一、鼠抗人CD3、CD4单克隆抗体治疗肾移植后急性排斥反应的疗效观察（论文文献综述）
叶书林[1]（2021）在《木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究》文中研究指明目的:同种异体器官移植是治疗终末器官衰竭的有效手段。为了维持移植物在受者体内的存活,往往需要长期服用免疫抑制剂。一方面,术后器官排斥反应因免疫抑制剂的使用得以降低;另一方面长期应用免疫抑制剂的不良反应严重影响移植物和移植患者的存活,是移植免疫学和临床医学研究亟待解决的一大难题。中药免疫调节相关的基础研究和临床研究取得许多新的进展,从中药中寻求高效、低毒的免疫抑制剂是当今移植免疫学领域的研究方向之一。木犀草素是一种黄酮类化合物,研究表明木犀草素具有许多药理作用,如抗炎、抗肿瘤、抗氧化和神经保护等。在免疫调节作用方面的研究中发现木犀草素可以抑制小鼠T细胞的增殖和活化,下调IFN-γ、IL-6、IL-5等细胞因子的表达,具有免疫抑制作用。此外,还可以通过诱导CD4+CD25T淋巴细胞向CD4+CD25+调节性T细胞分化来减轻气道炎症。然而,目前木犀草素对于同种异体器官移植排斥反应方面的作用研究仍为空白。由于皮肤上抗原呈递细胞很多,排斥反应比其他器官移植更强,若药物能抑制皮肤排斥反应,则更能抑制其他器官移植排斥。因此,本实验首先通过小鼠同种异体皮肤移植模型探讨木犀草素对移植排斥反应的作用,再以同种异体胰岛移植模型进行验证,研究木犀草素对小鼠同种异体器官排斥反应的作用,以及其免疫调节的作用机制。方法:1.木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究建立小鼠皮肤移植模型,以BALB/c小鼠为供体,C57BL/6小鼠为受体。造模成功后随机分为四组,分别为同种异体皮肤移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、雷帕霉素组（Rapa,腹腔注射,1mg/kg）、木犀草素低剂量组（Lut-low,灌胃,25mg/kg）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）,观察木犀草素对移植皮片生存时间的影响,用中位存活时间（Mediansurvival time,MST）表示;移植10天后,取移植皮片检测炎症细胞浸润、CD3、Foxp3及相关细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-17a、Foxp3基因的表达情况;同时取移植小鼠脾脏和外周引流淋巴结检测CD4+CD44high CD62Llow 和 CD8+CD44high CD62Llow 效应 T 细胞、CD4+Foxp3+调节性 T细胞、CD11c+CD86+和CD11c+CD80+成熟树突状细胞的比例。木犀草素联合应用Anti-CD25删除小鼠体内Treg对小鼠皮肤移植反应的实验研究,分为四组:同种异体皮肤移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）、木犀草素高剂量联合同型对照组（Lut-H+Isotype,木犀草素50mg/kg灌胃联合Isotype抗体第0、3、6天0.2mg腹腔注射）,以及木犀草素高剂量联合Anti-CD25抗体组（Lut-H+PC61,木犀草素50mg/kg灌胃联合PC61抗体第0、3、6天0.2mg腹腔注射）,观察移植皮片生存时间,同时检测移植10天后脾脏和淋巴结中CD11c+CD86+和CD11c+CD80+成熟DC的比例。2.木犀草素对小鼠同种异体胰岛移植排斥反应的研究以BALB/c小鼠胰岛细胞为供体,移植到STZ诱导的糖尿病C57BL/6小鼠肾包膜下,建立小鼠同种异体胰岛移植模型。造模成功后随机分为四组,分别为同种异体胰岛移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、雷帕霉素组（Rapa,腹腔注射,1mg/kg）、木犀草素低剂量组（Lut-low,灌胃,25mg/kg）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）,观察木犀草素对移植后血糖的影响,用中位存活时间（Median survival time,MST）表示;移植10天后,取胰岛移植物检测胰岛素、炎症细胞浸润及CD3+T的表达情况;同时取移植小鼠脾脏和引流淋巴结通过流式细胞术检测CD4+Foxp3+Treg的比例。3.木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验流式细胞术分选CD3+T淋巴细胞,采用CCK-8法检测木犀草素对体外CD3+T细胞的细胞毒性,CFSE法检测木犀草素对体外CD3+T淋巴细胞增殖的影响,ELISA检测CD3+T细胞上清液中细胞因子IFN-y、IL-10和IL-17a蛋白的表达水平,流式细胞术分选CD4+CD25-T,检测木犀草素干预后对CD4+CD25+Treg的分化情况,Western Blotting检测木犀草素干预后CD3+T细胞中AKT/mTOR信号通路的蛋白表达。结果:1.木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究（1）与对照组相比,木犀草素低剂量组和高剂量组均能延长移植皮片的存活时间[MST=23.50±5.34（Lut-low）VS.16.50±2.74（Control）,P<0.05;MST=33.00±5.04（Lut-high）VS.16.50±2.74（Control）,P<0.01]。此外,与雷帕霉素组比较,木犀草素高剂量组在延长皮肤移植物存活率的作用差异无统计学意义（MST=33.00±5.04（Lut-high）VS.35.00±6.70（Rapa）,P>0.05）。（2）在移植皮片中,与对照组相比,木犀草素低剂量和高剂量组均能改善炎症细胞浸润,抑制CD3+T淋巴细胞浸润,上调Foxp3的表达,同时抑制促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-17amRNA的表达,上调IL-10和Foxp3mRNA的表达。（3）在受体小鼠淋巴器官脾脏和淋巴结中,与对照组相比,木犀草素低剂量和高剂量组均可显着降低CD4+CD44highCD62Llow和CD8+CD44highCD62Llow 效应 T 细胞以及 CD11c+CD86+和 CD11c+CD80+成熟 DC 的比例,同时显着增加引流淋巴结中CD4+Foxp3+Treg的比例（P<0.05或P<0.01）。（4）在应用Anti-CD25抗体删除Treg后,可逆转木犀草素延长移植皮片生存时间的作用,同时逆转对成熟DC的抑制作用（P<0.05或P<0.01）。2.木犀草素对小鼠同种异体胰岛移植排斥反应的研究（1）与对照组相比,木犀草素可延长移植术后胰岛的存活时间。（2）在胰岛移植区域,与对照组相比,木犀草素可减轻炎症细胞浸润。（3）在受体小鼠周围淋巴器官中,与对照组相比,木犀草素可上调移植后引流淋巴结中CD4+Foxp3+Treg的比例。3.木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验（1）不同浓度的木犀草素（1.25、2.5、5、10和20μM）给药48h和96h后,仅20μM浓度木犀草素对T细胞有活力有明显抑制作用（P<0.01）。（2）在T细胞增殖实验中,与对照组相比,木犀草素低浓度（Lut-low,2.5μM）和木犀草素高浓度（Lut-high,5μM）组与雷帕霉素组（Rapa,0.1μM）一样,均能显着抑制T细胞的增殖（P<0.01）。（3）与对照组相比,木犀草素低浓度和高浓度组均能显着抑制CD3+T细胞上清液中IFN-y和IL-17a的蛋白水平（P<0.01）,并上调IL-10蛋白的表达水平（P<0.05或P<0.01）。（4）与对照组相比,木犀草素低浓度和高浓度组均能明显促使CD4+CD25-T细胞向CD4+Foxp3+Treg分化（P<0.01）。（5）木犀草素（无论低浓度还是高浓度）能有效抑制P-p70S6K、P-mTOR和P-AKT蛋白的表达（P<0.01）,而雷帕霉素组对P-AKT蛋白的表达无明显作用（P>0.05）。结论:我们实验结果揭示了不管是在小鼠同种异体皮肤移植模型中还是胰岛同种异体移植模型中,木犀草素均可显着延长移植物的存活时间,提示木犀草素可抑制同种异体器官移植排斥反应,其潜在的作用机制可能是通过抑制效应性T细胞的增殖、DCs的成熟,同时诱导CD4+Foxp3+Treg的分化,以及抑制AKT/mTOR信号通路的激活而实现的。因此,我们的研究填补了木犀草素在抑制移植反应作用方面的空白,木犀草素在自然界中来源广泛,无明显毒副作用,作为一种潜在的免疫抑制剂,具有进一步深入研究的价值。
郑璇[2]（2021）在《第一部分 重型再生障碍性贫血免疫稳态研究-CD4+T淋巴细胞转录组深度测序及整合分析 第二部分 伴Coombs’试验（+）血细胞减少患者临床特征及预后分析 第三部分 获得性再生障碍性贫血CD8+调节性T细胞的特征研究》文中研究表明目的 T淋巴细胞介导的造血干/祖细胞免疫损伤是再生障碍性贫血（AA）最主要的病例生理机制。本文旨在通过基于测序的转录组谱,全面分析mRNA、长非编码RNA（lncRNA）和microRNA（miRNA）在重型再生障碍性贫血（SAA）和健康对照（HC）中的表达,为探索SAA发病机制提供线索。方法（1）采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs）;（2）采用免疫磁珠法分选CD4+T细胞;（3）采用Trizol提取RNA;（4）对外周血SAA（n=4）和HC（n=3）的CD4+T细胞进行完整转录组RNA测序（RNA-seq）;（5）进行总体表达模式及差异表达（DE）分析;并利用辅助性T细胞1/2（Th1/Th2）lncRNA集及差异lncRNA确定核心lncRNA;对核心lncRNA进行功能富集分析,转录因子预测以及建立竞争性内源RNA（ceRNA）网络;对ceRNA网络中的核心mRNA进行可变剪切分析并利用GEO数据库进行交叉验证。结果 超过75%的RNA在SAA患者和健康对照共表达,但亦表现出不同的转录表达谱。（1）送检的7个样品中检测到39456个mRNA、10496个已知的lncRNA和658个miRNA。在SAA和HC中,所有三种类型的RNA的表达水平均相当。（2）以差异倍数（FC）≥1.5且P<0.05为标准,我们检测到78个DE miRNA,847个DE lncRNA,3753个DE mRNA和2670个DE基因。（3）无监督聚类和主成分分析显示lncRNA表达在患者与对照组中差异显着,另发现新lncRNA 1839种。（4）847个DE lncRNA中,其中320个lncRNA在SAA中上调,其余部分则下调。（5）lncRNA靶基因预测显示:80.8%的lncRNA与其对应的基因表达水平成正相关。（6）lncRNA转录因子预测发现:分别有13个lncRNA和8个lncRNA参与调控IFNG-IFNG通路中的关键因子干扰素调节因子1（IRF1）及信号转导转录激活因子3（STAT3）。（7）GO生物学功能富集显示:lncRNA预测的mRNA主要参与蛋白质结合、细胞质基质、细胞核、细胞质、核质、膜组成部分和金属离子结合。（8）KEGG功能富集提示:单纯疱疹病毒感染、代谢通路、肿瘤、PI3K-Akt通路和人类免疫缺陷病毒感染相关信号通路被显着富集。（9）根据lncRNA-miRNA,miRNA-mRNA的靶标预测,我们构建一个ceRNA网络。