑内神经元及突触受损,MGs为脑内执行突触吞噬的髓系细胞,可表达吞噬蛋白TREM2,TREM2可能参与调控HIBD后MGs及MDMs吞噬活动。2.MG可吞噬及分泌突触后膜蛋白PSD95,炎症因子（IL-6及IL-1β）均可刺激MGs 表达 PSD95。3.MGs与MDMs均可释放炎症因子IL-1β,但MDMs的炎症反应更强烈并主要表达IL-6,且其释放的IL-6对MGs的吞噬功能可能具有调控作用,CD200R参与调控MGs及MDMs炎症释放。
顾新丰[5]（2021）在《HMGB1在机械过载型肌腱病炎症中的作用机制》文中研究指明[背景和目的]肌腱病是临床常见病,多由反复机械过载牵拉所致,病程漫长且无特效治疗手段,严重影响患者的生活质量,加重社会的经济负担。肌腱病的发病机制尚不明确。随着现代分子免疫学的发展,已明确炎症参与肌腱病的发病,其作用也越来越受到重视。目前,损伤相关的分子模式（DAMP）理论被广泛用于解释各类无菌性炎症的发病机制。警报素家族是DAMP理论的炎症发生的始动因素。高迁移率族蛋白1（HMGB1）是一种存在于细胞核内的非组蛋白,广泛存在于各类组织中,释放到细胞外的HMGB1是最常见的警报素之一。通过研究HMGB1在调控机械过载型肌腱病炎症发生中的作用及机制,有助于深入探索肌腱病的发病机制,发现新的治疗靶点。[研究方法]第一部分:用短时间胶原酶消化结合组织块培养法进行肌腱细胞和肌腱干细胞的原代培养,再通过低密度接种后形成细胞克隆,用胰酶进行点状消化,分离和纯化肌腱细胞和肌腱干细胞。用CCK-8法测定细胞的增殖能力;台盼蓝染色测定细胞的活力;用免疫组化、流式细胞和qRT-PCR鉴别并鉴定这两种细胞。比较不同月龄大鼠来源的肌腱细胞的生长曲线。第二部分:使用Flexcell-FX5000细胞牵张仪对肌腱细胞进行体外牵拉实验,研究机械牵拉对肌腱细胞增殖和活力的影响以及细胞内、外HMGB1的变化。先用免疫组化染色和Western blot法证实肌腱细胞内存在HMGB1,观察肌腱细胞受到0%、4%、8%、12%不同牵张百分比的牵拉后,肌腱细胞的增殖能力和细胞活力变化,并用Western blot和ELISA法测定相应牵拉百分比下细胞内、外HMGB1浓度的变化。再观察肌腱细胞受到牵拉后,0h、6h、12h、24h及48h不同时间点培养液中HMGB1浓度变化。观察脂多糖（LPS）对肌腱细胞进行刺激后培养液中HMGB1浓度变化,与机械过载牵拉的DAMP途径进行比较。第三部分:研究内、外源性HMGB1在大鼠跟腱肌腱病动物模型的炎症中的作用。分别建立大鼠跟腱持续和一过性机械过载负荷的跑台模型,进行病理切片观察,用Western blot法测定一过性过载负荷后0h、6h、12h和48h四个不同时间点细胞核内、外HMGB1的变化。接着,使用外源性HMGB1进行跟腱局部注射及HMGB1的抑制剂甘草酸（GA）腹腔内注射,qRT-PCT法测定局部组织中炎症相关细胞因子IL-1 β、IL-6、TGF-β及肌腱细胞外基质Tenascin、ColⅠ、Col Ⅲ的基因表达情况。第四部分:进行HMGB1在肌腱病炎症中的细胞和分子机制研究。使用CCK-8检测不同浓度的HMGB1对肌腱细胞增殖的影响及细胞毒性。再用Western blot测定不同浓度的HMGB1对肌腱细胞的TLR4、RAGE受体和NF-κ B、MAPK信号通路的影响。[结果]第一部分:原代培养的肌腱细胞呈扁平梭形,而肌腱干细胞呈鹅卵石样。两者群体倍增时间分别为2.71天和2.18天,且1月龄大鼠的肌腱细胞较18月龄增殖速度更快。台盼蓝染色显示活细胞率均在90%以上。结晶紫染色都能形成细胞克隆,肌腱细胞的克隆面积较小且稀疏,而肌腱干细胞的克隆面积较大且致密。肌腱细胞的Ⅰ型胶原染色呈强阳性。流式细胞显示肌腱干细胞的细胞表面标记物CD44和CD90阳性,CD45和CD106阴性。qRT-PCR显示Scleraxis的基因在肌腱干细胞中高表达,而Tenomodulin的基因在肌腱细胞中表达更高。第二部分:体外培养的肌腱细胞受到牵拉后,细胞增殖增快。与未牵拉组相比,4%、8%和12%的肌腱细胞数分别为0%组的1.3倍、1.5倍和1.1倍,肌腱细胞的增殖随牵拉百分比的增加而增强,但拉伸12%组的细胞增殖较8%组反而下降。当肌腱细胞受到的牵拉百分比大于4%后,细胞活力出现降低。免疫组化染色显示肌腱细胞内表达HMGB1,细胞核内高表达。肌腱细胞受到牵拉后细胞核内HMGB1染色明显降低。Western blot和ELISA测定显示,随着牵拉百分比的增加,肌腱细胞核内HMGB1含量下降,细胞外培养液中HMGB1增加,牵拉百分比大于8%时变化更显着。用8%对肌腱细胞进行牵拉后6h,培养液中HMGB1的浓度达到峰值。而在培养液中加LPS刺激肌腱细胞,培养液中HMGB1的浓度24h后达到峰值,是加入LPS前的4.14倍。第三部分:持续性机械过载组在跑台跑步8W后的跟腱实质明显增粗,呈典型肌腱病表现,肌腱细胞数量增加,肌腱纤维排列紊乱,纤维束间有血管增生。Bonar评分显着高于对照组。一过性机械过载组的肌腱细胞外HMGB1含量在运动后逐渐升高,最高峰出现在运动后12h。局部注射外源性HMGB1后,单次注射HMGB1组仅有少许血管增生,持续局部注射HMGB1组出现类似肌腱病的典型表现,炎症相关的IL-1 β、IL-6、TGF-β及细胞外基质和胶原相关蛋白Tenascin、ColI、ColⅢ的mRNA表达明显增加。但持续注射HMGB1+GA组IL-6和TGF-β增加较少,炎症反应较轻,肌腱病病理表现不明显。第四部分:低浓度HMGB1组的肌腱细胞增殖稍有增快,但高浓度HMGB1组的肌腱细胞增殖明显减慢。Western blot结果显示,对照组中存在TLR4和RAGE两种蛋白的条带。TLR4的表达量与HMGB1浓度的呈正相关。低浓度组RAGE表达也增加,但中、高浓度组反而降低。NF-κ B通路的IKKβ和NF-κ B P65在低浓度和中浓度HMGB1组均增加,但高浓度时不再增加。MAPK通路的JNK、P38的表达量改变不明显。ERK1/2基础表达量相对较低,随HMGB1浓度的增加有所增加,但高剂量组的表达量反而比中剂量组降低。[结论]第一部分:采用短时间的酶消化法结合组织块培养法能原代培养肌腱细胞和肌腱干细胞。高-低密度接种法和克隆法能有效的分离和纯化肌腱细胞和肌腱干细胞。肌腱细胞和肌腱干细胞具有不同的细胞形态和增殖能力,标记物的表达量也有差别。不同个体来源的肌腱细胞的功能有所不同。第二部分:过载牵拉和过长时间的牵拉均影响肌腱细胞的增殖及活力。肌腱细胞内存在HMGB1,以细胞核内表达尤明显。机械过载牵拉能导致细胞内HMGB1释放到细胞外。LPS等致炎因子也能导致HMGB1释放,但发生时间较晚。第三部分:一过性的机械过载牵拉能导致肌腱炎症的发生;长时间的过载牵拉能导致肌腱病的发生。长时间高浓度的细胞外HMGB1能引起类肌腱病样表现。外源性HMGB1能明显提高跟腱组织中致炎因子IL-1 β、IL-6、TGF-β和腱系标记物Tenascin和Ⅲ型胶原的基因表达,而HMGB1的抑制剂GA能明显降低炎症因子相关基因表达。第四部分:高浓度HMGB1对肌腱细胞有细胞毒性。肌腱细胞表面存在TLR4和RAGE受体,低浓度的HMGB1能增加两种受体的表达,但高浓度的HMGB1抑制RAGE受体表达。HMGB1能激活NF-κ B信号通路。HMGB1/TLR4/NF-κ B通路可能是肌腱病产生炎症反应的主要信号通路。
