一、Cloning and enzymology analysis of farnesyl pyrophosphate synthase gene from a superior strain of Artemisia annua L.（论文文献综述）
赵一瑾[1]（2021）在《代谢工程改造酿酒酵母生产萜类化合物》文中指出萜类化合物在食品、药品和化学品等多方面都具有较高的经济价值。通过从自然界中天然提取和化学法合成均不能满足日益增长的市场需求,而利用微生物细胞工厂生产萜类化合物则被认为是绿色且经济的途径。酿酒酵母因为具有生物安全性高、易于遗传操作和可利用廉价碳源等优势而成为合成萜类化合物的最有价值的一种宿主。目前,关于在酿酒酵母中异源合成萜类化合物的主要研究方向有以下几个方面:引入并过表达异源代谢途径酶;增加前体代谢物的供应;动态控制或删除竞争途径;筛选合适的发酵底物,降低合成成本。亲脂性的萜类化合物一般被认为是积累并包裹在脂滴（LD）中的,但是脂滴中各组分的代谢合成与萜类化合物的合成共用多种前体代谢物、ATP和NADPH,这使整个代谢网络变得复杂。所以,虽然在酿酒酵母中已有很多策略用于萜类化合物的异源合成,但其产量仍受到存储方式和代谢网络的复杂调控等多种因素的影响。因此,研究重新定向脂类代谢通量对增加萜类化合物的生物合成十分重要。在底物利用方面,SUC2基因编码的酿酒酵母蔗糖转化酶（Sc In V）能够水解蔗糖进入细胞参与多种生化反应,这使酿酒酵母能够利用廉价的蔗糖进行代谢发酵。为了更好的利用蔗糖发酵生产高价值的化合物,有必要对转化酶进行定点突变研究其突变体酶活性。本研究以酿酒酵母CEN.PK 113-5D菌株为宿主菌,通过引入并过表达β-胡萝卜素和α-葎草烯的异源合成途径,探究了脂类代谢通量扰动与不同萜类化合物合成的关系。通过对酿酒酵母中的蔗糖转化酶进行定点突变降低酶活性,研究了蔗糖转化酶活性对β-胡萝卜素积累和其他特性的影响,为在酿酒酵母中利用更为廉价的甘蔗糖蜜发酵生产高价值的化合物提供一定的参考。本论文的主要研究结果如下:1.为了表征酿酒酵母积累不同萜类化合物的能力,分别在酵母细胞中引入了β-胡萝卜素和α-葎草烯的异源合成途径。首先,通过采取基因组整合表达方式和强启动子实现crt YB基因、crt I基因、crt E基因和t HMG1基因的高表达,使构建的YZ03菌株可生产3.67 mg/g DCW的β-胡萝卜素。其次,通过采取强启动子并利用基因组整合方式表达ZSS1基因,并进一步过表达内源性的限速酶ERG20基因和动态调控竞争途径中的ERG9基因,使构建的ZH04菌株可生产93.94 mg/L的α-葎草烯。在酿酒酵母中成功构建了分别产生β-胡萝卜素和α-葎草烯的工程菌株。2.细胞的多种功能离不开脂类代谢网络的调控,我们表征了改造脂类代谢网络对不同萜类化合物合成的影响。通过在YZ03菌株基因组上整合一个额外的由强启动子控制表达的ARE1和ARE2可以产生5.67 mg/g DCWβ-胡萝卜素,比YZ03的产量提高了54%;在YZ03菌株中敲除磷脂酸磷酸酶基因（PAH1、DPP1和LPP1）也使β-胡萝卜素产量增加了2倍。结合上述两种策略更是将β-胡萝卜素的产量提高了2.4倍。结果表明,脂质代谢网络的改造与调控对于酿酒酵母中β-胡萝卜素的积累很重要。然而,在α-葎草烯生产菌株中过表达ARE1或删除磷脂酸磷酸酶基因导致其产量均有所下降。这表明针对不同的萜类化合物,其在酿酒酵母中的积累、存储与脂类代谢网络之间的关系十分复杂,不同萜类产物与脂类代谢的关系具有一定差异。虽然具体机理尚不清楚,但该工作也为研究改变脂质代谢网络与萜类化合物积累之间的关系提供了见解。3.酿酒酵母中内源的蔗糖转化酶使其利用蔗糖发酵成为可能。研究了在蔗糖条件下,降低蔗糖转化酶活性对β-胡萝卜素积累和其他特性的影响。通过设计具有不同标签并与Golden Gate克隆兼容的标准化载体,构建了几种含有不同标签的蛋白表达质粒,并在此基础上快速高效地完成蔗糖转化酶的定点诱变,加速了突变蛋白的表达。在高蔗糖条件下,SUC2Q148A和SUC2Q201V突变体具有较低的转化酶活性和增强的发酵能力,为菌株的筛选提供一定的参考。
刘彦婷[2]（2020）在《广藿香PatPTS启动子功能及G-box结合因子参与的转录调节研究》文中指出广藿香醇合成酶（Patchoulol synthase,PTS）是广藿香中萜类合成途径下游的关键酶,对于广藿香醇的合成积累至关重要,是广藿香醇合成代谢中的重要调控位点。通过调控PatPTS的表达可以提高植物萜类化合物的含量,但是具体的转录调节机制尚未了解。课题组前期研究工作发现PatPTS基因受光诱导表达,本研究以PatPTS基因启动子为主要研究对象,以期找出相关顺式作用元件。利用FPNI-PCR技术克隆PatPTS的完整启动子,预测其可能具有的顺式作用元件,构建5’端缺失的启动子片段与GUS相融的表达载体,进行植物表达分析,探究该启动子在不同诱导下的表达模式,初步了解启动子元件对其功能的影响,为后续研究PatPTS基因启动子及其受光诱导表达机制奠定基础。为了进一步发掘调节启动子活性的潜在的转录因子,基于启动子元件分析的基础,本研究克隆了广藿香GBF（G-box结合因子）基因,分析其对PatPTS启动子和广藿香醇合成的调控作用。