（10）Th细胞相关ceRNA网络核心mRNA功能预测分析显示:破骨细胞分化,类风湿性关节炎,NF-κB信号通路,疟疾及军团菌感染,CD8+αβ-T细胞活化信号通路均被显着富集。（11）利用GEO数据库进行交叉验证,发现炎症因子ICOS,RELB及TNFSF8在SAA患者中高表达,而免疫负调控因子SOCS1同样高表达,提示SAA患者免疫内环境存在稳态调节。结论（1）lncRNA转录因子预测及靶基因功能预测发现SAA免疫相关通路异常表达,提示lncRNA在其发病机制中可能具有重要作用;（2）炎症因子及免疫负调控因子的共同高表达提示SAA患者免疫内环境可能存在稳态调节。目的 观察伴Coombs’试验（+）血细胞减少患者的临床特征、疗效及长期生存情况。方法 回顾性分析我科2009年07月01日至2020年06年30日期间伴Coombs’试验（+）的血细胞减少患者,比较获得性骨髓衰竭（BMF组）和继发性血细胞减少（继发组）的临床特征差异,并评估BMF组患者的疗效及预后,采用Kaplan-Meier法分析其5年总体生存率。结果 82例患者符合纳入标准,其中BMF组58例,继发组24例。继发组女性比例明显高于BMF组（83%对41%,P=0.001）,该组患者贫血以轻中度为主[血红蛋白中位数78（31～129）g/L],白细胞水平略低于正常,而血小板显着高于BMF组[71（4～384）×109/L对31.5（4～401）×109/L,P=0.020]。脾脏肿大在继发组更常见,其阳性率高于BMF组（38%对7%,P=0.002）。两组患者红细胞破坏的间接指标如网织红细胞绝对值、总胆红素、间接胆红素及乳酸脱氢酶中位数处于正常范围且差异无统计学意义。BMF组患者淋巴细胞比例明显高于继发组[58.3%（16.4%～94.5%）对34.6%（5.4%～73.7%）,P<0.001],而CD19+B细胞比例低于继发组[9.3%（0.3%～27.1%）对14.0%（1.2%～35.6%）,P=0.010]。继发组患者的风湿免疫相关指标如抗核抗体滴度/阳性率、可提取性核抗原抗体谱阳性率及IgG水平均高于BMF组,但其补体C3、C4水平较BMF组下降（P值均<0.050）。BMF组48例（83%）患者既往有输血史,12例（21%）患者入院前2周有发热病史并予青霉素类或头孢类等抗菌素治疗,4例（7%）患者有丙种球蛋白治疗史（3个月内）。共有17例BMF患者复查Coombs试验,11例（65%）转阴。余6例阳性患者中,1例效价值较前升高,1例持平,4例较前降低。Coombs试验效价转阴或降低的15例患者,其中10例（67%）经免疫抑制及促造血治疗后脱离输血;另5例均为MDS及PNH患者,尚未获得血液学缓解,仍依赖输血。49例BMF组患者纳入随访,其中39例规范服药患者有31例（79.5%）获得血液学缓解,5例死亡;8例未规律服药患者有4例死亡,4例患者带病生存,需依赖血制品输注。本组患者5年总体生存率为（79.8±7.3%）,服药患者生存率与未服药组差异无统计学意义。另2例患者行骨髓移植治疗获得血液学缓解。结论 伴Coombs’试验（+）的骨髓衰竭患者应积极给予经典的免疫抑制及促造血治疗,预后良好;而因风湿免疫病继发的伴Coombs’试验（+）血细胞减少患者,临床特征显着,容易鉴别。目的本研究旨在检测再生障碍性贫血（AA）患者CD8+调节性T细胞（CD8+Treg）的数量及生物学功能特征,并探讨其在AA发病机制中的作用。方法（1）采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs）;（2）采用流式细胞术（FCM）检测外周血CD8+Treg占CD3+淋巴细胞比例;（3）采用FCM检测外周血CD8+Treg体外分泌细胞因子的能力;（4）采用CFSE标记法检测外周血CD8+Treg体外增殖能力;（5）采用免疫磁珠分选法（MACS）分选CD4+T细胞、CD8+细胞毒性T细胞（Tcyt）和CD8+Treg;（6）采用Transwell板检测CD8+Treg的趋化能力;（7）采用FCM检测外周血CD8+Treg趋化因子受体CCR7、CCR8的表达水平;（8）采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测骨髓（BM）上清中趋化因子配体CCL21的浓度;（9）采用CFSE标记法检测共培养体系中CD8+Treg抑制CD4+T/Tcyt增殖的能力;（10）ELISA检测共培养上清IFN-γ的水平;（11）采用FCM检测由外周血单核细胞诱导的成熟树突状细胞（mDC）表面免疫球蛋白样转录物（ILT3）的表达水平;（12）MACS分选脐血来源CD34+细胞,通过甲基纤维素半固体培养基（H4435）中加入体外共培养体系获得的上清,比较AA组和健康对照（HC）组CD8+Treg改善造血克隆形成的能力。结果（1）重型再生障碍性贫血[SAA（n=19）]、非重型再生障碍性贫血[NSAA（n=7）]患者PBMC中CD8+Treg细胞数量较HC组（n=22）均明显减低（分别为7.61±0.99%vs 16.08±1.21%,P<0.0001 和 10.32±1.38%vs 16.08±1.21%,P=0.043）;（2）SAA组中CD28-IFN-γ+T细胞占CD3+CD8+细胞的比例明显低于HC组（8.38±2.25%vs 20.03±2.17%,P=0.010,n=4）;与治疗前相比,抗胸腺球蛋白（ATG）治疗后达完全缓解（CR）患者（n=3）其数量明显恢复（8.38±2.25%vs 28.67±8.22%,P=0.040）。同时SAA组CD28-TGF-β+T细胞也较HC组和CR组降低（分别为 0.63±0.14%vs 1.57±0.26%,P=0.020 和 0.63±0.13%vs 1.59±0.32%,P=0.029）（3）SAA组患者CD8+Treg体外增殖能力明显低于HC组（21.68±1.91%vs 53.86±4.94%,P=0.001,n=4）；（4）BM 上清中 CCL21 浓度在SAA组和HC组中无显着差异；（5）SAA组患者CD8+Treg表达趋化因子受体CCR 7明显低于HC组（1.54±0.33%vs4.33±0.39%,P=0.005,n=5）；（6）SAA 组患者 CD8+Treg体外趋化指数明显低于HC组（0.47±0.22%vs 1.64±0.62%,P=0.008,n=3）；（7）SAA组患者CD8+Treg抑制CD4+T细胞增殖的能力显着低于HC组；（8）SAA组患者CD8+Treg抑制CD4+T淋巴细胞产生IFN-γ的能力较HC组明显减弱；（9）SAA组患者CD8+Treg上调mDC表达ILT3的能力较HC组减弱（45.05±2.45%vs55.9±4.54%,P=0.028,n=4）；（10）SAA患者CD4+T淋巴细胞体外培养上清可明显抑制造血克隆形成,且SAA患者CD8+Treg改善造血克隆形成能力较HC组减弱。结论（1）AA患者CD8+Treg数量减少且增殖能力减弱。（2）AA患者CD8+Treg免疫抑制功能存在缺陷。
陈晓晨[3]（2020）在《PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究》文中认为研究背景及目的淋巴瘤是目前发病率最高的血液恶性肿瘤,严重威胁人类健康。淋巴瘤异质性强,病理分型复杂。弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是其中最常见的亚型,发病率约占所有淋巴瘤30%。R-CHOP方案作为标准一线方案应用临床,明显改善了DLBCL患者的疗效和生存,但复发难治（R/R）DLBCL仍然是临床面临的棘手问题。免疫治疗的临床应用,尤其是免疫检查点治疗和嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,CAR-T）的突破性进展,给R/R DLBCL患者带来新的希望。程序性细胞死亡1受体（PD-1）是关键的免疫检查点分子之一。PD-1单抗治疗R/R霍奇金淋巴瘤的总反应率高达90%。然而,目前PD-1单抗治疗DLBCL的临床数据尚不多见,有待进一步探索和研究。此外,当前CAR-T治疗R/R DLBCL的临床试验也正在国内外广泛开展中。T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3（TIM-3）是另一个重要的免疫检查点分子。文献报道,PD-1单抗治疗后,患者效应T细胞诱导性表达TIM-3上调,这可能是PD-1单抗继发性耐药的机制之一。本课题关注于免疫治疗R/R DLBCL,拟探究T细胞表达PD-1水平对于DLBCL的临床意义;分析PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）临床治疗R/R DLBCL患者的疗效、安全性、预测生物标记物及耐药机制;并进一步探索PD-1单抗和TIM-3单抗联合治疗B系淋巴瘤的疗效和免疫学机制,为未来相关临床应用提供实验基础。研究方法（1）应用流式细胞仪检测DLBCL患者外周血（40例）和淋巴结（30例）T细胞亚群分布及其细胞表面PD-1表达情况;应用ELISA方法检测患者血浆（40例）可溶性PD-1及PD-L1水平及动态演变。将患者的上述指标与对照组（正常人群及淋巴结反应性增生患者）对比,分析PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1在DLBCL发病机制中的作用;对DLBCL患者进行临床特征（病理亚型,IPI评分）亚组分析和生存分析,以进一步探究PD-1/PD-L1对DLBCL患者临床特征和生存的影响。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL患者,观察疗效和毒副反应情况;并应用外显子基因捕获二代测序、寡核苷酸阵列芯片和免疫组化技术对患者淋巴结组织进行检测,以探寻PD-1靶向治疗相关的预测生物标记物;应用流式细胞仪监测患者治疗前后外周血T细胞表达PD-1和TIM-3的动态变化,以进一步探究PD-1靶向治疗耐药与耗竭T细胞可能的相关机制。（3）建立BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型,观察肿瘤成瘤率及生长速度;分别应用阻断性PD-1单抗单药和PD-1单抗+TIM-3单抗联合方案治疗成瘤小鼠,观察各组治疗效果和生存情况;并应用CD8+磁珠分选、流式细胞仪、ELISA、CCK8等方法进一步探究PD-1+TIM-3单抗联合方案治疗的免疫学机制。研究结果（1）与正常对照组相比,初诊DLBCL患者外周血CD4+T细胞占CD3+T细胞的比例明显下降（45.47±10.07%VS.61.91±10.52%,P=0.036）,而CD8+T细胞比例则相应升高（43.99±9.32%VS.31.94±6.50%,P=0.045）,且CD4+T细胞及CD8+T细胞表达PD-1水平均明显上调（CD4+PD-1+:16.30±4.58%VS.8.96±2.95%,P=0.017;CD8+PD-1+:18.12±5.43%VS.10.13±3.30,P=0.023）。与淋巴结反应性增生患者相比,DLBCL患者淋巴结CD3+T细胞比例明显下降（23.55±15.62%VS.56.65±10.36%,P=0.002）;CD4+和CD8+T细胞占CD3+T细胞的比例差异无显着性（P>0.05）,但CD4+和CD8+T细胞表达PD-1水平均明显上调（CD4+PD-1+:45.95±11.61%VS.18.26±3.61%,P=0.001;CD8+PD-1+:55.11±13.45%VS.19.32±3.78%,P=0.001）。