一、DCG-Ⅳ在大鼠脑损伤及二次脑损伤中的神经保护作用（论文文献综述）
汤运梁[1]（2021）在《迷走神经电刺激对创伤性脑损伤的神经保护作用及其机制研究》文中研究表明背景和目的:创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）是临床上较为常见的创伤,多由交通事故、摔倒、暴力事件等原因导致。据统计,全球每年有超过5000万人罹患TBI,是一种发病率、致残率和致死率较高的临床急症,已成为威胁人类健康和生命的重大公共问题。TBI损伤机制复杂,可分为原发性损伤和继发性损伤,原发性损伤指外力直接作用导致脑组织的损伤;继发性损伤包括一系列病理生理过程,如氧化应激、水肿、血-脑脊液屏障破坏、炎性反应、颅内血肿形成等对脑组织形成的二次损伤。然而,TBI的具体分子机制仍不完全明确,而且目前缺乏有效的康复治疗手段。生物信息学是融合生命科学与计算机科学等学科而形成的一门新兴前沿学科。随着生物信息学的发展及组学大数据的产生,我们可以通过对现有的生物数据进行分子生物功能分析,挖掘可用信息进行可视化,从而认识疾病的分子机制,丰富我们对疾病的认识;并且形成新的生物学研究模式,即利用现有的数据信息,先做理论推测,再进行实验验证,最终应用到临床实践。随着TBI基础研究的不断深入和临床诊治技术的提高,一些基础研究成果已经转化至临床应用。然而,目前针对TBI康复治疗存在诸多局限。因此,探索TBI新的治疗策略,并促进TBI患者功能恢复、减少致残率、提高生存质量具有重要的临床意义。迷走神经电刺激（vagus nerve stimulation,VNS）是一种神经调控治疗方法,已在难治性癫痫、持续性及复发性抑郁、和认知功能障碍中取得了显着疗效。近年来一些动物实验和临床研究发现,VNS具有改善脑损伤的潜在作用。然而,VNS在TBI中的具体作用和可能机制尚不明确。因此,本课题首先通过生物信息学技术研究TBI有关的潜在分子机制并进行实验验证,然后探讨VNS对TBI的作用和可能机制。研究方法:下载基因表达综合数据库（gene expression omnibus,GEO）中TBI相关数据集,并利用在线分析工具GEO2R筛选差异表达基因。针对不同时间点（4h、24h）的差异基因表达谱,利用DAVID在线数据库进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,从而探索TBI的潜在分子机制。同时,利用Cytoscape构建可视化PPI网络,运用Cyto Hubba插件筛选PPI网络中的关键基因,并通过动物实验验证筛选的关键基因。然后,通过构建TBI大鼠模型,予以VNS刺激,检测大鼠行为学、脑组织水容量改变指标;通过HE染色观察大鼠脑组织形态学变化;Western Blot和免疫组化技术检测NLRP3、NF-κB、Caspase-3、ASC等蛋白表达情况;实时荧光定量PCR检测TNF-α、IL-6等基因表达水平;TUNEL染色检测脑细胞凋亡,从而分析VNS对TBI的治疗作用及可能分子机制。结果:生物信息学研究结果发现,与假创伤对照组（4h）相比,TBI-4h大鼠脑皮层样本中存在109个差异表达的基因,包括67个表达上调基因以及42个表达下调基因;与假创伤对照组（24h）相比,TBI-24h大鼠脑皮层样本中存在66个差异表达的基因,包括39个表达上调以及27个表达下调基因。然后,分别对TBI-4h及TBI-24h差异表达的基因进行GO和KEGG功能富集分析,结果显示其主要富集在MAPK信号通路、TNF信号通路、正向调控NF-kappa B转录因子活性等通路上。通过PPI网络及Cyto Hubba插件鉴定出TBI-4h及24h前20个关键基因,并且对排名前5位的差异基因进行实验验证。研究结果显示,与对照组相比,TNF-α、C-MYC、SPP1和CXCL10 m RNA水平在TBI-4h组显着升高,而FN1 m RNA水平显着下降;PTPRC、EGF、MMP9和LCN2 m RNA水平在TBI-24h组显着升高,从而提示这些基因可能参与早期脑外伤继发性损伤。接着,我们研究了VNS对脑外伤的保护作用及可能机制。研究结果显示,VNS治疗TBI模型大鼠可以显着减轻脑组织水肿与坏死,并降低神经功能缺损评分。我们进一步研究VNS治疗TBI的可能作用机制,研究结果发现VNS可以促进TBI大鼠脑组织抗氧化酶SOD、CAT、GSH活性,并抑制脂质过氧化产物MDA活性。而且,VNS可以降低TBI大鼠脑组织促凋亡蛋白Bax表达水平,升高抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平,从而减轻TBI大鼠脑组织神经元凋亡。另外,VNS可以促进TBI大鼠脑组织核转录因子NF-κB向核内转移、抑制NLRP3炎症小体活化（NLRP3、ASC、Caspase-1表达下调）,并降低IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6炎症因子水平。结论:本研究结果表明,炎症相关信号通路在TBI损伤中具有重要作用,TNF-α、C-MYC、SPP1、CXCL10、FN1、PTPRC、EGF、MMP9、LCN2基因可能参与早期脑外伤继发性损伤;VNS通过抑制氧化应激、炎症反应和凋亡促进TBI大鼠脑组织修复的作用,而且NF-κB/NLRP3信号通路可能是介导VNS抑制炎症反应的分子机制。本项目将为VNS治疗TBI的作用机制提供理论支持,为推进VNS的临床应用转化提供新的实验数据。
李守信[2]（2021）在《维生素K2通过降低细胞焦亡对创伤性脑损伤大鼠神经保护作用的研究》文中研究表明背景与目的:创伤性脑损伤可引起严重的神经炎症反应,最终导致神经细胞死亡,其中细胞焦亡是脑损伤后炎性细胞死亡中最常见的种类之一。维生素K2（Vitamin K2,VK2）作为一种能通过血脑屏障的抗炎抗氧化剂,可抑制受损细胞炎症反应和氧化应激,进而抑制细胞焦亡,提示VK2在脑损伤后能通过减轻神经炎性反应而发挥神经保护作用。本研究通过构建大鼠创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）模型,观察和分析VK2对TBI大鼠的神经保护作用及其对细胞焦亡经典途径的相关蛋白,NOD样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein3,NLRP3）、半胱天冬蛋白酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-1）、细胞焦亡相关炎性因子白介素1β（Interleukin-1,IL-1β）和白介素18（Interleukin-18,IL-18）表达的影响,探讨VK2是否通过抑制神经细胞焦亡经典途径而对创伤性脑损伤大鼠产生神经保护作用。方法:选择健康、雄性、SPF级SD大鼠36只,体质量约为280～300g,购于辽宁长生生物技术有限公司,进行随机分组（n=12/组）,包括假损伤组（Sham+vehicle group）、创伤性脑损伤组（TBI+vehicle group）,VK2治疗组（TBI+VK2 group）。造模后0.5h,VK2治疗组给予VK2 400 mg/kg腹腔注射。术后24h,采用改良神经功能缺损评分体系（modified neurological severity score,mNSS）和旷场实验（open field test,OFT）评估分析大鼠神经功能改变,然后经麻醉后断头取脑,通过脑水含量测定评估脑创伤处理后实验动物的脑水肿情况、采用TTC染色检测脑组织损伤程度,采用Western blot检测NLRP3、Caspase-1和IL18等参与细胞焦亡过程的蛋白表达情况,采用免疫荧光染色方法检测NLRP3的表达强度,通过Elisa检测细胞焦亡相关炎症因子IL1β和IL18含量的改变。结果:TBI造模后24h采用mNSS评估体系分析实验大鼠的神经功能检测结果显示,与Sham+vehicle组相比,TBI+vehicle组大鼠的mNSS评分在脑损伤后显着升高（P<0.001）;与TBI+vehicle组相比较,TBI+VK2组mNSS评分显着下降（P<0.01）;应用旷场实验评估大鼠的自发活动和焦虑程度,分析结果如下:脑损伤后TBI+vehicle组的运动总路程较Sham+vehicle组显着减少（P<0.001）,TBI+VK2组与TBI+vehicle组相比,运动总路程明显增加（P<0.05）;与Sham+vehicle组相比,TBI+vehicle组中央区域的停留时间显着减少（P<0.01）;给予VK2后,TBI+VK2组较TBI+vehicle组的中央区域的停留时间明显增加（P<0.01）。上述结果提示TBI造模后24h,TBI模型组大鼠出现神经功能障碍、自发活动减少和焦虑程度增加,给予VK2能够缓解TBI大鼠的神经功能障碍、减少的自发活动和增加的焦虑程度。通过脑水含量测定判断TBI造模后24 h大鼠的脑水肿程度,结果如下:与Sham+vehicle组相比,TBI+vehicle组脑损伤24 h后大鼠脑水含量（%）明显升高（P<0.01）;给与VK2后,TBI+VK2组脑组织水含量较TBI+vehicle组显着降低（P<0.05）。通过脑TTC染色检测TBI造模后24 h大鼠脑组织损伤体积,结果如下:与Sham+vehicle组相比,TBI+vehicle组大鼠脑组织损伤体积明显升高（P<0.001）;给与VK2后,TBI+VK2组较TBI+vehicle组损伤体积明显下降（P<0.05）。上述结果提示,VK2能显着降低TBI大鼠的脑损伤体积,减轻TBI大鼠的脑水肿。采用Western blot检测TBI大鼠皮层损伤周围区域焦亡相关靶分子蛋白NLRP3、Caspase-1和IL-18的表达,结果均为靶蛋白表达的灰度与内参蛋白GAPDH相应的灰度比值。结果如下:与Sham+vehicle组相比,TBI+vehicle组大鼠皮层损伤周围区域的NLRP3（P<0.05）、Caspase-1（P<0.05）和IL-18（P<0.01）蛋白表达显着上调;给与VK2治疗后,TBI+VK2组NLRP3（P<0.01）、Caspase-1（P<0.05）和IL-18（P<0.05）的表达含量较TBI+vehicle组明显下调。采用Elisa方法检测大鼠皮层损伤周围区域焦亡相关靶分子Caspase-1、IL-18、IL-1β的含量,结果如下:与Sham+vehicle组相比,TBI+vehicle组Caspase-1（P<0.001）、IL-18（P<0.01）和IL-1β（P<0.05）含量显着增加;给与VK2后,TBI+VK2组Caspase-1（P<0.05）、IL-18（P<0.05）和IL-1β（P<0.05）含量较TBI+vehicle组明显下降。采用免疫荧光染色方法检测TBI大鼠皮层损伤周围区域焦亡相关靶分子NLRP3的免疫反应活性,结果如下:与Sham+vehicle组相比,TBI+vehicle组NLRP3免疫反应阳性信号显着增多（P<0.05）;给与VK2后,TBI+VK2组大鼠NLRP3免疫反应阳性信号较TBI+vehicle组显着下降（P<0.01）。上述结果提示TBI造模后24h,TBI大鼠皮层损伤周围区域焦亡相关靶分子蛋白的表达和含量表达均明显增加。VK2能显着减轻TBI大鼠的脑损伤,下调焦亡相关靶分子蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-18和IL-1β的表达,通过抑制神经细胞焦亡对TBI大鼠发挥神经保护作用。结论:1.VK2能够缓解TBI大鼠的神经功能障碍、减少的自发活动和增加的焦虑程度;2.VK2能够降低TBI大鼠的脑损伤体积,缓解TBI大鼠的脑水肿;3.VK2能够降低TBI大鼠皮层损伤周围区域明显增加的焦亡相关靶分子NLRP3和Caspase-1的蛋白表达和NLRP3的免疫反应活性,同时降低炎症因子IL-18和IL-1β的含量,VK2能够通过抑制细胞焦亡对TBI大鼠起到神经保护作用。
