一、大肠在钙吸收中的作用（论文文献综述）
邹昕羽[1]（2021）在《枯草芽孢杆菌对蛋鸡生产性能和骨代谢的影响及其机理研究》文中研究指明由于蛋鸡的饲养周期长,产蛋需求量大,蛋鸡出现骨质疏松的风险较高,而骨质疏松症易出现蛋鸡的产蛋量下降,蛋壳质量降低,骨折,瘫痪,甚至死亡,严重影响蛋鸡的经济效益及动物福利。益生菌是一种新型无毒、无残留、无污染的绿色安全微生态制剂,能维护宿主肠道健康,提高机体免疫力和生长生产性能,是一类有效的抗生素替代品。最新研究显示,益生菌还可影响人和动物的骨代谢,增加腿骨密度和矿物质含量,阻止骨量减少。因此本文旨在研究枯草芽孢杆菌对蛋鸡生产性能和骨性能的影响并探究其可能作用机制,给枯草芽孢杆菌在实际应用的推广上提供科学依据。本研究选取24只48周龄的蛋鸡,随机分成对照组（Cont,饲喂基础饲料）,枯草芽孢杆菌组（B0.5,在基础饲料中添加0.5 g/kg的枯草芽孢杆菌）,每组12只,持续饲养60 d,自由饮水饮食。为分析枯草芽孢杆菌对蛋鸡生产性能的影响,日常记录产蛋率和软破壳蛋率,每10 d,从各组收集12个鸡蛋,使用蛋品质分析仪、蛋壳强度测定仪和蛋壳厚度计检测蛋重、哈氏单位、蛋白高度、蛋黄颜色、蛋壳强度和厚度。在第30和60 d,收集新鲜粪便,检测粪便中枯草芽孢杆菌菌落数,验证枯草芽孢杆菌定植与否。为验证枯草芽孢杆菌对蛋鸡骨代谢的影响,并探讨它的作用机制,在第30 d和第61d采血后,利用ELISA和生化仪检测了血液因子1,25-（OH）2D3、PTH、CT、E、IL-1、IL-6、TNF-α、LPS、D-LA、Ca、P、ALP、AST和TRACP水平。其次,第61 d实验结束后解剖所有的生存鸡采集蛋鸡股骨和胫骨、各肠段及其肠内容物,利用万能试验机和骨密度测定仪检测骨强度和骨密度,HE染色观察胫骨和各肠段组织形态学变化,使用电感耦合等离子体发射光谱仪检测了股骨、蛋壳和粪便内Ca、P和Mg元素的含量。同时,利用荧光定量检测了股骨骨代谢相关基因OPG、SOST、COL1A2、RANK、RANKL的表达量。通过各肠段的紧密连接蛋白OCLN和JAM-A mRNA的表达水平的检测及各肠段的pH值,确定了枯草芽孢杆菌主要影响的肠段。之后选取十二指肠进行转录组测序分析,验证了免疫相关差异目的基因TF、CYBB、P2RX7、PRKCB mRNA以及炎症基因IL-1、IL-6和TNF-αmRNA的表达情况。同时,还进行了十二指肠中氧化应激指标SOD、MDA和GSH-Px含量检测和利用16s r RNA对蛋鸡盲肠菌群多样性分析。实验一:结果显示B0.5组蛋鸡的软破壳蛋率（P<0.05）,蛋壳厚度（P<0.05）分别被显着降低和提高,同时股骨最大载荷（P=0.06）,最大应力（P<0.01）,刚度（P<0.01）和杨氏模量（P<0.01）也显着增加,而骨应变（P=0.06）明显减小。与对照组相比,在第61 d,B0.5组的血清P（P<0.01）含量显着性降低,但股骨中P（P<0.05）含量显着性增加。股骨中Mg含量减少（P=0.04）,并被大量排出。另外,B0.5组的血浆中雌二醇（P<0.01）含量显着提高,炎症因子IL-1、TNF-α（P<0.01）的含量降低,并股骨中OPG mRNA的表达量增加。实验二:结果显示B0.5组的十二指肠、回肠和盲肠的pH值与对照组相比没有变化,但空肠的pH水平显着高于对照组（P<0.01）。与对照组相比,B0.5组蛋鸡十二指肠紧密连接蛋白OCLN mRNA（P<0.05）的相对表达量显着增高,但其他肠段没有。根据PCR结果选取十二指肠进行转录组分析,获得了上调基因397条和下调基因501条共898条基因。这些基因主要富集在炎症、免疫相关GO功能上,基因CYBB（P<0.01）、TF（P<0.05）、P2RX7（P=0.066）、PRKCB（P=0.091）、TNF-α（P<0.01）相对表达量的变化与转录组分析结果一致。饲喂枯草芽孢杆菌显着降低十二指肠内MDA（P<0.05）含量,但不改变SOD和GSH-Px酶活性。16s RNA分析结果显示,枯草芽孢杆菌显着性在门水平上减少蓝藻菌门（P=0.02）和梭杆菌门（P=0.10）的相对丰度。在属水平上降低Eubacterium＿hallii＿group（P=0.04）、Mailhella（P=0.04）、norank＿f＿＿nor-ank＿o＿＿Saccharimonadales（P=0.02）、Lachnospiraceae＿FCS020＿group（P=0.03）、norank＿f＿＿norank＿o＿＿Gastranaerophilales（P=0.04）、Oxalobacter（P=0.03）、Hy-drogenoanaerobacterium（P=0.05）、Ruminiclostridium（P=0.04）和Lachnospirace-ae＿UCG-010（P<0.05）,Ruminococcus＿torques＿group（P=0.06）,CHKCI001（P=0.07）、Fusobacterium（P=0.10）、Bilophila（P=0.08）的相对丰度并增加Weissella（P=0.08）的相对丰度。以上结果表明,枯草芽孢杆菌可减少有害促炎菌的含量调节肠道微生物屏障,并可抑制十二指肠氧化损伤和炎症反应,提高紧密连接蛋白OCLN的表达,维护肠道的免疫屏障和物理屏障。这有利于降低全身炎症反应,提高雌二醇分泌量,改变钙磷代谢,从而保护骨质量,增强骨强度,改善蛋壳质量。
郑丹艳[2]（2021）在《桑树钙胁迫转录组和miRNA分析及相关基因功能鉴定》文中认为钙（Ca）是植物生长发育中必不可少的元素。不仅作为基本元素,为植物提供并且储存养分;同时作为“第二信使”,调控体内生理及代谢活动的进行,保证植物正常生长。土壤中含钙量的巨大差异以及植物对钙素的吸收程度都对植物自身生长发育和生理活动有极大影响。以桑树为研究对象,分析不同浓度钙胁迫下的相关生理生化指标、转录组测序及smallRNA测序的结果;并对差异表达基因进行克隆、microRNA及其靶标基因进行鉴定分析。研究结果有助于阐述植物对钙的高效利用,为植物抗钙胁迫提供一定的分子机理及依据。研究结果如下:1、桑树钙胁迫的生理生化指标测定、测序数据分析及差异基因的表达鉴定桑苗以4个浓度的CaCl2·2H2O（含0 mg/L、220 mg/L、440 mg/L、660 mg/L的CaCl2·2H2O的MS液体培养基,以440 mg/L的CaCl2·2H2O作为对照组,其余三组为实验组）处理,每组3个重复,测定其生理生化指标:可溶性蛋白（Cpr）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）及脯氨酸（PRO）。结果显示,五种指标均有不同程度的变化趋势,证明钙对桑树的生长发育有影响。选择4个钙胁迫的桑叶样本进行转录组和小RNA测序;转录组测序结果中,经过滤、GC含量分布检测等一系列处理后得到可用的clean reads为94.89 G,其中各样品的Q20、Q30碱基数占92.44%以上。钙胁迫下桑叶样本中3个比较组合依次有6134、11169和1870个差异基因。从差异基因中选取12个基因进行q RT-PCR,验证转录组数据。GO注释发现差异基因在生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）中都有富集;KEGG通路中,3组差异基因比较组合主要集中在核糖体、光合作用、蛋白酶体等代谢通路上。小RNA测序,3个比较组合共得到原始数据8.208 G;鉴定出53个已知miRNA和61个前体发夹结构。文库同时预测到42种新型miRNA和51种新型发夹结构。3个比较组合中,差异miRNA一共鉴定到36个。选择上调和下调的7个差异miRNA进行q RT-PCR验证,显示7个miRNA均有显着性表达,与测序结果一致。候选靶基因的GO注释和KEGG通路分析:GO注释中,0vs440及660vs440的靶基因富集在在分子功能（MF）上;220vs440的候选靶基因在生物过程（BP）和细胞组分（CC）上更为集中。KEGG通路中,淀粉和蔗糖代谢途径、α-亚麻酸代谢途径和甘油磷脂代谢途径上富集了较多靶基因。2、桑树转录因子MYB30基因的克隆及表达桑树中克隆得到MmMYB30基因（Gen Bank:MZ343300）,cds区为867 bp,编码蛋白质为288个氨基酸,预测质量为32.53 KD,等电点为6.47,属于MYB转录因子家族。预测其三级结构并利用生物信息学方法与其他植物物种进行同源性及亲缘关系分析。定量分析结果表明,MmMYB30基因在不同钙胁迫下表达量增加,与转录组结果一致。SDS-PAGE技术可在大肠杆菌中成功表达MmMYB30蛋白。3、桑树类钙调素CML37基因的克隆及功能验证桑树中克隆得到MmCML37基因（Gen Bank:MZ343301）,cds区为435 bp,编码144个氨基酸,预测蛋白质分子质量为16.36 KD,等电点为4.53,属于类钙调素CML（calmodulin-like）家族。分析与其他物种的同源性及亲缘性。定量结果表明不同浓度钙胁迫下MmCML37基因表达量上调,与转录组中结果一致。利用VIGS技术在桑树中沉默MmCML37基因。经鉴定,桑叶中的丙二醛（MDA）、脯氨酸（PRO）含量、过氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及可溶性蛋白（Cpr）含量在钙胁迫下均出现不同程度的变化。沉默MmCML37基因后,引起桑苗体内与钙胁迫相关酶活性的变化,影响桑苗应对外界钙胁迫,进一步说明MmCML37基因在桑苗的逆境胁迫中起正向作用。4、桑树miR156g瞬时转化过表达鉴定其钙胁迫应答功能获得miR156g前体序列后,预测二级茎环结构,发现成熟体序列位于5’臂上。成功构建miR156g瞬时过表达转化体系,在桑树幼苗中瞬时过表达miR156g后,miR156g及其对应靶基因表达量有相反的变化趋势,推测miR156g在桑苗应对钙胁迫中发挥重要作用。
邵志鹏[3]（2021）在《ε-聚赖氨酸—乳清蛋白复合物的构建、抑菌机理及其分子动力学模拟的研究》文中认为近年来,消费者对“天然”和“最低限度加工”食品的追求,使得天然防腐剂的开发与利用方兴未艾,已成为当今食品科学领域新的研究热点。ε-聚赖氨酸由于具有高效和广谱的抑菌特性,目前已被包括我国在内的多个国家批准作为食品防腐剂。然而,ε-聚赖氨酸在实际应用中却遇到了诸多瓶颈,例如,ε-聚赖氨酸易与食品体系中的大分子（如阴离子多糖或蛋白质等）发生相互作用,导致其在富含蛋白质食品中的最适添加量远远高于其在淀粉类制品中的最适添加量,而过多的添加量会给产品带来涩味,同时也会提高产品的成本。静电复合物体系能够缓解ε-聚赖氨酸对食品理化性质的影响,同时保留ε-聚赖氨酸的抗菌活性,从而解决ε-聚赖氨酸在食品应用中遇到的瓶颈。因此,研究如何解决上述问题,关键在于理解ε-聚赖氨酸静电复合物体系的本质与规律,揭示ε-聚赖氨酸静电复合物体系结构与其抑菌特性的关系。因此,本论文以ε-聚赖氨酸和乳清蛋白为研究对象,研究了ε-聚赖氨酸和乳清蛋白复合体系的构建及其抑菌特性和机制。主要研究工作和结论如下:1.以ε-聚赖氨酸和乳清蛋白为研究对象,研究ε-聚赖氨酸-乳清蛋白浓度、ε-聚赖氨酸和乳清蛋白的质量比、p H和离子浓度对ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物浊度、粒径、Zeta电位和稳定性的影响。结果如下,（1）复合物的浊度和粒径与ε-聚赖氨酸-乳清蛋白浓度呈线性关系,线性关系说明ε-聚赖氨酸-乳清蛋白浓度的增加不会改变体系的相行为,其公式分别为y=0.0501*x+0.0025和y=41.3075*x+390.7667;体系的Zeta电位始终大于20 m V,其和ε-聚赖氨酸-乳清蛋白浓度不存在显着性的关系;（2）ε-聚赖氨酸和乳清蛋白质量比对复合物的影响可分为四段,当质量比为0-0.01时,复合物的浊度和粒径保持稳定,Zeta电位小于-20 m V,稳定性指数（TSI）小于20;当质量比为0.01-0.1时,复合物的浊度和粒径剧增,Zeta电位为-20至0 m V,TSI大于20;当质量比为0.1-0.5时,复合物的浊度和粒径剧减,Zeta电位为0至20 m V,TSI大于20;当质量比为0.5-1时,复合物的浊度和粒径再次保持稳定,Zeta电位大于20 m V,TSI小于20;（3）p H能够改变复合物的Zeta电位,Zeta电位的改变能够影响复合物间的静电排斥力,从而导致体系浊度和粒径发生改变;同时,体系存在一临界p Hc值,当体系p H小于p Hc值时,复合物的Zeta电位为正值,当体系p H大于p Hc值时,复合物的Zeta电位为负值;p Hc值和ε-聚赖氨酸和乳清蛋白质量比呈对数关系,其公式为y=1.7906*log10x-0.0069+8.0448;（4）钠离子浓度对复合物的影响可分为三段,当浓度为0-40 m M时,复合物的浊度和粒径保持稳定,Zeta电位大于13.5 m V;当浓度为40-100 m M时,钠离子能够破坏体系中ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用的动态平衡,从而导致复合物浊度和粒径剧增,Zeta电位为6.5至13.5 m V;当浓度为100-200 m M时,钠离子能够提供额外的静电斥力来维持复合物的稳定性,从而导致复合物浊度和粒径停止增长并保持稳定,Zeta电位小于6.5 m V;（5）钙离子浓度对复合物的影响可分为四段,当浓度为0-20 m M时,复合物的浊度和粒径保持稳定,Zeta电位大于15.7 m V;当浓度为20-60m M时,钙离子能够破坏体系中ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用的动态平衡,导致复合物浊度和粒径剧增,Zeta电位为7.4至15.7 m V;当浓度为60-100 m M时,钙离子会引起复合物体系的解离,从而导致复合物浊度和粒径剧减,Zeta电位为4.3至7.4 m V;当浓度为100-200 m M时,复合物的浊度和粒径再次保持稳定,Zeta电位小于4.3 m V。2.