与正常对照组相比,DLBCL患者初诊时血浆可溶性PD-1明显上升（4.49±3.53ng/ml VS.0.47±0.36ng/ml,P=0.002）,PD-L1水平也明显上升（1.21±1.03ng/ml VS.0.26±0.24ng/ml,P=0.039）。对DLBCL患者进行临床特征亚组分析显示PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1水平和患者临床特征（病理亚型,IPI评分）相关;生存分析显示PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1高表达组的OS和PFS均明显低于低表达组（P<0.05）;动态分析患者血浆可溶性PD-1及PD-L1水平显示,其与患者病情状态密切相关。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL,部分患者获得了明显疗效（PD-1单抗治疗ORR达33%;PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞治疗ORR达72%）,总体耐受性好,毒副反应较轻;外显子基因捕获二代测序和寡核苷酸阵列芯片分析提示患者肿瘤染色体及基因突变程度高者对PD-1单抗治疗更加敏感（P<0.05）;免疫组化提示肿瘤浸润T细胞数量或/和PD-L1表达高者,对PD-1单抗治疗反应更好（P<0.05）。患者治疗前后外周血T细胞表达PD-1和TIM-3呈动态变化,随着PD-1单抗治疗的进行,T细胞PD-1表达下调,但TIM-3表达上调,且疗效不佳组患者T细胞表达TIM-3上调更加明显（CD4+TIM-3+:29.12±3.52%VS.20.10±2.71%,P=0.001;CD8+TIM-3+:30.12±3.65%VS.19.93±3.52%,P=0.001）。（3）成功建立BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型;PD-1单抗+TIM-3单抗联合组疗效和生存明显优于PD-1单抗单药组和对照组;免疫学机制研究提示:PD-1单与PD-1单抗单药组和对照组相比,PD-1+TIM-3单抗联合组瘤体中CD8+T细胞浸润增加（30.12±2.15%VS.14.94±1.42%VS.4.99±0.95%,P=0.001）,且其TIM-3表达明显下调（20.55±1.46%VS.60.14±2.98%VS.40.01±2.52%,P=0.001）;体外T细胞功能学实验提示PD-1+TIM-3单抗联合组瘤体中CD8+T细胞增殖及杀伤能力明显强于PD-1单抗单药组和对照组（P<0.05）;凋亡明显低于另外两组（P<0.05）;PD-1+TIM-3单抗联合组血浆IL-2、IFN-γ及TNF-α动态水平也明显高于另外两组（P<0.05）。结论（1）DLBCL患者T细胞表达PD-1上调和血浆可溶性PD-1/PD-L1水平升高在DLBCL发病机制中发挥重要作用;上述指标与患者临床特征（病理亚型,IPI评分）及生存（OS/PFS）密切相关;患者血浆可溶性PD-1及PD-L1水平动态变化与其病情状态密切相关,可将其作为DLBCL病情监测的潜在生物标记物。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL总体耐受性好,毒副反应较轻,但仅对部分患者有效;外显子基因捕获二代测序、寡核苷酸阵列芯片分析及免疫组化分析提示:患者肿瘤突变程度、肿瘤浸润T细胞数量和肿瘤微环境PD-L1表达等因素,与PD-1单抗疗效密切相关,提示上述指标有可能成为预测PD-1单抗疗效的潜在生物标记物;PD-1单抗治疗后,患者效应T细胞将诱导性上调TIM-3分子表达,这可能是PD-1单抗继发性耐药的机制之一。（3）BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型中,PD-1单抗+TIM-3单抗联合组的疗效及生存明显优于PD-1单抗单药组和对照组,从而提示:PD-1单抗和TIM-3单抗联合应用能够发挥更强的抗肿瘤作用。免疫学机制研究进一步揭示:PD-1+TIM-3单抗联合可以抑制效应T细胞的TIM-3诱导性表达,并通过增强CD8+T细胞增殖及杀伤能力、抑制CD8+T细胞凋亡、上调多种因子表达（IL-2、IFN-γ及TNF-α）等机制,避免T细胞耗竭从而增强T细胞抗肿瘤效应。
陈亮[4]（2020）在《Treg细胞外泌体诱导移植肝免疫耐受的机制研究》文中认为[目的]优化提取方法,分离活化高质量、高增殖率的Treg细胞。证实Treg细胞除了通过直接接触抑制CD8+T细胞增殖外,也可以通过非接触方式抑制CD8+T细胞增殖。证实Treg细胞对CD8+T的抑制是可以通过exosomes实现的。Treg及其 exosomes 可通过 microRNA-194-1-3p 靶向 LAT1（Slc7a5）调控 mTOR 信号传导通路,影响氨基酸的转运,从而抑制CD8+T细胞增殖。建立SD大鼠供体,Wistar大鼠异体原位肝移植模型,通过动物体内实验证实Treg-exosomes对同种异体肝移植的保护作用。[方法]1、Treg细胞对CD8+T细胞功能和增殖影响:取BALB/C小鼠脾脏,分别采用磁珠吸附分选和流式分选Treg细胞。分离得到的Treg细胞通过CD3、CD28、IL-2单克隆抗体以及Rapamycin共同活化并扩增。CD8+T细胞采用磁珠吸附分选,通过CD3、IL-2单克隆抗体活化CD8+T细胞。采用Transwell系统及直接共培养Treg细胞和CD8+T细胞。采用CCK-8检测不同时间点CD8+T细胞增殖情况,以及通过PI染色分析CD8+T细胞细胞周期变化情况。2、Treg-exosomes对CD8+T细胞功能和增殖影响:收集Treg细胞上清液,分别采用exosomes提取试剂盒和超高速差速离心法两种方法提取exosomes,并通过western blot检测CD63表达,确定不同培养时间Treg细胞上清液不同提取方法中exosomes的含量。通过电镜分析以及粒径分析和western blot检测CD63、LAPMP-1蛋白表达三方法,共同鉴定提取的exosomes。构建绿色荧光蛋白（GFP）标记的CD63慢病毒,感染Treg细胞,并在荧光显微镜检测感染效率,提取带荧光的Treg-exosomes感染活化的CD8+T细胞,共聚焦荧光显微镜检测感染效率。按照下面分组进行干预细胞:a对照组:正常培养的CD8+T细胞;b共培养组:Treg细胞和CD8+T细胞组;c高剂量exosomes组:在CD8+T细胞中加入40ug Treg细胞来源的exosomes;d低剂量exosomes组:在CD8+T细胞中加入10ug Treg细胞来源的exosomes;e抑制剂Treg组:活化Treg细胞加入GW48692小时后与CD8+T细胞共培养;f抑制剂exosomes组:在CD8+T细胞中加入40ug Treg细胞来源的exosomes的同时加入GW4869。采用CCK-8检测不同时间点上面6组CD8+T细胞增殖情况及细胞周期变化情况,同时通过QPCR、Western blotting、流式细胞术检测CD8+T细胞分泌细胞因子IFNλ和Perforin的表达情况。3、Treg 细胞及其 exosomes 可通过 microRNA-194-1-3p靶向LAT1（Slc7a5）调控mTOR信号通路:收集Treg细胞和exosomes干预后CD8+T细胞,使用microRNA芯片检测筛选差异microRNA,并进行QPCR验证、靶基因预测、靶基因GO和KEGG分析。生物信息学预测网站预测microRNA-194-1-3p与LAT1（Slc7a5）的靶向关系,并通过双荧光素酶报告基因实验证实。mumics和inhibitor转染CD8+T细胞,QPCR检测mmu-miR-194-1-3p和Slc7a5基因的变化情况,mmu-miR-194-1-3p mimics 和 inhibitor 干预 CD8+T 细胞检测 CD8+T 细胞增殖情况。通过 western blot 检测 mmu-miR-194-1-3p的mimics 和 inhibitor 干预 CD8+T细胞后靶基因Slc7a5和p-mTOR蛋白表达情况。4、Treg-exosomes对同种异体肝移植保护作用:本实验通过Kamada“二袖套”法,建立Wistar大鼠异体原位肝移植模型,分为A、B两组,术后第4天开始均给予雷帕霉素,A组在第1、3、5天注射Treg细胞中提取的exosomes。术后3day、11day、18day尾静脉取血浆检查ALT、TBIL水平,同时观察存活时间。[结果]1、Treg细胞对CD8+T细胞功能和增殖抑制作用:流式细胞术鉴定流式分选和磁珠吸附分选Treg细胞CD4+CD25+Treg阳性比率分别为93.2%和87%,CD8+T细胞磁珠吸附分选阳性比率为91.44%。Treg细胞与CD8+T细胞共培养后CCK-8检测结果显示,无论是Transwell系统共培养还是直接共培养,CD8+T细胞增殖都显着下降（均P<0.05）。共培养后增殖周期检测结果显示,GO/G1期的CD8+T细比例显着增加,S期和G2/M期都表现出更少的富集细胞。2、Treg-exosomes对CD8+T细胞功能和增殖抑制作用:（1）Western Blot检测结果显示,聚合沉淀法提取的exosomes CD63表达明显高于超速离心法。透射电镜下观察exosomes是圆形或类圆形的,直径分布在30-150nm的范围内。Western Blot检测结果显示exosomes中CD63、LAPMP-1蛋白均呈阳性表达。荧光显微镜观察慢病毒感染Treg细胞,48h后显示荧光表达含量达到70%以上。共聚焦荧光显微镜可以观察到Treg-exosomes感染了 CD8+T细胞。（2）Treg-exosomes与CD8+T细胞共培养后,CCK-8检测CD8+T细胞增殖情况显示:Treg-exosomes与活化CD8+T细胞共培养后,CD8+T细胞的增殖明显降低,而且在高剂量exosomes组中抑制作用更为明显。而预先在Treg中加入了 GW4869抑制exosomes的分泌,结果显示Treg细胞对CD8+T细胞的抑制作用减弱了。流式细胞仪检测CD8+T细胞周期情况得到了相似的结果。（3）QPCR、Western blotting和流式细胞术检测perforin、IFN-γ。结果显示,Treg细胞以及高剂量exosomes干预CD8+T细胞后IFN-γ和Perforin蛋白表达明显下调（均P<0.05）,相比之下,Treg细胞加入GW4869后IFN-y和Perforin蛋白表达无明显变化。3、Treg 细胞及其 exosomes 通过 microRNA-194-1-3p靶向LAT1（S1c7a5）调控mTOR信号通路:基因芯片及QPCR验证Treg细胞及exosomes一致变化的有13个microRNA。双荧光素酶报告基因实验证实,mmu-miR-194-1-3p与S1c7a5基因3’-UTR靶向结合。细胞转染构建高表达miR-194-1-3p和低表达miR-194-1-3p的细胞株检测mRNA和蛋白水平表达的变化,结果提示miR-194-1-3p与Slc7a5、p-mTOR在CD8+T细胞中的表达呈直接负相关。高表达miR-194-1-3p可以显着抑制CD8+T细胞的增殖,G0/G1、G2/M期表现细胞显着增加而S期表现细胞显着减少。