陈野[3]（2021）在《H2S对RhoA的Ser188位点磷酸化的调节及其介导的大鼠脑缺氧/缺血性损伤的保护作用》文中进行了进一步梳理背景中风是目前最常见的死亡原因之一,也是在全世界范围内持续性和获得性残疾的主要原因,随着人口变化,发病率进一步增加,对人们生活的质量带来巨大负担。中风分为出血性中风和缺血性中风,后者更常见,当前治疗的重点是通过静脉溶栓和血管内血栓切除术进行快速再灌注,但再灌注的同时也会损害大脑组织,因此对中风可用的治疗方法极为有限,研究预防策略正朝着卒中管理的前沿发展,一些新的进展为神经保护带来了新的希望。Ras同源家族成员A（Rho A）,是一种分布广泛的胞质蛋白,属于小GTP酶家族,鸟苷三磷酸水解酶（Rho GTPases）构成了相当普遍表达的胞质分子开关,控制了一系列下游效应子的活性,Rho依赖性卷曲螺旋激酶（ROCK）是Rho A最直接、最主要的效应分子,有ROCK1和ROCK2两种亚型。缺血性脑损伤可诱导Rho A激活和ROCK2表达的显着上调,越来越多的证据表明,Rho A/ROCK通路参与了中枢神经系统一些疾病的病理过程。Rho A的磷酸化是导致其功能发生改变和调节其活性的主要方式之一,Rho A在Ser188位点磷酸化能够抑制Rho A激活。硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）是一种普遍存在的第二信使分子,起神经调节剂的作用,在许多哺乳动物器官和系统中均具有重要功能,参与大脑的生理和病理机制。内源性H2S合成的酶主要包含胱硫醚-γ-裂解酶（L-cystathionine-γ-lyase,CSE）,胱硫醚-β-合酶（L-cystathionine-?-synthetase,CBS）和3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST）。我们前期研究证明了H2S可促进大鼠脑血管平滑肌细胞中KCa通道的开放,CSE产生的H2S对小鼠脑缺血再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）损伤具有保护作用,但其作用的分子机制尚不明确。前期研究者报道脑内皮/神经血管单位（Neurovascular unit,NVU）存在重要作用,脑血管的自动调节对于保护神经细胞免受缺血性损伤非常重要,缺血性脑组织的重塑涉及神经元和微血管细胞之间的相互作用,对神经血管单位缺血性死亡过程涉及的机制有待深入的了解。基于以上的研究背景,我们做了以下几个方面研究:1.构建并表达Glutathione S-transferase（GST）标签的Rho A野生型(GST-Rho Awild)和Rho A Ser188位点突变型(GST-Rho AS188A)蛋白,观察外源性H2S（Sodium hydrosulfide,Na HS）对其体外磷酸化的影响。2.探讨H2S抑制Rho A/ROCK通路的靶点和机制,并研究H2S促进Rho A Ser188磷酸化对海马神经元缺氧复氧（Hypoxia-Reoxygenation,H/R）损伤和大鼠脑缺血再灌注损伤的作用。目的1.观察H2S对Rho A的Ser188位点磷酸化的调节;2.探讨H2S对海马神经元Rho A Ser188位点的作用及其潜在的H/R损伤保护机制;3.探讨Rho A Ser188位点在H2S对大鼠缺血性脑损伤保护的影响。方法1.构建Rho Awild-p GEX-6p-1和Rho A S188A-p GEX-6p-1重组原核质粒,诱导表达并纯化GST-Rho Awild和GST-Rho AS188A蛋白,在进行体外磷酸化测定。2.构建Rho Awild-p EGFP-N1和Rho AS188A-p EGFP-N1重组真核质粒,再进行大鼠原代海马神经细胞（Hippocampal nerve cells,HNCs）培养与鉴定,并将重组质粒通过电转染到HNCs中,给与不同浓度的外源性H2S（Na HS）后western blot测定Rho A Ser188磷酸化蛋白及其膜质蛋白和ROCK2蛋白表达,酶联免疫实验（ELISA）法测定Rho A和ROCK2活性。3.全细胞膜片钳记录Na HS对转染重组质粒后的神经细胞大电导钙激活钾通道（BKCa）电流的影响。4.建立H/R损伤模型,通过细胞计数试剂盒（CCK-8）检测转染重组质粒后的神经细胞活力变化,乳酸脱氢酶（LDH）,神经特异性烯醇化酶（NSE）释放变化评估其损伤。5.原代大鼠脑血管内皮细胞（ECs）培养与鉴定,CSE-/-小鼠和3-MST-/-大鼠的原代内皮细胞与神经细胞共培养,加入乙酰胆碱（ACh）刺激内皮细胞释放H2S,测定Rho A Ser188磷酸化蛋白及其膜质蛋白和ROCK2蛋白表达水平,测定Rho A和ROCK2活性,同时测定两种内皮细胞释放的H2S含量。6.分别将Rho Awild-p EGFP-N1和Rho AS188A-p EGFP-N1真核质粒转染到HNCs,与CSE-/-ECs进行共培养,加入乙酰胆碱（ACh）刺激内皮细胞释放H2S,并进行H/R损伤造模。测定Rho A Ser188磷酸化蛋白及其膜质蛋白和ROCK2蛋白表达,测定Rho A和ROCK2活性,以及细胞活力、培养上清LDH和NSE的变化。7.Hoechst 33258染色,在荧光显微镜下观察神经细胞核损伤情况,Annexin V/PI染色通过流式细胞仪检测凋亡细胞。8.Ca2+成像系统荧光显微镜（Olympus IX73）检测神经细胞内Ca2+含量并获得细胞内Ca2+信号的荧光图像。9.脑立体定位转染Rho Awild-p EGFP-N1和Rho AS188A-p EGFP-N1真核质粒到大鼠海马区域,通过western blot检测Rho Awild和Rho AS188A蛋白表达,冰冻切片在荧光显微镜下观察转染效果。10.双侧颈总动脉结扎2VO对转染成功的大鼠建立脑I/R模型,激光散斑成像技术（Laser speckle imaging,LSI）检测血流变化,观察造模成功与否。缺血2h再灌注24h后,采用苏木素-伊红（HE）染色观察海马区域损伤程度,TUNEL检测海马神经细胞凋亡情况,western blot检测海马组织Rho A Ser188磷酸化蛋白和ROCK2蛋白表达,测定Rho A和ROCK2活性,以及血清LDH,NSE的变化。结果1.放射自显影结果显示,在PKG1存在下,H2S供体Na HS（100μmol/L）显着促进了GST-Rho Awild蛋白的磷酸化,但是GST-Rho AS188A蛋白并没有发生磷酸化。这表明Na HS可以通过Ser188位点促进Rho A的磷酸化。2.H2S（Na HS和内皮源性CSE产生）可促进空质粒或GFP-Rho Awild或GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中Rho A的磷酸化,以及GFP-Rho Awild质粒转染的神经元中GFP-Rho Awild的磷酸化。与对照组相比,p-Rho A/Rho A比值或p-GFP-Rho Awild/GFP-Rho Awild比值明显增加。但对GFP-Rho AS188A的磷酸化没有影响,GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中的p-GFP-Rho AS188A/GFP-Rho AS188A比值与对照组相比没有明显变化。这些结果表明,H2S可以诱导大鼠海马神经元中的Rho A磷酸化,并且这种磷酸化由Rho A Ser188介导。3.H2S能够使Rho A和GFP-Rho Awild在细胞膜中的含量显着减少,在胞质中的表达增高,但对GFP-Rho AS188A在细胞膜和细胞质中的分布没有明显影响。这些结果表明,Ser188是H2S引起神经元中Rho A从细胞膜向细胞质内易位的必需条件,同时可以通过Ser188抑制Rho A活性。4.Na HS对转染GFP-Rho AS188A质粒的神经细胞BKCa通道电流的增加低于转染空质粒和GFP-Rho Awild质粒组且具有显着性差异（30 m V-70 m V）这些结果表明,Na HS对BKCa通道电流的增加受到Rho A Ser188的调控。5.在空质粒或GFP-Rho Awild质粒转染的大鼠海马神经元中,H2S可显着抑制ROCK2蛋白的表达及其活性,但在GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中,抑制作用减弱,表明Rho A Ser188与H2S抑制神经元中ROCK2蛋白表达及其活性有关。6.在空质粒或GFP-Rho Awild质粒转染的神经元中,H2S显着抑制细胞活力的降低以及LDH和NSE活性的增加。然而,在GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中,H2S的这些作用显着降低。这些结果表明,Rho A Ser188介导了H2S对神经细胞H/R损伤的保护作用。7.在空质粒或GFP-Rho Awild质粒或GFP-Rho AS188A质粒转染的CSE-/-EC共培养神经元中,H/R损伤诱导神经细胞凋亡和细胞内游离Ca2+荧光强度显着增加。在空质粒或GFP-Rho Awild质粒共培养的神经元中,CSE+/+EC可以明显降低H/R损伤诱导神经细胞凋亡的增加和细胞内游离Ca2+荧光强度,但对转染GFP-Rho AS188A质粒共培养的神经元没有影响。这些结果表明,内皮CSE产生的H2S可以通过抑制细胞内游离Ca2+的增加来保护神经元免受H/R损伤,并且该作用是由Rho A Ser188介导的。8.动物体内实验中,在空质粒或GFP-Rho Awild质粒转染的大鼠海马中,Na HS能够促进Rho A的磷酸化,抑制Rho A活性,同时降低ROCK2的表达和活性,减轻大鼠脑I/R损伤诱导的血清LDH和NSE的增高,以及海马组织中神经细胞损伤和凋亡。但对转染GFP-Rho AS188A质粒的海马组织中这些作用显着降低。这些结果表明,Na HS减轻大鼠脑I/R损伤且与Rho A Ser188有关。结论1.Na HS可以通过Ser188位点促进Rho A的磷酸化。2.Na HS可能通过Rho A Ser188增加大鼠海马神经细胞中BKCa通道电流。3.内外源性H2S通过促进大鼠海马神经细胞Rho A Ser188磷酸化来保护海马神经元免受H/R损伤。4.Rho A Ser188介导了H2S对大鼠脑I/R损伤的保护作用。
顾超[4]（2021）在《ZNRF2对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用及机制》文中指出缺血性脑卒中是一类常见的神经系统疾病,是世界上疾病致死致残的主要原因,严重危害了人类的身心健康,阻碍社会经济的发展。目前临床上有效的治疗手段是通过溶解栓塞或通过手术治疗实现缺血区血液复灌,但该方法又会引起“脑缺血再灌注损伤”。脑缺血再灌注损伤的致病因素十分复杂,因此深入探究脑缺血再灌注损伤分子病理过程是寻找缺血性脑卒中的有效治疗策略的基础。自噬是一类在外界刺激下细胞自我保护的手段,但越来越多的研究表明,在脑缺血再灌注损伤中自噬是一把“双刃剑”,参与了脑缺血再灌注损伤中神经元的死亡过程。锌指/环指蛋白酶2（zinc and ring finger2,ZNRF2）在中枢神经系统中高度表达,参与神经元突触的建立和维持突触可塑性,但其在神经系统疾病中的研究较少。本研究通过构建大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注体内模型（cerebral ischemia/reperfusion injury,CIRI）以及氧糖剥夺/复糖复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）体外模型,探究ZNRF2对脑缺血再灌注损伤的作用,并明确其机制是否与调控神经元自噬相关,该研究结果可能为缺血性脑卒中治疗和预后评估提供新的靶标。第一部分ZNRF2在缺血性脑卒中患者血液的表达变化目的:观察非卒中对照组和缺血性脑卒中患者外周血中ZNRF2mRNA的表达变化,探讨ZNRF2与脑卒中是否存在相关性。方法:根据缺血性脑卒中的诊断标准,制定患者纳入/排除标准,收集重庆市垫江县人民医院患有缺血性脑卒中的患者以及非卒中对照组的血液样本,采用q RT-RCR法检测血液中ZNRF2 mRNA的表达水平。结果:总共收集81例临床血液标本,其中缺血性脑卒中患者40例,非卒中对照组41例。1.非卒中对照组与缺血性脑卒中患者之间年龄、性别、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白均无统计学差异;而缺血性脑卒中患者中高血压患者数目明显高于正常人群（62.5%vs.26.8%,P<0.01）,缺血性脑卒中患者的HDL水平明显低于正常人群（1.25±0.29 mmol/m L vs.1.46±0.37mmol/m L,P<0.01）。2.与非卒中对照组相比,缺血性脑卒中患者血液中ZNRF2 mRNA显着降低（P<0.05）;缺血性患者血液中ZNRF2 mRNA的表达与NIHSS评分呈负相关（R2=0.1054,P<0.05）;结论:1.ZNRF2在缺血性脑卒中患者临床血液样本中明显降低2.ZNRF2 mRNA表达与缺血性脑卒中患者NIHSS评分呈负相关3.ZNRF2可能参与了缺血性脑卒中疾病的发生与发展第二部分ZNRF2对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用观察目的:观察ZNRF2在脑缺血再灌注大鼠血浆和再灌注不同时间皮层中的表达改变;给予ZNRF2过表达慢病毒,观察ZNRF2对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用及对神经元自噬的影响。方法:1.大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型的构建雄性SD大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（1m L/kg）麻醉,激光多普勒血流仪检测脑血流动态变化过程;分离颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）,结扎CCA和ECA,线栓从ICA切口处插入（深度约为2 cm）,脑血流下降70%左右。缺血1.5 h后,进行再灌注,大鼠再灌注时间随实验目的不同而不同。2.实验分组及处理（1）脑缺血再灌注大鼠血液及皮层ZNRF2 mRNA、蛋白表达变化:将大鼠随机分为7组,正常组（normal）、假手术组（sham）、MCAO/R6 h组、MCAO/R 12 h组、MCAO/R 24 h组、MCAO/R 48 h组和MCAO/R72 h组,n=4。