基于荧光光谱、紫外光谱、红外光谱、扫描电子显微镜、流变仪和质构仪等手段,研究ε-聚赖氨酸和乳清蛋白的相互作用以及ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物的结构。结果如下,（1）在ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用过程中,ε-聚赖氨酸对乳清蛋白的荧光猝灭类型为静态猝灭;（2）在红外光谱中,复合物在1750 cm-1处出现一新的特征峰,其对应于C=O的振动,这可能是ε-聚赖氨酸和乳清蛋白的相互作用（氢键）导致C=O基团发生了偏移;（3）ε-聚赖氨酸、乳清蛋白和复合物具有不同的表面形态:ε-聚赖氨酸表面呈海绵状,乳清蛋白呈球形,复合物表面粗糙且形状不规则;（4）复合物仍具有凝胶能力,其凝胶温度依赖于ε-聚赖氨酸-乳清蛋白的浓度、ε-聚赖氨酸和乳清蛋白质量比、p H和离子浓度:ε-聚赖氨酸-乳清蛋白的浓度、ε-聚赖氨酸和乳清蛋白质量比能够降低复合物的凝胶温度;复合物易于在碱性环境（p H≥7）和强酸环境（p H≤2）中形成凝胶;钠离子能够降低复合物的凝胶温度,而钙离子则会造成复合物凝胶温度的升高;（5）复合物凝胶的硬度和咀嚼性与乳清蛋白浓度呈正相关关系,而弹性呈负相关关系;复合物凝胶的硬度、弹性、内聚力和咀嚼性与ε-聚赖氨酸-乳清蛋白质量比呈负相关关系;在碱性p H值（7-9）中,复合物凝胶的硬度、弹性、内聚力和咀嚼性与p H呈正相关关系;复合物凝胶的硬度和咀嚼性与钠离子浓度呈正相关关系,与钙离子浓度呈负相关关系。3.基于分子动力学模拟技术,研究ε-聚赖氨酸和乳清蛋白（α-乳白蛋白和β-乳球蛋白）的相互作用机制。结果表明,在ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用过程中,涉及的相互作用主要为范德华相互作用、盐桥、静电作用、氢键、亲水作用等。其中,静电相互作用是相互作用的主要驱动力,盐桥、氢键和疏水作用则维持相互作用后复合物构象的稳定。在ε-聚赖氨酸中,肽键上羰基的氧原子和氨基是参与相互作用的主要原子和基团。在乳清蛋白中,GLU和ASP是参与相互作用的主要基团,其对相互作用结合自由能的贡献最大,而ARG和LYS则阻碍ε-聚赖氨酸和乳清蛋白的相互作用。其原因在于,GLU和ASP侧链上COO-可以作为氢键受体与ε-聚赖氨酸形成氢键,而ARG和LYS侧链上的NH4+与ε-聚赖氨酸具有相同的电荷,从而导致两者产生相互排斥。4.以大肠杆菌（革兰氏阴性菌）、金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）和枯草芽孢杆菌（革兰氏阳性菌）为研究对象,研究ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物的抑菌特性。结果表明,ε-聚赖氨酸和乳清蛋白的相互作用并没有导致复合物失去相应的抑菌功能。复合物保留着与ε-聚赖氨酸同等的抑菌功能,其抑菌活性和复合物中ε-聚赖氨酸浓度呈正相关关系。复合物对杆菌（大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）的抑菌效果优于对球菌（金黄色葡萄球菌）的抑菌效果。在抑菌过程中,复合物能够通过静电相互作用结合到细菌膜表面,从而造成细菌膜出现孔洞,扰乱细菌的新陈代谢,最终导致细菌裂解死亡。在冷鲜肉抑菌实验中,复合物和ε-聚赖氨酸表现出同等的抑菌效果,复合物的抑菌特性在实际应用中并没降低或受到抑制。5.基于分子动力学模拟技术,研究ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物在细菌单层膜（POPG）和双层膜（POPE/POPG）中的抑菌机制。单层膜研究结果表明,复合物具有结合到单层POPG膜表面的能力,这是其具有抑菌能力的原因。复合物和单层POPG膜的相互作用主要为氢键、盐桥、静电相互作用和范德瓦尔斯力等,ε-聚赖氨酸肽键中的氨基是复合物参与相互作用的主要位点,而肽键中的氧原子并未参与相互作用。最终,复合物中的ε-聚赖氨酸分子能够稳定在单层POPG膜的头基和甘油酯区域,从而导致细菌膜的流动性增强,有序度变差,有利于ε-聚赖氨酸分子深入到疏水的酰基链区域。双层膜研究结果表明,复合物和双层膜的相互作用能够改变双层膜中内外环境的电势差,而电势差的改变会导致双层膜形成亲水性的孔洞。在模拟过程中,结合在亲水性孔洞附近的ε-聚赖氨酸分子能够沿着孔洞向双层膜内环境移动,随后镶嵌在双层膜中或者穿过孔洞进入到双层膜内环境中。单层膜和双层膜的结果共同表明,复合物能够诱导细菌的细菌膜出现孔洞,并能够抑制细菌膜孔洞的自主修复,从而影响细菌的新陈代谢,最终导致细菌死亡。
郭丹郡[4]（2020）在《基于CaSR及Wnt/β-catenin信号通路的鸭蛋蛋清肽促钙吸收及促骨合成活性及机制研究》文中进行了进一步梳理缺钙是全球范围内常见的健康问题,且随着社会人口老龄化日趋严重,骨质疏松症也日益成为重要的公共健康问题。本实验前期研究发现鸭蛋蛋清肽（Desalted duck egg white peptides,DPs）及蛋清源四肽VSEE在体内外实验模型中均具有良好的促钙吸收作用,其主要是通过激活TRPV6钙离子通道促进钙吸收的。然而对于钙敏感受体（Calcium sensing receptor,Ca SR）是否是DPs的另一作用靶标,以及DPs和VSEE是否能直接影响骨合成代谢尚不明确。本文采用阴离子交换柱、HPLC-ESI/MS/MS、分子对接虚拟筛选技术和在体小肠单向灌流法（Single-pass intestinal perfusion,SPIP）,考察了Ca SR是否介导DPs对肠钙吸收的调控作用,以期更全面地诠释鸭蛋蛋清肽的促钙吸收机理。此外,本文通过MC3T3-E1细胞和去势大鼠骨质疏松模型,并结合钙离子荧光探针技术、分子生物学手段、Micro CT分析、组织学观察等方法,将DPs促钙吸收研究拓展到促进骨合成研究,并对其相关机理进行了探究。同时,本文采用体外模拟胃肠道消化试验、Caco-2/HT-29共培养模型、药物代谢动力学试验,考察了VSEE的体外稳定性、转运吸收和相关机制,以及药物代谢动力学特征和代谢稳定性,旨在为VSEE未来的应用和开发上提供理论依据。本文主要研究结果如下:1.正构调节钙敏感受体鸭蛋蛋清肽的筛选与鉴定采用阴离子交换柱对DPs进行初步的分离纯化,筛选出具有高可溶性钙结合活性的组分（F3）,并对F3进行HPLC-ESI-MS/MS分析,解析出49条肽段,其中包含16条含有芳香族氨基酸的肽段。采用分子对接虚拟筛选技术对这16条肽段与Ca SR蛋白的亲和力进行预测,根据Total score打分从中选取了FAE、FNE、INSW、FDPE和NFE进行后续实验。在体小肠单向灌流实验结果表明:INSW和NFE能显着降低由NPS-2143引起的甲状旁腺激素（Parathyroid hormone,PTH）水平升高（P<0.05）,抑制率分别为45.80%和48.81%,并能显着提高小肠钙吸收百分比、吸收速率常数（Ka）和有效渗透系数（Peff）,显着上调十二指肠上Ca SR基因表达量（P<0.05）。此外,分子对接结果表明这两条肽段均能很好地进入Ca SR蛋白的活性口袋,并占据活性中心,其主要结合作用力为氢键作用和疏水相互作用,结合位点位于Ca SR蛋白的捕虫夹结构域（Venus flytrap domain,VFTD）,与芳香族氨基酸结合位点类似。2.DPs及VSEE对MC3T3-E1增殖、分化和矿化的影响及相关机制研究DPs（0.8-10mg/m L）和VSEE（0.2-2m M）在含或不含4m M Ca Cl2下分别处理前成骨细胞MC3T3-E15天和7天后发现,细胞增殖率均显着增加,并显着提高MC3T3-E1细胞在S期的比例（P<0.05）。DPs和VSEE在含/不含4m M Ca Cl2下分别处理MC3T3-E1细胞均能显着提高其碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性（P<0.05）,促进矿化结节的产生;DPs/VSEE+4m M Ca Cl2组的效果均优于相同浓度但不添加Ca Cl2处理组。此外,DPs、VSEE能显着上调Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白（Wnt3a、LRP5、β-catenin）表达量,以及相关下游蛋白Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）、骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）蛋白的表达水平（P<0.05）,继而促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化。此外,在[Ca2+]i为2m M时,DPs能激活L-型钙离子通道,对促进MC3T3-E1细胞“外钙内流”有部分贡献;VSEE能诱导MC3T3-E1细胞内钙库中钙离子的释放,同时能激活L-型钙离子通道,且其促进细胞“外钙内流”的能力较DPs大幅提升。VSEE促MC3T3-E1细胞分化、矿化的构效关系研究结果表明,VSEE的酸性氨基酸簇“EE”对于MC3T3-E1细胞分化和矿化有重要的贡献;四肽氮端为“V”对MC3T3-E1分化和矿化的促进作用优于氮端为“A”;VSEE的丝氨酸“S”磷酸化后,其对MC3T3-E1细胞分化和矿化也具有明显的促进作用,但若外源添加钙离子时,则还需考虑钙磷比对骨形成的影响。3.VSEE体内外消化、吸收和代谢研究VSEE分别在37-100℃和p H 4-10下处理后,其含量均能保持在95%以上,VSEE先后经过胃蛋白酶和胰蛋白酶共同作用后,其含量仍能保持在80%以上;提示VSEE具有较高的体外稳定性,同时对消化酶也具有较高的耐受性。在Caco-2/HT-29细胞共培养模型中,VSEE的最优转运条件为转运时间2h和浓度0.5mmol/L,其转运量可达到16.51%;此外,VSEE是通过细胞旁路转运和小肽转运蛋白1（Peptide transporter 1,Pep T1）两种途径转运吸收的。药物代谢动力学研究发现,VSEE的血药浓度经时曲线符合1/C2权重的二室模型,其在大鼠体内的表观分布容积较小（1.17±0.15 L/kg）,但滞留时间（76.05±1.11 min）和半衰期（57.0±0.42 min）较长;提示VSEE脂溶性较差,但具有较好的稳定性,在体内不易被降解。4.鸭蛋蛋清肽对去势大鼠骨质疏松及脂质代谢紊乱的干预作用及机理研究在去势大鼠骨质疏松模型中,DPs和VSEE能显着降低血清中骨转换标志物ALP、I型原胶原N端前肽（N-terminal propeptide of type I procollagen,PINP）、I型胶原羟基端肽β降解产物（Cross-linked C-terminal telopeptide,β-CTX）水平（P<0.05）,显着提高股骨与胫骨干重指数和骨钙含量（P<0.05）;DPs和VSEE也可以有效地改善去势大鼠股骨与胫骨的生物力学性能,减轻骨微结构的破坏,增加骨小梁数量。同时,DPs和VSEE能显着上调骨骼中Wnt3a、LRP-5、β-catenin以及小肠中occludin、claudin-3蛋白的表达量（P<0.05）,也能显着改善肠道微生物种类组成和比例（P<0.05）。此外,DPs和VSEE能显着降低血清中总胆固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterin,LDL-C）水平（P<0.05）,显着升高高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterin,HDL-C）水平（P<0.05）,且明显地减少脂肪细胞大小,减少肝脏组织中脂肪滴聚集。综上所述,DPs和VSEE能通过改善去势大鼠的小肠屏障功能、肠道微生物群落的结构,激活骨代谢和脂质代谢交叉信号通路——Wnt/β-catenin信号通路,进而对雌激素水平降低引起的骨质疏松症和伴随而来的脂质代谢紊乱有明显的改善作用。