李会[6]（2021）在《昆虫细胞和原核细胞表达系统制备基孔肯雅病毒主要抗原》文中研究指明[目的]基孔肯雅热（Chikungunya Fever,CHIKF）是以伊蚊作为传播媒介,由基孔肯雅病毒（Chikungunya Virus,CHIKV）感染引起的急性传染病,临床症状主要表现为发热、关节疼痛、皮疹。病死率较低,但其持续性后遗症给感染者以及国家带来巨大的经济损失。另外,基孔肯雅热和登革热具有相同的传播媒介和相似的临床特征,临床上会误诊疾病,导致耽误治疗的严重后果。因此,有效地预防和及时准确地诊断基孔肯雅热,不仅可以阻止疾病的发生发展,而且能节省了医疗资源。疫苗和诊断试剂是防控传染病的有效手段,在疾病的预防、诊断、治疗方面具有重大作用。病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）和病毒亚单位重组蛋白是疫苗及诊断试剂的关键组成部分,本论文研究主要通过昆虫细胞杆状病毒和原核表达系统制备基孔肯雅病毒主要抗原,包括基孔肯雅病毒全结构蛋白和E2蛋白,以期为基孔肯雅热的预防和诊断奠定基础。[方法]为了获得基孔肯雅病毒的主要抗原蛋白,本论文研究分别用昆虫细胞和原核细胞系统表达抗原蛋白。（1）昆虫细胞-杆状病毒系统表达:首先将基孔肯雅病毒的结构蛋白基因序列（C-E3-E2-6K-E1）根据昆虫细胞对密码子的偏好性进行优化,然后通过人工方法合成基因片段,经无缝克隆方法将合成的基因片段克隆至昆虫细胞杆状病毒表达载体中,并用酶切和测序方法进行验证。重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定后,获得重组杆状病毒杆粒（Bacmid）。采用无内毒素大提试剂盒提取重组杆状病毒杆粒,使用不同用量Bacmid和不同体积转染试剂转染ExpiSf9昆虫细胞,优化转染条件以提高转染效率。以获得的重组杆状病毒感染ExpiSf9昆虫细胞表达基孔肯雅病毒结构蛋白。通过细胞超薄切片验证杆状病毒的产生和流式细胞仪测定病毒滴度、间接免疫荧光和蛋白免疫印迹分析目的蛋白表达,并通过蔗糖密度梯度离心纯化病毒样颗粒。最后用透射电镜鉴定病毒样颗粒的形态大小和纯度。（2）原核表达系统表达:将基孔肯雅病毒结构蛋白E2基因根据原核细胞密码子的偏好性进行优化,然后通过人工方法合成基因片段,克隆至原核表达载体。经测序验证正确后,转化BL21（DE3）pLysS感受态细胞;经不同浓度的IPTG和不同温度诱导优化后,表达融合蛋白,并通过SDS-PAGE凝胶电泳和免疫印迹分析进行验证。最后通过免疫小鼠以验证表达抗原的免疫原性。[结果]通过以上方法的实施,获得了如下研究结果:（1）昆虫细胞杆状病毒表达系统:酶切和测序鉴定结果表明,成功地构建了含基孔肯雅病毒结构蛋白（CHIKV-SP）的杆状病毒重组质粒（pFastBac l-CHIKV-SP）。重组质粒转化DH10Bac后,PCR结果表明获得重组杆状病毒杆粒（rBE-CHIKV-SP）。优化和流式细胞分析结果表明,4ug重组杆状病毒杆粒和10ul转染试剂进行转染,能获得较高的病毒滴度。免疫印迹分析表明,目的蛋白在昆虫细胞内得到了表达。免疫荧光分析发现,基孔肯雅病毒结构蛋白表达在昆虫细胞胞质内。蔗糖密度梯度离心纯化时发现,形成的VLPs颗粒主要在35%蔗糖层。电子显微镜结果表明颗粒的大小在40-70nm之间,其中60nm-70nm颗粒占81%,和野生型病毒粒子大小相似。（2）原核细胞表达系统:酶切和测序鉴定结果表明,成功地构建了含基孔肯雅病毒包膜蛋白E2（CHIKV-E2）的重组原核表达质粒（pGEX-6P-1-CHIKV-E2）。SDS-PAGE和免疫印迹分析结果表明,成功地表达了重组蛋白,然而,表达蛋白的90%以上存在于包涵体中。表达的蛋白用于免疫小鼠以检测其免疫原性,ELISA结果表明,表达的蛋白在小鼠中能够诱导高达1:102400的特异性抗体产生,这提示表达的基孔肯雅病毒E2抗原具有较好的免疫原性。[结论]综上所述,本论文研究通过昆虫细胞杆状病毒表达系统成功地制备了纯度较高和均一性较好的基孔肯雅病毒样颗粒;通过原核表达系统制备了基孔肯雅病毒的抗原E2蛋白,并获得高效价的多克隆抗体。因此,本论文研究不仅获得了基孔肯雅病毒的主要抗原,为基孔肯雅热的诊断试剂和疫苗研发奠定了基础,也建立了昆虫细胞杆状病毒表达系统和原核细胞表达系统,为实验室将来开展其它病原体的抗原表达建立了平台。
赵文轩[7]（2020）在《基于连续激光的紧凑STED成像系统及其荧光探针特性研究》文中提出在生命科学等领域的研究中,光学显微镜依其非侵入、无损伤等特点,成为科研人员最常用的研究工具之一。由于阿贝衍射极限的存在,传统光学显微镜的空间分辨率被限制在200 nm以上。然而,许多分子生物学信息,例如细胞微管等结构的特征尺度在百纳米以内,传统光学技术无法对这些生物结构进行有效观测。因此,突破光学衍射极限的限制成为相关领域科研工作者共同努力的方向。近年,受激辐射损耗（STED）成像技术凭其远场、超越衍射极限的空间分辨率、多维度活体成像且可特异性标记跟踪等优势,从各类研究方法中脱颖而出,在生物医学研究中发挥重要作用。本文中自主搭建了一套基于连续激光405 nm/532 nm的紧凑型STED成像系统,并利用该系统对不同荧光探针进行了光谱学、荧光动力学、生物组织特异性染色成像等方面的研究工作,主要内容包括:1.设计、搭建与优化紧凑型连续激光STED（CW-STED）系统。利用405 nm和532 nm连续激光器做光源,结合快速响应的声光控制模块,实现纳秒量级精确控制光束开关,抑制染料漂白现象。通过使用空间光滤波模块协同空间光精细调节模块,确保了扫描光斑的质量和双光束空间的重合。采用多波段信号收集模块,配合声光控制器、单光子计数器和压电纳米平移台,实现了高速点扫描成像。优化了激发光与损耗光聚焦光斑重合的校准方法。设计、优化光学元器件与结构,实现了STED系统的一体化、紧凑化,系统稳定性显着增强。2.基于CW-STED系统研究Coumarin 102染料荧光淬灭速率。首先,建立了基于荧光寿命、淬灭速率和振荡弛豫时间三个参数的CW-STED荧光动力学模型。随后,基于该模型,通过405 nm/532 nm CW-STED系统测量Coumarin 102染料的抑制因子,计算出荧光淬灭速率。实验结果发现,由于存在聚集态荧光淬灭现象（ACQ）,荧光淬灭速率随荧光剂浓度的增大而增加。同时,损耗光功率的增大也会产生抑制光诱导淬灭现象（DIQ）,显着增加荧光淬灭速率。理论分析认为DIQ现象归因于增大的损耗光功率引起了局部增强的分子间碰撞导致淬灭速率的上升。DIQ抑制了CW-STED系统的损耗效果,对提升系统空间分辨率产生不利影响。3.研究新型量子点染料STED特性。结合自主搭建的CW-STED系统,针对405nm/532nm波段,研究了三种碳量子点和两种CdSe量子点的光学特性。研究发现不同有机溶剂中,碳量子点的消光特性曲线和饱和光强值变化很大。CDs-2样品在乙醇溶剂中的饱和光强值最小,在492/10 nm荧光波段中表现出0.4 MW/cm2的低饱和光强,是一种极具潜力的新型STED荧光探针。CdSe量子点消光效果一般,存在荧光上转换发光现象,有潜力作为新型荧光差分成像探针。4.研究生物样品的超分辨成像。介绍了多种量子点,Coumarin 102非特异性染色的小鼠脑细胞切片,Atto 390 Phalloidin免疫荧光标记神经母瘤细胞切片的STED样品制备方法。基于商用共聚焦荧光显微镜和自主搭建的CW-STED系统,研究样品共聚焦及超分辨成像,结果表明CDs-2样品实现了180 nm的共聚焦扫描分辨率。CdSe样品存在较强的自发荧光辐射和上转换发光现象,可以用于开发为荧光差分成像的新型探针。Coumarin 102染料无法特异性结合蛋白,普遍存在于细胞质,富集在不同尺寸的蛋白质结构上,存在一定生物兼容性。Atto 390 Phalloidin通过直接免疫荧光染色法与神经母瘤细胞中的F actin蛋白特异性结合,初步实现了120 nm的空间分辨率,为蓝光STED在生命科学研究领域提供更多可选方法。