（2）为了探究ZNRF2对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用,将实验大鼠随机分为4组:假手术组（sham）、模型组（MCAO/R）、模型组+空载病毒组（MCAO/R+LV-NC）、模型组+ZNRF2过表达慢病毒组（MCAO/R+LV-ZNRF2）,n=10。大鼠缺血1.5 h,再灌注24 h。模型组+空载病毒组、模型组+ZNRF2过表达慢病毒组在造模前14天侧脑室分别给予空载病毒和ZNRF2过表达病毒感染动物。3.观察指标:激光多普勒血流仪检测脑血流动态变化过程;Zea-longa评分法观察各组大鼠的神经行为障碍;TTC染色观察各组大鼠脑梗死体积;HE染色观察各组大鼠皮层组织病理学改变;透射电镜观察皮层神经元中自噬小体;q RT-PCR检测大鼠血浆、损伤侧皮层中ZNRF2mRNA表达;WB检测大鼠损伤侧皮层ZNRF2、m TOR、p-m TOR（ser2448）、LC3II/LC3I、p62、Beclin1、Bax、Bcl-2蛋白的表达改变;免疫荧光法观察大鼠皮层神经元LC3、p62蛋白表达改变。结果:1.激光多普勒血流仪检测缺血过程中脑血流下降70%左右;与sham组相比,MCAO/R组大鼠血浆的ZNRF2 mRNA表达明显降低（P<0.001）,大鼠皮层中ZNRF2 mRNA和蛋白在再灌注6-12 h均先上升,再灌注24 h、48 h以及72 h后显着降低（P<0.05）;神经功能缺损评分（P<0.001）和脑梗死体积明显增加（P<0.001）;大鼠皮层细胞核固缩、核深染、空泡现象明显增加（P<0.001）;皮层神经元自噬小体数目增加（P<0.001）;p-m TOR（ser2448）/m TOR（P<0.001）、p62（P<0.01）、Bcl-2（P<0.01）蛋白明显下调,Beclin1（P<0.01）、Bax（P<0.05）蛋白以及LC3II/LC3I（P<0.01）表达显着上调。2.与LV-NC组相比,给予ZNRF2过表达慢病毒后,大鼠神经功能缺陷评分（P<0.01）和脑梗死体积显着降低（P<0.01）;皮层中细胞的细胞核固缩、核深染、空泡现象明显改善（P<0.001）;皮层神经元的自噬小体数目明显减少（P<0.05）;大鼠皮层ZNRF2（P<0.01）、p-m TOR（ser2448）/m TOR（P<0.001）、p62（P<0.01）、Bcl-2（P<0.01）蛋白明显上调,Beclin1（P<0.01）、Bax（P<0.05）蛋白以及LC3II/LC3I（P<0.05）表达显着降低。结论:1.ZNRF2 mRNA、蛋白在MCAO/R大鼠血液和皮层均明显降低2.MCAO/R大鼠皮层中自噬过度激活,脑组织受损3.ZNRF2对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用4.ZNRF2保护大鼠脑缺血再灌注损伤与抑制皮层神经元自噬相关第三部分ZNRF2对OGD/R致PC12细胞损伤中的作用观察目的:观察ZNRF2在OGD/R处理的PC12细胞中表达改变;观察ZNRF2对OGD/R致PC12细胞损伤的作用以及对细胞自噬的影响。方法:1.OGD/R模型建立:PC12细胞氧糖剥夺2 h,复糖复氧24 h。2.实验分组及处理（1）OGD/R处理的PC12细胞ZNRF2 mRNA、蛋白表达:将PC12细胞分为正常对照组（normal）、模型组（OGD/R）,n=3。（2）为了探究ZNRF2对OGD/R致PC12细胞损伤的作用,将细胞分为:正常组（normal）、模型组（OGD/R）、模型+空载病毒组（OGD/R+LV-NC）、模型+ZNRF2过表达慢病毒组（OGD/R+LV-ZNRF2）、模型+小干扰RNA阴性对照组（OGD/R+si NC）、模型+ZNRF2小干扰RNA组（OGD/R+si R-ZNRF2）,n=3。3.观察指标:MTT实验观察PC12细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率;q RT-PCR检测ZNRF2 mRNA的表达;WB观察PC12细胞中ZNRF2、LC3II/LC3I、p62、Beclin1、m TOR、p-m TOR（ser2448）蛋白的表达。结果:1.与normal组相比,OGD/R组ZNRF2 mRNA（P<0.01）和蛋白（P<0.01）均显着降低;PC12细胞活力明显降低（P<0.01）;细胞凋亡率增加;p62（P<0.001）、p-m TOR（ser2448）/m TOR相对比值显着降低（P<0.001）,Beclin1（P<0.001）、LC3II/LC3I（P<0.001）蛋白表达明显上调。2.与LV-NC组相比,ZNRF2过表达慢病毒组PC12细胞活性明显增加（P<0.01）;细胞凋亡率降低;ZNRF2（P<0.05）、p-m TOR（ser2448）/m TOR相对比值明显降低（P<0.01）,Beclin1（P<0.001）、LC3II/LC3I（P<0.001）蛋白表达明显降低,p62（P<0.05）蛋白明显上调。3.与si NC组相比,si R-ZNRF2组PC12细胞活力降低（P<0.05）;细胞凋亡率增加;p62蛋白表达明显下调（P<0.001）,Beclin1（P<0.05）、LC3II/LC3I（P<0.01）蛋白表达明显增加。结论:1.OGD/R处理的PC12细胞ZNRF2 mRNA和蛋白表达明显降低2.PC12细胞经OGD/R处理后自噬过度激活,细胞受损3.ZNRF2保护OGD/R致PC12细胞损伤4.ZNRF2保护OGD/R致PC12细胞损伤可能与抑制PC12细胞自噬激活相关第四部分ZNRF2对OGD/R致原代培养皮层神经元损伤的作用观察目的:观察上调ZNRF2对OGD/R致原代培养皮层神经元损伤的影响,并探究其机制是否与m TORC1介导的神经元自噬相关。方法:1.原代培养皮层神经元OGD/R模型建立:皮层神经元原代培养7天,氧糖剥夺30 min,复糖复氧24 h,建立OGD/R致皮层神经元损伤模型。2.实验分组及处理:（1）OGD/R处理的皮层神经元ZNRF2 mRNA和蛋白表达:将皮层神经元分为两组:正常组（control）、模型组（OGD/R）,观察ZNRF2的表达改变,n=3。（2）为了探讨ZNRF2对OGD/R诱导的皮层神经元损伤的作用及机制,将神经元分为:control组、OGD/R组、模型+空载病毒+DMSO组（OGD/R+LV-NC+DMSO）、模型+ZNRF2过表达慢病毒组（OGD/R+LV-ZNRF2）、模型+ZNRF2过表达慢病毒组+rapamycin（200n M）组（OGD/R+LV-ZNRF2+rapamycin）,n=3。空载病毒和ZNRF2过表达慢病毒分别于细胞造模前72 h给予。3.观察指标:MTT检测神经元活力;TUNEL染色检测神经元凋亡率;q RT-PCR检测ZNRF2 mRNA的表达;WB检测ZNRF2、m TOR、p-m TOR（ser2448）、LC3II/LC3I、p62、Beclin1、Bax、Bcl-2蛋白的表达改变。结果:1.与contral组相比,OGD/R组中ZNRF2 mRNA（P<0.01）和蛋白（P<0.001）均显着降低;神经元活性明显降低（P<0.001）;神经元凋亡率明显增加（P<0.001）;p62（P<0.01）、p-m TOR（ser2448）/m TOR相对比值（P<0.01）、Bcl-2蛋白明显降低（P<0.001）,Beclin1（P<0.001）、LC3II/LC3I（P<0.001）、Bax（P<0.01）蛋白表达明显增加。2.与LV-NC+DMSO组相比,LV-ZNRF2组神经元活性明显增加（P<0.05）;神经元凋亡率明显降低（P<0.01）;ZNRF2（P<0.001）、p-m TOR（ser2448）/m TOR相对比值（P<0.05）、p62（P<0.001）、Bcl-2（P<0.01）蛋白明显上调,Beclin1（P<0.01）、Bax（P<0.01）蛋白以及LC3II/LC3I（P<0.01）表达明显降低。3.与OGD/R+LV-ZNRF2组相比,OGD/R+LV-ZNRF2+rapamycin联合干预组中,神经元活性明显降低（P<0.05）;神经元凋亡率明显增加（P<0.05）;p62（P<0.05）、Bcl-2（P<0.05）蛋白明显降低,Beclin1（P<0.05）、LC3II/LC3I（P<0.05）、Bax（P<0.05）蛋白表达明显增加。结论:1.ZNRF2 mRNA和蛋白在OGD/R处理的皮层神经元中显着降低2.OGD/R处理的皮层神经元中自噬过度激活3.ZNRF2明显改善OGD/R导致的皮层神经元损伤4.ZNRF2保护OGD/R导致的皮层神经元损伤可能与抑制m TORC1介导的神经元自噬激活相关
袁俊杰[5]（2021）在《组蛋白修饰在衰老导致脑出血脑损伤加重中的作用及机制》文中研究说明背景与目的脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）是指脑实质内血管破裂引起的颅内出血,包括创伤性脑出血和自发性脑出血。其中,自发性脑出血是第二大常见的脑卒中类型,具有发病率高、死亡率高、致残率高的特点。研究发现,衰老是自发性脑出血发生发展的重要促进因素,然而其在脑出血所致的脑损伤中的作用及机制仍不清楚。衰老具有多种特征性改变,其中表观遗传学异常可在不改变基因序列下调控基因的转录,在衰老研究中备受关注。组蛋白甲基化、乙酰化等修饰改变是其主要的调控机制之一,研究表明H3K27me3（抑制性）、H3K4me3（激活性）和H3K9ac（激活性）修饰不仅是大脑衰老的重要标志,并与神经退行性疾病的进展密切相关,提示上述三种组蛋白修饰可能在衰老导致的脑出血脑损伤加重中具有重要作用。新近的研究发现,取自健康青年人群中的血浆——“年轻血浆”是衰老及衰老相关疾病的有效的治疗方式。年轻血浆中富含各种分泌蛋白、激素、代谢产物或脂质等年轻因子,它们以局部和分泌入血的远距离作用方式影响多种组织器官的衰老进程。研究发现,年轻血浆及其年轻因子可延缓衰老、AD和老年缺血性脑卒中导致的脑损伤,提示年轻血浆极可能同样减轻衰老导致的脑出血脑损伤加重。但至今年轻血浆在衰老导致脑出血脑损伤加重中的作用及机制尚不十分清楚。综上,本研究围绕衰老在脑出血脑损伤中的作用及机制,采用不同年龄阶段的脑出血模型,通过Ch IP-seq、RNA-seq测序和LC-MS/MS等技术,检测H3K27me3、H3K4me3和H3K9ac三种组蛋白修饰在衰老脑出血脑组织中的变化及作用机制,并明确年轻血浆在衰老导致脑出血脑损伤加重中的治疗作用、与组蛋白修饰的关系及可能的关键因子。本研究有望揭示衰老加重脑出血脑损伤的内在分子机制,为老年脑出血患者的治疗奠定扎实的理论及实验基础。材料与方法1、脑出血模型的构建:构建13月龄（中年期）和22月龄（老年期）大鼠脑出血模型,记录脑出血后7天两组的死亡情况,并收集脑出血后第3天的血肿周围脑组织。所有标本收集完毕后立即冻存于-80℃或液氮中。2、脑出血后三种组蛋白修饰分布检测:WB和免疫组化检测不同年龄阶段脑出血后第3天中三种组蛋白修饰整体标记水平和细胞定位的变化。Ch IP-seq检测三种组蛋白在全基因组中标记基因的变化。3、脑出血后脑组织转录组检测:RNA-seq检测13月龄和22月龄脑出血第3天转录组的变化,并与Ch IP-seq结果作关联分析,并进行q PCR验证。4、年轻血浆干预:构建并联共生小鼠模型:年轻-老年并联、老年-老年并联。并联50天后分离,取老年鼠构建脑出血模型,检测脑损伤和H3K27me3及H3K9ac组蛋白修饰。同时收集年轻和老年大鼠血浆,在老年大鼠脑出血后30min经尾静脉输注,观察脑损伤变化。5、血浆成分检测:收集青年、中年、老年健康人群的血浆,LC-MS/MS筛查血浆中蛋白的变化。从中筛选“年轻因子”,并通过ELISA、q PCR在不同年龄大鼠血浆和脑组织中进行验证。6、脑损伤指标检测:检测脑出血后7天的死亡率并绘制生存曲线、神经功能缺损评分（Modified Neurological Deficient Score,m NDS）,评估出血第3天脑含水量（Brain water content,BWC）变化,利用TUNEL、FJB、Nissl染色检测出血后第3天血肿周围脑组织神经元的损伤情况。7、其它:给予脑出血大鼠干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）抗体或胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factors,IGF-1）蛋白,检测年轻血浆治疗在衰老导致脑出血脑损伤加重中的关键效应通路。结果1、衰老导致脑出血脑损伤加重:相较于13月龄（中年期）,22月龄（老年期）大鼠脑出血的7天死亡率和m NDS均更高,且脑出血第3天的BWC及TUNEL、FJB阳性的损伤神经元的数量皆显着升高。2、衰老脑出血鼠H3K27me3及H3K9ac组蛋白修饰在基因组中存在显着重分布:脑出血后H3K4me3、H3K27me3及H3K9ac整体修饰水平皆可呈现不同程度的变化。其中,H3K27me3修饰13月龄和22月龄组中均显着下降;H3K4me3修饰水平在两组中呈下降的趋势但差异无统计学意义;H3K9ac修饰仅在22月龄脑出血中显着升高。Ch IP-seq分析结果提示三种组蛋白修饰皆主要分布在基因组TSSs区域,提示其主要参与基因转录的调控。进一步的GO分析发现三种组蛋白修饰在不同年龄阶段参与调控的分子通路截然不同。