高利娟[5]（2020）在《哈氏噬纤维菌Ⅸ型分泌系统的组成及功能研究》文中提出迄今为止,在细菌中已发现九种蛋白分泌系统,参与细菌的营养吸收、吸附、致病性等多种生命过程,包括2010年在Porphyromonas gingivalis和Flavobacterium johnsoniae中发现Ⅸ型分泌系统-Type Ⅸ secretion system（T9SS）。T9SS由一系列的Por、Gld、Spr蛋白组成,广泛分布且仅存在于拟杆菌门中,参与致病性、细胞滑动和生物大分子的降解。含有N端信号肽和保守的C-terminal domain（CTD）的T9SS底物蛋白首先经Sec系统跨内膜转运至周质空间,后经T9SS识别,跨外膜转运至细胞表面或胞外。据报道,大部分的金属离子可通过孔蛋白以被动扩散的方式跨外膜转运,进而被菌体吸收利用。当胞外的金属离子浓度较低时,以被动扩散方式转运的金属离子往往不能满足胞内需要。在金属离子匮乏的情况下,一些细菌可跨外膜主动转运金属离子（如Burkholderia thailandensis中锌离子的转运）。Cytophaga hutchinsonii是广泛分布在土壤中的革兰氏阴性细菌,属拟杆菌门。C.hutchinsonii可快速高效地降解结晶纤维素,其降解机制不同于好氧真菌的游离纤维素酶系机制和厌氧细菌的纤维小体机制,Wilson推测其采用第三种纤维素降解机制。另外C.hutchinsonii无鞭毛和Ⅳ型菌毛,可在介质表面快速地滑动,其运动机制也是未解之谜。近年来的研究表明外膜蛋白在纤维素降解和滑动中发挥着重要的作用。C.hutchinsonii 基因组中含有全套的T9SS编码基因。研究报道CHU3237（PorU）和CHU—0170（SprP）是C.hutchinsonii T9SS的组分,影响纤维素降解和滑动,尚未有研究报道T9SS其他组分（尤其是核心组分）的功能。本文改进了 C.hutchinsonii T9SS突变株的筛选条件,获得了 T9SS核心组分GldN以及重要组分SprA和SprT编码基因的敲除株。另外鉴定了两个未知功能蛋白为C.hutchinsonii T9SS的组分。通过研究各T9SS组分的功能,首次发现T9SS参与低浓度条件下钙离子和镁离子吸收。具体研究内容以及取得的主要结果如下:C.hutchinsonii T9SS核心组分蛋白GldN的功能研究:拟杆菌门T9SS的编码基因中,gldK、gldL、gldM、gldN的分布比较保守,在基因组中连续分布且转录方向一致。研究表明GldK、GldL、GldM、GldN可形成跨细胞膜的蛋白复合体,为T9SS的核心组分。为了研究C。hutchinsonii中GldN的功能,我们改进了突变株的筛选培养基,在完全培养基（PY6）中添加0.9mM钙离子和0.8 mM镁离子,命名为PYT培养基。用PYT和同源重组技术成功地敲除了gldN,得到△gldN突变株。研究发现GldN在纤维素降解、菌体滑动和CTD蛋白分泌过程中均发挥着关键作用。gldN敲除后,突变株的纤维素降解能力完全缺失,既不能降解结晶纤维素,也不能降解无定形纤维素。同时,△gldN的运动能力完全缺失,在硬琼脂和软琼脂上不扩散,个体细胞在玻璃表面的附着能力降低且失去滑动能力。CHU0344是C.hutchinsonii分泌的主要胞外蛋白,含有CTD,其分泌在△gldN中发生缺陷。另外,通过细胞表面蛋白组学在野生株（WT）的细胞表面鉴定到38个CTD蛋白,而△gldN的细胞表面缺失了其中的35个,包括CHU3220,其是纤维素结晶区降解必需蛋白。蛋白免疫印迹实验进一步证明CHU3220在△gldN中分泌缺陷,并在△gldN的周质空间积累。我们首次发现在钙、镁离子含量低的条件下,GldN参与钙、镁离子的跨外膜转运。研究发现△gldN在钙离子和镁离子缺少的培养基中生长能力显着减弱,且胞内钙离子和镁离子的浓度明显下降。通过分析外膜差异蛋白,发现gldN的敲除影响了外膜外排泵蛋白CHU2807在外膜上的定位。敲除chu2807后同样导致突变株在缺乏钙离子和镁离子的培养基中生长能力显着减弱,并且△2807胞内的钙离子和镁离子浓度也有一定程度的降低,表明CHU2807参与低浓度条件下钙离子和镁离子的吸收。目前关于细菌中阳离子跨外膜转运机制的研究报道非常有限,特别是钙离子和镁离子的转运机制。我们的研究首次发现T9SS参与钙离子和镁离子的跨膜转运,揭示了蛋白分泌系统与离子转运系统的联系。以上研究结果表明GldN是C.hutchinsonii T9SS的核心组分,在绝大多数CTD蛋白的分泌、离子吸收、纤维素降解和菌体滑动中发挥着关键作用。C.hutchinsonii T9SS重要组分SprA和SprT的功能研究:SprT（PorT）是最早被发现的T9SS组分,在P.gingivalis参与牙龈蛋白酶的分泌,并在F.johnsoniae中参与SprB、RemA、ChiA的分泌。随后发现Sov（SprA）也参与牙龈蛋白酶的分泌。最近的研究表明SprA是T9SS位于外膜的易位子。SprA由36个β-折叠片形成桶状结构,最大直径为70 A,足以容纳折叠完成的大分子量蛋白通过。为了鉴定C.hutchinsonii中SprA和SprT的同源蛋白,并研究它们在C.hutchinsonii中的功能,我们敲除了 C.hutchinsonii中sprA和sprT的同源基因chu0029（sprA）和chu2709（sprT）。研究发现sprA和sprT的敲除转化子用完全培养基（PY6）培养无法获得,而用富含钙离子和镁离子的培养基（PYT）培养时可成功获得。进一步的研究表明在缺乏钙离子和镁离子的条件下,SprA和SprT参与钙离子和镁离子的吸收,尤其是SprT。在PY6,Stanier不添加CaCl2和Stanier减少MgSO4添加量（自0.8 mM减少至0.1 mM）的培养基中△sprT生长严重缺陷。而在富含钙离子和镁离子的PYT和Stanier培养基中△sprT的生长状态良好。生长曲线结果表明SprT在钙离子和镁离子的胞内转运过程中发挥着不可替代的作用。敲除sprA和sprT后,突变株失去结晶纤维素和无定形纤维素的利用能力。另外,△sprA和△sprT失去纤维素吸附能力,不能在滤纸纤维上有序排列。同时△sprA和△sprT的群体扩散能力和个体细胞的运动能力也完全缺失。上述研究结果表明SprA和SprT在跨外膜转运纤维素降解相关蛋白,纤维素吸附蛋白和粘附素的过程中发挥着重要的作用。△sprA和△sprT分泌CHU0344和细胞表面纤维素酶Ce19A缺陷,且CHU0344和Cel9A在其周质空间积累,进一步证明SprA和SprT是T9SS组分,参与蛋白分泌。分析细胞表面蛋白组学发现△sprA和△sprT的细胞表面分别缺失了32和27个CTD蛋白（在WT的细胞表面鉴定到38个CTD蛋白）。以上研究结果表明SprA和SprT是C.hutchinsonii T9SS的重要组分,参与多数CTD蛋白的分泌、离子吸收、纤维素降解和菌体滑动。C.hutchinsonii T9SS其他组分及调控系统PorX-PorY的功能:为了进一步研究C.hutchinsonii T9SS的组成,我们鉴定到两个未知功能蛋白CHU2991和CHU3410 参与 CTD 蛋白 CHU0344 的分泌,为 C.hutchinsonii T9SS 组分。△2991不能利用纤维素利用,而且在软琼脂上的群体扩散能力部分缺陷,推测CHU2991影响了纤维素降解相关蛋白和部分运动相关蛋白的分泌。CHU2991是C.hutchinsonii中首个被发现部分参与群体扩散的T9SS组分,说明CHU 2991不是T9SS核心组分。CHU一3410是C.hutchinsonii中新发现的T9SS组分,在纤维素利用和运动方面均发挥着关键作用。研究发现CHU3410参与钙离子的胞内转运。△3410仅可在Ca2+含量丰富的培养基中生长。深入研究CHU3410的功能有助于阐明C.hutchinsonii的钙离子转运机制。另外我们研究了 T9SS调控系统PorX-PorY在C.hutchinsonii中的功能。研究发现敲除其编码基因后,突变株纤维素降解能力部分缺陷,菌落扩散能力正常,在钙离子和镁离子缺乏的培养基中无显着生长缺陷,说明PorX-PorY在C.hutchinsonii中未参与多种生理过程。T9SS核心编码基因敲除后,敲除株在PY6培养基中生长能力弱,这是一直以来难以获得△gldN,△sprA和△sprT等突变株的主要原因。我们通过改进T9SS敲除株的筛选条件,用富含钙离子和镁离子的PYT培养基,成功筛选到T9SS敲除株。本文首次发现C.hutchinsonii T9SS不仅参与纤维素降解和菌体滑动,还参与钙离子和镁离子的跨外膜转运,揭示了蛋白分泌系统和离子转运系统的密切联系。另外,本研究发现不同T9SS组分在蛋白分泌和离子吸收过程中发挥的作用不同。我们的研究结果表明T9SS在拟杆菌门中的功能多样性,可为其他细菌T9SS的研究提供了一些研究策略和方法。
朱必洋[6]（2020）在《基于酪蛋白磷酸肽和壳寡糖的三种新型钙递送体系组装、评价及体内活性研究》文中指出现有的各种膳食钙强化剂都存在溶解度和生物利用率受限等问题,开发载钙效率更高和促钙吸收效果更好的新型钙递送体系是解决上述问题的重要途径。已有研究尝试利用蛋白质和多糖等天然生物高聚物组装保护性载钙体系,在提高钙强化剂载钙能力的同时,以期控制其在机体内的钙释放速率。本文利用壳寡糖（COS）和酪蛋白磷酸肽（CPP）等天然原料组装了三种新型钙递送体系。借助Caco-2细胞模型、小鼠低钙膳食模型以及micro-CT断层扫描成像技术、凝胶电泳、波谱学、显微镜观察等手段,系统考察了三种钙递送体系的理化特性、形貌结构特征和分子间作用力,以及在体内外实现可控的钙释放、促进钙吸收和调节肠道微生物菌群的能力。主要研究结果如下:1 Amadori型和TGase型钙递送体系的制备基于Maillard反应和TGase催化反应两种分子交联方法,利用CPP和COS之间的糖基化反应,构建了两种不同组装模式的钙递送体系。Maillard反应的最佳条件为:CPP与COS质量比为0.6:1,p H 7.5,加热时间3 h,加热温度95°C,其钙载量相较于CPP单体提高了43.2%。TGase催化反应最佳条件为:CPP与COS质量比为1:1,温育时间2.5 h,加酶量12.5 U/g,其钙载量相较于CPP单体提高了59.3%。两种钙递送体系在制备过程中均具有较好的工艺操作性。2 Amadori型和TGase型钙递送体系的评价粒径和Zeta电位分析结果显示:利用两种糖基化反应制备的钙递送体系在微观尺寸上较CPP和COS单体均明显增大,但其溶液稳定性较CPP和COS单体并无明显变化。抑制磷酸钙结晶和胃肠道模拟消化等体外实验结果表明,两种钙递送体系均能有效抑制钙盐类的结晶沉淀,并可有效延长CPP-Ca在胃肠道环境中的降解时间。红外光谱分析结果显示,Amadori型COS-CPP由CPP的-NH2与COS乙酰基上的C=O形成Amadori连接;而TGase型COS-CPP则由CPP的谷氨酰胺残基作为酰基供体,COS中葡糖胺（Glc N）的-NH2作为酰基受体,形成共价键。原子力显微镜和扫描电镜分析图像显示,两种钙递送体系在微观结构上均为CPP-Ca提供了屏障保护作用。另外,细胞实验结果表明,两种钙递送体系均能促进Ca2+在Caco-2细胞中的跨膜转运和吸收。3 Amadori型和TGase型钙递送体系的体内活性研究利用低钙饲料小鼠模型研究上述两种钙递送体系体内促钙吸收活性,结果发现,小鼠持续饲喂Amadori型和TGase型钙递送聚合物8周后,其骨骼指标中最大应力（Maximum stress）和骨干重指数（Bone weight index）相较于模型组显着升高（P<0.05）,显示两种钙递送体系均能有效提高小鼠骨骼抵抗外力形变的能力和改善小鼠骨骼的矿化程度。从小鼠股骨骨小梁micro-CT断层扫描成像技术分析结果发现两种钙递送体系组的骨小梁分离度（Tb.Sp）、骨表面积/骨量（BS/BV）和骨小梁模式因子（Tb.Pf）相较于模型组均显着降低（P<0.05）,骨表面积密度（BS/TV）相较于模型组均显着提高（P<0.05）,表明两种钙递送体系均可显着提高小鼠骨骼的抗疲劳能力、降低其发生骨质疏松的风险。两种钙递送体系均能较好地维持回肠绒毛的结构完整性和正常的结构形态。另外,Amadori型和TGase型钙递送体系均能有效发挥益生元作用,调节宿主肠道内部微生物菌群的分布,促进小鼠盲肠内容物中双歧杆菌属（Bifidobacterium）和乳酸菌属（Lactobacillus）的生长繁殖,降低大肠杆菌属（Escherichia Coli）和产气荚膜梭菌（C.perfringens.）的相对丰度,还能促进丁酸等有益次级代谢产物的合成,维护肠道健康,且TGase型钙递送体系对大肠杆菌属和产气荚膜梭菌的抑制效果要优于Amadori型递送体系。4 COS/TPP离子交联型钙递送体系的制备、评价及体内缓释研究利用COS与三聚磷酸钠（TPP）之间的离子交联反应,成功组装了包载CPP-Ca的载钙递送微粒。载钙量分析和质构特性分析结果表明,COS/TPP交联型钙递送体系具有良好的抗形变能力,且在酸性环境中具有较高的稳定性,能满足在胃酸环境中缓慢崩解并释放Ca2+的要求。热力学稳定性分析和红外光谱分析结果表明,COS/TPP交联型钙递送体系的热稳定性较好,可作为合适的装载材料,且COS与TPP分子之间的交联位点是P-O键。通过荧光电镜和扫描电镜等手段从微观结构上观察到COS/TPP离子交联型网状结构中包埋了大量的CPP-Ca聚合物。通过体外模拟消化实验和短期大鼠钙吸收实验发现,COS/TPP交联型钙递送体系可有效延长CPP-Ca在消化液中的降解和释放时间,且可在大鼠消化道内实现持续稳定地钙释放,并促进Ca2+在小肠内的转运吸收。
陈庆华[7]（2020）在《PVC含氮有机热稳定剂的制备与应用研究》文中进行了进一步梳理众所周知,聚氯乙烯（PVC）是应用普遍、产量巨大的五大通用塑料之一。因为PVC自身的结构因素和结构缺陷致使其热稳定性很差,在加工成型中PVC往往需要加入热稳定剂以抑制其降解。随着人们对环保意识的增强和有关法律法规的实施,目前热稳定剂的研究和应用正朝着无毒、环保的方向发展。其中,有机稳定剂因其无毒环保的特性而备受关注。本文选取了6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶作为研究对象,通过控制反应温度、原料比、催化剂用量等因素,探讨合成工艺条件对6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶产率的影响,确定了6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶较佳的合成工艺条件。并通过熔点测试、傅里叶红外光谱、X射线衍射光谱等方法对产物进行结构表征。利用刚果红法、热老化法、热重分析法和转矩流变仪法等评价6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶对PVC的静态热稳定性和动态热稳定性的影响。结果表明,6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶的加入有助于改善PVC制品的变色程度,延长热稳定时间。6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶与硬脂酸锌（Zn St2）、硬脂酸钙（Ca St2）复配后热稳定性能更加优异。在此基础上,利用热重红外联用技术分析6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶在钙锌复合体系中对PVC的热稳定机理。数据显示,6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶具有置换PVC分子链中活泼氯原子的能力,可阻止共轭双键的形成,宏观上表现为改善PVC初期着色性,展现出了初期热稳定剂的特性。此外,6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶与Zn St2存在良好的协同热稳定效果,可以有效延缓自催化现象,这归因于6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶的杂环结构能络合Zn St2的副产物Zn Cl2。