苏维维[8]（2020）在《基于核素-纳米药物实现恶性肿瘤细胞核定向放射治疗的实验研究》文中认为研究背景将放射性核素与纳米材料相结合用于改善恶性肿瘤的治疗的研究,将多种跨学科的领域交叉融合起来,具有独特的科研意义和潜在的临床应用前景。然而,目前将二者联合的相关研究多是机械地将纳米材料作为核素的运载体,产生的生物效应多是二者单纯的作用叠加。如果能找到一种方法将二者的特性巧妙地结合起来,诱导发生某种相互作用,不仅有利于材料的有效利用和简化设计,而且能通过协同效应促进实现高效的肿瘤治疗。本论文聚焦于以上科研理念,依托于课题组的长期合作方中国科学院上海硅酸盐研究所稀土生物化学与医用功能材料团队先进的纳米材料合成技术。我们将临床常用的放射性核素与合成技术成熟的纳米材料巧妙结合,利用二者优势互补,创新性地构建了两种核素-纳米材料复合物体系。经一系列生物学检测手段证实,本课题构建的两种体系均实现了多功能协同增强的高效肿瘤治疗。主要包括以下两方面内容:主要研究内容和实验结果1.基于131I-AuNPs-TAT实现肿瘤细胞核靶向的内源性放射免疫治疗利用改进的非极性还原方法,成功合成超小粒径（8.36 nm）的金纳米颗粒（Aunanoparticels,AuNPs）,尺寸均一、分散性及稳定性良好;进一步在其表面连接细胞穿透肽（TAT）,共聚焦显微镜和生物透射电镜下观察确定AuNPs-TAT具备良好的细胞核靶向功能;最后采用经典的Iodogen标记法标记放射性核素131I并获得终产物131I-AuNPs-TAT,131I的初始标记率高,标记产物的体外稳定性良好。在该核素-纳米复合物体系中,TAT多肽将131I靶向递送到肿瘤细胞核内部直接损伤DNA;AuNPs诱导131I衰变产生的β-射线转化为X射线,不仅扩大了辐照范围,而且产生了“免疫增强效应”。细胞实验和活体实验结果表明,该复合材料能显着抑制结肠癌的生长,协同增强131I对肿瘤的放疗效果。基于此,我们提出一种新型的内源性放射免疫疗法（internal radio-immunity therapy,IRIT）,并将131I-AuNPs-TAT的合成过程及其发挥高效放疗作用的机制总结为如下示意图:2.基于125I-TiO2-TAT/HA2实现溶酶体逃逸与肿瘤细胞核靶向的催化内照射治疗采用经典的溶剂热技术,成功合成高活性{101}晶面的锐钛矿型单晶氧化钛纳米颗粒（TiO2nanoparticles,TiO2NPs）,形貌均一,呈菱形,粒径长11.78±2.23 nm,宽3.91±0.56 nm;在TiO2NPs表面连接兼具溶酶体逃逸与细胞核靶向功能的融合肽（TAT/HA2）,生物电镜扫描证实获得的TiO2-TAT/HA2能在逃逸溶酶体捕获后高效靶向进入细胞核内;进一步采用Iodogen标记法将放射性核素125I标记在TiO2-TAT/HA2上,获得的125I-TiO2-TAT/HA2具有良好的体外稳定性。在该结构中,TAT/HA2能介导125I对肿瘤细胞核内DNA的靶向杀伤;而125I的俄歇电子与TiO2反应后能催化水分子的活化,进而促进125I的γ射线诱导的毒性羟基自由基（·OH）的产生。细胞及活体实验证实,125I-TiO2-TAT/HA2能显着抑制实体肿瘤（胰腺癌）的生长,明显改善125I对肿瘤的放疗效果。本研究最大创新性在于,有效利用125I作为电子给体激活TiO2NPs的催化活性并促进水的活化,使γ射线诱导的水辐解过程更容易发生,从而产生大量·OH,最终实现高效放疗。我们将该创新性的催化内照射疗法（catalytic internal radiotherapy,CIRT）的作用机理总结如下:讨论分析在恶性肿瘤的常规治疗手段中,放疗占据了重要的地位,其中内照射治疗（internal radiation therapy,IRT）因较外照射治疗对正常组织副损伤小这一独特优势而受到关注。IRT通过放射性核素衰变产生射线而发挥肿瘤治疗作用,然而,某些类型的射线的能量不足、穿透深度不够等缺陷制约着核素的治疗效果和临床应用。近年来,纳米材料在医学中的应用不断更新发展,但其在IRT中的应用研究很少,研究内容相对局限,因此还有很大研究和发展空间。本文即是对此做了初步探索,以期为恶性肿瘤的治疗寻找新的思路和手段。本课题组着眼于提高肿瘤疗效,促进人民健康,深入研究了改善癌症治疗的新策略。通过分析临床常用放射性核素(131I,125I)的衰变射线特点,针对性地制备了两种具有特殊性能的纳米材料（AuNPs,TiO2NPs）,利用巧妙的合成工艺将核素与纳米材料相结合,通过特定的物理及化学反应实现二者的优势互补。我们通过一系列实验检测手段证实了两种复合物均对肿瘤产生了良好的治疗效果,并对相关治疗机制做了深入的探讨和严格的验证。综上所述,本课题通过巧妙的材料设计将放射性核素的衰变产物特点与纳米材料的优异性质相结合,分别实现了基于“内源性放射免疫疗法（IRIT）”和“催化内照射疗法（CIRT）”的肿瘤高效治疗。本课题的设计不仅有望拓宽核素-纳米药物的临床应用范围,也为肿瘤治疗的科学研究提供了新思路、新策略。
王璐[9]（2020）在《多肽金纳米粒对巨噬细胞极化的调控及其在急性肺损伤小鼠模型中的保护作用》文中研究说明研究背景和目的:急性肺损伤（acute lung injury,ALI）及其严重阶段急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）是临床常见的呼吸系统危重症,死亡率高达40%,至今仍缺乏有效的药物治疗。研究显示,巨噬细胞极化在ALI/ARDS的发生、发展及转归过程中发挥重要作用,调控巨噬细胞极化有望成为治疗ALI/ARDS的新方向。近期,课题组研发了一类可有效抑制巨噬细胞Toll样受体（TLR）信号通路的新型抗炎纳米粒子,是一种多肽与金纳米粒子形成的复合物,简称多肽金纳米粒（P12）。本研究旨在探明P12对巨噬细胞极化的调控及其对ALI小鼠的保护作用,为临床ALI/ARDS的救治提供新的思路。方法:采用透射电子显微镜成像及动态光散射技术对多肽金纳米粒的粒径大小和表面电荷等理化性质进行表征。