3、H3K27me3及H3K9ac组蛋白修饰重分布导致老年脑出血大鼠炎症和免疫反应相关因子的上调:RNA-seq结果提示不同年龄阶段脑出血后均可显着上调IFN-γ、氧化脂质相关代谢酶等多种炎症和免疫反应相关分子,然而上述分子在13月龄和22月龄两组中的表达水平存在一定的差异,这种差异可能因大脑的衰老所致。进一步与Ch IP-seq关联分析发现在22月龄脑出血大鼠中,H3K27me3与H3K9ac组蛋白修饰相应的差异表达基因与RNA-seq中上调的差异表达基因大量重合;13月龄脑出血大鼠则以H3K4me3与H3K9ac相应基因为主。GO分析表明这些重合的基因主要参与脑出血后炎症和免疫反应。4、年轻血浆应用可减轻衰老导致的脑出血脑损伤加重,IGF-1可能在其中发挥重要作用:利用年轻鼠与老年鼠的并联模型发现,年轻鼠的并联可显着降低老年鼠脑出血的死亡率、m NDS及BWC,同时TUNEL、FJB和Nissl染色均提示年轻鼠并联组中,脑血肿周围损伤或凋亡的神经元数量显着减少;通过尾静脉年轻血浆的输注模型发现,年轻血浆应用同样可以减少老年脑出血大鼠的死亡率、m NDS、BWC及神经元损伤。由此可见,年轻血浆的应用可减轻衰老导致的脑出血脑损伤加重。LC-MS/MS分析不同年龄阶段人类血浆内蛋白成分及含量变化,发现血浆中IGF-1随年龄的增大显着下降。通过ELISA在脑出血大鼠中进行验证,发现IGF-1随大鼠月龄增大而减少,衰老可抑制脑出血后IGF-1的表达;年轻血浆的输注可提高衰老脑出血脑组织中IGF-1的含量,进一步研究发现这些增多的IGF-1并非来源于脑组织自身的表达,而是可能来源于血浆中富含的IGF-1。进一步将IGF-1重组蛋白输注于老年的脑出血大鼠中发现,IGF-1可明显减轻衰老导致的脑出血脑损伤加重。5、H3K27me3与H3K9ac组蛋白修饰参与年轻血浆对老年脑出血中炎症及免疫反应的调控:WB及组化结果提示,年轻血浆的治疗可一定程度上逆转H3K27me3与H3K9ac组蛋白修饰在老年脑出血中的分布水平。Ch IP-seq结果发现H3K27me3或H3K9ac组蛋白修饰的IFN-γ、Lrg1等多种炎症和免疫分子可被年轻血浆所改变,从而并抑制其转录表达。进一步的我们应用IFN-γ抗体后,老年脑出血大鼠的死亡率、m NDS、BWC及神经元损伤均显着下降,提示对IFN-γ的抑制作用可能是年轻血浆发挥抗衰老脑出血脑损伤的重要途经。结论衰老作为脑出血的重要危险因素,可显着加重脑出血导致的脑损伤。H3K27me3、H3K4me3和H3K9ac三种组蛋白修饰的重分布在衰老加重脑出血损伤中伴有重要作用。其中,衰老主要介导H3K27me3修饰的减少和H3K9ac修饰的增多,且H3K27me3及H3K9ac修饰的重分布可促进衰老脑出血后炎症和免疫反应相关因子表达的上调。年轻血浆可一定程度逆转H3K27me3与H3K9ac组蛋白修饰在老年脑出血鼠中的重分布、抑制IFN-γ等促炎性因子的表达,从而减轻衰老导致的脑出血脑损伤加重。
赵亚林[6]（2021）在《舒筋健脑方对脑瘫患者认知功能影响及机制研究》文中提出1 目的1.1文献研究:探讨文献中治疗脑瘫中药的用药规律,为临床中药用药提供依据。1.2药理研究:采用网络药理学探索益智仁治疗脑瘫（CP）作用机制,探寻改善脑瘫的认知功能的可能机制。1.3临床研究:观察舒筋健脑方联合选择性脊神经后根切断（SPR）手术治疗痉挛型脑瘫患者的临床疗效,为中药用于改善痉挛型脑瘫患者的康复提供临床依据。1.4基础研究:基于Bcl-2/Bax、Caspase-3研究舒筋健脑方改善缺血缺氧脑损伤认知功能作用机制。2 方法2.1 文献研究:检索中国知网、万方、维普、Pubmed、Web of science、Co-chrane library数据库中药治疗脑瘫的文献,采用EXCEL表格分析药物的服用方法、频次、四气五味及归经;SPSS Modeler18.0软件进行组方规律分析、SPSS Statistics 24进行药物的因子分析和聚类分析。2.2药理研究:通过中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）获得并筛选益智仁的活性成分及作用靶点,通过Gencards、OMIM、TTD、DRUGBANK数据库获取CP的主要靶点,运用Cytoscape3.7.2软件构建益智仁活性成分-靶点交集网络,利用String平台构建共同靶点蛋白相互作用（PPI）网络,获得关键活性成分与核心蛋白靶点,通过微生信网对共同靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析。2.3临床研究:采用前瞻性、单中心、随机对照临床试验,随机数字表将患者分为试验组和对照组,两者都采用SPR手术和康复训练,试验组术后同时给予口服舒筋健脑方颗粒2个月。收集两组的一般资料、中国比内测试评分、GMFM-88评分、CSI评分、ADL评分、肌力、肌张力及患者和母亲的体质量表评分。2.4基础研究:7日的SD大鼠分为对照组、模型组、米诺环素组、舒筋健脑方低、中、高剂量组6组,采用Rice-Vannucci模型建立脑瘫缺血缺氧脑损伤模型,术后给予称重、行为学检测和HE染色,之后对照组、模型组等量的生理盐水灌胃,药物组给予相对应的药物灌胃1周后,复测体重、行为学检测,取脑组织行免疫组化,查看海马CA1区Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达。取脑中海马组织,采用WB检测Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白量表达。3结果:3.1文献研究:用药频数前6位:当归、伸筋草、牛膝、黄芪、红花、白芍,用药性温,味为甘、辛、苦,归肝、肾、脾经,补虚药、祛风湿、活血化瘀药最多。关联分析核心用药透骨草、牛膝、伸筋草。提取6个公因子。聚类分析有当归;川芎、甘草、黄芪;杜仲、丹参、桂枝、红花、白芍、牛膝、木瓜、透骨草、鸡血藤、伸筋草。3.2药理研究:共筛选出益智仁有效活性成分8种,关键活性成分为:油酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇等,益智仁作用于CP的靶点18个,PPI网络显示TP53、MYC、CASP3、CASP8、ALB等为核心靶点,共富集GO条目84条,KEGG通路292条（均P<0.05）,主要富集在癌症信号通路。3.3临床研究:（1）两组基线未见异常,主要为男性,年龄5-13岁之间,多为头胎顺产,混合喂养,痉挛型脑瘫多为双瘫患者。（2）中国比内测试量表统计的智商分数,治疗后试验组比对照组的智商分数高（P=0.002<0.05）,比治疗前的智商明显提高（P<0.05）。（3）GMFM-88评分中,治疗后试验组比对照组的运动评分均有提高,在评分C、D、E区的功能改善明显（P<0.05）。组内比较,除了对照组GMFM-A区P=0.094>0.05,其余四区及试验组的五个区的运功评分明显改善（P<0.05）。（4）CSI评分、ADL组内比较显示改善明显（P<0.05）。（5）肌力统计,治疗后两组比较,髂腰肌、股二头肌及胫后肌试验组比对照组好转（P<0.05）;组内比较,试验组与对照组都是髂腰肌、股四头肌、股二头肌的肌力治疗后比治疗前好转（P<0.05）。（6）肌张力组内分析,试验组与对照组治疗后较治疗前好转（P<0.05）。（7）体质中试验组治疗前偏气虚和阴虚,治疗后均衡质和偏阴虚,对照组治疗前后都常见偏气虚的体质。母亲的以阴虚质和痰湿质为主。3.4基础研究:（1）体重:术后给予灌胃1周后组间体重均明显改善（F=11.799,P=0.000<0.05）。中剂量和高剂量组体重比模型组改善明显（P<0.05）。（2）行为学:组间比较,术后24小时检测及灌胃1周悬吊实验、倾斜板实验、Longa评分差异明显（P<0.05）。灌胃1周后米诺环素组、中药中剂量组和高剂量组比模型组悬吊时间延长（P<0.05）。中药中剂量组和高剂量缩短了倾斜的时间（P<0.05）。各用药组均可改善神经功能（P<0.05）。（3）HE染色:脑组织的海马CA1区对照组的神经细胞丰富且排列整体,细胞结构清晰。模型组的神经细胞数量减少,细胞外形不规则,胞浆减少,细胞核变小或者消失。（4）免疫组化表达中,米诺环素、中药低剂量组明显减少海马组织CA1区Bax、Caspase-3的表达（P<0.05）,中药中剂量和高剂量增加Bcl-2的表达（P<0.05）,减少Bax、Caspase-3的表达（P<0.05）。（5）WB实验统计分析:中药高剂量组促进Bcl-2的表达,米诺环素组、中药低中高剂量可以减少Bax蛋白的含量（P<0.05）。而药物治疗都可以提高Bcl-2/Bax的比值（P<0.05）,且与中药剂量成正比。Caspase-3蛋白表达量与中药药物的剂量成反比,只有中药高剂量明显降低Caspase-3蛋白表达（P<0.05）。4结论:4.1文献研究:脑瘫患者治疗应扶正与祛邪并用,补益肝脾肾扶助正气,以祛风活血通络祛邪,重视扶助正气药物。4.2药理研究:本研究初步揭示了益智仁的多成分、多靶点、多通路的作用机制,bcl-2、bax、caspase-3是细胞凋亡的主要基因蛋白,是之后基础实验研究的重点。4.3临床研究:中药可以辅助改善术后痉挛型脑瘫患者的运动功能,有效的改善认知功能,有利于患者体质改善。4.4基础研究:在缺血缺氧脑损伤引起的脑部海马细胞损伤中,舒筋健脑方药物可以通过提高Bcl-2/Bax 比值比,降低Caspase-3的蛋白表达保护海马神经细胞,减轻细胞的凋亡,而且与药物的剂量成正相关性。
潘晓飞[7]（2021）在《控制减压技术治疗兔重型颅脑损伤后急性颅高压中NDRG2和NF-κB介导的凋亡信号通路关系的实验研究》文中认为目的通过动物实验明确控制减压技术治疗兔重型颅脑损伤后急性颅高压中NDRG2与NF-κB介导凋亡信号通路之间的相互作用关系,为进一步探究控制减压术的机制提供基础依据。方法60只健康的新西兰白兔随机分成控制减压组（n=20）、快速减压组（n=20）、假手术组（n=20）。术后24小时评价各组动物的行为学评分、检测脑组织含水量、NDRG2、NF-κB和Caspase-3分子的表达水平、以及利用TUNEL荧光染色方法检测手术部位神经细胞凋亡情况。结果控制减压组和快速减压组与假手术组相比,动物行为学评分（控制减压组:2.90±0.57,快速减压组:4.20±0.79）均大于假手术组（1.30±0.95）（p<0.05）、术后脑组织含水量与NF-κB以及Caspase-3的表达水平升高,但NDRG2的表达水平降低、TUNEL荧光染色提示神经细胞凋亡程度显着增加;控制减压组与快速减压组相比,动物行为学评分小于快速减压组（p<0.05）,术后脑组织含水量与NF-κB以及Caspase-3表达水平低于快速减压组,但NDRG2表达水平升高,TUNEL荧光染色提示神经细胞凋亡程度明显减少。结论控制减压手术方式较传统手术方式改善了疾病预后,利用阶梯式减压的方式逐步提高脑灌注压,从而减轻了继发性脑损伤中脑缺血再灌注损伤发生,降低了神经细胞凋亡程度,减轻颅脑创伤后脑水肿程度。本实验中,控制减压组中NDRG2的表达较快速减压组中有所增加,但NF-κB和Caspase-3的表达较快速减压组中有所减少,两者大致呈负相关关系,进一步验证了NDRG2在神经系统疾病中起着重要的保护作用,可能是通过控制减压手术方式来增加NDRG2的表达进而来抑制NF-κB介导的凋亡信号通路的产生,对重型颅脑创伤后的神经细胞起到保护作用。
田军[8]（2021）在《降钙素基因相关肽（CGRP）通过调控Akt/mTOR信号通路介导的凋亡和自噬减轻创伤性颅脑损伤的实验研究》文中认为创伤性颅脑损伤（Traumatic Brain Injury TBI）的定义是由于外部机械力造成的脑损伤,并导致大量的死亡和残疾,许多受害者有功能障碍,如运动和感觉功能障碍,甚至认知功能缺陷。据估计,全世界每年约有5000万人被诊断为TBI。颅脑损伤根据发生的不同过程和阶段,可分为原发性和继发性脑损伤,都是由脑外伤引起的复杂疾病。组织丢失和细胞死亡是主要的损伤,TBI后由于原发性颅脑损伤导致的继发性脑损伤,导致激活的小胶质细胞、募集的中性粒细胞和巨噬细胞以及血液代谢物中引起的炎症反应均可导致继发性脑损伤,进而导致进一步的功能性和器质性的脑损伤。炎症反应被认为是TBI继发性损伤的重要机制。从理论上讲,减少炎症改善受损脑组织能量及代谢可以减轻TBI引起的继发性脑损伤。降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide CGRP）是由37个氨基酸组成的多肽,广泛表达于中枢和外周神经系统。目前,CGRP被认为是最有效的血管舒张药。CGRP在脑组织中起保护作用。当脑组织受到损伤并出现缺血时,小鼠脑TBI后产生大量自我保护物质,CGRP是其中最重要的保护物质之一。研究表明,在TBI后的病理过程中,CGRP的分泌在TBI后增多。增加的目的是使脑血管扩张,尽快为损伤后缺血缺氧的脑组织提供血液供应。然而,当脑组织损伤缺血较严重时,脑组织产生的CGRP不能完全防御这种损伤。因此出现了严重的脑组织继发性和永久性损伤。考虑到CGRP具有保护脑损伤的潜力,而自噬和凋亡在TBI诱导的继发性损伤中发挥重要作用,我们检测了CGRP是否能抑制TBI小鼠的自噬和凋亡的表达。结果表明,CGRP通过减轻脑水肿、调节神经元自噬和凋亡,减低TBI后神经炎症反应来保护大脑。