与长期热稳定剂Ca St2亦能各自弥补短板,在提高初期热稳定性的同时也延长了长期热稳定时间。采用TG-DTG热分析技术研究了6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶复配钙锌热稳定剂PVC的非等温热降解过程,通过建立动力学函数得到了PVC的热降解反应机理。结果表明,PVC存在两个降解阶段,第一个降解阶段由于发生了两次脱氯反应又可细分为两步,第二个降解阶段则因为反应过于复杂难以用数学模型描述。其中第一阶段中的第一步热降解的活化能为ES1=131.93 KJ?mol-1,热降解机理为随机成核和随后生长。第二步热降解的活化能为ES2=174.43 KJ?mol-1,热降解机理为三维扩散。将不同份数的6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶加入到钙锌体系PVC中,通过转矩流变仪、万能试验机、透明度测试考察PVC制品的加工性能、拉伸性能以及透明性能。结果表明,6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶使用份数越多,PVC的加工性能、拉伸性能以及透明性能越差。利用刚果红法和热老化法讨论6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶在PVC钙锌稳定剂体系中的影响。结果显示,6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶与钙锌比为4:1的钙锌复合稳定剂复配的热稳定性能最好,并且热稳定性随6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶用量的增大而增大。综合考虑,在钙锌体系中6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶的适宜用量建议在1～3 phr之间。针对6-氨基-1,3-二甲基脲嘧啶在长期稳定性不佳的缺陷,引入四羟甲基甘脲作为辅助稳定剂可以有效延长PVC制品的热稳定时间。
郭苗苗[8]（2020）在《VDR调控小鼠Cyp11a1基因表达影响睾丸间质细胞雄性激素合成》文中提出胆固醇侧链裂解酶（Cholesterol side-chain cleavage enzyme）属于细胞色素P450家族XIA亚族,简称为CYPXIA1,其基因为Cyp11a1。胆固醇侧链裂解酶定位于线粒体内膜,主要分子功能是催化胆固醇与孕烯醇酮（大多数类固醇激素的前体）的侧链裂解反应,故此基因高度表达于哺乳动物的肾上腺、睾丸、卵巢、子宫等组织。胆固醇侧链裂解酶是雄性激素睾酮合成途径中关键酶,睾丸间质细胞是睾酮分泌的主要场所。维生素D受体（Vitamin D Receptor,VDR）是一种核转录因子,属于类固醇激素/甲状腺激素受体超家族成员。VDR在睾丸间质细胞、支持细胞、精子等多种生殖细胞中广泛表达,表明其与雄性生殖间的密切关系。我们前期研究发现VDR缺失会降低Cyp11a1基因表达水平,且雄性小鼠生殖能力降低。基于此,我们推测VDR作为核转录因子调控Cyp11a1基因以及雄性激素合成的一些相关酶的表达水平,从而影响雄性激素的合成与分泌,最终影响雄性小鼠生殖能力。因此本课题以野生（WT）和VDR敲除(VDR-/-)小鼠睾丸转录组和蛋白质组分析结果为基础,检测Cyp11a1基因表达水平,应用蛋白质免疫印迹验证组学结果,采用细胞免疫荧光染色分析Cyp11a1基因在睾丸组织中的表达和定位;其次利用活性VD、VDR干扰或过表达处理后检测小鼠睾丸间质细胞（TM3细胞）的增殖、激素分泌水平指标确定VDR影响TM3细胞激素分泌;最后采用双荧光素酶报告系统,筛选Cyp11a1基因上游启动子区的潜在VDR结合元件（VDRE）。本课题揭示了VDR通过调控Cyp11a1基因表达影响雄性小鼠睾酮的合成,为VDR调控雄性生殖相关研究提供理论依据。本研究主要获得实验结果如下:1.分析比较WT与VDR-/-小鼠睾丸组织转录组及蛋白质组数据,Cyp11a1基因表达水平和蛋白质在敲除型小鼠中显着低于野生型。Cyp11a1基因主要高表达于肾上腺、睾丸,在心脏、皮肤等组织水平表达较低;VDR敲除后,Cyp11a1基因的表达变化趋势有组织差异性。2.活性VD3提高了小鼠TM3中VDR和Cyp11a1的表达水平,促进细胞增殖。过表达VDR基因亦能提高Cyp11a1基因表达水平,促进睾酮的合成和分泌。进一步说明VDR提高Cyp11a1基因表达量,促进睾丸激素分泌量,进而影响雄性小鼠生殖。3.利用生物信息学软件预测出Cyp11a1基因转录调控区的VDR应答元件（VDRE）,通过构建双荧光素酶报告系统,筛选出了潜在的VDRE区域,进一步验证了VDR调控Cyp11a1基因表达。
金鹿,娜美日嘎,孙海洲,桑丹,李胜利,张春华,张崇志,任晓萍,珊丹,凌树礼[9]（2020）在《钙离子跨膜吸收相关基因在内蒙古白绒山羊胃肠道中的差异表达》文中研究说明本试验旨在研究钙离子(Ca2+)跨膜吸收途径中的相关基因在内蒙古白绒山羊胃肠道中的表达差异分析。选用9只4月龄内蒙古白绒山羊断奶羔羊,屠宰后取瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠组织样品用于RNA提取,利用实时荧光定量PCR检测维生素D依赖性钙结合蛋白（CaBP-D9k）、瞬时性受体电位通道香草酸受体6（TRPV6）和维生素D受体（VDR）的mRNA表达量。结果表明:CaBP-D9k、TRPV6和VDR mRNA均在十二指肠中表达量最高,CaBP-D9k和TRPV6 mRNA与VDR mRNA分别在大肠内、胃内处于较低的表达水平;CaBP-D9k、TRPV6和VDR mRNA表达量随着小肠的延伸而逐渐降低。综合来看,CaBP-D9k、TRPV6和VDR mRNA表达量与胃肠道Ca2+跨膜吸收能力存在关联性。
徐慧慧[10]（2018）在《白念珠菌中与钙离子敏感性相关基因的鉴定和功能研究》文中进行了进一步梳理白念珠菌是常见的条件致病性真菌之一,自然界中以二倍体形式存在。由于钙信号转导途径在真菌应对环境胁迫中的重要作用,近年来对它的研究已成为热点。通过对2358个GRACE（Gene replacement and conditional expression）文库菌株的钙离子表型筛选,我们一共发现21个基因的缺失导致白念珠菌对高浓度的胞外钙离子敏感。这些基因的功能除了参与钙离子/钙调磷酸酯酶信号转导途径外,还与三羧酸循环、细胞壁完整性途径、细胞分裂和细胞内pH稳态相关。这些基因中的9个基因的失活导致的钙离子敏感性可以部分或完全被钙调磷酸酯酶抑制剂（环孢菌素A）所抑制。因此,这21个基因中接近一半的基因失活菌株的钙离子敏感性是由于钙调磷酸酯酶信号途径的激活引起的。为了通过RNA测序方法进一步研究Crz1调控的钙离子激活基因,我们通过CRISPR（Clusters of regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9手段,在CRZ1基因起始密码子ATG下游引入两个TAA终止密码子,提前终止Crz1蛋白的表达,成功构建了crz1/crz1失活突变菌株。通过对野生型菌株和crz1/crz1失活突变菌株在钙离子处理条件下的全基因组规模RNA测序,我们发现钙离子胁迫条件下,219个基因的表达受Crz1正调控,59个基因的表达受Crz1负调控。Karababa等人以前通过DNA芯片方法找到的钙离子激活Crz1正调控的65个基因中,有40个基因存在于我们发现的219个基因中。对这40个重叠基因的启动子序列进行分析,我们发现一个新的Crz1结合位点[GGAGGC（A/G）（C/G）（A/T）G],它的序列与Karababa等以前发现的白念珠菌Crz1结合位点[G（C/T）GGT]明显不同,但是和以前报道的酿酒酵母Crz1结合位点[GNGGC（G/T）CA]很相似。凝胶电泳迁移率变动分析（EMSA）结果表明,白念珠菌Crz1蛋白在体外均能专一性结合Crz1目标基因之一UTR2启动子上的两个Crz1结合位点,5’-G（-376）GGCT-3’和5’-T（-333）GAGGCGTTG-3’。染色质免疫共沉淀（ChIP）分析证实白念珠菌Crz1蛋白在体内可以结合包含这两个位点的UTR2启动子序列。前人研究发现白念珠菌中与细胞周期调控相关的蛋白激酶Hsl1,与我们实验室最近发现的细胞质膜上钙离子摄入的负调控因子Rch1蛋白一样,存在于白念珠菌的芽颈部位。有趣的是,我们的GRACE文库筛选结果表明HSL1基因与白念珠菌的钙离子敏感性相关。所以,本研究构建了hsl1/hsl1失活突变菌株,发现hsl1/hsl1失活突变株除了对钙离子敏感外,还对其他导致细胞壁和细胞膜胁迫的药物敏感。本论文的所有结果为我们深入和全面了解白念珠菌细胞内钙离子稳态的调控机理奠定了基础,同时为发现新的抗真菌药物靶标提供了重要线索。
二、大肠在钙吸收中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大肠在钙吸收中的作用（论文提纲范文）
（1）枯草芽孢杆菌对蛋鸡生产性能和骨代谢的影响及其机理研究（论文提纲范文）
| 本研究承以下项目资助 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1 笼养蛋鸡骨质疏松症 |
| 1.1 蛋鸡骨质疏松症症状及诱因 |
| 1.2 常用预防骨质疏松的措施 |
| 2 益生菌对蛋鸡的有益作用 |
| 2.1 益生菌的种类 |
| 2.2 益生菌对蛋鸡生产性能的影响 |
| 2.3 益生菌对肠道屏障功能的影响 |
| 2.4 益生菌对骨代谢疾病的影响 |
| 3 研究目的和意义 |
| 第2章 引言 |
| 第3章 枯草芽孢杆菌对蛋鸡生产性能和骨性能的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物与实验菌株 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物实验 |
| 2.2 样品采集 |
| 2.3 枯草芽孢杆菌定植效率测定 |
| 2.4 生产性能及蛋样品分析 |
| 2.5 血液样品分析 |
| 2.6 骨样品分析 |
| 2.7 矿物质含量分析 |
| 2.8 数据处理和分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 枯草芽孢杆菌的定植效率 |
| 3.2 生产性能和蛋品质分析 |
| 3.3 血液学分析结果 |
| 3.4 骨性能检测结果 |
| 3.5 矿物质含量分布 |
| 3.6 胫骨病理组织学检测结果 |
| 3.7 骨相对基因mRNA水平变化 |
| 3.8 骨性能与钙磷含量及免疫因子相关性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第4章 枯草芽孢杆菌对蛋鸡肠道组织结构、转录组和肠道菌群的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 主要溶液和试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物实验 |
| 2.2 样品采集 |
| 2.3 肠道pH值测定 |
| 2.4 肠病理组织学检查 |
| 2.5 十二指肠转录组测序 |
| 2.6 肠基因mRNA水平分析 |
| 2.7 LPS和 D-LA含量的测定 |
| 2.8 十二指肠中SOD、GSH-Px、和MDA含量的测定 |
| 2.9 盲肠微生物区系测序 |
| 2.10 数据处理和分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 肠pH值测定 |
| 3.2 肠病理组织学检测结果 |
| 3.3 肠紧密连接蛋白mRNA和 LPS、D-LA的测定结果 |
| 3.4 肠促炎因子测定结果 |
| 3.5 十二指肠转录组分析 |
| 3.6 SOD、GSH-Px和 MDA含量 |
| 3.7 盲肠微生物区系分析结果 |
| 3.8 差异菌与骨代谢、免疫因子和转录组相关性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 发表论文及参加会议 |
（2）桑树钙胁迫转录组和miRNA分析及相关基因功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究目的和意义 |
| 1.2 研究现状 |
| 1.2.1 植物中的钙感受器 |
| 1.2.2 病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术 |
| 1.2.3 转录组测序技术的研究 |
| 1.2.4 MicroRNA研究进展 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.3.1 桑树钙胁迫的生理生化指标测定、测序数据分析及差异基因的表达 |
| 1.3.2 桑树MYB转录因子MYB30基因的克隆及表达 |
| 1.3.3 桑树类钙调素CML37基因的克隆及功能验证 |
| 1.3.4 桑树miR156g瞬时转化过表达鉴定其功能 |
| 第2章 桑树钙胁迫测序数据分析、生理生化指标测定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 桑树钙胁迫下生理生化指标测定 |
| 2.1.2 桑树钙胁迫下转录组分析及差异基因鉴定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 桑树钙胁迫下生理生化指标分析 |
| 2.2.2 桑树钙胁迫下转录组数据分析及验证 |
| 2.2.3 桑树钙胁迫下smallRNA测序数据分析及验证 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 桑树MYB转录因子家族MYB30基因的克隆及表达 |