4、Treg-exosomes对同种异体肝移植保护作用:术后第3天时A组的ALT、TBIL水平较B组的低,但差别不大,第11天时两组的ALT、TBIL水平均有降低,但A组更为明显,两组之间有显着差异（P<0.05）。到第18天时两组的ALT、TBIL水平继续有降低,但仍然是A组降低更为明显（P<0.05）,两组之间有显着差异。注射Treg-exosomes大鼠存活时间明显延长。对照组（B组）在移植后有28天的中位存活时间,而Treg-exosomes治疗组（A组）的存活时间明显更长,达到90天。[结论]1、通过磁珠吸附分选得到的Treg细胞,在CD3/CD28单抗、雷帕霉素、IL-2刺激培养下,可以良好增殖。Treg细胞对CD8+T细胞的增殖具有明显抑制作用,Treg细胞对CD8+T细胞既可以通过细胞间直接接触,也可以通过非直接接触的方式抑制CD8+T细胞增殖。2、通过ExoQuick precipitation法可以提取到更多的Treg细胞exosomes,同时显示Treg细胞培养72h收集上清得到的exosomes量更多。Treg细胞可以被pCT-CD63-GFP慢病毒转染且标记其分泌的exosomes,并可以直观地观察到Treg分泌的exosomes转移并整合到CD8+T细胞内。Treg细胞可以通过分泌exosomes影响CD8+T细胞的细胞周期分布,抑制CD8+T细胞增殖,以及抑制其分泌穿孔素以及IFN-γ。3、Treg细胞及其分泌的exosomes可以通过miR-194-1-3p发挥其对CD8+T细胞的抑制作用。miR-194-1-3p可能通过靶向下调LAT1（Slc7a5）抑制mTOR信号传导通路,影响氨基酸的转运,从而抑制CD8+T细胞增殖。4、同种异体肝移植大鼠注射Treg细胞来源的exosomes后同,移植大鼠存活时间明显延长。Treg-exosomes在大鼠体内发挥免疫抑制作用需要一定的反应时间,且随着时间的推移有进一步扩大的趋势。
胡永浩[5]（2020）在《CD73在子宫内膜再生细胞抑制小鼠同种异体心脏移植物排斥反应中的作用机制研究》文中指出背景:目前在临床实践中,对于那些患有终末期疾病或者患有先天性器官缺陷的患者,器官移植的实施已经成为了一种行之有效的治疗手段。免疫抑制剂的研发和应用在器官移植的发展过程中起到了不可或缺的作用,虽然现有的免疫抑制方案也在朝着个体化和联合用药的方向不断地进行优化,但是其长期应用仍然会带来许多免疫抑制剂相关的并发症,比如:感染、肿瘤和器官损伤等。此时,间充质干细胞（Mesenchymal stem cell,MSC）的发现和应用,为抑制移植排斥反应带来了新的选择。MSC是一种多能干细胞,能够分化多种谱系包括脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。研究表明MSC能够抑制机体的免疫功能,而且在器官移植中应用能够使移植受体获益。与常用的免疫抑制剂相比,MSC更安全,也能避免免疫抑制剂相关的副作用。但是,若将MSC的应用于临床治疗,其也存在自身的局限性（有创的获取方式以及相关的并发症,有限的增殖能力以及来源短缺等）。然而,一种新发现的类间充质干细胞:子宫内膜再生细胞（Endometrial regenerative cell,ERC）,其不仅拥有与MSC相似的免疫调节功能,并且具有高增殖率、低免疫原性、广泛扩增等特点,最重要的是ERC能够无创的从无限来源的月经血中提取出来。不仅如此,相关的研究也已经发现ERC在器官移植中具有诱导免疫耐受和保护器官移植物的作用。然而,ERC发挥免疫抑制的机制尚不清楚,仍需要进一步的研究。与此同时,我们发现ERC表面能够表达5’-核苷酸外切酶（Ecto-5’-nucleotidase,CD73）。CD73是细胞外腺苷（Adenosine,ADO）生成过程中的限速酶,而ADO又可以与其下游的受体结合,发挥相应的生物学功能。因此,阐明ERC表达CD73对其在免疫调节过程中发挥作用的机制将会对ERC的应用具有极大的指导意义。所以,本课题聚焦于CD73表达对ERC在体内和体外调节免疫细胞过程中的影响和机理。课题的成功实施将会为ERC的临床转化和规范化应用提供坚实的理论和实践依据。目的:分离提纯ERC并验证其表面能够稳定表达CD73。探究ERC表面所表达的CD73的体外催化功能及其在体外培养中对树突状细胞、巨噬细胞和调节T细胞的调控作用。探讨CD73表达对ERC延长同种异体心脏移植物生存时间及抑制免疫排斥反应发生的作用机制。方法:本研究主要由三个部分构成:第一部分,从健康女性志愿者的月经血中提取ERC并进行体外培养;通过流式细胞术鉴定ERC的细胞表型;通过细胞的免疫荧光实验再次验证ERC表面CD73的表达。第二部分,使用Pi Color Lock TM磷酸检测试剂盒检测ERC表面的CD73在体外催化单磷酸腺苷（Adenosine monophosphate,AMP）分解为ADO的能力;通过体外培养研究CD73表达对ERC体外调控树突状细胞（Dendritic cell,DC）,巨噬细胞和调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）分化增殖能力的影响,并通过流式细胞术检测细胞群数量的变化。第三部分为体内实验,建立小鼠同种异体异位心脏移植模型;体内探究ERC表面表达CD73在其抑制小鼠同种异体异位心脏移植排斥反应中的作用以及相应的作用机制。结果:第一部分:成功的从志愿者的月经血中提取出ERC,并且实现了体外扩增;流式细胞术结果显示ERC可以稳定表达CD90、CD105、CD73,低表达CD39;ERC免疫荧光的结果也显示CD73表达在ERC的细胞膜上。第二部分:ERC表面的CD73在体外可以催化AMP水解为ADO,并且CD73的功能可以被抗CD73单克隆抗体阻滞;ERC表面的CD73被阻滞后其体外抑制成熟DC增殖的能力会下降,促进2型巨噬细胞（Macrophages type 2,M2）和Treg增殖的能力也会被抑制。第三部分:成功制备了小鼠同种异体异位心脏移植模型;ERC表面的CD73功能被阻滞后其延长移植物生存时间,减轻移植物病理改变,减轻CD4+和CD8+细胞浸润,上调耐受性树突状细胞（Tolerogenic dendritic cells,Tol-DC）、M2、Treg的比例,减少促炎因子IFN-γ和TNF-α分泌,增加抗炎因子IL-10分泌以及促进心肌组织A2B受体表达等功能均受到抑制。结论:通过三部分的实验研究,可以得出以下结论:1)可以从健康适龄女性志愿者的月经血中提取出表型稳定的ERC,并且ERC的表面可以稳定表达CD73。2)ERC表面表达的CD73体外具有催化AMP脱磷酸分解为ADO的能力,并且CD73的功能可以被抗CD73单克隆抗体阻滞,同时表达CD73对ERC发挥抑制DC细胞成熟、促进M2和Treg增殖的作用极其重要。3)表达CD73的ERC可以抑制小鼠同种异体心脏移植排斥反应,延长移心脏移植物的生存期。因此,课题的成功实施为ERC的临床转化和规范化应提供了理论和实践依据。
孙赫[6]（2020）在《共抑制分子TIGIT在抗器官移植排斥反应中的作用及机制研究》文中认为研究背景及目的:同种异体肾移植术作为20世纪最令世人瞩目的医学成就之一,是目前临床上治疗终末期肾病的主要治疗手段。同时,接受肾移植手术的病人均不可避免的于术后终身服用免疫抑制治疗,目前临床上最经典的免疫抑制方案是以钙调磷酸酶抑制剂为基础的二联或三联免疫抑制方案,现有的免疫抑制方案取得了非常卓越的短期疗效,但因其作用靶点的广泛性,其远期疗效一直无法令人满意。于是,专门针对免疫系统细胞的共刺激阻滞剂-贝拉希普便在此背景下应运而生。大量临床试验证实,贝拉希普可明显改善移植受者及移植物的存活率,大大降低免疫抑制剂相关药物毒副作用,但同时也造成了更高的急性排斥反应发生率。鉴于此,移植免疫工作者开始探索造成贝拉希普相关排斥反应发生的危险细胞群,目前有三群细胞已被发现并证实是造成贝拉希普相关排斥反应发生的可能原因,即:CD4+CD28+TEM,CD8+CD28null和CD4+CD57+PD1-细胞亚群。与此同时,在具有高度异质性的CD4阳性的辅助性T细胞中,Th17细胞群也被认为是造成贝拉希普相关急性排斥反应发生的可能原因。而对于以上这些高危细胞群的异同点以及它们之间是否存在着相互重叠的“极高危细胞群”,目前尚无定论;同时寻找新的共抑制作用靶点来控制这些高危细胞群更成为了当务之急。新兴的共抑制分子TIGIT已被证实在肿瘤免疫中发挥着至关重要的免疫抑制作用,而其在实体器官移植领域的应用,尤其对上述高危细胞群的作用,尚无相关报道。本研究拟对共抑制分子TIGIT在贝拉希普相关移植排斥反应中的作用及机制进行深入的探讨及研究。研究方法:1、研究对象:所有健康受试者以及在美国埃默里大学（Emory University）器官移植中心接受同种异体肾移植手术的病人,在征求其本人同意后,均签署了知情同意书。所有实验流程均符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》,并经过美国埃默里大学伦理委员会审批通过。2、细胞体外刺激实验:（1）多克隆刺激实验:用无菌细胞培养液（R10）以1×106/m L的比例将细胞重悬,并将细胞悬液转移至无菌24孔平板内,每孔保证含有2m L R10和2×106的细胞。按照bead-to-cell ratio of 1:1的比例加入人anti-CD3/CD28 Dynabeads,或3μg/m L plate-bound anti-CD3,于37℃恒温孵育箱内（5%CO2）孵育3天。（2）同种异体抗原刺激实验:选取HLA配型不匹配的配对组合,受体PBMC用细胞增殖特异性染料CTV染色标记,供体PBMC进行体外辐照,在96孔板内按照受体细胞与供体细胞1:2的比例混合,同时加入10%的受体血浆25μL及相应的免疫抑制剂,模拟免疫维持治疗过程。将培养液内各成分充分混匀后,置于37℃恒温孵育箱内（5%CO2）孵育5-7天。3、小鼠皮肤移植模型:获取供体小鼠的耳朵及尾部皮肤,修剪并置于预冷的PBS液中。受体小鼠麻醉成功后,选择合适的移植位置,通常为背部两侧,局部备皮、消毒。用钩镊轻轻提起局部皮肤,用剪刀剪去背部两侧各1×1cm大小皮肤,作为移植床。将供者皮片湿润后,置于移植床,通常左侧放置尾部皮肤,右侧放置耳部皮肤,将皮肤移植物平整的平铺在移植床上,保证供体与受体皮肤对合联合,并用剪刀剪去多余的皮片。用无菌创可贴对局部皮肤移植物进行加压包扎。术后每日观察皮肤移植物状态。4、实验方法:（1）单细胞悬液制备;（2）细胞表面染色;（3）细胞内细胞因子染色;（4）CD4阳性传统性T淋巴细胞分离（MACS法）;（5）CD8阳性T淋巴细胞分离;（6）细胞解冻与复苏;（7）细胞培养液fgl2检测（ELISA法）;（8）细胞特殊染色法。结果:1、CD4+CD28+TEM和CD4+CD57+PD1-两群细胞亚群在多克隆刺激时,表现出相似的增殖潜能（Ki-67+）,相近的促炎细胞因子（TNF+,IL-2+）分泌功能,和类似的T细胞活化指标（CD69+）表达。2、在同种异体抗原刺激下,CD4+CD28+TEM细胞亚群表现出更强的增殖能力（Ki-67+）,更强的效应器功能（TNF+,IFN-γ+,IL-17+）和极少量的细胞凋亡（Caspase3/7+7-AAD+）。3、CD4+CD28+TEM和CD4+CD57+PD1-两群细胞亚群存在着极少量的重叠部分。4、共抑制分子TIGIT无论在体内还是体外,均在各危险记忆性T细胞上表达,可以作为调节贝拉希普相关移植排斥反应发生的潜在靶点。5、在小鼠皮肤移植后,共抑制分子TIGIT的表达显着增高,而在应用贝拉希普免疫抑制治疗后TIGIT表达又迅速下降。6、接受贝拉希普及TIGIT激动剂联合免疫抑制治疗的皮肤移植小鼠,其皮肤移植物存活率显着优于单纯贝拉希普组皮肤移植小鼠。7、共抑制分子TIGIT可显着增加贝拉希普相关高危记忆性T淋巴细胞凋亡（Caspase3/7+7-AAD+）。8、共抑制分子TIGIT可显着降低和控制Th17细胞群的细胞因子释放,分化和转录。9、共抑制分子TIGIT可明显降低IL-17阳性的调节性T细胞表达。10、将高危记忆性T细胞或Th17细胞单独分离后,TIGIT对其抑制作用消失。结论:1、CD4+CD28+TEM和CD4+CD57+PD1-两群细胞亚群在免疫反应中的特点及功能相近,且均较CD8+CD28null细胞亚群发挥更强大的效应器功能。2、在同种异体移植免疫反应中,CD4+CD28+TEM细胞亚群较其他亚群发挥更强大的效应器功能,是造成免疫抑制剂贝拉希普排斥反应的最可能的潜在危险T细胞群。3、CD4+CD28+TEM和CD4+CD57+PD1-细胞亚群是两群相互独立的T细胞群,它们在移植排斥反应中各自发挥相应的效应器功能。4、贝拉希普及TIGIT激动剂联合免疫抑制治疗较贝拉希普单药治疗可显着改善移植物存活率。5、共抑制分子TIGIT通过诱导T细胞凋亡来抑制贝拉希普相关高危记忆性T淋巴细胞反应。6、TIGIT可有效调控Th17细胞免疫反应。7、TIGIT可有效控制belatacept和lulizumab所致的Treg细胞不稳定性。8、TIGIT通过细胞外源性途径间接地对高危记忆性T细胞和Th17细胞发挥免疫抑制作用。