第一部分创伤性颅脑损伤患者血清CGRP水平及与预后的关系目的:临床工作中,观察不同TBI患者CGRP表达变化、判断伤情程度,进一步探讨CGRP与TBI患者病情程度及预后的关系,并探讨CGRP是否可以作为判断TBI预后的可靠指标。方法:选取138例TBI患者进行分组:健康体检者54例（对照组）,重度TBI组73例,轻度TBI组65例。采用酶联免疫分析试剂法（ELISA）,测定TBI患者特定时间的血清CGRP水平。采用格拉斯哥昏迷量表（GCS）判定TBI严重程度。统计分析:各组不同时间CGRP比较采用重复测量资料的方差分析,同一时间组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法。采用wilicoxon秩和检验分析患者血清CGRP水平与临床变量的关系。结果:1.TBI后患者血清CGRP的变化对照组随时间变化呈现平稳状态,TBI（轻度组）和TBI（重度组）先下降后逐渐上升。两组血清CGRP水平均低于对照组。入院时、1天、3天、7天和14天时间点,TBI（重度组）低于TBI（轻度组）,差异显着,有统计学意义;入院时、1天、3天时间点,TBI（轻度组）低于对照组,差异显着,有统计学意义;入院时间点7天和14天,TBI（轻度组）低于对照组,但差异不显着。2.入院时TBI患者血清CGRP水平与临床病理特征关系相对于GCS评分<5分的患者,GCS评分≥5分的患者血清CGRP水平较高（Z=-2.277,P=0.023）。存活患者的CGRP水平高于死亡患者（Z=-3.571,P<0.001）。3.入院血清CGRP预测TBI患者伤后死亡的价值评估血清CGRP水平预测TBI患者伤后死亡的特异度为88.24%,灵敏度为68.82%,CGRP预测最佳临界值为13.255pg/ml。4.TBI患者预后与血清CGRP的相关性CGRP高水平组患者生存情况优于低水平组患者,差异显着;单因素Cox分析发现,年龄,中线结构移位,GCS分数,CGRP水平与TBI患者预后相关;多因素Cox分析发现,中线结构移位,CGRP水平是TBI患者独立预后因素。小结:1.TBI后患者血清中的CGRP变化趋势为随伤后时间变化先降低,然后逐渐升高。约至24小时到达最低点,大约在14天前后达高峰。2.血清CGRP水平可以预测TBI患者的预后不良及死亡,而且该预测效能较高。第二部分降钙素基因相关肽（CGRP）对小鼠创伤性颅脑损伤神经功能的保护作用目的:通过重物打击法（Feeney重物下降挫伤法）,建立开放性创伤性颅脑损伤（Traumatic Brain Injury TBI）动物模型,并予以脑室注射联合尾静脉注射外源性降钙素基因相关肽（CGRP）干预TBI模型小鼠;通过旷场实验、水迷宫实验、巴恩斯迷宫实验、跳台实验对实验小鼠的行为学评分进行测量,验证（CGRP）对创伤性颅脑损伤神经功能的保护作用。通过测量CGRP干预前后小鼠脑挫伤面积比较、脑水肿比较、血脑屏障破坏程度等方面的比较,来探讨CGRP对TBI小鼠脑损伤的保护作用。方法:清洁级（SPF）雄性BALB/C小鼠390只,随机分为sham组、TBI组和TBI+CGRP组。用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg,i.p.i.）麻醉小鼠,根据Feeney重物下降法,建立开放性颅脑创伤模型。TBI+CGRP两组分别用CGRP肽（脑室注射+尾静脉注射）,术后每日采用改良神经严重程度评分（m NSS）检测各组小鼠的神经功能缺损程度。各组小鼠分别于术后相应的时间点（1、3、5、7天）取材;苏木精伊红染色（HE染色法）和（TTC）染色法:测量小鼠脑组织损伤面积,并进行组间对比;通过干湿重法测量不同组别小鼠的脑组织含水量;通过测量Evans Blue（EB）渗透率的方法,来判定TBI后血脑屏障的破坏程度。通过蛋白质印迹法（Western blot）测量脑组织CGRP蛋白的表达量。通过行为学测试对小鼠神经行为学进行测量:术后第8、9天进行旷场实验;术后第10-15天行水迷宫实验;术后第16-22天行巴恩斯迷宫实验;术后第23、24天为跳台实验的训练和测试阶段。结果:1.创伤性颅脑损伤（TBI）（Feeney重物下降挫伤法）动物模型稳定:术后小鼠平均昏迷时间约为1.5-2h,生命体征较平稳,体温恢复,呼吸平稳,逐渐苏醒和爬行,可进食水。脑组织经解剖,均可见局部挫伤灶,局部坏死、淤血,伴部分脑组织的凹陷缺损;部分样本损伤灶同侧可见蛛网膜下腔出血。2.各组小鼠m NSS评分差异术后第1天,TBI+CGRP组和TBI组相对sham组,神经功能均受损明显。TBI+CGRP组和TBI组神经功能基本相同,差异无统计学意义;在TBI后第2-7天,TBI+CGRP组小鼠m NSS评分低于TBI组,差异显着;第2-7天TBI+CGRP组和TBI组神经功能逐渐有所好转,两组小鼠的分数逐渐下降。3.TBI小鼠神经功能行为学评分结果旷场实验（Open field test）评分结果:总活动距离测试:sham组总距离最长,TBI+CGRP组小鼠的总距离居中间水平,TBI组的总距离最短。TBI+CGRP组小鼠的总距离相比TBI组的总距离长,差异显着。静止次数和静止时间和测试方面:TBI组小鼠静止次数最多,sham组和TBI+CGRP组静止次数较低,和TBI组小鼠相比,差异不显着,无统计学意义。TBI组小鼠静止时间最长,sham组和TBI+CGRP组静止时间相对较最低,和TBI组小鼠相比,差异不显着,无统计学意义。水迷宫实验:定位航行实验阶段:水迷宫测试小鼠发现平台的潜伏期,TBI+CGRP组小鼠的潜伏期相比TBI组小鼠的潜伏期时间短,差异显着,有统计学意义。TBI组小鼠比sham组小鼠的潜伏期长,差异显着,有统计学意义。空间探索实验阶段:在测试的第五天小鼠穿过平台次数,sham组最多,TBI组最少,TBI+CGRP组居中。TBI组穿过平台次数相比sham组少,差异显着,有统计学意义;TBI+CGRP组穿越平台次数多于TBI组,差异显着,有统计学意义。巴恩斯迷宫测试:训练阶段:TBI组小鼠的潜伏期相比较TBI+CGRP组小鼠的潜伏期长,差异显着,有统计学意义。第六天试验中,第一次探查目标洞（无暗箱）前的错误探查次数比较,TBI+CGRP组小鼠的探错次数相比TBI组小鼠多,差异显着,有统计学意义。跳台实验评分:在跳台试验测试阶段,TBI+CGRP组小鼠的潜伏期相比较TBI组小鼠的潜伏期长,差异显着,有统计学意义;错误次数:TBI+CGRP组小鼠的错误次数相比较于TBI组小鼠的错误次数少,差异显着,有统计学意义。4.不同组别小鼠脑组织标本创伤面积的测量和比较:三组小鼠脑组织切片相比较:TBI+CGRP组与TBI组相比较,均可见一定程度的脑组织损伤及局灶性神经细胞组织缺失,早期缺损范围的差异性较小。随着时间的推移,TBI小鼠脑组织切片可见更严重的脑损伤;定量计算脑损伤体积,TBI+CGRP组小鼠脑组织切片与TBI组小鼠脑组织切片相比较,损伤面积略小,但差异不显着,无统计学意义。5.脑水肿测定:外源性CGRP干预,将TBI术后脑水肿消退的时间点提前,减少了TBI诱导的脑水肿在TBI后持续时间,加速了TBI诱导的脑组织水肿的吸收,进而减轻脑损伤;另一方面,TBI+CGRP组小鼠的脑含水量在1天、3天、5天、7天这四个时间点,脑水肿程度均低于TBI组小鼠,差异显着,有统计学意义。6.血脑屏障损伤程度:TBI术后第1天,sham组未见明显依文思蓝（EB）渗出,TBI+CGRP组小鼠（EB）渗透率和TBI组相比无明显差异;TBI后第3、5、7天,TBI+CGRP组和TBI组小鼠依文思蓝（EB）渗透率仍较高,TBI+CGRP组小鼠依文思蓝（EB）渗透率低于TBI组,两者差异显着,有统计学意义。7.TBI后各组小鼠CGRP蛋白表达水平的差异:TBI组小鼠脑组织中CGRP表达水平显着降低,并随着时间的推移逐渐升高;TBI+CGRP组脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,差异显着,有统计学意义。小结:1.根据Feeney重物下降法,可建立标准、可靠的开放性颅脑损伤动物模型,术后正常喂养及观察行为学变化,确认TBI模型建立。2.CGRP干预减低了创伤性颅脑损伤小鼠的神经功能损伤,减低了创伤性颅脑损伤挫伤灶的损伤面积;减低了创伤性颅脑损伤后脑水肿的程度,减少了TBI后脑水肿的持续时间;减轻了TBI后血脑屏障的破坏程度。3.通过蛋白印迹法可见TBI后小鼠脑组织中CGRP的表达水平显着降低,24h达最低,随时间推移逐渐回升。TBI+CGRP组小鼠脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,提示本实验采用的脑室注射+尾静脉注射干预途径有效可靠。第三部分降钙素基因相关肽（CGRP）对创伤性颅脑损伤后神经元细胞自噬和凋亡的影响目的:通过对小鼠挫伤脑组织部位取材,对其进行自噬和凋亡相关标志性蛋白检测,观察对比CGRP干预前后自噬和凋亡标志性蛋白的变化情况,探讨CGRP在TBI环境下对自噬和凋亡的调控作用。方法:通过免疫荧光双染法:定位分析LC3和Neu N及GFAP蛋白;蛋白质印迹法,定量分析LC3、P62、Beclin-1、cleaved-caspase-3表达量;TUNEL和Neu N双染色法,分析TBI后神经元凋亡的表达变化情况。结果:1.CGRP对TBI小鼠神经元细胞自噬的影响免疫荧光双染法:脑皮层挫伤区LC3（+）蛋白定位于挫伤部位神经元的胞质中,Sham组可见少量阳性表达,随时间推移阳性表达程度无变化。TBI组于伤后1天可见LC3（+）细胞显着增多,随时间推移表达程度逐渐增强,高于Sham组,差异显着;TBI+CGRP组与TBI组比较,LC3（+）细胞数量较少,表达程度明显减弱,TBI后第1天,差异不显着,无统计学意义;而TBI后第3、5、7天,两组差异性逐渐增强,差异显着,有统计学意义。蛋白质印迹法:部分自噬标志物LC3、P62、Beclin-1蛋白表达与双染结果一致。TBI+CGRP组的LC3II/LC3I比值和Beclin-1水平较TBI组明显降低,差异显着,有统计学意义。P62水平的变化则相反,与sham组相比,TBI导致小鼠P62表达降低,TBI+CGRP组的P62较TBI组明显升高,差异显着,有统计学意义。CGRP的干预导致P62蛋白表达逐渐增强并维持在一个相对较高的阶段。2.CGRP对TBI小鼠神经元细胞凋亡的影响:TUNEL和Neu N双染色显示:TBI导致神经元凋亡增加,挫伤灶周围TUNEL（+）细胞明显增加;TBI+CGRP组的TUNEL（+）较TBI组明显降低,差异显着,有统计学意义;蛋白质印迹法:（Western blot法）:TBI导致神经元凋亡,小鼠挫伤灶脑组织凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3表达升高,皮层组织细胞凋亡增加。TBI+CGRP组的cleaved-caspase-3较TBI组明显降低,差异显着,有统计学意义。3.CGRP对TBI小鼠神经元细胞神经胶质纤维酸性蛋白GFAP的影响:与sham组相比,TBI导致小鼠神经元细胞GFAP数量明显增加,Neu N数量明显减低,而CGRP的干预降低了神经元细胞损伤。脑皮层挫伤区GFAP（+）表达:Sham组可见少量阳性细胞表达,表达不明显。TBI组和TBI+CGRP组伤后1、3、5、7天均可见阳性细胞显着增多。TBI组GFAP（+）计数率高于Sham组,差异显着;TBI+CGRP组GFAP（+）计数率低于TBI组第1、3天差异无显着性,第5、7天差异显着,有统计学意义。脑皮层挫伤区Neu N（+）表达:Sham组可见适量Neu N（+）表达。TBI组和TBI+CGRP组伤后1、3、5、7天均可见Neu N（+）细胞显着减少。TBI组Neu N（+）计数率低于Sham组,差异显着,有统计学意义;TBI+CGRP组Neu N（+）计数率高于TBI组差异显着,有统计学意义。小结:1.TBI后小鼠神经细胞自噬和凋亡水平增加,予以外源性CGRP干预,有效抑制了TBI所致小鼠神经元细胞的自噬和凋亡;2.TBI后小鼠神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在显着增加,CGRP干预后,减少了TBI小鼠颅脑损伤部位的胶质纤维酸性蛋白的出现,保护神经细胞功能。第四部分AKT/m TOR信号通路参与了外源性CGRP对神经元细胞自噬和凋亡的调控目的:通过利用CGRP干预TBI小鼠模型,在信号通路层面探讨CGRP对自噬和凋亡相关通路蛋白的调控情况,进一步探讨CGRP对自噬和凋亡的调控机制。方法:通过CGRP干预TBI小鼠模型,采用蛋白质印迹法（Western Blot法）,测定CGRP干预前后挫伤灶局部脑组织的AKT/m TOR、Fox O3a通路相关标志蛋白的变化情况,并对比CGRP干预前后的蛋白表达变化差异。结果:1.CGRP对AKT/m TOR通路的影响TBI术后导致了小鼠脑神经元细胞内p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR水平降低,TBI+CGRP组和TBI组均低于sham组,差异显着,有统计学意义。CGRP使这两者比值均升高。其中,CGRP对p-Akt/Akt激活作用较明显,术后1、3、5、7天四个时间点,TBI+CGRP组的p-Akt/Akt相比TBI组表达升高,差异显着,有统计学意义;CGRP对p-m TOR/m TOR激活作用较弱,术后第1、3天TBI+CGRP组p-m TOR/m TOR相比TBI组,差异显着,有统计学意义;术后第5、7天TBI+CGRP组p-m TOR/m TOR相比TBI组,差异不显着,无统计学意义;同时,Akt/m TOR信号的激活也在TBI后逐渐增强。