经气管内滴注脂多糖（LPS）建立经典的ALI小鼠模型,通过支气管肺泡灌洗液细胞学检查、肺组织病理评分、肺湿/干重比测定和Luminex多因子检测评估P12对ALI小鼠的保护效应。耗竭小鼠肺部巨噬细胞,明确巨噬细胞为P12发挥保护作用的靶细胞。此外,应用酶联免疫吸附实验和实时荧光定量核酸扩增检测技术探究P12对小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）极化的影响。利用多色流式分析技术和肺组织免疫荧光检测评估经P12处理后肺部巨噬细胞表型的变化,明确P12对肺部巨噬细胞极化的作用。结果:本研究首次证实了经气管滴注的P12主要靶向肺部巨噬细胞发挥抗炎活性。P12通过减少ALI小鼠的肺部炎症细胞浸润程度,并提高抗炎细胞因子（IL-10）水平来减轻肺部炎症和损伤。此外,P12可以驱动BMDMs向M2抗炎表型极化。在ALI小鼠模型中,P12干预可显着增加M2型肺泡巨噬细胞,并减少肺泡和间质来源的M1型巨噬细胞。结论:多肽金纳米粒P12可在体内、外诱导巨噬细胞向M2型极化。在LPS诱导的ALI小鼠体内,经气管滴注的P12通过靶向肺部巨噬细胞降低其炎症反应,并通过调控其向抗炎M2型极化,从而有效缓解ALI小鼠肺部炎症。该研究提供一种新型纳米生物材料来调控巨噬细胞向M2型极化,进而调节急性肺部炎症反应,有望成为新一代治疗ALI/ARDS的有效方法。
曹雯[10]（2020）在《荷载二氧化锰探针的间充质干细胞在肺癌精准治疗上的应用》文中研究说明纳米药物递送的关键问题是提高肿瘤靶向效率,因为这保证了纳米药物在肿瘤部位的最大聚集量,从而决定了更好的治疗效果。在本课题中,我们采取了一种主动有力的策略,是基于具有肿瘤主动靶向能力的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）来搭载MnO2@Ce6纳米颗粒进入肿瘤部位。值得一提的是,在MnO2@Ce6对MSCs几乎无细胞活性和生理特性影响的前提下,MSCs对其大量摄取可增加MnO2@Ce6-MSCs纳米平台在肿瘤部位的聚集和分布。简单来说,Ce6光敏剂通过静电吸附连接在MnO2纳米球的表面,来提高自身的稳定性。另外,递送至肿瘤组织的MnO2@Ce6纳米颗粒可以通过与H+和H2O2间的灵敏反应产生氧气,从而调节肿瘤微环境。因此,生成的氧气可以在633 nm激光照射下作为1O2的转换原料,这有效地突破了乏氧的微环境对光动力治疗的限制。与此同时,MnO2可分解生成Mn2+,这在核磁成像中有很高的T1加权系数增强核磁信号,并且可快速地通过肝脏分解和肾脏过滤排泄出体外。这些结果表明由MSCs靶向、Ce6转化、MRI监测的MnO2@Ce6-MSCs纳米平台在未来肿瘤成像和治疗上具有很强的临床转化潜力。
二、一种培养细胞切片用于免疫细胞化学染色方法的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一种培养细胞切片用于免疫细胞化学染色方法的建立（论文提纲范文）
（1）诱导性心脏祖细胞的生成及其3D水凝胶培养体系的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.iCMs的生成 |
| 1.1 体外重编程 |
| 1.2 体内重编程 |
| 2.iCPCs的生成 |
| 2.1 体外重编程 |
| 2.2 体内重编程 |
| 2.3 转录因子 |
| 2.3.1 Gata4 |
| 2.3.2 Nkx2.5 |
| 2.3.3 Tbx5 |
| 2.3.4 Mesp1 |
| 2.3.5 Baf60c |
| 3.壳聚糖-3D水凝胶 |
| 3.1 壳聚糖的结构和理化性质 |
| 3.2 壳聚糖的生物学特性及应用 |
| 3.3 壳聚糖-3D水凝胶在心脏组织工程中的应用 |
| 4.总结和展望 |
| 第2章 试验部分 |
| 引言 |
| 试验一 iCPCs的生成与鉴定 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 主要药品与试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 HEK-293T细胞的培养 |
| 2.1.1 HEK-293T细胞的复苏 |
| 2.1.2 HEK-293T细胞的传代培养 |
| 2.1.3 HEK-293T细胞的冻存 |
| 2.2 免疫细胞化学染色 |
| 2.3 质粒构建 |
| 2.4 质粒DNA的提取 |
| 2.5 质粒DNA的酶切验证 |
| 2.5.1 1 %琼脂糖凝胶的制备 |
| 2.5.2 样品准备 |
| 2.5.3 酶切及琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.6 细胞转染 |
| 2.7 iCPCs的鉴定 |
| 2.7.1 形态学观察 |
| 2.7.2 免疫细胞化学染色 |
| 2.7.3 RT-qPCR |
| 2.8 iCPCs的体外分化和鉴定 |
| 2.8.1 形态学观察 |
| 2.8.2 免疫细胞化学染色 |
| 2.8.3 RT-qPCR |
| 2.9 数据统计分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 HEK-293T细胞的体外培养 |
| 3.1.1 形态学观察 |
| 3.1.2 免疫细胞化学染色 |
| 3.2 质粒DNA提取 |
| 3.2.1 菌液电泳 |
| 3.2.2 酶切验证 |
| 3.2.3 HEK-293T细胞的转染 |
| 3.3 iCPCs的鉴定 |
| 3.3.1 形态学观察 |
| 3.3.2 免疫细胞化学染色 |
| 3.3.3 RT-qPCR |
| 3.4 iCPCs的体外诱导分化 |
| 3.4.1 形态学观察 |
| 3.4.2 免疫细胞化学染色 |
| 3.4.3 iCPCs及其体外诱导分化所得细胞的阳性率 |
| 3.4.4 RT-qPCR |
| 4.讨论 |
| 4.1 iCPCs的体外生成 |
| 4.2 iCPCs的体外诱导分化 |
| 5.小结 |
| 试验二 iCPCs的3D水凝胶培养体系构建 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 主要药品与试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 3D水凝胶的构建及性能表征 |
| 2.1.1 3D水凝胶的制备 |
| 2.1.2 3D水凝胶支架的电镜观察 |
| 2.1.3 3D水凝胶支架孔隙度的测定 |
| 2.1.4 3D水凝胶溶胀率的测定 |
| 2.1.5 3D水凝胶体外降解率的测定 |
| 2.2 3D水凝胶的细胞培养 |
| 2.2.1 不同比例组成3D水凝胶对iCPCs增殖的影响 |
| 2.2.2 不同比例组成3D水凝胶对iCPCs存活的影响 |
| 2.2.3 3D水凝胶培养iCPCs回收条件的研究 |
| 2.3 iCPCs在3D水凝胶中的形态学观察 |
| 2.4 iCPCs在3D水凝胶中的诱导分化 |
| 2.4.1 形态学观察 |
| 2.4.2 免疫细胞化学染色 |