杨楠[7]（2019）在《PD-L1基因修饰增强间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用及其调控机制》文中提出研究背景急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host disease,aGVHD）是异基因造血干细胞移植后的严重并发症,是造成患者移植后死亡的重要原因。目前临床试验研究表明间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）在急性移植物抗宿主病的预防和治疗中发挥一定作用,但其应用仍存在一定争议,因此寻找提升间充质干细胞免疫调节能力的新方法有望增强间充质干细胞在预防和治疗急性移植物抗宿主病中的作用。研究目的探究程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1,PD-L1）基因修饰的MSC对免疫效应细胞的抑制作用,为进一步用于临床预防和治疗aGVHD奠定基础。研究方法和结果1.体外培养和鉴定人脐带MSC。镜下观察MSC呈纺锤形,具有贴壁、涡旋状排列生长的特性;流式结果显示,本研究中使用的MSC细胞表面CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR 阳性率在2%以下,CD73、CD90和CD105阳性率在99%以上;成脂肪诱导后油红O染色可检测到细胞内的脂肪,成骨诱导后定量PCR（qPCR）可检测到成骨标志性基因RUNX2和Osteocalcin（OC）在mRNA水平表达的升高。2.过表达PD-L1对人脐带MSC免疫调节作用的影响。腺病毒感染MSC进行PD-L1基因修饰后,流式可检测到MSC表面PD-L1的表达随着MOI的增加逐渐升高;通过cck-8法检测增殖、流式检测细胞凋亡和表面标志,我们发现过表达PD-L1不改变MSC的细胞形态、增殖能力、凋亡情况以及细胞表面标志;利用植物血球凝集素（phytohaemagglutinin,PHA）刺激人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,将MSC与人外周血单个核细胞共培养,CFSE染色后流式检测T淋巴细胞增殖和激活标志物CD25、CD69阳性细胞的水平,我们发现①当MSC与PBMC共培养的比例为1:5或1:10时,与PD-L1基因修饰的MSC共培养的CD3+T淋巴细胞和CD3+CD8+T淋巴细胞增殖能力显着下降（1:5,CD3+T细胞数量486 vs 310 p=0.007,CD3+CD8+T 细胞数量 249 vs 102 p=0.001,CD3+T 细胞增殖指数 1.72 vs 1.10 p=0.005,CD3+CD8+T 细胞增殖指数 2.37 vs 1.26 p=0.005;1:10,CD3+T 细胞数量 1015 vs 671 p=0.014,CD3+CD8+T 细胞数量 521 vs 245 p=0.002,CD3+T 细胞增殖指数 1.16 vs 1.05 p=0.005,CD3+CD8+T 细胞增殖指数 1.95 vs 1.26 p=0.002）②当 MSC 与 PBMC共培养的比例为1:10时,CD3+CD8+T淋巴细胞的激活水平显着降低（CD25 阳性细胞数量 13 vs4p=0.019,CD25 阳性细胞比例 4.07%vs 1.13%p=0.039）。3.人脐带MSC中PD-L1的表达调控机制研究。干扰素γ（Interferonγ,IFN γ）刺激后 qPCR 法检测 MSC 中 PD-L1 以及 Aire、HIF1 α、IRF1、STAT3、NFκB 和 A20等基因mRNA表达水平的变化,我们发现IFN γ刺激后PD-L1表达显着升高的同时,IRF1、STAT3、NFκB和A20的表达水平也显着升高,其中IRF1升高的幅度最大（最高可达70倍以上）;通过脂质体转染siRNA敲低IRF1的表达,qPCR检测IRF1和PD-L1 mRNA表达水平,我们发现敲低IRF1后PD-L1的表达也随之降低,其中150nM siRNA加 30ng/mlIFN γ 刺激 20h 条件下的结果最明显（IRF1 1 vs 0.68 p<0.001,PD-L11 vs 0.53 p=0.001）;另一方面,通过慢病毒感染过表达IRF1,qPCR检测IRF1和PD-L1 mRNA表达水平,我们发现过表达IRF1可导致PD-L1表达的升高（IRF1 1 vs 30.80 p=0.018,PD-L1 1 vs 10.87 p=0.009）。研究结论1.本研究中使用的人脐带MSC状态良好,在生长特性、表面标志和成脂肪、成骨分化能力上符合目前的国际鉴定标准;2.PD-L1基因修饰可增强人脐带MSC对T淋巴细胞激活和增殖的抑制作用;3.在人脐带MSC中,IRF1参与了 PD-L1的表达调控。
杨锦涛[8]（2019）在《滤泡辅助T细胞及单核/巨噬细胞来源的外泌体在肾移植术后抗体介导的排斥反应中的作用及机制研究》文中研究指明目的与意义:抗体介导的排斥反应是移植肾失功的关键因素,目前对于其免疫分子机制认识尚不充分,临床上对于ABMR的治疗仍停留在非特异性抑制或清除产生抗体的细胞或阻断已产生的抗体作用层面,靶向性差。滤泡辅助T细胞是一类促进B细胞成熟、形成抗体的CD4细胞。外泌体是一种小囊泡,由细胞装配和释放,参与譬如细胞迁移、抗原提呈、免疫应答、肿瘤侵袭等许多生物学过程。Tfh来源外泌体与B细胞分化以及与ABMR相关性尚无报道。肾移植术后,供者肾小球内皮细胞最先接触到受者免疫细胞,研究两者之间外泌体的传递对于研究移植排斥至关重要。移植肾进入体内后将立即激活受体的先天性免疫,大量的单核/巨噬细胞归巢和并浸润到移植物中。单核/巨噬细胞表面配体能作用于内皮细胞上受体,发挥粘附、促炎功能,因此其可作为一个有效模型,研究肾移植后免疫细胞同供体组织细胞之间外泌体传递。本课题在前期对Tfh细胞在ABMR中的作用机制研究的基础上,进一步研究其分泌的外泌体在ABMR的作用,检测CRAD患者循环CD4+CXCR5+外泌体,分析其与ABMR的相关性。并进一步分离Tfh细胞体外培养后获取Tfh细胞来源的外泌体,将其在SEB刺激下与B细胞共培养,分析其对B细胞增殖与分化的影响。不仅为阐明Tfh细胞辅助B细胞增殖和分化的机制提供了新的视角,而且为ABMR的预防和监测提供了新的途径。并且以Netrin-1作为一种分子模型来讨论神经分子对单核/巨噬细胞和肾小球内皮细胞信息交流的影响,为理解器官同种异体移植后神经、免疫和血管之间的相互作用和联系外泌体的传递提供新的见解。CD4+CXCR5+外泌体与肾移植术后ABMR的相关性研究方法:1、研究对象选择:选取在解放军总医院第八医学中心就诊的肾移植术后慢性移植肾失功（CRAD）患者作为研究对象,并选择同时期术后肾功正常患者做为对照组。2、标本的采集:入组的研究对象于清晨空腹收集液标本,ABMR组患者标本均为临床确诊ABMR针对治疗前及时收集血清标本。3、研究对象分组:依据2013年ABMR的Banff标准分两组,包括ABMR及非ABMR组。4、外泌体分离方法:利用聚合物沉淀法提取。5、鉴定外泌体:TEM鉴定外泌体形状和大小;NTA技术鉴定粒径和浓度;Western鉴定分子标志。6、流式检测:使用包被抗CD63抗体磁珠结合外泌体,应用流式细胞术检测CD4、CXCR5等表面标志:使用Invitrogen公司的Exosome-Human CD63分离/检测试剂,使外泌体和磁珠结合,应用流式检测CD4、CXCR5、CTLA-4、HLA-G,比较ABMR组患者与非ABMR组患者之间CD4+CXCR5+外泌体的差异,分析其与ABMR的相关性。7、收集临床资料:性别、年龄、肾移植术后的时间等和化验指标。8、数值数据记录为平均值土标准差（x±s）。应用SPSS 19.0对数据进行分析计算。使用双侧Wilcoxon秩和检验来比较临床资料。Spearman等级测试相关性和配对t检验比较实验数据。P<0.05设定为具备统计学差异。结果:1、外泌体的基本特点:TEM显示,分离的外泌体呈茶盘型/半球形,具有凹面,粒径50-100nm;NTA结果显示囊泡粒径约100nm;Western Blot检测外泌体蛋白表达;CD9、CD81及TSG101这三种标志蛋白在血清分离出的囊泡中均有表达。2、流式细胞仪比较各组受者血清分离的外泌体及其亚型的差异:CRAD组病例血清和移植肾功能正常病例血清CD4+CXCR5+外泌体比例无明显差异。在CRAD组中,CD4+CXCR5+CXCR3-外泌体的比例高于对照组。CRAD患者进一步分为ABMR组和非ABMR组,组间CD4+CXCR5+外泌体比例无显着差异,而ABMR组CD4+CXCR5+CXCR3-外泌体比例显着高于非ABMR组。3、流式检测Tfh细胞来源外泌体上HLA-G和CTLA-4水平:与对照组相比,CRAD组中HLA-G和CTLA-4的CD4+CXCR5+外泌体表达没有明显变化。CRAD患者中,ABMR组中CD4+CXCR5+外泌体上CTLA-4水平显着低于非ABMR组,但HLA-G水平差异不明显。结论:肾移植术后ABMR患者血清中CD4+CXCR5+CXCR3-外泌体增加,提示其和ABMR有关。ABMR患者血CD4+CXCR5+外泌体表面CTLA-4水平明显降低。ABMR患者外周血Tfh来源外泌体对B细胞的影响方法:1、研究对象及分组:同第一部分。2、标本的采集:获取外周血,保存抗凝管中。3、分离PBMC:淋巴细胞分离液获取PBMC。4、分选滤泡辅助T细胞:磁珠法先阴性分选标本CD4细胞;再阳性分选CD4+CXCR5+Tfh。5、培养滤泡辅助T细胞:将Tfh加入含10%去除外泌体胎牛血清RPMI1640培养基48h。6、分离Tfh细胞来源的外泌体:利用聚合物沉淀法提取。7、流式细胞术检测外泌体中HLA-G和CTLA-4的表达。8、外泌体示踪实验:使用PKH67进行染色,然后加至B细胞培养,验证其是否被吞噬。9、将外泌体加入耗尽Tfh细胞的淋巴细胞培养基共培养48h,流式细胞术测量其中B细胞（CD3-CD19+细胞）和浆细胞（CD3-CD19-CD38+细胞）的比例。并用ELISA检测Ig浓度。