2.CGRP对Fox O3a表达的影响TBI术后细胞核中Fox O3a蛋白水平显着升高,而细胞浆中Fox O3a蛋白水平显着降低,证实TBI导致了小鼠脑神经元细胞内Fox O3a蛋白分布的变化。CGRP使细胞核内Fox O3a增加逐渐减弱,而胞浆中Fox O3a逐渐升高。细胞核中Fox O3a蛋白表达情况可见,TBI+CGRP组的Fox O3a蛋白表达低于TBI组,差异显着,有统计学意义;而细胞浆中Fox O3a表达情况可见,TBI术后1、3、5、7天四个时间点,TBI+CGRP组的Fox O3a蛋白表达高于TBI组,差异显着,有统计学意义。小结:1.TBI抑制了Akt/m TOR信号通路的激活,对神经元细胞有损伤作用;外源性CGRP干预促进了Akt/m TOR信号通路的激活,导致了神经元细胞自噬和凋亡的降低,起到了脑保护作用。2.TBI促进了Fox O3a蛋白向神经元细胞核内转移,对神经元细胞有损伤作用;外源性CGRP干预可缓解细胞核内的Fox O3a升高趋势,保护神经元细胞。结论:1.临床TBI患者血清样本中CGRP变化趋势为先迅速降低然后逐渐升高,约24小时到达最低点,大约在14天前后达高峰,与动物模型变化趋势相同。2.血清CGRP水平可以预测TBI患者的预后不良及死亡情况,而且该预测的效能较高。CGRP高水平组远期预后、存活率优于CGRP低水平组;存活患者血清CGRP水平高于因TBI死亡的患者。CGRP可以作为TBI预后不良及死亡评估的参考指标。3.根据Feeney重物下降法,可建立标准、可靠的颅脑挫伤动物模型,术后正常喂养及观察行为学变化,确认TBI模型建立。4.CGRP干预,减低了创伤性颅脑损伤鼠的神经功能损伤,减低了创伤性颅脑损伤挫伤灶的损伤面积;减低了创伤性颅脑损伤后脑水肿的程度,减少了TBI后脑水肿的持续时间;减轻了TBI后血脑屏障的破坏程度;通过蛋白印迹法,可见TBI+CGRP组脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,提示脑室注射联合尾静脉注射的外源性干预途径有效可靠。5.TBI后小鼠神经细胞自噬和凋亡水平增加,神经胶质纤维酸性蛋白GFAP增加;CGRP的干预有效抑制了TBI所致小鼠神经元细胞的自噬和凋亡,减少了TBI小鼠颅脑损伤部位GFAP的表达。6.TBI抑制了Akt/m TOR信号通路的激活,导致了神经元细胞自噬和凋亡水平升高,同时促进了Fox O3a蛋白向细胞核内转移,对神经元细胞有损伤作用;相反,外源性CGRP干预可促进Akt/m TOR信号通路的激活,抑制了神经元细胞自噬和凋亡,缓解了细胞核内的Fox O3a升高趋势,起到了脑保护作用。
程杰[9]（2021）在《鼠尾草酸抑制铁死亡减轻脊髓损伤的实验研究》文中研究表明目的:脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后损伤部位出现各种病理级联反应,导致一系列细胞死亡的发生。反之,死亡的细胞释放众多危险信号,进而加重继发性损伤,形成一种恶行循环。铁死亡是一种新明确的细胞死亡形式,广泛参与中枢神经系统相关疾病的发生发展。鼠尾草酸（carnosic acid,CA）是一种双萜类小分子化合物,具有抗氧化、神经保护等作用,但目前尚缺乏鼠尾草酸对脊髓损伤保护性效应的研究。故本研究的主要目的是:1)制备大鼠脊髓损伤模型,探究铁死亡在脊髓损伤后的表现及其时间进程;2)借用PC12细胞拟神经元细胞构建铁死亡模型,在体外环境中探究鼠尾草酸能否抑制铁死亡;3)探索鼠尾草酸抑制铁死亡的作用机制;4)体内实验探究鼠尾草酸能否促进SCI大鼠神经功能恢复,及其具体机制。方法:1)将SD大鼠随机分为6个组:假手术组、SCI-6h组、SCI-1d组、SCI-3d组、SCI-7d组和SCI-14d组。利用改良的Allen’s重物坠落法制备大鼠脊髓损伤模型。利用生物信息学对脊髓损伤和铁死亡共同靶点进行分析,借用RT-q PCR技术对铁死亡特异性基因PTGS2、RPL8F、HMGB1、ATP5G3、IREB2和CS进行定量分析,免疫印迹（western blot,WB）检测各组中ACSL4、FPN、FTH1、GPX4和x CT的蛋白质表达水平,利用普鲁士蓝染色和铁离子试剂盒测量各组脊髓组织中铁离子水平,试剂盒检测各组GPX4酶活性水平,借用FJB染色分析变性神经元细胞情况;2)细胞增殖活性检测试剂盒（CCK-8）检测不同浓度的鼠尾草酸和erastin对PC12细胞活性的影响,确定后续实验所需药物浓度。实验分为6个组:对照组、模型组、阳性对照组（Fer-1组）、低、中、高剂量鼠尾草酸组。试剂盒检测各组中丙二醛（malonaldehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）、二价铁离子(Fe2+)和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）活性的水平。利用流式细胞技术检测鼠尾草酸对细胞内ROS水平的影响。利用Mito-Tracker Red染色及醋酸双氧铀和枸橼酸铅双染色观察鼠尾草酸对线粒体膜电位和形态的影响;3)实验分为九个组:对照组、模型组、低剂量CA干预组、中剂量CA干预组、高剂量CA干预组和Nrf2抑制剂组。采用WB和免疫荧光（immunofluorescence,IF）技术检测鼠尾草酸对Nrf2表达水平和分布的影响,利用RT-q PCR和WB分别检测鼠尾草酸对Nrf2、x CT、GCLM、GCLC、GSS、GPX4、FTH1和FPN的m RNA和蛋白质表达的影响。试剂盒检测鼠尾草酸对MDA、GSH、Fe2+和GPX4酶活性的影响;4)将SD大鼠随机分为4个组:假手术组、模型组、鼠尾草酸低剂量组、鼠尾草酸高剂量组。借用BBB评分和斜板实验评估大鼠的运动功能,采用HE染色观察脊髓形态的变化,利用FJB染色和尼氏染色观察鼠尾草酸对脊髓损伤后神经元细胞状态的影响,利用试剂盒检测鼠尾草酸对脊髓损伤后MDA、GSH、Fe2+和GPX4酶活性的影响,借用RT-q PCR和WB技术分别检测鼠尾草酸对脊髓损伤后铁死亡相关靶点的m RNA水平和蛋白质水平的影响。结果:1)RT-q PCR结果显示,脊髓损伤后PTGS2、RPL8F和HMGB1的m RNA水平高于假手术组（P<0.01）,其中PTGS2在脊髓损伤后6小时表达最高,RPL8F和HMGB1约在第三天达到峰值。WB结果显示,术后第3天ACSL4的表达水平较假手术组显着升高（P<0.01）;脊髓损伤后FPN的表达水平显着降低（P<0.01）,术后第3天表达最低,而FTH1在术后第3天表达水平显着升高（P<0.01）;脊髓损伤后第1天,GPX4和x CT的表达较假手术组显着降低（P<0.01）。脊髓组织铁离子检测结果显示,脊髓损伤后6小时,铁离子水平显着增加（P<0.01）,第3天达到最高峰。术后第1天,GPX4酶活性较假手术组显着降低（P<0.01）,第3天达到最低值。FJB染色结果显示术后6h,变性的神经元数量即显着增加（P<0.01）,术后第3天达到峰值;2)CCK-8结果显示,鼠尾草酸浓度≤20μM对PC12细胞无明显毒性作用（P>0.5）,选择浓度为1、5和10μM的鼠尾草酸用于后续实验。结果显示,鼠尾草酸能够恢复erastin诱导的PC12细胞活力下降。Erastin刺激诱导PC12细胞,能够明显地降低细胞内GSH水平和GPX4酶活力（P<0.01）,同时增加细胞内MDA的含量（P<0.01）,而鼠尾草酸能够逆转erastin所产生的效应。流式结果显示erastin能够增加PC12细胞内ROS水平（P<0.01）,而鼠尾草酸能够降低ROS的含量（P<0.01）。线粒体形态观察结果显示,erastin能够降低线粒体膜电位,导致线粒体皱缩、线粒体嵴减少或消失,而鼠尾草酸能够明显地改善线粒体膜电位和形态的变化;3)RT-q PCR结果显示,鼠尾草酸对PC12细胞内Nrf2的m RNA水平无明显作用,但WB和IF结果显示,与模型组相比,鼠尾草酸显着增加了细胞内Nrf2蛋白质水平,同时促进了其向细胞核内聚积。RT-q PCR和WB的结果显示,鼠尾草酸能够显着地上调PC12细胞内x CT、GCLM、GCLC、GSS、GPX4、FTH1和FPN的m RNA及蛋白质表达水平,而Nrf2特异性抑制剂ML385能够削弱鼠尾草酸的上调效应;4)BBB运动学评分结果显示,术后第7天,SCI+H-CA组的BBB评分优于SCI组（P<0.05）,从术后第14天开始,SCI+L-CA组和SCI+H-CA组的BBB评分高于SCI组。斜板实验结果显示,术后第3天,SCI+H-CA组的斜坡角度大于SCI组（P<0.05）,从术后第7天开始,SCI+L-CA组和SCI+H-CA组的斜坡角度明显优于SCI组（P<0.01）。与SCI组相比,鼠尾草酸能够减轻脊髓组织形态病理学改变,减少变性神经元数量（P<0.01）,增加存活的神经元数目（P<0.01）。鼠尾草酸能够逆转脊髓损伤后高水平的PTGS2的m RNA含量、ACSL4的蛋白质含量、MDA含量和铁离子含量,以及低表达的GSH含量和GPX4酶活性水平。RT-q PCR和WB实验结果显示,与SCI组相比,鼠尾草酸能够上调Nrf2、x CT、GCLC、GCLM、GSS、GPX4、FPN和FTH1的m RNA表达水平及蛋白质表达量。结论:1)铁死亡参与脊髓继发性损伤过程,并且在损伤早期（6 h）即可出现铁死亡现象,于术后第3天最显着;2)鼠尾草酸能够抑制erastin诱导的PC12细胞铁死亡的发生;3)鼠尾草酸能够通过激活Nrf2通路,上调GSH-GPX4轴,同时增加FTH1和FPN的表达水平,提高细胞内源性抗氧化能力,进而抑制铁死亡的发生;4)鼠尾草酸能够通过激活Nrf2通路,抑制铁死亡的发生,增加存活的神经元细胞,减轻脊髓损伤,促进神经功能的恢复。
王文良[10]（2021）在《粉防己碱通过SIRT3-AMPK-mTOR介导自噬减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的研究》文中研究说明蛛网膜下腔出血（Subarachnoid Hemorrhage,SAH）是一种较为常见的出血性脑卒中疾病,SAH在大多数情况下是由于动脉瘤破裂造成的。虽然SAH只占脑卒中总病例数的5%左右,但因其高死亡率和高致残率的特点,SAH对个人和社会有重大的影响。随着医疗技术的发展,手术夹闭或栓塞动脉瘤可以有效降低死亡率,改善病人预后。但是手术治疗只能降低其再次出血的风险,SAH对大脑的损伤依然存在。过去认为影响预后的主要原因是迟发性脑血管痉挛,然而针对脑血管痉挛的治疗并未改善SAH患者的预后。这说明还有其他病因影响着SAH预后。早期脑损伤（Early brain injury,EBI）目前得到了越来越多国内外专家的关注,EBI指的是从SAH开始至其72小时这段时间的颅脑损伤。但目前没有针对早期脑损伤治疗的药物。因此探索有效的治疗药物是成为解决该领域问题的主要任务。中药防己具有辛能行散,苦寒降泄的作用。其有效成分粉防己碱已经应用于临床。有研究指出粉防己碱具有神经保护作用,但具体机制尚未完全阐明。自噬是真核细胞对自身受损的蛋白和细胞器降解回收的过程。对维持细胞稳态和能量代谢起到至关重要的作用。自噬受多条信号通路调控,其中AMPK/mTOR信号通路在调控自噬中发挥着重要的作用。SAH后的EBI会上调自噬水平已经被多个研究证实过,但是粉防己碱是否可以通过AMPK-mTOR信号通路调控自噬,是否通过影响自噬水平而发挥对EBI神经保护作用,尚未见报道。SIRT3是属于Sirtuins家族。在脑组织中表达丰富且主要分布于线粒体之中。SIRT3参与了细胞的氧化应激,能量代谢的调节。SIRT3的上调在多种疾病中起到了减轻损伤,改善预后的作用。已经成为减轻氧化应激反应、缺血损伤和炎症反应的研究热点。进一步的研究发现SIRT3可以通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬。但是在SAH中,粉防己碱是否可以通过SIRT3来调控AMPK/mTOR信号通路进而影响自噬尚未可知。因此本实验通过血管内穿刺法制作SAH模型,模拟临床上SAH后的EBI的病理生理学过程,观察粉防己碱是否可以通过SIRT3/AMPK/mTOR信号通路介导自噬减轻SAH后的EBI。第一部分粉防己碱通过调控自噬改善蛛网膜下腔出血后大鼠早期脑损伤的研究。目的:通过蛛网膜下腔出血大鼠动物模型观察粉防己碱对SAH后自噬的影响,探讨粉防己碱是否可以通过调控自噬改善蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤。方法:将300-330g的雄性SD大鼠随机分为三组:假手术组,SAH组,粉防己碱组。三组均采用血管内穿刺法制造SAH模型,除假手术组外,其他两组在感受到血管阻力后刺破血管。假手术组当感受到血管阻力后撤出线栓,避免刺破血管。粉防己碱组于模型制作完成后立即腹腔注射粉防己碱（20mg/kg）。通过SAH出血量评分,评估SAH模型的均一稳定性。通过神经功能评分和脑含水量的测定观察其神经损伤程度。采用TUNEL染色观察各组鼠的脑皮质区细胞凋亡情况。采用尼式染色观察各组大鼠细胞形态和神经细胞的数量。通过Western Blot法检测LC3和p62蛋白的表达水平。结果:1 SAH出血评分:SAH组和粉防己碱组的蛛网膜下腔出血评分明显高于假手术组（P<0.01）。