| 2.4.3 RT-qPCR |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 3D水凝胶支架的超微结构 |
| 3.2 3D水凝胶支架孔隙率、溶胀率和降解率的测定 |
| 3.2.1 孔隙率的测定 |
| 3.2.2 溶胀率的测定 |
| 3.2.3 降解率的测定 |
| 3.3 不同比例组成3D水凝胶对iCPCs细胞行为的影响 |
| 3.3.1 细胞增殖 |
| 3.3.2 存活率 |
| 3.4 3D水凝胶中iCPCs回收条件的研究 |
| 3.5 3D水凝胶中iCPCs的形态学观察 |
| 3.6 iCPCs在3D水凝胶中的诱导分化 |
| 3.6.1 形态学观察 |
| 3.6.2 免疫细胞化学染色 |
| 3.7 3D水凝胶中iCPCs诱导分化所得细胞的比率 |
| 3.8 RT-qPCR |
| 4.讨论 |
| 4.1 不同凝胶比例组成对3D水凝胶物理特性的影响 |
| 4.2 不同比例组成3D水凝胶对iCPCs行为的影响 |
| 4.3 3D水凝胶支架中iCPCs回收条件的研究 |
| 4.4 3D水凝胶对iCPCs诱导分化的影响 |
| 5.小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 在读期间发表论文及参加课题参研情况一览表 |
| 致谢 |
（2）聚合物基复合纳米梭的制备及肿瘤诊疗应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 聚合物纳米粒子的肿瘤诊疗应用 |
| 1.1.1 聚苯胺纳米粒子的肿瘤诊疗应用 |
| 1.1.2 聚吡咯纳米粒子的肿瘤诊疗应用 |
| 1.1.3 聚多巴胺纳米粒子的肿瘤诊疗应用 |
| 1.1.4 聚氨基酸纳米粒子的肿瘤诊疗应用 |
| 1.2 纳米粒子的物理性质对诊疗功能的影响 |
| 1.2.1 纳米粒子的表面电势对诊疗功能的影响 |
| 1.2.2 纳米粒子的尺寸对诊疗功能的影响 |
| 1.2.3 纳米粒子的形貌对诊疗功能的影响 |
| 1.3 肿瘤微环境特性 |
| 1.3.1 肿瘤微环境的弱酸性 |
| 1.3.2 肿瘤微环境的缺氧 |
| 1.3.3 肿瘤微环境过表达的过氧化氢 |
| 1.3.4 肿瘤微环境过表达的谷胱甘肽 |
| 1.3.5 肿瘤微环境过表达的硫化氢 |
| 1.4 肿瘤微环境响应的诊疗 |
| 1.4.1 肿瘤酸性微环境响应的诊疗 |
| 1.4.2 肿瘤缺氧微环境响应的诊疗 |
| 1.4.3 肿瘤微环境过氧化氢响应的诊疗 |
| 1.4.4 肿瘤微环境谷胱甘肽响应的诊疗 |
| 1.4.5 肿瘤微环境硫化氢响应的诊疗 |
| 1.5 本文设计及选题思路 |
| 第二章 耐药细胞与聚苯胺复合纳米梭间的静电吸引用于增强耐药肿瘤诊疗 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 PEG-VCR-CuFePani NSs的制备 |
| 2.2.2 细胞实验 |
| 2.2.3 动物实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 PEG-VCR-CuFePaniNSs的合成、结构、体外成像和治疗功能 |
| 2.3.2 对肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞的治疗 |
| 2.3.3 肿瘤-耐药肿瘤裸鼠双瘤模型中的成像和治疗 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 肿瘤微环境响应的聚苯胺复合纳米梭通过分级靶向增强诊疗效果 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 SC-VCR-CuFePani NSs的制备 |
| 3.2.2 细胞实验 |
| 3.2.3 动物实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 SC-VCR-CuFePani NSs的合成、结构、体外成像和治疗功能 |
| 3.3.2 肿瘤细胞中的协同治疗 |
| 3.3.3 裸鼠肿瘤模型中的成像和协同治疗 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 聚酪氨酸复合纳米梭通过铁死亡治疗膀胱癌 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 聚酪氨酸复合纳米梭的制备 |
| 4.2.2 细胞实验 |
| 4.2.3 动物实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 聚酪氨酸复合纳米梭的合成与结构 |
| 4.3.2 聚酪氨酸复合纳米梭的体外成像和治疗功能 |
| 4.3.3 膀胱癌细胞内的协同治疗 |
| 4.3.4 大鼠原位膀胱癌模型中的协同治疗 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（3）慢性淋巴细胞白血病小鼠模型的制备及生姜挥发油抑癌作用的初步探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 白血病概述 |
| 1.1 慢性淋巴细胞白血病(CLL) |
| 1.2 慢性髓细胞白血病(CML) |
| 1.3 急性淋巴细胞白血病(ALL) |
| 1.4 急性髓细胞白血病(AML) |
| 2.白血病小鼠模型的制备 |
| 2.1 自发模型 |
| 2.2 诱发模型 |
| 2.2.1 化学致癌剂诱发 |
| 2.2.2 病毒诱发 |
| 2.2.3 放射辐射诱发 |
| 2.3 移植模型 |
| 2.3.1 同源移植 |
| 2.3.2 异种移植 |
| 2.4 遗传修饰模型 |
| 2.4.1 转基因模型 |
| 2.4.2 基因敲除模型 |
| 3.中药挥发油的功能 |
| 3.1 中药挥发油抑制白血病细胞增殖 |
| 3.2 中药挥发油诱导白血病细胞凋亡 |
| 3.3 中药挥发油诱导白血病细胞分化 |
| 3.4 中药挥发油抗肿瘤机制 |
| 4.展望 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 慢性淋巴细胞白血病小鼠模型的制备 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验试剂及耗材 |
| 2.3 实验小鼠 |
| 2.4 实验细胞 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 模型小鼠的制备 |
| 3.1.1 免疫抑制小鼠模型的制备 |
| 3.1.2 CLL小鼠模型的制备-化学物质诱导法 |
| 3.1.3 CLL小鼠模型的制备-细胞移植法 |
| 3.2 检测方法 |
| 3.2.1 小鼠血液中白细胞数量检测 |
| 3.2.1.1 白细胞计数 |
| 3.2.1.2 吉姆萨染色 |