结果:1、在ABMR组患者中,Tfh细胞来源的外泌体上的CTLA-4表达降低,但HLA-G与非ABMR组无差异;2、Tfh细胞来源的外泌体可以被B细胞吞噬;3、ABMR患者Tfh来源外泌体刺激B细胞分化、扩增,相对于非ABMR组,B细胞和浆细胞的比例分别增加87.52%和110.2%;4、ABMR患者中Tfh来源外泌体刺激IgG和IgA产生,但对IgM产生没有显着影响。结论:1、Tfh来源外泌体可以被B细胞吞噬;2、ABMR患者Tfh来源外泌体促进B细胞分化、增殖,并且能够增加IgG、IgA抗体生成;3、ABMR组患者Tfh细胞来源的外泌体上的CTLA-4表达降低,但HLA-G的表达与非ABMR组无差异,推测外泌体可能是CTLA-4发挥免疫抑制效应的重要载体。单核细胞/巨噬细胞通过外泌体靶向递送HLA-G至内皮细胞方法:1、获取志愿者PBMC,分选单核/巨噬细胞;2、与丝裂霉素C处理过的肾小球内皮细胞以及来自相同志愿者的淋巴细胞进行混合淋巴细胞培养（MLC）;3、更换培养基继续培养单核/巨噬细胞,分组加入Netrin-1及外泌体抑制剂GW4869,流式细胞术检测单核/巨噬细胞的表型及HLA-G蛋白的表达;4、MLC48小时后,从单核/巨噬细胞中除去刺激因子,然后将细胞加入到室的上部,并且预先在室的下部放进肾小球内皮细胞。培养48h后获取下部内皮细胞;5、流式检测内皮细胞表面HLA-G及其受体、黏附分子水平;6、聚合物沉淀法试剂盒分离单核/巨噬细胞来源的外泌体,示踪实验检测是否被内皮细胞吞噬;7、外泌体同内皮细胞共培养,流式检测HLA-G蛋白水平。结果:Netrin-1促进了单核/巨噬细胞的表型转化和HLA-G的表达,神经突起导向因子Netrin-1刺激的单核/巨噬细胞通过外泌体的递送促进内皮细胞中HLA-G及其受体的表达,单核/巨噬细胞在Netrin-1刺激后外泌体HLA-G表达的显着增强;使用抗体密封外泌体上的HLA-G,可以显着抑制Netrin-1组中内皮细胞的HLA-G的表达。神经突起导向因子Netrin-1促进单核/巨噬细胞来源外泌体HLA-G靶向递送至内皮细胞。Netrin-1刺激的单核/巨噬细胞抑制内皮细胞中促炎分子表达。结论:1、MLC诱导单核/巨噬细胞向M1极化,增强其HLA-G表达,神经突起导向因子Netrin-1能部分逆转这种极化,进一步促进单核/巨噬细胞的HLA-G表达;2、单核/巨噬细胞通过外泌体靶向递送HLA-G至进内皮细胞,神经突起导向因子Netrin-1能促进这种传递方式。
冯豪[9]（2019）在《巴利昔单抗抑制人T淋巴细胞活化与增殖的体外实验研究》文中认为目的:抗人CD25单克隆抗体（巴利昔单抗）是临床器官移植常用的免疫诱导治疗药物,虽然理论上其主要通过阻断T淋巴细胞激活的第三信号发挥免疫抑制作用,但其对T细胞活化、增殖以及细胞因子分泌的影响却鲜有报道。本实验通过在体外建立稳定的抗原非特异性T淋巴细胞反应体系及同种异体抗原特异性混合淋巴细胞反应（MLR）体系,利用舒莱（巴利昔单抗,Novartis）进行干预,观察舒莱抑制T细胞活化及增殖反应的强度,为阐明巴利昔单抗的免疫学作用机制提供实验证据。方法:体外分别建立抗原特异性人T淋巴细胞反应及抗原非特异性人T淋巴细胞反应体系。其中抗原非特异性T淋巴细胞反应是利用抗人CD3/CD28抗体直接刺激T细胞活化增殖,刺激后第3天使用抗人CD3、CD4、CD8、CD25及CD69等流式抗体检测反应性T细胞活化及增殖情况,并留取培养体系的上清做细胞因子检测。而抗原特异性T淋巴细胞反应则是首先分离不同健康人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,其中一个个体的PBMC作为MLR的反应细胞,另一个体的PBMC进行放射照射灭活后作为MLR的刺激细胞,应用细胞培养技术,建立同种异体混合淋巴细胞反应（MLR）体系。两种体外细胞培养体系中的反应细胞均在培养前使用CFSE进行染色,以便通过流式细胞技术检测培养后T细胞的增殖情况。两种实验方法均分为阴性对照组和给药组,其中给药组设计0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml等6个不同药物浓度梯度的舒莱进行干预,培养3天后用流式细胞术检测各组T细胞活化和增殖的程度,CBA法检测细胞因子的分泌情况,观察不同浓度舒莱抑制T细胞增殖的强度。结果:体外实验证实,不同浓度的舒莱对特异性和非特异性T细胞增殖均有剂量依赖性抑制效果,正常同种异体淋巴细胞反应（MLR）体系中,T细胞增殖比例可达20-50%,而抗CD3/CD28抗体刺激T细胞增殖比例可达50-70%（CD4+T和CD8+T细胞均有显着增殖）。而给药组T细胞的增殖受到显着抑制,T细胞的增殖比例分别降至4%-10%和8-20%。此外,T细胞中期活化标志CD25分子的表达也明显下调,而对T细胞早期活化标志CD69分子的表达影响较小。CBA法检测细胞分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子,其中给药的大剂量组IFN-γ分泌量较对照组明显减少,而IL-2的含量显着高于对照组。结论:体外实验表明,巴利昔单抗能显着结合初始活化的人T淋巴细胞,抑制其进一步激活与增殖,对T淋巴细胞反应具有较强的免疫抑制作用。本研究为巴利昔单抗的临床应用提供了进一步的实验证据。
陈旗龙[10]（2019）在《免疫诱导在公民逝世后器官捐献肾移植的临床研究》文中指出背景:自1954年完成全球首例肾移植手术以来,肾移植手术便逐渐成为了终末期肾病最有效且常规的治疗方式,随着医学发展,手术成功率已经非常高。肾移植手术能够获得如此突飞猛进的成果与不断深入的加强对移植免疫学认识密不可分。伴随移植手术的发展,各种安全有效、低毒的免疫抑制剂被开发并被广泛的应用于临床,因为免疫抑制剂的出现才使得真正意义上的器官移植变为可能,并极大地推动了器官移植事业的发展。目前常见的免疫抑制剂包括:化学免疫抑制剂和生物免疫抑制剂两大类;第一类:化学免疫制剂:（1）抗细胞增殖类药物,代表药物如硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯、咪唑立宾、环磷酰胺;（2）肾上腺糖皮质激素,代表药物如:泼尼松、泼尼松龙、氢化可的松等;（3）钙调磷酸酶抑制剂,代表药物如:环孢素、他克莫司;（4）雷帕霉素靶分子抑制剂,代表药物如:西罗莫司、依维莫司;（5）其他免疫抑制剂,代表药物如:15-脱氧精胍素、二氢乳清酸脱氢酶抑制剂-来氟米特等;第二类:生物免疫抑制剂-（抗淋巴细胞抗体）:（1）多克隆抗淋巴细胞抗体,代表药物如:抗淋巴细胞球蛋白、抗胸腺细胞球蛋白;抗淋巴细胞球蛋白、抗胸腺细胞球蛋白等多克隆抗体能够干扰由细胞介导的免疫反应,包括移植物排斥反应、对结核菌素的敏感性以及移植物抗宿主反应。多克隆抗体可以去除已经发生的迟发型超敏反应。尤其在对于治疗经过激素冲击治疗后未逆转的排斥反应有较好的效果。（2）单克隆淋巴细胞抗体:代表药物如巴利昔单抗（舒莱）、达利珠单抗（赛尼派）;（3）其他新型单克隆抗体如:阿仑单克隆抗体（卡帕什）、力利妥昔单克隆抗体（美罗华）;与多克隆抗体相比较,单克隆抗体的优势在于单克隆抗体是由杂交瘤细胞所产生的只针对某一特定的抗原决定簇的抗体,具有纯度高、特异性高、性质均一、可无限重复等特点,避免了多克隆抗体各批次之间效价不一的缺点[1]。目前常用的免疫诱导剂为巴利昔单抗（舒莱）以及抗胸腺细胞球蛋白[2];我院采取术前给予多克隆抗体抗人胸腺细胞兔免疫球蛋白进行免疫诱导,根据个体情况术后选择联合环孢素/他克莫司+吗替麦考酚酯(/麦考酚钠肠溶片+激素三联免疫抑制方案。肾移植术后发生移植肾功能延迟恢复、急性排斥反应术后不良并发症等情况都会严重影响移植人/肾的存活率,而移植人/肾能够长期存活以及实现免疫耐受状态一直是移植专家们所追求的目标。抗体免疫诱导在临床上得到应用已有30余年的历史,随着生物学技术不断进步,对抗体免疫诱导剂的不断深入研究,国内外已有大量动物实验以及研究证实移植术前应用抗体类生物免疫诱导剂可以有效地降低术后急性排斥反应的发生率,但对于生物免疫诱导剂的选择以及是否能够减少移植术后感染及其他并发症的出现目前鲜有研究（或报道）。目的:回顾公民逝世后器官捐献供肾肾移植受者临床资料探讨以抗人胸腺细胞兔免疫球蛋白（ATG-F）为主的肾移植围手术期免疫诱导方案的安全性及有效性。方法:回顾性分析自2007年1月-2018年12月期间在内蒙古包钢医院泌尿外科行公民逝世后器官捐献供肾肾移植手术的68例患者,选取病例完整、术后随访时间满1年的患者共56例纳入本次研究,调取这56例患者的临床资料作为研究对象,根据是否给予免疫诱导治疗分为实验组、对照组两组,实验组,共30例,依据受者体重、体质情况给予ATG-F治疗,对照组,共26例,未接受免疫诱导治疗的肾移植受者;两组患者术后均联合环孢素/他克莫司+吗替麦考酚酯/麦考酚钠肠溶片+激素三联免疫抑制方案并依据血药浓度调整他克莫司浓度或者环孢素剂量。通过临床数据分析两组术后早期急性排斥反应、移植肾功能延迟恢复、原发性肾移植移植肾无功能、各类感染、移植肾失功、受体死亡等数据的分析得出结论。结果:56例肾移植术后患者,共有33例受者术后肾功能正常恢复,比例为48.21%;其中实验组为22例,占39.28%;对照组为11例,占19.64%;共有10例发生急性排斥反应,比例为17.85%;其中实验组为2例,占3.57%;对照组为8例,占14.28%;移植肾延迟恢复共有9例;比例为16.07%:其中实验组为6例;占10.71%,对照组为3例,占5.35%;共有4例患者发生死亡,试验组为1例,对照组为3例;两组比较,实验组急性排斥反应发生率明显低于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）;两组患者移植肾延迟恢复发生率比较,差异无统计学意义,（均为P>0.05）;两组患者移植肾缓慢恢复发生率比较,差异无统计学意义（均为P>0.05）;术后12月移植人/肾存活率差异无统计学意义（P>0.05）;实验组受者的肺部感染发生率稍高于对照组,但两组之间比较差异无统计学意义（均为P>0.05）,术后发生骨髓抑制的受者组间比较差异无统计学意义（均为P>0.05）;两组移植受者,泌尿道感染的发生率比较,无显着差异,无统计学意义（均为P>0.05）;两组移植受者消化道反应发生率比较,无显着统计学差异（P>0.05）;两组患者术后1月、3月及6个月的血肌酐值变化无显着差异（P>0.05）;术后12个月的血肌酐值存在显着统计学差异（P<0.05）。结论:在围手术期给予ATG-F诱导可明显降低肾移植术后急性排斥反应的发生率,但不增加术后各类感染等并发症的发生率,可能由于样本量少,在实际例数上以及感染的严重程度上足以引起临床上的重视。短期内人/肾存活率较高,有较好的安全性及有效性。
二、鼠抗人CD3、CD4单克隆抗体治疗肾移植后急性排斥反应的疗效观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鼠抗人CD3、CD4单克隆抗体治疗肾移植后急性排斥反应的疗效观察（论文提纲范文）
（1）木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究（论文提纲范文）
| 答辩委员会名单及评定意见 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 移植免疫概述 |
| 一、器官移植排斥反应概述 |
| 二、调节性T细胞在移植免疫中的作用 |
| 三、DC细胞在移植免疫中的作用 |
| 第二节 免疫抑制剂在器官移植中的作用 |
| 一、免疫抑制剂分类 |
| 二、雷帕霉素 |
| 第三节 中医药在器官移植中的研究进展 |