| 3.1 材料、仪器与试剂 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 缓冲液的配制 |
| 3.2 桑树MYB转录因子家族MYB30基因的克隆及分析 |
| 3.2.1 桑树钙胁迫处理 |
| 3.2.2 桑叶总RNA提取 |
| 3.2.3 反转录 |
| 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.2.5 桑树MYB30基因PCR引物设计 |
| 3.2.6 桑树MmMYB30基因cds区的克隆 |
| 3.2.7 桑树MmMYB30基因的cds区生物信息分析 |
| 3.2.8 桑树MmMYB30基因的原核表达 |
| 3.2.9 桑树MmMYB30基因钙胁迫下的定量分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 桑树MmMYB30基因的克隆验证 |
| 3.3.2 桑树MmMYB30基因cds区的分析 |
| 3.3.3 桑树MmMYB30基因编码的氨基酸同源性及进化树分析 |
| 3.3.4 桑树MmMYB30基因在不同钙浓度下的表达鉴定 |
| 3.3.5 桑树MmMYB30基因的诱导及原核表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 桑树类钙调素蛋白CML37基因的克隆及功能鉴定 |
| 4.1 材料、仪器与试剂 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 试剂的配制 |
| 4.2 桑树类钙调素蛋白MmCML37基因的克隆及功能验证 |
| 4.2.1 桑树钙胁迫处理 |
| 4.2.2 桑叶样本总RNA提取 |
| 4.2.3 反转录 |
| 4.2.4 大肠杆菌感受态制备 |
| 4.2.5 桑树MmCML37基因扩增引物设计 |
| 4.2.6 桑树MmCML37基因cds区克隆验证 |
| 4.2.7 桑树MmCML37基因生物信息分析 |
| 4.2.8 桑树MmCML37基因钙胁迫下定量分析 |
| 4.3 桑树MmCML37基因功能鉴定 |
| 4.3.1 桑苗的培养 |
| 4.3.2 桑叶总RNA提取及c DNA反转录 |
| 4.3.3 VIGS沉默体系建立 |
| 4.3.4 桑树MmCML37的VIGS体系建立 |
| 4.3.5 桑树MmCML37基因沉默后的表达水平鉴定 |
| 4.3.6 桑树MmCML37基因沉默后钙胁迫下的生理生化指标测定 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 桑树MmCML37基因的克隆验证 |
| 4.4.2 桑树MmCML37基因cds区分析 |
| 4.4.3 桑树MmCML37基因的同源性及亲缘关系分析 |
| 4.4.4 MmCML37基因在钙胁迫下的表达鉴定 |
| 4.4.5 重组病毒载体p TRV2-MmCML37的构建 |
| 4.4.6 桑树MmCML37基因沉默后在钙胁迫下的表达鉴定 |
| 4.4.7 桑树MmCML37基因沉默后在钙胁迫下的生理生化指标鉴定 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 桑树miR156g瞬时转化过表达鉴定其钙胁迫应答功能 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 缓冲液配制 |
| 5.1.5 引物设计 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 桑苗种植 |
| 5.2.2 桑叶DNA提取 |
| 5.2.3 桑树miR156g的前体序列分析、克隆及靶基因鉴定 |
| 5.2.4 构建miR156g过表达的载体 |
| 5.2.5 农杆菌转化 |
| 5.2.6 桑树miR156g对应靶基因的荧光定量检测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 桑树miR156g前体序列克隆 |
| 5.3.2 桑树过表达载体构建验证 |
| 5.3.3 miR156g在不同钙胁迫下的表达水平 |
| 5.3.4 桑树miR156g过表达对其靶基因表达水平鉴定 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）ε-聚赖氨酸—乳清蛋白复合物的构建、抑菌机理及其分子动力学模拟的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 食品的腐败及其控制 |
| 1.1.1 食品腐败的概述 |
| 1.1.2 食品腐败的主要微生物 |
| 1.1.3 食品腐败的影响因素 |
| 1.1.4 食品腐败微生物的检测方法 |
| 1.1.5 食品的防腐和防腐剂 |
| 1.2 ε-聚赖氨酸的性质和应用 |
| 1.2.1 ε-聚赖氨酸的发现和生产 |
| 1.2.2 ε-聚赖氨酸的结构和性质 |
| 1.2.3 ε-聚赖氨酸的抗菌活性和机理 |
| 1.2.4 ε-聚赖氨酸的安全性 |
| 1.2.5 ε-聚赖氨酸在食品中的应用 |
| 1.3 乳清蛋白的性质和应用 |
| 1.3.1 乳清蛋白的结构和性质 |
| 1.3.2 乳清蛋白的生物学功能 |
| 1.3.3 乳清蛋白的食品特性 |
| 1.3.4 乳清蛋白在食品工业中的应用 |
| 1.4 ε-聚赖氨酸和乳清蛋白的相互作用 |
| 1.4.1 ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用的理论研究 |
| 1.4.2 ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用的影响因素 |
| 1.4.3 ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用的经典研究方法 |
| 1.4.4 ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用的分子动力学模拟方法 |
| 1.5 本课题的研究意义和研究主要内容 |
| 1.5.1 课题的研究意义 |
| 1.5.2 课题的研究内容及技术路线 |
| 第2章 ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物体系理化性质的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相关溶液的制备 |
| 2.4.2 ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用体系的研究变量 |
| 2.4.3 体系浊度的测定 |
| 2.4.4 体系粒径和Zeta电位的测定 |
| 2.4.5 体系稳定性的测定 |
| 2.4.6 数据处理 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 不同乳清蛋白浓度对ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物的影响 |
| 2.5.2 不同R_(PL-WP)对ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物的影响 |
| 2.5.3 不同pH对ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物的影响 |
| 2.5.4 不同离子浓度对ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物的影响 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用及其复合物结构特性的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.3 实验仪器 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相关溶液的制备 |
| 3.4.2 ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用体系的荧光光谱测定 |
| 3.4.3 ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用体系的紫外光谱测定 |
| 3.4.4 ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用体系的红外光谱测定 |
| 3.4.5 ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物表面形态结构的测定 |
| 3.4.6 ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物凝胶温度的测定 |
| 3.4.7 ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物凝胶质构特性的测定 |
| 3.4.8 数据处理 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 3.5.1 ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用体系的荧光光谱分析 |
| 3.5.2 ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用体系的紫外光谱分析 |
| 3.5.3 ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用体系的红外光谱分析 |
| 3.5.4 ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物表面形态结构的分析 |
| 3.5.5 ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物凝胶温度的分析 |
| 3.5.6 ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物凝胶质构特性的分析 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用的分子动力学模拟研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 分子数据及模型 |
| 4.2.2 分子动力学模拟 |
| 4.2.3 结合自由能计算 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 体系RMSD值的分析 |
| 4.3.2 相互作用3D和2D模型的示意图 |
| 4.3.3 相互作用对乳清蛋白二级结构的影响 |
| 4.3.4 体系氢键和离子对的分析 |
| 4.3.5 疏水作用 |
| 4.3.6 相互作用结合自由能 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物抑菌效果的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.3 实验仪器 |
| 5.4 实验方法 |
| 5.4.1 ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物溶液的制备 |
| 5.4.2 菌悬液的制备 |
| 5.4.3 抑菌圈的测定 |
| 5.4.4 最小抑菌浓度(MIC)的测定 |
| 5.4.5 最小杀菌浓度(MBC)的测定 |
| 5.4.6 动态杀菌曲线的测定 |
| 5.4.7 细菌表面Zeta电位的测定 |
| 5.4.8 细菌表面形态的测定 |
| 5.4.9 复合物在冷鲜肉中的应用 |
| 5.5 结果与讨论 |
| 5.5.1 复合物抑菌圈的分析 |
| 5.5.2 复合物MIC的分析 |
| 5.5.3 复合物MBC的分析 |
| 5.5.4 复合物杀菌动力学的分析 |
| 5.5.5 复合物对细菌表面Zeta电位的影响 |
| 5.5.6 复合物对细菌表面形态的影响 |
| 5.5.7 复合物在冷鲜肉中抑菌效果的分析 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物抑菌机理的分子动力学模拟研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 单层模模型 |
| 6.2.2 双层模模型 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 单层膜抑菌3D和2D模型示意图 |
| 6.3.2 单层膜体系组分的密度分布曲线 |
| 6.3.3 单层膜体系相互作用的分析 |
| 6.3.4 单层膜结构性质的影响 |
| 6.3.5 双层膜抑菌3D模型示意图 |
| 6.3.6 双层膜体系Z轴电势差的分析 |
| 6.3.7 双层膜体系组分的密度分布曲线 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 总结与展望 |
| 7.1 主要研究结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）基于CaSR及Wnt/β-catenin信号通路的鸭蛋蛋清肽促钙吸收及促骨合成活性及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 钙敏感受体的研究进展 |
| 1.1 CaSR功能 |
| 1.1.1 钙调组织 |
| 1.1.2 非钙调组织 |
| 1.2 CaSR结构 |
| 1.3 CaSR配体 |
| 1.3.1 Ⅰ型配体 |