| 3.2.1.3 流式细胞术 |
| 3.2.2 小鼠各组织病变检测 |
| 3.2.2.1 组织石蜡切片的制备 |
| 3.2.2.2 骨髓石蜡切片的制备 |
| 3.2.2.3 HE染色 |
| 3.2.2.4 组织免疫荧光染色 |
| 3.2.3 小鼠骨髓细胞凋亡相关因子的鉴定 |
| 3.2.3.1 总RNA的提取 |
| 3.2.3.2 去基因组及RNA反转录 |
| 3.2.3.3 qRT-PCR |
| 3.2.3.4 Western blot检测 |
| 3.2.4 数据统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 模型小鼠的制备 |
| 4.1.1 免疫抑制小鼠模型的制备 |
| 4.1.1.1 小鼠体重分析 |
| 4.1.1.2 小鼠免疫器官重量分析 |
| 4.1.1.3 外周血免疫细胞数量变化分析 |
| 4.1.1.4 流式细胞术检测外周血免疫细胞种类变化 |
| 4.1.1.5 HE染色观察免疫器官中免疫细胞数量变化 |
| 4.1.1.6 免疫抑制小鼠模型的制备 |
| 4.1.2 CLL小鼠模型的制备-化学物质诱导法 |
| 4.1.2.1 小鼠体重分析 |
| 4.1.2.2 外周血白细胞数量变化分析 |
| 4.1.2.3 流式细胞术检测外周血CD19~+CD5~+B淋巴细胞 |
| 4.1.2.4 小鼠骨髓细胞凋亡相关因子的鉴定 |
| 4.1.3 CLL小鼠模型的制备-细胞移植法 |
| 4.1.3.1 小鼠体重分析 |
| 4.1.3.2 外周血白细胞数量变化分析 |
| 4.1.3.3 流式细胞术检测外周血CD19~+CD5~+B淋巴细胞 |
| 4.1.3.4 小鼠各组织MEC-1 细胞浸润情况鉴定 |
| 4.1.3.5 小鼠骨髓细胞凋亡相关因子的鉴定 |
| 4.1.4 化学物质诱导法及细胞移植法的对比 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 第二章 生姜挥发油抑癌作用的初步探究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验试剂及耗材 |
| 2.3 实验细胞 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 生姜挥发油对CLL细胞的作用 |
| 3.1.1 细胞增殖检测 |
| 3.1.1.1 MEC-1 细胞接种密度及CCK8 检测时间确定 |
| 3.1.1.2 MEC-1 细胞增殖活性检测 |
| 3.1.2 细胞凋亡检测 |
| 3.1.3 细胞凋亡相关因子的鉴定 |
| 3.1.3.1 qRT-PCR |
| 3.1.3.2 Western blot检测 |
| 3.2 生姜挥发油对CLL小鼠的作用 |
| 3.2.1 小鼠外周血白细胞数量检测 |
| 3.2.2 小鼠骨髓细胞凋亡相关因子鉴定 |
| 3.2.2.1 qRT-PCR |
| 3.2.2.2 Western Blot检测 |
| 3.3 数据统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 生姜挥发油对CLL细胞的作用 |
| 4.1.1 细胞增殖检测 |
| 4.1.1.1 MEC-1 细胞接种密度及CCK8 检测时间确定 |
| 4.1.1.2 MEC-1 细胞增殖活性检测 |
| 4.1.2 MEC-1 细胞形态 |
| 4.1.3 MEC-1 细胞凋亡检测 |
| 4.1.4 MEC-1 细胞凋亡相关因子鉴定 |
| 4.2 生姜挥发油对CLL小鼠的作用 |
| 4.2.1 外周血白细胞数量变化分析 |
| 4.2.2 小鼠骨髓细胞凋亡相关因子的鉴定 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（4）新生儿缺氧缺血性脑损伤后脑内髓系细胞吞噬—炎症失衡参与突触损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 围产期缺氧缺血性脑损伤的免疫调节机制及潜在治疗 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）HMGB1在机械过载型肌腱病炎症中的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 一、肌腱病概况 |
| 二、肌腱的结构和组成 |
| 三、肌腱病的病理和分子学变化 |
| 四、机械负载对肌腱的影响 |
| 五、炎症在肌腱腱病中的作用 |
| 六、DAMP理论与警报素HMGB1 |
| 七、本课题研究假说 |
| 第一部分 肌腱细胞和肌腱干细胞的培养和鉴定 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第二部分 机械牵张对肌腱细胞及HMGB1的影响 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第三部分 内、外源性HMGB1对肌腱病炎症的影响 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第四部分 HMGB1在肌腱病炎症中的细胞及分子机制 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（6）昆虫细胞和原核细胞表达系统制备基孔肯雅病毒主要抗原（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 基孔肯雅病毒(CHIKV) |
| 1.1 基孔肯雅病毒(CHIKV)结构特点和基因组组成 |
| 1.2 基孔肯雅病毒(CHIKV)的流行病学特征 |
| 2. CHIKV抗原制备系统 |
| 3. CHIKV结构蛋白抗原应用 |
| 4. 本文的研究内容和研究意义 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 基因、菌株、细胞 |
| 1.3 主要试剂和试剂盒 |
| 1.4 实验仪器和耗材 |
| 1.5 引物 |
| 1.6 实验佐剂和抗体 |
| 2. BEVS制备CHIK-VLPs |
| 2.1 ExpiSf9细胞生长特性摸索 |
| 2.2 pFastBacl-CHIKV-SP质粒构建与鉴定 |
| 2.3 构建和鉴定(rBE-CHIKV-SP)重组杆状病毒杆粒 |
| 2.4 优化转染效率,包装获得重组杆状病毒P0 |
| 2.5 扩增P0病毒 |
| 2.6 P1病毒感染ExpiSf9细胞，表达CHIKV-SP蛋白 |
| 2.7 细胞超薄切片鉴定杆状病毒和CHIK-VLPs |
| 2.8 间接免疫荧光鉴定CHIKV-SP |
| 2.9 CHIK-VLPs的纯化及检测 |
| 2.10 负染CHIK-VLPs,透射电镜观察 |
| 3. 原核表达系统制备CHIKV-E2 |
| 3.1 重组质粒pGEX-6P-1-CHIKV-E2的构建和鉴定 |
| 3.2 诱导表达CHIKV-E2,鉴定并分析可溶性 |