| 一、中医药对移植前后的病因病机认识 |
| 二、中医药对移植前后的辨证认识 |
| 三、中药对器官移植的治疗 |
| 第四节 木犀草素的研究进展 |
| 一、木犀草素药代动力学及生物利用度的研究进展 |
| 二、木犀草素药理作用的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 木犀草素对小鼠皮肤移植排斥反应的实验研究 |
| 一、小鼠同种异体皮肤移植模型的建立 |
| 二、木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的作用 |
| 三、木犀草素联合应用Anti-CD25抗体删除Treg对小鼠皮肤移植反应的影响 |
| 四、讨论 |
| 第二节 木犀草素对小鼠胰岛移植排斥反应的实验研究 |
| 一、小鼠同种异体胰岛移植模型的建立 |
| 二、木犀草素对小鼠胰岛移植的作用 |
| 三、讨论 |
| 第三节 木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验 |
| 一、实验内容 |
| 二、讨论 |
| 第三章 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、创新性 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（2）第一部分 重型再生障碍性贫血免疫稳态研究-CD4+T淋巴细胞转录组深度测序及整合分析 第二部分 伴Coombs’试验（+）血细胞减少患者临床特征及预后分析 第三部分 获得性再生障碍性贫血CD8+调节性T细胞的特征研究（论文提纲范文）
| 第一部分 重型再生障碍性贫血免疫稳态研究——CD4~+T淋巴细胞转录组深度测序及整合分析 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 伴COOMBS'试验(+)血细胞减少患者临床特征及预后分析 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 病例与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 获得性再生障碍性贫血CD8~+调节性T细胞的特征研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 CD8~+CD28~-T细胞作用机制研究现状 |
| 参考文献 |
| 附录一 主要实验仪器和试剂 |
| 附录二 英文缩略语表 |
| 附录三 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（3）PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 外周血和淋巴结中T细胞PD-1表达以及血浆中可溶性PD-1和PD-L1水平动态变化对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| 一、外周血和淋巴结中T细胞PD-1表达对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、血浆中可溶性PD-1和PD-L1水平动态变化对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 第二部分 PD-1阻断策略临床应用于难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及其预后生物标记物和耐药机制研究 |
| 一、PD-1单抗临床应用难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及其预后生物标记物和耐药机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、PD-1基因敲减的CAR-CD19T细胞临床应用难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及耐药机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 第三部分 小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的疗效观察及机制研究 |
| 一、小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的疗效观察 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 淋巴瘤免疫治疗的现状及展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（4）Treg细胞外泌体诱导移植肝免疫耐受的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 Treg细胞对CD8~+T细胞功能和增殖影响的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 Treg细胞来源的exosomes对CD8~+T细胞功能和增殖影响的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 Treg及其exosomes可通过microRNA-194-1-3p靶向LAT1 (Slc7a5)调控mTOR信号传导通路 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 Treg细胞对同种异体原位肝移植影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Treg细胞及其来源的exsomes与移植免疫耐受 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）CD73在子宫内膜再生细胞抑制小鼠同种异体心脏移植物排斥反应中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、ERC的提取、培养、细胞表型鉴定以及CD73表达情况的鉴定 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 ERC的提取和培养 |
| 1.1.2 ERC的形态学观测 |
| 1.1.3 ERC的细胞表型鉴定 |
| 1.1.4 CD73的免疫荧光 |
| 1.1.5 主要仪器、耗材、试剂 |
| 1.1.6 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 ERC的形态 |
| 1.2.2 细胞表型鉴定结果 |
| 1.2.3 ERC表面CD73免疫荧光结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、ERC表面表达的CD73的体外功能研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 ERC细胞悬液的制备 |
| 2.1.2 ERC表面CD73的体外催化功能研究 |
| 2.1.3 小鼠脾脏细胞悬液的制备 |
| 2.1.4 抗CD73抗体预处理的ERC |
| 2.1.5 体外细胞共培养实验 |
| 2.1.6 流式细胞技术 |
| 2.1.7 主要仪器耗材和实验试剂 |
| 2.1.8 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 ERC表达的CD73能够体外催化AMP脱磷酸形成ADO |
| 2.2.2 表达CD73的ERC于体外可以抑制成熟DC的产生 |
| 2.2.3 表达CD73的ERC于体外能够促进M2 的增殖 |
| 2.2.4 表达CD73的ERC于体外能够促进Treg的增殖 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、ERC表达CD73在其抑制小鼠同种异体心脏移植物排斥反应中的作用及作用机制 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 小鼠同种异体异位心脏移植模型的制备 |
| 3.1.3 实验分组及治疗 |
| 3.1.4 同种异体异位心脏模型移植物生存观察 |
| 3.1.5 模型标本取材 |
| 3.1.6 组织病理检测及评分 |
| 3.1.7 免疫组织化学染色及分析 |
| 3.1.8 流式细胞术 |
| 3.1.9 单向混合淋巴细胞反应 |
| 3.1.10 酶联免疫吸附实验 |
| 3.1.11 实时荧光定量PCR |
| 3.1.12 相关仪器、耗材、试剂 |
| 3.1.13 统计学方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 ERC表达CD73能够延长小鼠心脏移植物的生存期 |
| 3.2.2 ERC表达CD73能够改善小鼠心脏移植物的病理改变 |
| 3.2.3 ERC表达CD73能够减轻小鼠心脏移植物急性细胞排斥反应 |
| 3.2.4 ERC表达CD73能够降低成熟DC的比例 |
| 3.2.5 ERC表达CD73能够增强Tol-DC的功能 |
| 3.2.6 ERC表达CD73能够降低总巨噬细胞数量并促进巨噬细胞向M2 极化 |
| 3.2.7 ERC表达CD73能够诱导体内Treg细胞增多 |
| 3.2.8 ERC表达CD73参与调节抗炎细胞因子和促炎因子的平衡 |
| 3.2.9 ERC表达CD73影响移植心脏A_(2A)和A_(2B)受体mRNA的转录水平 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 CD73/ADO/ADOR信号通路在实体器官移植免疫中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）共抑制分子TIGIT在抗器官移植排斥反应中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:接受贝拉希普免疫抑制治疗的肾移植病人发生移植排斥反应的潜在“高危”T细胞亚群的研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器及设备 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 单细胞悬液(Human PBMC)的分离和制备 |
| 2.2.2 细胞悬液的解冻和复苏技术 |
| 2.2.3 多克隆抗原刺激-免疫细胞体外刺激实验 |
| 2.2.4 同种异体抗原刺激-单向混合淋巴细胞反应 |
| 2.2.5 细胞表面染色 |
| 2.2.6 细胞内细胞因子染色 |
| 2.2.7 荧光染料Cell Trace Violet的细胞染色 |
| 2.2.8 凋亡标记物Caspase3/7和7-AAD的流式染色法 |
| 2.2.9 流式细胞仪的上机检测 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 设门策略(Gating Strategy) |
| 3.1.1 CD4~+或CD8~+T淋巴细胞群的设门策略 |
| 3.1.2 Belatacept相关“高危”T淋巴细胞亚群的设门策略 |