而SAH组和粉防己碱组之间无统计学差异。2脑含水量和神经功能缺陷评分结果的比较::SAH相较于假手术组,神经功能缺陷评分显着下降,脑含水量显着上升（P<0.01）。同时,相较于SAH组,粉防己碱组大鼠的神经功能缺陷评分上升、脑含水量下降（P<0.01）。3细胞凋亡情况:TUNEL染色结果显示,与假手术组相比,SAH组大鼠脑皮质区细胞凋亡率显着升高（P<0.01）;与SAH组比较,粉防己碱组大鼠脑皮质区细胞凋亡率显着降低（P<0.01）。4细胞形态学观察:尼式染色结果显示:假手术组神经细胞形态正常,尼式体丰富。SAH组与假手术组相比损伤严重,并伴随大量神经细胞丢失（P<0.01）。但粉防己碱组与SAH组相比损伤得到明显缓解,且神经细胞数量增多（P<0.01）。5 P62和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达情况:相较于假手术组,SAH组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显着升高（P<0.01）,P62的表达水平显着下降（P<0.01）。而与SAH组相比较,粉防己碱组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显着降低（P<0.01）而P62的表达水平显着升高（P<0.01）。小结:粉防己碱对SAH后的EBI具有神经保护作用,体现在粉防己碱改善了 SAH介导的神经功能损伤情况和神经细胞形态损伤,减少了脑含水量、神经细胞的凋亡率和神经细胞的损失。同时粉防己碱降低了 SAH后的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平,并升高了 P62蛋白的表达,表明粉防己碱可能通过抑制自噬减轻SAH后的EBI。第二部分 粉防己碱通过SIRT3/AMPK/mTOR信号通路抑制自噬减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的研究目的:通过SAH模型观察粉防己碱对SIRT3/AMPK/mTOR信号通路的影响,探讨粉防己碱是否可以通过SIRT3/AMPK/mTOR信号通路调控自噬发挥对SAH后EBI的神经保护作用。方法:将雄性SD大鼠随机分配为假手术组,SAH组,粉防己碱组,粉防己碱+3-TYP组。在术前对粉防己碱+3-TYP组的大鼠进行预处理,每两天给予大鼠3-TYP（30mg/kg）一次,共三次,然后再进行SAH手术。术后立刻对粉防己碱组和粉防己碱+3-TYP组的大鼠腹腔注射粉防己碱溶液（20mg/kg）。通过SAH出血量评分,评估SAH模型的均一稳定性。通过神经功能评分和脑含水量的测定观察其神经损伤程度。采用HE染色观察各组鼠的脑皮质区神经细胞的形态。采用免疫荧光和Western Blot检测SIRT3在各组中的蛋白表达水平。使用Western Blot检测各组的LC3、p-AMPK、AMPK、p-mTOR及mTOR的蛋白表达水平。结果:1 SAH出血评分:假手术组与SAH组、粉防己碱组和粉防己碱+3-TYP组的评分差距有统计学意义（P<0.01）。而SAH组、粉防己碱组和粉防己碱+3-TYP组之间SAH评分无统计学意义（P>0.05）。2脑含水量和神经功能缺陷评分结果的比较:相较于假手术组,SAH组大鼠的脑含水量明显上升且神经功能缺陷评分明显下降（P<0.01）。但与SAH组相比,粉防己碱组脑含水量显着下降、神经功能缺陷评分显着上升（P<0.01）,与粉防己碱组相比,粉防己碱+3-TYP组脑含水量上升且神经功能缺陷评分下降（P<0.05）。3各组大鼠神经细胞形态比较:HE染色结果显示:假手术组大鼠脑皮质区神经细胞形态正常;SAH组大鼠脑皮质区大量神经细胞出现核固缩,深染现象;粉防己碱组大鼠脑组织的上述情况相较于SAH组显着缓解。与粉防己碱组相比,粉防己碱+3-TYP组神经细胞损伤加重。4 SIRT3在各组大鼠脑组织的表达情况:免疫荧光结果表明:相较于假手术组,SAH组大鼠脑皮质区的SIRT3荧光强度明显减少（P<0.01）。与SAH组相比,粉防己碱组荧光强度明显增加（P<0.01）。与粉防己碱组相比,粉防己碱+3-TYP组荧光强度明显下降（P<0.01）。5 SIRT3蛋白表达情况:Western blot结果显示:与假手术组相比,SAH组SIRT3蛋白表达减少（P<0.05）。与SAH相比,粉防己碱组SIRT3蛋白表达上调（P<0.05）。相较于粉防己碱组,粉防己碱+3-TYP组蛋白表达下降（P<0.05）。6各组大鼠脑组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达情况:Western blot结果显示:与Sham相比,SAH组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值显着上升（P<0.01）。与SAH相比,粉防己碱组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值显着下降（P<0.01）。相较于粉防己碱组,粉防己碱+3-TYP组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值显着上升（P<0.01）。7各组大鼠脑组织p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR的蛋白表达情况:Western blot结果显示:与假手术组相比,SAH组p-AMPK/AMPK的比值显着上升,但p-mTOR/mTOR的比值显着下降（P<0.01）。与SAH组相比,粉防己碱组的p-AMPK/AMPK 比值显着下降,但p-mTOR/mTOR的比值显着上升（P<0.01）。相较于粉防己碱组,粉防己碱+3-TYP组p-AMPK/AMPK的比值显着上升,但p-mTOR/mTOR的比值显着下降（P<0.01）。小结:3-TYP可以部分逆转粉防己碱对SAH后大鼠的神经保护作用。该作用可能与3-TYP抑制了粉防己碱对SAH后大鼠SIRT3蛋白的上调,激活了 AMPK-mTOR信号通路,进而解除了粉防己碱对SAH后大鼠大脑自噬抑制作用有关。表明粉防己碱可通过SIRT3-AMPK-mTOR信号通路抑制自噬发挥对EBI的保护作用。结论:粉防己碱可以对SAH后的EBI发挥神经保护作用,这可能与上调SIRT3蛋白的表达并通过SIRT3-AMPK-mTOR信号通路抑制SAH后脑组织的自噬有关。此外SIRT3可以负向调控AMPK-mTOR信号通路进而影响自噬。
二、DCG-Ⅳ在大鼠脑损伤及二次脑损伤中的神经保护作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、DCG-Ⅳ在大鼠脑损伤及二次脑损伤中的神经保护作用（论文提纲范文）
（1）迷走神经电刺激对创伤性脑损伤的神经保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 基于生物信息学探讨脑外伤分子机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要实验设备与仪器 |
| 2.4 芯片数据资料获取 |
| 2.5 差异基因筛选 |
| 2.6 富集分析 |
| 2.7 蛋白质互作网络与关键基因 |
| 2.8 动物实验分组 |
| 2.9 建立脑外伤动物模型 |
| 2.10 qRT-PCR法验证关键基因表达 |
| 2.11 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 差异表达基因的确定 |
| 3.2 差异基因功能富集分析 |
| 3.3 筛选TBI的关键基因 |
| 3.4 关键基因富集分析 |
| 3.5 动物实验验证关键基因 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二章 迷走神经电刺激对脑外伤的保护作用及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验动物及分组 |
| 2.3 建立脑外伤大鼠模型 |
| 2.4 迷走神经电刺激 |
| 2.5 荧光定量PCR |
| 2.6 Western Blot |
| 2.7 脑水容量检测 |
| 2.8 神经功能评分 |
| 2.9 石蜡切片制备 |
| 2.10 HE染色 |
| 2.11 免疫组化 |
| 2.12 免疫荧光 |
| 2.13 氧化应激指标检测 |
| 2.14 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 VNS对脑组织病理损伤的作用 |
| 3.2 VNS对神经功能缺损的作用 |
| 3.3 VNS对脑含水量的作用 |
| 3.4 VNS对脑组织氧化应激指标的作用 |
| 3.5 VNS对脑组织细胞凋亡的作用 |
| 3.6 VNS对脑组织细胞凋亡相关蛋白的作用 |
| 3.7 VNS对脑组织NF-κB活化水平的作用 |
| 3.8 VNS对脑组织NLRP3 活化水平的作用 |
| 3.9 VNS对脑组织炎症因子的作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第3章 全文总结 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 创新点 |
| 3.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 迷走神经电刺激在创伤性脑损伤康复中的研究进展 |
| 参考文献 |
（2）维生素K2通过降低细胞焦亡对创伤性脑损伤大鼠神经保护作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| 参考文献 |
| 三、综述 程序性细胞死亡在创伤性脑损伤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 五、攻读学位期间论文发表情况 |
| 六、致谢 |
（3）H2S对RhoA的Ser188位点磷酸化的调节及其介导的大鼠脑缺氧/缺血性损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 英汉缩略词对照(Abbreviations) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂和来源 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 外源性H_2S体外磷酸化实验(~(32)P) |
| 2.1.1 重组质粒的转化 |
| 2.1.2 重组质粒的诱导表达 |
| 2.1.3 重组蛋白Rho A的分离与纯化 |
| 2.1.4 体外磷酸化 |
| 2.2 外源性H_2S实验 |
| 2.2.1 大鼠原代海马神经细胞培养与鉴定 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 神经细胞RhoA及ROCK_2活性测定 |
| 2.2.4 缺氧性损伤模型(Hypoxia-Reoxygenation Protocol) |
| 2.2.5 细胞活力的测量 |
| 2.2.6 神经特异性烯醇化酶(NSE)活性测定 |
| 2.2.7 乳酸脱氢酶(LDH)活性测定 |
| 2.2.8 细胞膜蛋白和胞质蛋白的提取 |
| 2.2.9 蛋白免疫印迹(Western blotting) |
| 2.2.10 全细胞膜片钳技术 |
| 2.3 内皮源性H_2S实验 |
| 2.3.1 原代脑血管内皮细胞培养 |
| 2.3.2 细胞共培养系统 |
| 2.3.3 流式细胞仪细胞凋亡测定 |
| 2.3.4 神经细胞内钙含量测定 |
| 2.3.5 H_2S浓度的测量 |
| 2.3.6 神经细胞活力和LDH及 NSE的测定 |
| 2.3.7 神经细胞RhoA及ROCK_2活性测定 |
| 2.3.8 Western blotting |
| 2.4 动物实验 |
| 2.4.1 质粒转染大鼠(脑立体定位注射) |
| 2.4.2 大鼠脑缺血模型(双侧颈总动脉结扎2VO) |
| 2.4.3 脑组织(海马)HE染色 |
| 2.4.4 脑组织(海马)TUNEL染色 |
| 2.4.5 血清LDH和 NSE测定 |
| 2.4.6 海马组织RhoA和ROCK_2活性测定 |
| 2.4.7 Western blotting |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 硫化氢(H_2S)对RhoA Ser188体外磷酸化的影响 |
| 3.1.1 目的蛋白在大肠杆菌(BL-21)中的表达 |
| 3.1.2 目的蛋白(RhoA~(wild),RhoA~(S188A))的纯化 |
| 3.1.3 NaHS(外源性H_2S)对RhoA Ser188体外磷酸化的影响 |
| 3.2 Ser188 介导NaHS对大鼠海马神经元的保护作用 |
| 3.2.1 大鼠原代海马神经细胞的培养与鉴定 |
| 3.2.2 真核质粒(RhoA~(wild)-pEGFP-N1;RhoA~(S188A)-pEGFP-N1)转染原代大鼠神经细胞 |
| 3.2.3 Ser188 介导Na HS诱导大鼠海马神经元Rho A的磷酸化 |