| 1.3.2 Ⅱ型配体 |
| 2 骨质疏松症的研究进展 |
| 2.1 危险因素 |
| 2.1.1 年龄 |
| 2.1.2 饮食模式 |
| 2.1.3 营养素摄入 |
| 2.1.4 生活方式 |
| 2.1.5 继发性原因与遗传因素 |
| 2.2 骨质疏松症的预防与治疗 |
| 2.2.1 药物治疗 |
| 2.2.2 非药物干预 |
| 2.3 骨代谢信号通路 |
| 2.3.1 OPG/RANKL/RANK |
| 2.3.2 BMP/Smad |
| 2.3.3 Wnt/β-catenin |
| 2.4 生物活性肽与骨质疏松症 |
| 2.4.1 乳源肽 |
| 2.4.2 胶原肽 |
| 2.4.3 其他来源 |
| 3 本课题的研究目的与意义 |
| 4 本课题的研究内容 |
| 5 本课题的创新点 |
| 第二章 正构调节钙敏感受体鸭蛋蛋清肽的筛选与鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 DPs的分离纯化 |
| 2.3 可溶性钙结合量测定 |
| 2.4 高活性级份DPs的 RP-HPLC分析 |
| 2.5 高活性级份DPs的 HPLC-ESI/MS/MS分析 |
| 2.6 质谱解析 |
| 2.7 分子对接虚拟筛选 |
| 2.7.1 配体准备 |
| 2.7.2 受体蛋白准备 |
| 2.7.3 分子对接计算 |
| 2.8 大鼠在体小肠单向灌流实验方法 |
| 2.8.1 实验溶液和试验药物的配制 |
| 2.8.2 大鼠在体小肠单向灌流法 |
| 2.8.3 大鼠血清中甲状旁腺激素(PTH)检测 |
| 2.8.4 小肠钙吸收百分比、吸收速率常数(Ka)和有效渗透系数(Peff)计算公式 |
| 2.8.5 十二指肠CaSR基因检测 |
| 2.9 数据统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭蛋蛋清肽的分离纯化 |
| 3.2 鸭蛋蛋清肽的RP-HPLC分析 |
| 3.3 鸭蛋蛋清肽的质谱鉴定 |
| 3.4 分子对接虚拟筛选 |
| 3.5 六种含芳香族氨基酸小肽对大鼠肠钙吸收的影响 |
| 3.6 CaSR抑制剂对六种寡肽促肠钙吸收作用的影响 |
| 3.7 CaSR抑制剂对六种寡肽引起血清中PTH水平改变的影响 |
| 3.8 六种寡肽与CaSR抑制剂对大鼠十二指肠CaSR基因表达的影响 |
| 3.9 NFE、INSW与 CaSR蛋白分子对接 |
| 4 讨论 |
| 4.1 生物活性肽的活性预测 |
| 4.2 在体小肠单向灌流法 |
| 4.3 鸭蛋蛋清肽与钙敏感受体的作用 |
| 5 本章小节 |
| 第三章 DPS对 MC3T3-E1 增殖、分化和矿化的影响及相关机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞复苏 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞增殖的影响 |
| 2.2.4 MC3T3-E1细胞周期测定 |
| 2.2.5 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞分化和矿化的影响 |
| 2.2.6 MC3T3-E1细胞中相关蛋白的测定 |
| 2.2.7 MC3T3-E1 细胞中Ca~(2+)的测定 |
| 2.3 数据统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞增殖的影响 |
| 3.2 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞周期的影响 |
| 3.3 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞分化的影响 |
| 3.4 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞矿化的影响 |
| 3.5 鸭蛋蛋清肽对Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 3.6 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞内钙离子浓度的影响 |
| 3.7 鸭蛋蛋清肽促MC3T3-E1细胞“外钙内流”的机理探究 |
| 3.8 VSEE促 MC3T3-E1 细胞分化、矿化的构效关系研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸭蛋蛋清肽与Wnt/β-catenin信号通路的作用 |
| 4.2 钙振荡与骨形成 |
| 5 本章小节 |
| 第四章 VSEE体内外消化、吸收和代谢研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 VSEE体外稳定性研究 |
| 2.2.1 VSEE的温度稳定性 |
| 2.2.2 VSEE的 pH稳定性 |
| 2.2.3 VSEE的体外消化稳定性 |
| 2.2.4 RP-HPLC分析 |
| 2.3 Caco-2/HT-29 细胞共培养模型建立 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 VSEE对 Caco-2和HT-29 细胞的毒性作用 |
| 2.3.3 Caco-2/HT-29 共培养模型建立 |
| 2.3.4 细胞跨膜电阻测定 |
| 2.3.5 阿尔新蓝染色 |
| 2.3.6 药物转运 |
| 2.4 VSEE在大鼠体内的药物代谢动力学试验 |
| 2.4.1 VSEE在大鼠血浆中HPLC分析方法的建立 |
| 2.4.4 药物代谢动力学检测及相关参数 |
| 2.4.5 VionIMS QTOF MS/MS验证 |
| 2.5 数据统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 VSEE体外稳定性研究 |
| 3.1.1 温度对VSEE稳定性的影响 |
| 3.1.2 pH对 VSEE稳定性的影响 |
| 3.1.3 体外消化酶对VSEE稳定性的影响 |
| 3.2 Caco-2/HT-29 细胞共培养模型的建立与评价 |
| 3.2.1 共培养细胞单层跨膜电阻值(TEER) |
| 3.2.2 阿尔新蓝染色实验 |
| 3.3 VSEE转运吸收及相关机理研究 |
| 3.3.1 不同转运时间对VSEE转运吸收的影响 |
| 3.3.2 不同浓度的VSEE对转运吸收的影响 |
| 3.3.3 VSEE转运吸收的机理探究 |
| 3.4 VSEE在大鼠体内的药物代谢动力学研究 |
| 3.4.1 VSEE在大鼠血浆中HPLC分析方法的建立 |
| 3.4.2 药物代谢动力学检测及相关参数 |
| 3.4.3 Vion IMS QTOF MS/MS验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 VSEE的结构与消化稳定性的关系 |
| 4.2 VSEE的结构与肠道吸收的关系 |
| 4.3 VSEE的药代动力学特点 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 鸭蛋蛋清肽对去势大鼠骨质疏松及脂质代谢紊乱的干预作用及机理研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 去势大鼠骨质疏松模型实验方法 |
| 2.2.1 动物分组与给药 |
| 2.2.2 血清指标测定 |
| 2.2.3 骨生物力学指标、骨干重指数、骨钙含量测定 |
| 2.2.4 MicroCT分析 |
| 2.2.5 小肠、脂肪和肝脏的组织学观察 |
| 2.2.6 骨组织、小肠相关蛋白的测定 |
| 2.2.7 盲肠内容物中微生物分析 |
| 2.3 数据统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭蛋蛋清肽对去势大鼠骨质疏松的干预作用及相关机理研究 |
| 3.1.1 血清ALP、OCN、β-CTX和PINP分析 |
| 3.1.2 各组大鼠骨干重指数、骨钙含量 |
| 3.1.3 各组大鼠骨生物力学指标分析 |
| 3.1.4 大鼠股骨Micro-CT分析 |
| 3.1.5 Wnt/β-catenin通路相关蛋白分析 |
| 3.1.6 各组大鼠小肠绒毛面积、紧密连接蛋白分析 |
| 3.1.7 盲肠微生物16SrRNA的测序分析 |
| 3.2 鸭蛋蛋清肽对去势大鼠脂代谢紊乱的干预作用 |
| 3.2.1 各组大鼠体重、皮下脂肪、腹腔脂肪 |
| 3.2.2 各组大鼠血清中TC,TG,LDL-C和 HDL-C分析 |
| 3.2.3 各组大鼠脂肪HE染色和肝脏油红O染色分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 雌激素缺乏与骨质疏松症 |
| 4.2 雌激素缺乏与脂质代谢 |
| 4.3 脂质代谢紊乱与骨质疏松症 |
| 4.4 肠道屏障与骨质疏松症 |
| 4.5 肠道微生物与骨质疏松症 |
| 5 本章小节 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1.主要结论 |
| 2.展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（5）哈氏噬纤维菌Ⅸ型分泌系统的组成及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词表 |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 纤维素资源的开发和利用 |
| 1.2 木质纤维素的结构 |
| 1.3 纤维素降解微生物 |
| 1.4 纤维素降解酶 |
| 1.5 纤维素降解协同因子 |
| 1.6 微生物降解纤维素的策略 |
| 1.6.1 游离纤维素酶系协同机制 |
| 1.6.2 纤维小体机制 |
| 1.6.3 第三种降解机制 |
| 1.7 细菌的运动 |
| 1.7.1 细菌运动的分类 |
| 1.7.2 Myxococcus xanthus的运动模式 |
| 1.7.3 Flavobacterium johnsoniae的运动模式 |
| 1.8 细菌的蛋白分泌系统 |
| 1.8.1 跨内膜和外膜的蛋白分泌系统 |
| 1.8.2 跨外膜的蛋白分泌系统 |
| 1.8.3 IX型分泌系统(T9SS) |
| 1.9 细菌的离子转运机制 |
| 1.10 Cytophaga hutchinsonii的研究背景 |
| 1.10.1 C.hutchinsonii的系统发育和特征 |
| 1.10.2 C. hutchinsonii的研究进展 |
| 1.11 论文的立题依据与研究内容 |
| 第二章 C.hutchinsonii T9SS核心组分GldN的功能研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 主要试剂和仪器 |
| 2.1.4 培养基和缓冲液 |
| 2.1.5 分子生物学反应体系和操作 |
| 2.1.6 E.coli感受态制备及热激转化 |
| 2.1.7 C.hutchinsonii感受态的制备及电击转化 |
| 2.1.8 再生无定形纤维素(RAC)的制备 |
| 2.1.9 蛋白的生物信息学分析 |
| 2.1.10 chu_0174和chu_2807的敲除 |
| 2.1.11 突变株的回补 |
| 2.1.12 C.hutchinsonii生长曲线测定 |
| 2.1.13 蛋白质浓度的测定(考马斯亮蓝法) |
| 2.1.14 C.hutchinsonii滤纸降解分析 |
| 2.1.15 C.hutchinsonii内切纤维素酶活测定 |
| 2.1.16 C.hutchinsonii的纤维素吸附 |
| 2.1.17 扫描电镜观察菌体在滤纸纤维上的排列 |
| 2.1.18 C. hutchinsonii菌体在PY2T软、硬琼脂表面的运动 |
| 2.1.19 C.hutchinsonii单个细胞在玻璃表面的运动 |
| 2.1.20 胞外蛋白,外膜蛋白,周质空间蛋白和全膜蛋白的提取 |
| 2.1.21 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 2.1.22 蛋白免疫印迹实验(Western blot) |
| 2.1.23 RT-PCR和RT-qPCR |
| 2.1.24 ICP检测胞内钙离子和镁离子浓度 |
| 2.1.25 C. hutchinsonii细胞表面T9SS底物蛋白的检测 |
| 2.1.26 CHU_0174和CHU_0171的异源表达 |
| 2.1.27 目的蛋白的诱导表达和纯化 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 CHU_0171-CHU_0174的生物信息学分析 |
| 2.2.2 gldN的敲除 |
| 2.2.3 GldN参与CTD蛋白CHU_0344的分泌 |
| 2.2.4 GldN参与纤维素降解 |
| 2.2.5 △gldN的纤维素吸附能力分析 |
| 2.2.6 △gldN的运动能力分析 |
| 2.2.7 GldN参与CHU_3220的分泌 |
| 2.2.8 ΔgldN中degQ的转录水平显着升高 |
| 2.2.9 GldN参与钙离子和镁离子的吸收 |
| 2.2.10 gldN的敲除对外膜蛋白谱的影响 |
| 2.2.11 CHU_2807参与钙离子和镁离子的吸收 |
| 2.2.12 GldN对细胞表面CTD蛋白分泌的影响 |
| 2.2.13 GldN的亚细胞定位 |
| 2.2.14 GldN与GldK相互作用 |
| 2.2.15 GldN的三维结构预测 |
| 2.2.16 钙离子结合蛋白的预测 |
| 2.3 讨论与小结 |