| 3.2 Belatacept相关“高危”T淋巴细胞亚群的增殖能力评价 |
| 3.2.1 多克隆抗原刺激下,“高危”T淋巴细胞亚群的增殖能力评价 |
| 3.2.2 同种异体抗原刺激下,“高危”T淋巴细胞亚群的增殖能力评价 |
| 3.2.3 多克隆性与同种异体特异性-贝拉希普相关“高危”T淋巴细胞亚群库的比较 |
| 3.3 Belatacept相关“高危”T淋巴细胞亚群的功能评价 |
| 3.3.1 促炎细胞因子IL-2的分泌功能评价 |
| 3.3.2 促炎细胞因子TNF的分泌功能评价 |
| 3.3.3 促炎细胞因子IFN-γ的分泌功能评价 |
| 3.3.4 促炎细胞因子IL-17的分泌功能评价 |
| 3.4 Belatacept相关“高危”T淋巴细胞亚群的活化指标评价 |
| 3.4.1 T淋巴细胞活化指标CD69表达评价 |
| 3.4.2 T淋巴细胞活化指标CD38表达评价 |
| 3.4.3 T淋巴细胞活化指标HLA-DR表达评价 |
| 3.5 Belatacept相关“高危”T淋巴细胞亚群的细胞凋亡水平评价 |
| 3.6 Belatacept相关“高危”T淋巴细胞亚群的重叠程度分析 |
| 3.7 Belatacept相关“高危”T淋巴细胞亚群的共刺激分子和共抑制分子表达评价 |
| 3.7.1 T淋巴细胞表面共抑制分子FcγRⅡB表达评价 |
| 3.7.2 T淋巴细胞表面共抑制分子TIGIT表达评价 |
| 3.7.3 T淋巴细胞表面共刺激分子DNAM表达评价 |
| 3.7.4 在贝拉希普存在时,T淋巴细胞表面共刺激分子DNAM和共抑制分子TIGIT的表达评价 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:共抑制分子TIGIT激动剂调节贝拉希普相关移植排斥反应的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器及设备 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠皮肤移植模型的建立 |
| 2.2.2 同种异体抗原刺激-单向混合淋巴细胞反应 |
| 2.2.3 人CD4阳性T_(conv)细胞分离实验 |
| 2.2.4 人CD8阳性T淋巴细胞分离实验 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 共抑制分子TIGIT在小鼠皮肤移植排斥反应中的作用研究 |
| 3.1.1 小鼠皮肤移植后,共抑制分子TIGIT在器官特异性淋巴细胞上的表达评价 |
| 3.1.2 共刺激阻滞剂对共抑制分子TIGIT表达的作用研究 |
| 3.1.3 共刺激阻滞剂对共刺激分子DNAM表达的作用研究 |
| 3.1.4 共刺激阻滞剂对CD4阳性和CD8阳性器官特异性T淋巴细胞库的作用研究 |
| 3.1.5 共抑制分子TIGIT激动剂联合贝拉希普可显着提高小鼠皮肤移植物存活率 |
| 3.2 共抑制分子TIGIT对人体贝拉希普相关“高危”记忆性T淋巴细胞亚群凋亡水平的作用研究 |
| 3.2.1 Caspase3/7阳性、7-AAD阳性的凋亡细胞表达评价 |
| 3.2.2 Annexin V阳性、7-AAD阳性的凋亡细胞表达评价 |
| 3.3 共抑制分子TIGIT对人体贝拉希普相关“高危”记忆性T淋巴细胞亚群增殖能力的作用研究 |
| 3.4 共抑制分子TIGIT对人体贝拉希普相关“高危”记忆性T淋巴细胞亚群效应器功能的作用研究 |
| 3.5 共抑制分子TIGIT对T淋巴细胞活化水平的作用研究 |
| 3.5.1 共抑制分子TIGIT对T细胞活化指标CD38的作用评价 |
| 3.5.2 共抑制分子TIGIT对T细胞活化指标HLA-DR的作用评价 |
| 3.5.3 共抑制分子TIGIT对T细胞活化指标CD69的作用评价 |
| 3.6 共抑制分子TIGIT诱导T淋巴细胞凋亡的机制研究 |
| 3.6.1 共抑制分子TIGIT表达与共刺激分子DNAM的关系研究 |
| 3.6.2 共抑制分子TIGIT表达与其他共抑制分子的关系研究 |
| 3.6.3 共抑制分子TIGIT表达与效应器功能的关系研究 |
| 3.6.4 共抑制分子TIGIT表达与T细胞活化指标的关系研究 |
| 3.6.5 共抑制分子TIGIT通过细胞外源性途径来诱导高危记忆性T淋巴细胞凋亡 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:共抑制分子TIGIT调节Th17细胞亚群的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 同种异体抗原刺激-单向混合淋巴细胞反应 |
| 2.2.2 human fgl2的ELISA法检测 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Th1,Th17及Tc17细胞群的设门策略 |
| 3.2 共抑制分子TIGIT在不同细胞因子分泌细胞的表达 |
| 3.2.1 共抑制分子TIGIT在CD4阳性传统T淋巴细胞上的表达 |
| 3.2.2 共抑制分子TIGIT在不同细胞因子分泌细胞上的表达 |
| 3.2.3 共抑制分子TIGIT在不同Th17细胞亚群上的表达 |
| 3.3 共抑制分子TIGIT调节Th17细胞亚群细胞因子的分泌 |
| 3.3.1 共抑制分子TIGIT调节供体特异性Th17细胞免疫反应 |
| 3.3.2 共抑制分子TIGIT差异性调节Th17细胞群细胞因子的释放 |
| 3.4 共抑制分子TIGIT调节Th17细胞亚群的分化和转录 |
| 3.5 共抑制分子TIGIT联合belatacept或 lulizumab可有效调节Th17细胞免疫反应 |
| 3.5.1 Belatacept降低共抑制分子TIGIT在Th17细胞上表达 |
| 3.5.2 TIGIT联合belatacept或lulizumab可有效调节Th17细胞免疫反应 |
| 3.6 共抑制分子TIGIT调节Tc17细胞免疫反应 |
| 3.6.1 共抑制分子TIGIT在Tc17细胞上低表达 |
| 3.6.2 共抑制分子TIGIT调节Tc17细胞免疫反应 |
| 3.7 共抑制分子TIGIT调节IL-17阳性调节性T细胞表达 |
| 3.8 共抑制分子TIGIT通过细胞外源性途径调节Th17细胞反应 |
| 3.9 共抑制分子TIGIT不通过抑制性细胞因子fgl2发挥直接的抑制作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 共刺激阻滞剂:抗排斥战场上的新武器 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）PD-L1基因修饰增强间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用及其调控机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 人脐带MSC的培养与鉴定 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二部分 PD-L1基因修饰MSC对T淋巴细胞的免疫抑制作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三部分 PD-L1在人脐带MSC中的表达调控机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（8）滤泡辅助T细胞及单核/巨噬细胞来源的外泌体在肾移植术后抗体介导的排斥反应中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 CD4+CXCR5+外泌体与肾移植术后ABMR的相关性研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料及方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ABMR患者外周血Tfh来源外泌体对B细胞的影响 |
| 一、前言 |
| 二、材料及方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 单核细胞/巨噬细胞通过外泌体靶向递送HLA-G至内皮细胞 |
| 一、前言 |
| 二、材料及方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 外泌体在免疫应答中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章 |
| 致谢 |
（9）巴利昔单抗抑制人T淋巴细胞活化与增殖的体外实验研究（论文提纲范文）
| 主要缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪言 |
| 1 实验研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验装置 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 结果分析和讨论 |
| 3.1 实验结论 |
| 3.2 实验讨论 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（10）免疫诱导在公民逝世后器官捐献肾移植的临床研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、鼠抗人CD3、CD4单克隆抗体治疗肾移植后急性排斥反应的疗效观察（论文参考文献）
- [1]木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究[D]. 叶书林. 广州中医药大学, 2021(02)
- [2]第一部分 重型再生障碍性贫血免疫稳态研究-CD4+T淋巴细胞转录组深度测序及整合分析 第二部分 伴Coombs’试验（+）血细胞减少患者临床特征及预后分析 第三部分 获得性再生障碍性贫血CD8+调节性T细胞的特征研究[D]. 郑璇. 北京协和医学院, 2021(02)
- [3]PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究[D]. 陈晓晨. 苏州大学, 2020(06)
- [4]Treg细胞外泌体诱导移植肝免疫耐受的机制研究[D]. 陈亮. 昆明医科大学, 2020(02)
- [5]CD73在子宫内膜再生细胞抑制小鼠同种异体心脏移植物排斥反应中的作用机制研究[D]. 胡永浩. 天津医科大学, 2020(06)
- [6]共抑制分子TIGIT在抗器官移植排斥反应中的作用及机制研究[D]. 孙赫. 中国医科大学, 2020(02)
- [7]PD-L1基因修饰增强间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用及其调控机制[D]. 杨楠. 中国人民解放军医学院, 2019(02)
- [8]滤泡辅助T细胞及单核/巨噬细胞来源的外泌体在肾移植术后抗体介导的排斥反应中的作用及机制研究[D]. 杨锦涛. 中国人民解放军医学院, 2019(02)
- [9]巴利昔单抗抑制人T淋巴细胞活化与增殖的体外实验研究[D]. 冯豪. 华中科技大学, 2019(03)
- [10]免疫诱导在公民逝世后器官捐献肾移植的临床研究[D]. 陈旗龙. 内蒙古医科大学, 2019(03)