| 3.2.4 Ser188在Na HS诱导神经元中Rho A易位和失活的作用 |
| 3.2.5 RhoA Ser188在NaHS诱导的ROCK_2蛋白表达及其活性抑制的作用 |
| 3.2.6 Rho ASer188 介导Na HS对大鼠海马神经元H/R损伤的保护作用 |
| 3.2.7 Rho A Ser188 介导Na HS对 BKCa通道电流的影响 |
| 3.3 Ser188介导内皮源性H_2S对大鼠海马神经元的保护作用 |
| 3.3.1 大鼠原代脑血管内皮细胞(ECs)的培养与鉴定 |
| 3.3.2 内皮源性H_2S对神经元RhoA磷酸化,活性和易位的影响 |
| 3.3.3 内皮源性H_2S对神经元ROCK_2蛋白表达和活性的影响 |
| 3.3.4 内皮细胞中CSE产生内皮源性H_2S |
| 3.3.5 Ser188在CSE产生的H_2S诱导大鼠神经元RhoA磷酸化,转运和ROCK_2蛋白表达中的影响 |
| 3.3.6 Ser188在CSE产生的H_2S减轻神经元H/R损伤的作用 |
| 3.3.7 Ser188在CSE产生的H_2S对神经元(H/R损伤)RhoA和ROCK_2活性抑制的作用 |
| 3.3.8 Ser188在CSE产生的H_2S保护神经元H/R损伤的作用 |
| 3.4 Ser188 介导NaHS对大鼠缺血再灌注脑损伤的保护作用 |
| 3.4.1 大鼠脑定位转染质粒的表达与检测 |
| 3.4.2 大鼠双侧颈总动脉结扎(2VO)模型验证 |
| 3.4.3 Ser188在NaHS对大鼠缺血再灌注脑损伤中海马组织Rho A磷酸化及其活性的影响 |
| 3.4.4 Ser188在NaHS对大鼠缺血再灌注脑损伤中海马组织ROCK_2蛋白表达及其活性的影响 |
| 3.4.5 Ser188在NaHS降低大鼠缺血再灌注损伤中LDH、NSE的影响 |
| 3.4.6 Ser188在NaHS减轻大鼠缺血再灌注损伤中海马组织病理学的影响 |
| 3.4.7 Ser188在NaHS减轻大鼠缺血再灌注损伤中海马神经细胞凋亡的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 神经血管单位与缺血性脑中风关系 |
| 参考文献 |
（4）ZNRF2对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用及机制（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSRTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 ZNRF2 在缺血性卒中患者血液的表达变化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ZNRF2 对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ZNRF2对OGD/R致 PC12 细胞损伤的作用观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 ZNRF2对OGD/R致原代培养皮层神经元损伤的作用观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述:缺血性脑卒中的“双刃剑”——自噬 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（5）组蛋白修饰在衰老导致脑出血脑损伤加重中的作用及机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 不同年龄阶段脑出血脑损伤的比较 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 三种组蛋白修饰在不同年龄阶段脑出血中的重分布 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 组蛋白修饰重分布对不同年龄阶段脑出血脑组织转录组的影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 年轻血浆对老年脑出血的治疗作用及组蛋白修饰的变化 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 循环相关因子在大脑衰老及衰老相关疾病中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）舒筋健脑方对脑瘫患者认知功能影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 中医认识脑性瘫痪的研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 病因病机 |
| 3 辨证分型 |
| 4 体质 |
| 5 治疗 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 第二节 缺血缺氧脑损伤的机制研究进展 |
| 1 细胞凋亡 |
| 2 氧化应激 |
| 3 兴奋性氨基酸 |
| 4 单胺类神经递质 |
| 5 炎症反应 |
| 6 钙离子 |
| 7 NO及NOS酶类 |
| 8 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二章 |
| 第一节 基于因子和聚类分析脑瘫用药规律 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 益智仁治疗脑性瘫痪的网络药理学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三节 舒筋健脑方治疗痉挛型脑瘫临床研究 |
| 1 一般资料 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四节 基于Bcl-2/Bax、Caspase-3探讨舒筋健脑方改善HIBD的机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（7）控制减压技术治疗兔重型颅脑损伤后急性颅高压中NDRG2和NF-κB介导的凋亡信号通路关系的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 引言 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验主要仪器 |
| 1.3 实验主要试剂 |
| 1.4 实验模型的制作及步骤 |
| 2.实验设计 |
| 2.1 动物术后24 小时行为学评分 |
| 2.2 脑组织含水量测定 |
| 2.3 Western-blot法检测各组NDRG2、NF-κB以及Caspase-3 蛋白的表达 |
| 2.3.1 蛋白制备 |
| 2.3.2 BCA蛋白定量 |
| 2.3.3 制胶、制样 |
| 2.3.4 SDS-PAGE电泳 |
| 2.3.5 转膜、封闭 |
| 2.3.6 孵育一抗、二抗 |
| 2.3.7 ECL曝光 |
| 2.4 RT-PCR法检测NDRG2、NF-κB的 mRNA表达 |
| 2.5 TUNEL染色法检测细胞凋亡程度 |
| 2.6 统计学分析方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 各组死亡情况比较 |
| 3.2 各组术后24 小时动物行为学评分 |
| 3.3 各组脑组织含水量比较 |
| 3.4 各组术后24 小时NDRG2、NF-κB、Caspase-3的蛋白变化 |
| 3.5 各组术后24 小时NDRG2、NF-κB的mRNA变化 |
| 3.6 控制减压模型治疗后脑细胞凋亡程度比较 |
| 4.讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 硕士期间发表论文情况 |
| 硕士期间参与的科研项目 |
| 致谢 |
| 文献综述 NDRG2 在神经系统疾病中的作用研究 |
| 前言 |
| 1.NDRG2 的发现与分布 |
| 2.NDRG2 在星形胶质细胞中的作用 |
| 3.NDRG2 和神经系统肿瘤 |
| 4.NDRG2 和神经退行性疾病 |
| 5.NDRG2 和脑卒中 |
| 6.讨论 |
| 参考文献 |
（8）降钙素基因相关肽（CGRP）通过调控Akt/mTOR信号通路介导的凋亡和自噬减轻创伤性颅脑损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 创伤性颅脑损伤患者血清CGRP水平及与预后的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 降钙素基因相关肽(CGRP)对创伤性颅脑损伤模型小鼠的神经功能保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 降钙素基因相关肽(CGRP)对创伤性颅脑损伤后神经元细胞自噬和凋亡的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 AKT/mTOR信号通路参与了外源性CGRP对神经元细胞自噬和凋亡的调控 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 自噬和凋亡在颅脑创伤治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 降钙素基因相关肽CGRP在神经系统疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）鼠尾草酸抑制铁死亡减轻脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠脊髓损伤模型中铁死亡表现的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 鼠尾草酸抑制铁死亡减轻PC12 细胞损伤的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 鼠尾草酸抑制铁死亡的分子机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 鼠尾草酸改善大鼠脊髓损伤的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 铁死亡在创伤性脑和脊髓损伤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简介 |
| 导师评阅表 |
（10）粉防己碱通过SIRT3-AMPK-mTOR介导自噬减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 粉防己碱通过调控自噬改善蛛网膜下腔出血后大鼠早期脑损伤的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 粉防己碱通过SIRT3/AMPK/mTOR信号通路抑制自噬减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 SIRT3与自噬在蛛网膜下腔出血的关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、DCG-Ⅳ在大鼠脑损伤及二次脑损伤中的神经保护作用（论文参考文献）
- [1]迷走神经电刺激对创伤性脑损伤的神经保护作用及其机制研究[D]. 汤运梁. 南昌大学, 2021(01)
- [2]维生素K2通过降低细胞焦亡对创伤性脑损伤大鼠神经保护作用的研究[D]. 李守信. 大连医科大学, 2021(01)
- [3]H2S对RhoA的Ser188位点磷酸化的调节及其介导的大鼠脑缺氧/缺血性损伤的保护作用[D]. 陈野. 安徽医科大学, 2021(01)
- [4]ZNRF2对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用及机制[D]. 顾超. 重庆医科大学, 2021(01)
- [5]组蛋白修饰在衰老导致脑出血脑损伤加重中的作用及机制[D]. 袁俊杰. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [6]舒筋健脑方对脑瘫患者认知功能影响及机制研究[D]. 赵亚林. 北京中医药大学, 2021(01)
- [7]控制减压技术治疗兔重型颅脑损伤后急性颅高压中NDRG2和NF-κB介导的凋亡信号通路关系的实验研究[D]. 潘晓飞. 安徽医科大学, 2021(01)
- [8]降钙素基因相关肽（CGRP）通过调控Akt/mTOR信号通路介导的凋亡和自噬减轻创伤性颅脑损伤的实验研究[D]. 田军. 河北医科大学, 2021
- [9]鼠尾草酸抑制铁死亡减轻脊髓损伤的实验研究[D]. 程杰. 新疆医科大学, 2021(08)
- [10]粉防己碱通过SIRT3-AMPK-mTOR介导自噬减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的研究[D]. 王文良. 承德医学院, 2021(01)