| 第三章 C. hutchinsonii T9SS重要组分SprA和SprT的功能研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 菌种 |
| 3.1.2 引物 |
| 3.1.3 主要试剂和仪器 |
| 3.1.4 培养基和缓冲液 |
| 3.1.5 分子生物学反应体系和操作 |
| 3.1.6 E.coli感受态制备及热激转化 |
| 3.1.7 C.hutchinsonii感受态的制备及电击转化 |
| 3.1.8 再生无定形纤维素(RAC)的制备 |
| 3.1.9 蛋白的生物信息学分析 |
| 3.1.10 chu_0029和chu_2709的敲除 |
| 3.1.11 突变株的回补 |
| 3.1.12 C.hutchinsonii生长曲线的测定 |
| 3.1.13 蛋白浓度的测定(考马斯亮蓝法) |
| 3.1.14 C.hutchinsonii滤纸降解分析 |
| 3.1.15 C.hutchinsonii纤维素酶活测定 |
| 3.1.16 C.hutchinsonii纤维素吸附实验 |
| 3.1.17 扫描电镜观察菌体在滤纸纤维上的分布 |
| 3.1.18 C.hutchinsonii菌体在PY2T软、硬琼脂表面的扩散 |
| 3.1.19 C.hutchinsonii单个细胞在玻璃表面的运动 |
| 3.1.20 胞外蛋白,外膜蛋白,周质空间蛋白的提取 |
| 3.1.21 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 3.1.22 蛋白免疫印迹(Western blot) |
| 3.1.23 RT-PCR和RT-qPCR |
| 3.1.24 C.hutchinsonii细胞表面T9SS底物蛋白的检测 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 SprA和SprT的生物信息学分析 |
| 3.2.2 sprA和sprT的敲除 |
| 3.2.3 △sprA和AsprT的生长曲线 |
| 3.2.4 △sprA和AsprT降解纤维素缺陷 |
| 3.2.5 △sprA和△sprT的内切纤维素酶活和纤维素吸附能力分析 |
| 3.2.6 △sprA和△sprT的运动能力缺陷 |
| 3.2.7 SprA和SprT参与CHU_0344的分泌 |
| 3.2.8 SprA和SprT影响了CHU_1336的分泌和degQ的表达 |
| 3.2.9 △sprA和△sprT的外膜蛋白谱变化 |
| 3.2.10 SprA和SprT对细胞表面CTD蛋白分泌的影响 |
| 3.2.11 SprA和SprT的三维结构 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 第四章 C. hutchinsonii T9SS其他组分及调控系统PorX-PorY的功能 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 菌种 |
| 4.1.2 引物 |
| 4.1.3 主要试剂和仪器 |
| 4.1.4 培养基和缓冲液 |
| 4.1.5 分子生物学反应体系和操作 |
| 4.1.6 E.coli感受态制备及热激转化 |
| 4.1.7 C.hutchinsonii感受态的制备及电击转化 |
| 4.1.8 蛋白的生物信息学分析 |
| 4.1.9 基因的敲除 |
| 4.1.10 突变株的回补 |
| 4.1.11 C.hutchinsonii滤纸降解实验 |
| 4.1.12 C.hutchinsonii纤维素吸附实验 |
| 4.1.13 C.hutchinsonii菌体在PY2T软琼脂上的扩散 |
| 4.1.14 C.hutchinsonii生长曲线的测定 |
| 4.1.15 胞外蛋白,外膜蛋白,周质空间蛋白的提取 |
| 4.1.16 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 4.1.17 蛋白免疫印迹(Western blot) |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 生物信息学分析 |
| 4.2.2 △2991和△3410的滤纸降解能力 |
| 4.2.3 △2991和Δ3410的纤维素吸附率 |
| 4.2.4 △2991和△3410的运动能力 |
| 4.2.5 △2991和△3410的生长曲线 |
| 4.2.6 △2991和△3410的胞外蛋白谱 |
| 4.2.7 △2991和△3410中CHU 0344的定位 |
| 4.2.8 △2991和△3410的外膜蛋白谱 |
| 4.2.9 CHU_2991的三维结构预测 |
| 4.2.10 CHU_3410的三维结构预测 |
| 4.2.11 △porX和△porY的表型 |
| 4.3 讨论与小结 |
| 4.3.1 CHU_2991 (PorQ)的功能 |
| 4.3.2 CHU_3410的功能 |
| 4.3.3 PorX-PorY的功能 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表学术论文 |
| 致谢 |
| 博士学位论文评阅人及答辩委员会组成成员 |
（6）基于酪蛋白磷酸肽和壳寡糖的三种新型钙递送体系组装、评价及体内活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 钙吸收与补钙剂 |
| 1.1.1 钙吸收及其机制 |
| 1.1.2 补钙剂的研究现状 |
| 1.2 酪蛋白磷酸肽(CPP) |
| 1.2.1 CPP的组成及结构 |
| 1.2.2 CPP的功能活性及应用 |
| 1.2.2.1 抗氧化活性 |
| 1.2.2.2 免疫调节作用 |
| 1.2.2.3 促进矿物质吸收 |
| 1.3 壳寡糖(COS) |
| 1.3.1 COS的组成及结构 |
| 1.3.2 COS的功能活性及应用 |
| 1.3.2.1 益生元活性 |
| 1.3.2.2 抗菌活性 |
| 1.3.2.3 抗炎活性 |
| 1.3.2.4 抗氧化活性 |
| 1.3.2.5 药物递送载体 |
| 1.4 蛋白质-多糖递送体系的研究进展 |
| 1.4.1 基于美拉德反应的蛋白质糖基化修饰 |
| 1.4.2 基于转谷氨酰胺酶催化的蛋白质糖基化修饰 |
| 1.4.3 基于离子交联作用的壳寡糖微胶囊的制备 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 1.6 研究的创新点 |
| 第二章 Amadori型和TGase型钙递送体系的制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.1.4.1 组装Amadori型 COS-CPP-Ca递送体系单因素实验 |
| 2.1.4.2 组装Amadori型 COS-CPP-Ca递送体系正交优化 |
| 2.1.4.3 组装TGase型 COS-CPP-Ca递送体系单因素实验 |
| 2.1.4.4 组装TGase型 COS-CPP-Ca递送体系正交优化 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 组装Amadori型 COS-CPP-Ca递送体系单因素结果分析 |
| 2.2.1.1 CPP:COS质量比对钙结合量的影响 |
| 2.2.1.2 pH值对钙结合量的影响 |
| 2.2.1.3 加热时间对钙结合量的影响 |
| 2.2.1.4 加热温度对钙结合量的影响 |
| 2.2.2 组装Amadori型 COS-CPP-Ca递送体系正交结果分析 |
| 2.2.3 组装TGase型 COS-CPP-Ca递送体系单因素结果分析 |
| 2.2.3.1 CPP: COS质量比对体系钙结合量的影响 |
| 2.2.3.2 加酶量对体系钙结合量的影响 |
| 2.2.3.3 反应时间对钙结合量的影响 |
| 2.2.4 组装TGase型 COS-CPP-Ca递送体系正交结果分析 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 Amadori型和TGase型钙递送体系的评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验原料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.1.4.1 粒径分析 |
| 3.1.4.2 Zeta电位分析 |
| 3.1.4.3 抑制磷酸钙结晶实验 |
| 3.1.4.4 胃肠道模拟消化实验 |
| 3.1.4.5 红外光谱分析 |
| 3.1.4.6 原子力显微镜分析 |
| 3.1.4.7 扫描电镜分析 |
| 3.1.4.8 Caco-2细胞模型 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 粒径分析结果 |
| 3.2.2 Zeta电位分析结果 |
| 3.2.3 抑制磷酸钙结晶实验结果 |
| 3.2.4 胃肠道模拟消化实验结果 |
| 3.2.5 红外光谱分析结果 |
| 3.2.6 原子力显微镜分析结果 |
| 3.2.7 扫描电镜分析结果 |
| 3.2.8 Caco-2细胞模型实验结果 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 Amadori型和TGase型钙递送体系的体内活性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验原料 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 实验方法 |
| 4.1.5.1 饲料配方 |
| 4.1.5.2 小鼠饲养及给药 |
| 4.1.5.3 血清指标 |
| 4.1.5.4 骨骼指标 |
| 4.1.5.5 肠道组织学指标 |
| 4.1.5.6 肠道微生物分析 |
| 4.1.5.7 丁酸含量分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 血清指标结果 |
| 4.2.2 骨骼指标结果 |
| 4.2.3 肠道组织学观察结果 |
| 4.2.4 肠道微生物分析结果 |
| 4.2.5 丁酸含量分析结果 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 COS/TPP离子交联型钙递送体系的制备、评价及体内缓释研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验原料 |
| 5.1.2 实验动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 实验方法 |
| 5.1.5.1 质子滴定实验 |
| 5.1.5.2 离子交联型微粒体系的组装 |
| 5.1.5.3 pH值对递送体系稳定性的影响 |
| 5.1.5.4 热力学稳定性分析 |
| 5.1.5.5 红外光谱分析 |
| 5.1.5.6 X-ray衍射分析 |
| 5.1.5.7 荧光显微镜分析 |
| 5.1.5.8 扫描电镜分析 |
| 5.1.5.9 胃肠道模拟消化实验 |
| 5.1.5.10 大鼠钙吸收实验 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 质子滴定实验结果 |
| 5.2.2 微粒体系的组装条件分析 |
| 5.2.3 pH值对递送体系稳定性的影响 |
| 5.2.4 热力学稳定性分析结果 |
| 5.2.5 红外光谱分析结果 |
| 5.2.6 X-ray衍射分析结果 |
| 5.2.7 微观结构分析结果 |
| 5.2.8 胃肠道模拟消化实验结果 |
| 5.2.9 大鼠钙吸收实验结果 |
| 5.3 小结 |
| 第六章 讨论 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）PVC含氮有机热稳定剂的制备与应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 PVC概述 |
| 1.2 PVC的降解 |
| 1.2.1 PVC的缺陷结构 |
| 1.2.2 PVC热降解机理 |
| 1.3 PVC的热稳定机制 |
| 1.4 PVC热稳定剂 |
| 1.4.1 铅盐类热稳定剂 |
| 1.4.2 金属皂类热稳定剂 |
| 1.4.3 有机锡类热稳定剂 |
| 1.4.4 稀土类热稳定剂 |
| 1.4.5 有机热稳定剂 |
| 1.5 有机稳定剂的发展现状及研究进展 |
| 1.6 选题目的和意义 |
| 1.7 研究内容 |
| 1.8 创新点 |
| 第二章 ADMU的制备及表征 |
| 2.1 实验部分 |
| 2.1.1 主要原料及试剂 |
| 2.1.2 实验仪器及设备 |
| 2.1.3 ADMU的合成 |
| 2.1.4 表征方法 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 反应温度对产率的影响 |
| 2.2.2 投料摩尔比对产率的影响 |
| 2.2.3 催化剂用量对产率的影响 |
| 2.2.4 ADMU的结构表征 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 ADMU在 PVC热稳定剂中的应用 |
| 3.1 实验部分 |
| 3.1.1 主要实验药品和试剂 |
| 3.1.2 实验仪器和设备 |
| 3.1.3 制备PVC样品 |
| 3.1.4 热稳定性能评价方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 刚果红法 |
| 3.2.2 热老化法 |
| 3.2.3 热重分析法 |
| 3.2.4 转矩流变仪法 |