| 3.3 切胶纯化融合蛋白,并免疫小鼠 |
| 3.4 ELISA检测抗体效价 |
| 结果 |
| 1. BEVS制备CHIK-VLPs |
| 1.1 掌握ExpiSf9的生长特性 |
| 1.2 pFastBac1-CHIKV-SP质粒的构建及鉴定 |
| 1.3 构建和鉴定重组杆状病毒杆粒 |
| 1.4 重组杆状病毒P0滴度检测 |
| 1.5 重组杆状病毒P1的扩增与滴度检测 |
| 1.6 WB鉴定CHIKV-SP蛋白 |
| 1.7 透射电镜观察细胞超薄切片 |
| 1.8 荧光显微镜观察CHIKV-SP的表达和定位 |
| 1.9 WB检测纯化后的CHIK-VLPs |
| 1.10 透射电镜观察病毒样颗粒 |
| 2. 原核表达系统制备CHIKV-E2 |
| 2.1 重组质粒pGEX-6P-1-CHIKV-E2的构建和鉴定 |
| 2.2 诱导表达CHIKV-E2,鉴定并分析可溶性 |
| 2.3 切胶纯化融合蛋白并免疫小鼠 |
| 2.4 ELISA检测抗体效价 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基孔肯雅病毒疫苗研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（7）基于连续激光的紧凑STED成像系统及其荧光探针特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 超分辨成像技术研究现状 |
| 1.2.1 扫描近场光学显微技术 |
| 1.2.2 光激活定位显微技术 |
| 1.2.3 随机光学重构显微技术 |
| 1.2.4 饱和结构光照明显微技术 |
| 1.2.5 受激辐射损耗显微技术 |
| 1.3 受激辐射损耗显微技术的拓展及应用 |
| 1.4 研究内容 |
| 第二章 受激辐射损耗超分辨显微成像技术 |
| 2.1 受激辐射损耗超分辨成像原理 |
| 2.2 STED超分辨成像关键技术 |
| 2.2.1 激发光波长与损耗光波长的匹配 |
| 2.2.2 荧光染料 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 连续激光405 nm/532 nm STED超分辨成像系统 |
| 3.1 部分关键模块 |
| 3.1.1 声光控制模块 |
| 3.1.2 空间光滤波模块 |
| 3.1.3 空间光精细调节模块 |
| 3.1.4 多波段信号收集模块 |
| 3.1.5 数据处理模块 |
| 3.2 系统搭建及优化 |
| 3.3 系统校准 |
| 3.3.1 损耗光调制 |
| 3.3.2 金纳米颗粒扫描方法 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 连续激光STED系统中荧光淬灭速率的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 理论模型 |
| 4.3 实验研究 |
| 4.3.1 样品准备 |
| 4.3.2 数值模拟 |
| 4.4 实验结果与分析讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 405 nm\532 nm STED 系统中量子点消光特性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验研究 |
| 5.2.1 样品制备 |
| 5.2.2 实验设备 |
| 5.2.3 实验步骤 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 不同溶剂中碳量子点的消光特性 |
| 5.3.2 半导体量子点的光谱特性及消光特性 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 连续激光STED系统在生物研究中的应用 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验研究 |
| 6.2.1 样品制备 |
| 6.2.2 实验设备 |
| 6.2.3 实验步骤 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 碳/半导体量子点的荧光共聚焦成像 |
| 6.3.2 Coumarin102 染色小鼠脑细胞切片成像 |
| 6.3.3 ATTO390免疫荧光标记神经母瘤细胞成像 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 作者简介 |
（8）基于核素-纳米药物实现恶性肿瘤细胞核定向放射治疗的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 基于~(131)I-AuNPs-TAT实现肿瘤细胞核靶向的内源性放射免疫治疗 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料与方法 |
| 三、实验结果与讨论 |
| 四、本章小结 |
| 五、参考文献 |
| 第二章 基于~(125)I-TiO_2-TAT/HA2 实现溶酶体逃逸与肿瘤细胞核靶向的催化内照射治疗 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料与方法 |
| 三、实验结果与讨论 |
| 四、本章小结 |
| 五、参考文献 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 纳米材料在肿瘤核素内照射增敏治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 论文发表与研究成果 |
| 致谢 |
（9）多肽金纳米粒对巨噬细胞极化的调控及其在急性肺损伤小鼠模型中的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 全文主要缩略语中英文对照表 |
| 绪论 |
| 第一部分 多肽金纳米粒P12在ALI小鼠模型中的保护作用 |
| 1.引言 |
| 2.材料和试剂 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 多肽金纳米粒的合成及表征 |
| 3.2 LPS诱导小鼠急性肺损伤(ALI)模型的建立 |
| 3.3 支气管肺泡灌洗液(BALF)和血清样本的获取及BALF细胞学检测 |
| 3.4 肺组织病理切片制备和损伤评分方法 |
| 3.5 肺组织湿重/干重比值(W/D)测定 |
| 3.6 流式细胞学检测 |
| 3.7 细胞因子测定 |
| 3.8 统计分析 |
| 4.结果 |
| 4.1 多肽金纳米粒的理化性质表征 |
| 4.2 多肽金纳米粒P12在LPS诱导的ALI小鼠模型中的保护作用 |
| 4.3 P12通过靶向肺部巨噬细胞发挥对ALI小鼠的抗炎活性 |
| 5.讨论 |
| 5.1 ALI小鼠模型的复制 |
| 5.2 P12 的体内外抗炎活性 |