| 3.2.5 热稳定机理探讨 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 ADMU/PVC的热降解动力学研究 |
| 4.1 实验部分 |
| 4.1.1 主要实验药品和试剂 |
| 4.1.2 实验仪器和设备 |
| 4.1.3 制备PVC样品 |
| 4.1.4 热失重分析法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 热降解动力学分析 |
| 4.2.2 热降解最概然机理的判定 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 PVC复合稳定剂的应用研究 |
| 5.1 实验部分 |
| 5.1.1 主要实验药品和试剂 |
| 5.1.2 实验仪器及设备 |
| 5.1.3 材料性能评价方法 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 ADMU对材料加工性能的影响 |
| 5.2.2 ADMU对材料力学性能的影响 |
| 5.2.3 ADMU对材料透明性能的影响 |
| 5.2.4 ADMU复合体系中的钙锌比讨论 |
| 5.2.5 ADMU在钙锌体系中的用量讨论 |
| 5.2.6 ADMU与 SGN在钙锌体系中的协同作用 |
| 5.3 本章小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间(待)发表论文 |
| 致谢 |
（8）VDR调控小鼠Cyp11a1基因表达影响睾丸间质细胞雄性激素合成（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 维生素D与维生素D受体 |
| 1.1.1 维生素D |
| 1.1.2 维生素D受体 |
| 1.2 胆固醇侧链裂解酶与性激素合成 |
| 1.2.1 Cyp11a1基因 |
| 1.2.2 睾丸间质细胞 |
| 1.2.3 性激素睾酮的合成及生理作用 |
| 1.3 VD/VDR与雄性生殖 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第2章 Cyp11a1基因的表达特性 |
| 2.1 实验材料与设备 |
| 2.1.1 实验材料及试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 qPCR检测基因表达 |
| 2.2.2 Western Blot检测蛋白表达 |
| 2.2.3 睾丸组织CYP11A1蛋白免疫组化染色 |
| 2.2.4 睾丸细胞系免疫荧光染色 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 野生鼠与VDR敲除鼠睾丸组织中Cyp11a1表达差异分析 |
| 2.3.2 Cyp11a1不同组织表达差异 |
| 2.3.3 CYP11A1蛋白在小鼠睾丸组织中的表达与定位 |
| 2.3.4 睾丸不同细胞系中CYP11A1的表达与定位 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 VD/VDR对 TM3细胞增殖及性激素的影响 |
| 3.1 实验材料与设备 |
| 3.1.1 主要材料及试剂 |
| 3.1.2 主要设备及仪器 |
| 3.1.3 主要试剂配制方法 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 TM3细胞的培养与转染 |
| 3.2.2 EDU检测细胞增殖 |
| 3.2.3 CCK-8检测细胞增殖 |
| 3.2.4 Cyp11a11过表达载体构建 |
| 3.2.5 ELISA检测睾酮和孕烯醇酮浓度 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 VD_3/VDR对TM3细胞增殖的影响 |
| 3.3.2 VDR对TM3睾酮/孕烯醇酮分泌的影响 |
| 3.3.3 Cyp11a1过表达载体构建 |
| 3.3.4 过表达Cyp11a1基因对TM3睾酮和孕烯醇酮合成的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 Cyp11a1启动子区VDRE分析与验证 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 细胞株及质粒 |
| 4.1.2 主要试剂及抗体 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 主要试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 双荧光素酶报告载体构建 |
| 4.2.2 HEK293T细胞培养和转染 |
| 4.2.3 双荧光素酶活性检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 启动子区分析结果 |
| 4.3.2 启动子区双荧光素酶报告载体构建 |
| 4.3.3 启动子区载体活性验证 |
| 4.3.4 删除不同长度片段后双荧光素酶载体构建 |
| 4.3.5 VDR结合位点筛选 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 主要实验仪器 |
| 攻读硕士学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（9）钙离子跨膜吸收相关基因在内蒙古白绒山羊胃肠道中的差异表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 试验动物及样品采集 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 提取RNA |
| 1.2.2 反转录cDNA |
| 1.2.3 相对荧光定量PCR |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 内蒙古白绒山羊胃肠道中TRPV6 mRNA表达量 |
| 2.2 内蒙古白绒山羊胃肠道中CaBP-D9k mRNA的表达量 |
| 2.3 内蒙古白绒山羊胃肠道VDR mRNA表达量 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
（10）白念珠菌中与钙离子敏感性相关基因的鉴定和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白念珠菌简介 |
| 1.1.1 白念珠菌细胞形态 |
| 1.1.2 白念珠菌菌丝及毒力 |
| 1.2 白念珠菌细胞内钙离子平衡及钙离子/钙调磷酸酯酶信号途径 |
| 1.2.1 白念珠菌钙离子平衡与其毒力的关系 |
| 1.2.2 白念珠菌钙离子/钙调磷酸酯酶信号途径 |
| 1.2.3 钙调蛋白 |
| 1.2.4 钙调磷酸酯酶及其调控 |
| 1.2.5 转录因子Crz1 |
| 1.2.6 白念珠菌钙离子运输系统 |
| 1.3 白念珠菌GRACE文库 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器与材料 |
| 2.1.1 实验所用仪器 |
| 2.1.2 实验所用主要试剂 |
| 2.1.3 实验所用其它试剂及试剂盒 |
| 2.2 实验所用溶液及配制方法 |
| 2.2.1 白念珠菌基因组提取相关试剂 |
| 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳相关溶液 |
| 2.2.3 白念珠菌转化相关溶液 |
| 2.2.4 蛋白质提取缓冲液 |
| 2.2.5 SDS-PAGE相关缓冲液 |
| 2.2.6 蛋白质转印及封闭缓冲液 |
| 2.2.7 实验所用培养基及配制方法 |
| 2.3 通用实验方法 |
| 2.3.1 菌株保存 |
| 2.3.2 质粒提取 |
| 2.3.3 PCR反应体系和产物纯化 |
| 2.3.4 酶切反应体系 |
| 2.3.5 克隆反应体系 |
| 2.3.6 质粒转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.3.7 DNA片段转化白念珠菌细胞 |
| 2.3.8 白念珠菌细胞基因组提取方法 |
| 2.3.9 倍比稀释法进行表型分析实验 |
| 2.3.10 白念珠菌细胞总蛋白提取 |
| 2.3.11 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.3.12 Westernblot方法检测蛋白 |
| 2.3.13 转录组测序 |
| 2.3.14 诱导His6标签蛋白在大肠杆菌细胞中的表达 |
| 2.3.15 His6标签蛋白的纯化 |
| 2.3.16 凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)实验原理及步骤流程 |
| 2.3.17 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验原理及流程 |
| 2.3.18 生物信息学方法 |
| 第三章 白念珠菌基因组中与钙离子敏感性相关基因的文库筛选 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验菌株-白念珠菌GRACE基因突变菌株文库 |
| 3.1.2 实验中用到的引物 |
| 3.2 本章实验方法 |
| 3.2.1 本章实验所用到的通用实验方法 |
| 3.2.2 白念珠菌钙离子敏感菌株的筛选 |
| 3.2.3 钙离子敏感菌株表型抑制实验 |
| 3.2.4 GRACE1.0文库菌株构建 |
| 3.3 本章实验结果 |
| 3.3.1 白念珠菌钙离子敏感菌株GRACE文库筛选结果 |
| 3.3.2 CsA对钙离子敏感菌株敏感性的抑制作用 |
| 3.3.3 GRACE1.0菌株对钙离子表型 |
| 3.3.4 钙离子耐受所需基因的功能及其编码蛋白的亚细胞定位分析 |
| 3.3.5 白念珠菌21个GRACE菌株钙离子敏感表型的专一性 |
| 3.3.6 MgCl2对21个GRACE菌株钙离子敏感表型的抑制作用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 全基因组RNA测序鉴定钙离子激活且依赖Crz1的目标基因 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验所用菌株和质粒 |
| 4.1.2 实验所用引物 |
| 4.2 本章实验方法 |
| 4.2.1 本章实验所用到的通用实验方法 |
| 4.2.2 CRISPR/Cas9方法构建crz1/crz1失活突变株 |
| 4.2.3 crz1/crz1回复突变株构建 |
| 4.2.4 Crz1-HA融合蛋白构建策略 |
| 4.2.5 His6-Crz1诱导表达菌株的构建 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CRISPR/Cas9基因编辑手段构建白念珠菌CRZ1基因的失活突变体及表型验证 |
| 4.3.2 全基因组分析钙离子存在下受Crz1正调控的基因 |
| 4.3.3 钙离子激活和受Crz1正调控的基因的启动子上Crz1结合位点的分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 HSL1基因的失活突变菌株构建及其表型分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验所用菌株和质粒 |
| 5.1.2 实验所用引物 |
| 5.1.3 实验所用试剂 |
| 5.2 本章实验方法 |
| 5.2.1 本章实验所用到的通用实验方法 |
| 5.2.2 CRISPR/Cas9方法构建失活突变株 |
| 5.2.3 pCR4-HSL1回复质粒构建实验 |
| 5.3 本章实验结果 |
| 5.3.1 抑制CaHSL1基因的表达导致白念珠菌细胞对钙离子敏感 |
| 5.3.2 CRISPR方法获得的HSL1基因失活突变株的表型分析 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 ：作者在攻读博士期间发表的论文 |
| 与课题相关论文 |
| 其他论文 |
四、大肠在钙吸收中的作用（论文参考文献）
- [1]枯草芽孢杆菌对蛋鸡生产性能和骨代谢的影响及其机理研究[D]. 邹昕羽. 西南大学, 2021(01)
- [2]桑树钙胁迫转录组和miRNA分析及相关基因功能鉴定[D]. 郑丹艳. 江苏科技大学, 2021
- [3]ε-聚赖氨酸—乳清蛋白复合物的构建、抑菌机理及其分子动力学模拟的研究[D]. 邵志鹏. 浙江工商大学, 2021
- [4]基于CaSR及Wnt/β-catenin信号通路的鸭蛋蛋清肽促钙吸收及促骨合成活性及机制研究[D]. 郭丹郡. 华中农业大学, 2020(04)
- [5]哈氏噬纤维菌Ⅸ型分泌系统的组成及功能研究[D]. 高利娟. 山东大学, 2020(04)
- [6]基于酪蛋白磷酸肽和壳寡糖的三种新型钙递送体系组装、评价及体内活性研究[D]. 朱必洋. 华中农业大学, 2020(02)
- [7]PVC含氮有机热稳定剂的制备与应用研究[D]. 陈庆华. 广东工业大学, 2020(02)
- [8]VDR调控小鼠Cyp11a1基因表达影响睾丸间质细胞雄性激素合成[D]. 郭苗苗. 陕西理工大学, 2020
- [9]钙离子跨膜吸收相关基因在内蒙古白绒山羊胃肠道中的差异表达[J]. 金鹿,娜美日嘎,孙海洲,桑丹,李胜利,张春华,张崇志,任晓萍,珊丹,凌树礼. 中国畜牧杂志, 2020(07)
- [10]白念珠菌中与钙离子敏感性相关基因的鉴定和功能研究[D]. 徐慧慧. 江南大学, 2018(04)