| 5.3 P12 的巨噬细胞靶向性 |
| 6.小结 |
| 第二部分 多肽金纳米粒P12对巨噬细胞极化影响的体内外研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和试剂 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 多肽金纳米粒的合成 |
| 3.2 小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)的培养及诱导分化 |
| 3.3 细胞因子测定 |
| 3.4 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定 |
| 3.5 LPS诱导小鼠急性肺损伤(ALI)模型的建立 |
| 3.6 肺单细胞悬液制备 |
| 3.7 流式细胞学检测 |
| 3.8 肺组织免疫荧光分析 |
| 3.9 统计分析 |
| 4.结果 |
| 4.1 BMDMs的培养 |
| 4.2 P12对BMDMs向M1型极化的影响 |
| 4.3 P12对BMDMs向M2型极化的影响 |
| 4.4 P12在体内对ALI小鼠肺部巨噬细胞表型的影响 |
| 5.讨论 |
| 5.1 调控肺部巨噬细胞极化对ALI/ARDS治疗的重要性 |
| 5.2 P12调控巨噬细胞向M2型极化的潜在机制 |
| 5.3 利用纳米技术调节巨噬细胞极化在ALI/ARDS治疗方面的应用前景 |
| 6.小结 |
| 全文结论 |
| 主要参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（10）荷载二氧化锰探针的间充质干细胞在肺癌精准治疗上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肿瘤的光动力治疗 |
| 1.1.1 光敏剂的种类 |
| 1.1.2 激光穿透组织深度 |
| 1.1.3 氧气含量 |
| 1.2 纳米药物二氧化锰 |
| 1.2.1 纳米技术在肿瘤治疗上的应用 |
| 1.2.2 二氧化锰基体在纳米药物上的应用 |
| 1.3 纳米药物的肿瘤递送 |
| 1.3.1 被动靶向 |
| 1.3.2 主动靶向 |
| 1.3.3 细胞载体 |
| 1.4 本论文的研究目的和内容 |
| 1.5 本论文的创新性 |
| 第二章 MnO_2@Ce6 的制备及体外表征 |
| 2.1 试剂及仪器 |
| 2.1.1 材料试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 MnO_2 的制备 |
| 2.2.2 MnO_2@Ce6 的合成 |
| 2.2.3 材料表征 |
| 2.2.4 体外氧气释放实验 |
| 2.2.5 单线态氧(~1O_2)的测定 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 MnO_2@Ce6 的制备与表征 |
| 2.3.2 体外氧气释放实验 |
| 2.3.3 单线态氧(~1O_2)的测定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 MnO_2@Ce6-MSCs纳米平台的搭建 |
| 3.1 试剂及仪器 |
| 3.1.1 材料试剂 |
| 3.1.2 仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 小鼠肺癌细胞 LLC和间充质干细胞 MSCs的培养 |
| 3.2.2 MnO_2@Ce6-MSCs的表型鉴定 |
| 3.2.3 细胞增殖实验 |
| 3.2.4 细胞凋亡测定 |
| 3.2.5 细胞双染实验 |
| 3.2.6 MnO_2@Ce6 的细胞摄取测定 |
| 3.2.7 细胞内氧气和活性氧的含量测定 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 MnO_2@Ce6 的细胞毒性 |
| 3.3.2 MnO_2@Ce6-MSCs的表型鉴定 |
| 3.3.3 MnO_2@Ce6 的体外光动力治疗效果 |
| 3.3.4 MSCs对 MnO_2@Ce6 的摄取和细胞内分布 |
| 3.3.5 MSCs内氧气和ROS含量测定 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 MnO_2@Ce6-MSCs的体内成像和光动力治疗效果 |
| 4.1 试剂及仪器 |
| 4.1.1 材料试剂 |
| 4.1.2 仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 构建小鼠肿瘤模型 |
| 4.2.2 MnO_2@Ce6-MSC的肿瘤成像 |
| 4.2.3 MnO_2@Ce6-MSC的肿瘤治疗效果和生物安全性评价 |
| 4.2.4 统计学分析 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 MnO_2@Ce6-MSC的荧光成像 |
| 4.3.2 MnO_2@Ce6-MSC的核磁成像 |
| 4.3.3 MnO_2@Ce6-MSC的光声成像 |
| 4.3.4 MnO_2@Ce6-MSC的光动力治疗效果 |
| 4.3.5 MnO_2@Ce6-MSC的生物安全性评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
四、一种培养细胞切片用于免疫细胞化学染色方法的建立（论文参考文献）
- [1]诱导性心脏祖细胞的生成及其3D水凝胶培养体系的构建[D]. 褚新月. 西南大学, 2021
- [2]聚合物基复合纳米梭的制备及肿瘤诊疗应用[D]. 刘树威. 吉林大学, 2021(01)
- [3]慢性淋巴细胞白血病小鼠模型的制备及生姜挥发油抑癌作用的初步探究[D]. 南苗苗. 内蒙古大学, 2021(12)
- [4]新生儿缺氧缺血性脑损伤后脑内髓系细胞吞噬—炎症失衡参与突触损伤的机制研究[D]. 闵颖俊. 昆明医科大学, 2021
- [5]HMGB1在机械过载型肌腱病炎症中的作用机制[D]. 顾新丰. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(02)
- [6]昆虫细胞和原核细胞表达系统制备基孔肯雅病毒主要抗原[D]. 李会. 昆明医科大学, 2021(01)
- [7]基于连续激光的紧凑STED成像系统及其荧光探针特性研究[D]. 赵文轩. 西北大学, 2020(01)
- [8]基于核素-纳米药物实现恶性肿瘤细胞核定向放射治疗的实验研究[D]. 苏维维. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [9]多肽金纳米粒对巨噬细胞极化的调控及其在急性肺损伤小鼠模型中的保护作用[D]. 王璐. 上海交通大学, 2020
- [10]荷载二氧化锰探针的间充质干细胞在肺癌精准治疗上的应用[D]. 曹雯. 上海交通大学, 2020(09)