利用酵母单杂交调查分析PatPTS启动子及转录因子之间的互作情况,揭示响应光诱导的PatPTS表达调控机理,进一步认识广藿香萜类化合物的合成及调控机制。实验结果如下:1.采用FPNI-PCR克隆得到长度为1865 bp的PatPTS基因的启动子序列,通过在线数据库PLACE和Plant CARE分析其顺式作用元件,发现该启动子含有G-box等光响应相关元件、ABA响应相关元件以及Me JA响应相关元件等其他顺式元件。2.扩增不同长度的启动子片段区域（1865bp、1295bp、854bp、736bp、584bp）分别替换p CAMBIA1304载体上的35S启动子,构建5个不同长度片段的表达载体,进行农杆菌介导烟草瞬时表达实验。结果显示不同的光照条件会影响启动子的活性,全光照条件下只有1865bp和1295bp长度启动子驱动GUS表达,在黑暗和半光照条件下不同长度的启动子均可激活诱导报告基因GUS表达,其中1295bp长度的启动子活性较其他启动子强,736bp和584bp长度启动子活性较弱。3.克隆得到8条广藿香GBF基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明,克隆得到的GBF均含有bZIP类保守结构域,分别命名为PatbZIP1、PatbZIP2、PatbZIP3、PatbZIP4、PatbZIP5a、PatbZIP5b、PatbZIP6、PatbZIP7。通过实时荧光定量PCR技术检测了PatbZIPs在不同组织的表达情况,结果显示出这些GBF在广藿香中的表达量各不相同,有些在不同组织的表达量具有明显区别,表明这些GBF在广藿香生长发育中可能具有不同的功能。4.广藿香叶片中瞬时过表达实验表明PatbZIP1、PatbZIP3和PatbZIP5均能显着上调广藿香醇合成通路的多个关键酶基因的表达。与对照组相比,PatbZIP1、PatbZIP3过表达的叶片中广藿香醇含量明显上升。而PatbZIP5过表达的叶片中广藿香醇含量与对照组相比没有明显变化。其中PatbZIP1过表达处理中,广藿香醇含量提高了57.93%,而PatbZIP3过表达处理中,广藿香醇含量提高了30.88%。结果表明两个转录因子PatbZIP1和PatbZIP3具有正向调节广藿香醇合成的功能。5.运用酵母单杂交方法检测广藿香转录因子PatbZIP1、PatbZIP3和PatbZIP5与PatPTS启动子的互作情况,结果表明在酵母系统3个GBF不能与PatPTS基因启动子结合。
卢昌华[3]（2020）在《广藿香法尼基焦磷酸合酶和倍半萜合酶的基因功能研究》文中研究表明广藿香Pogostemon cablin（Blanco）Benth为唇形科刺蕊草属植物,具有芳香化浊,开胃止呕的功效,主要用于治疗胃肠道疾病,其挥发油广泛应用于香水行业,广藿香醇作为广藿香油中最主要的活性成分,具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等生物活性。因此,从基因水平上研究广藿香醇的合成机制,对其合成途径的关键酶进行调控,以期在体外通过发酵工程获得大量广藿香醇。同时通过转基因途径,从植物来源上提高广藿香醇的表达,为进一步利用广藿香药用资源奠定基础。法尼基焦磷酸合酶是广藿香倍半萜合成途径中合成中间体法尼基焦磷酸的关键酶,能够催化异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）生成法尼基焦磷酸等前体物质。本课题组对广藿香叶片进行2代+3代测序,获得广藿香转录组数据;使用逆转录法获得广藿香法尼基焦磷酸基因（FPPS）的cDNA序列,对其进行生物信息学分析,发现广藿香FPPS基因的cDNA全长1 050 bp,编码349个氨基酸,该蛋白的分子量为40 KD,等电点为5.43,蛋白的催化部位由一个大的中心腔组成,该中心腔主要由反平行的α螺旋组成,在中心腔有两个相对的壁,上面富含天冬氨酸富集区（DDXXD）。使用无缝克隆的方法构建pET-28a-FPPS和pET-32b-FPPS原核表达载体,并导入蛋白表达菌株BL21（DE3）中,在不同温度不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）下诱导蛋白表达,结果发现pET-28a-FPPS载体表达的蛋白出现截短,截短10 KD左右,p ET-32b-FPPS载体表达蛋白受温度调控比较明显,20、25℃温度下蛋白大部分表达在上清,30、37℃温度下蛋白大部分表达在沉淀中。选取25℃、130 rmp、1 mM IPTG条件下诱导蛋白大量表达,使用琼脂糖Ni柱对蛋白进行纯化,并使用BCA方法检测蛋白浓度,在IPP和DMAPP的缓冲液中进行酶促反应,反应结束后使用HPLC-MS检测产物,结果发现蛋白酶促反应结果符合预期,产生单萜化合物香叶基焦磷酸和倍半萜化合物α-羟基法尼基磷酸。倍半萜合酶（PTS）是广藿香中合成广藿香醇的关键酶,催化法尼基焦磷酸生成广藿香醇等倍半萜化合物。本研究使用自诱导方式代替IPTG诱导带有pET-32b-PTS载体的BL21（DE3）菌株,获得可溶性的PTS蛋白,蛋白纯化后进行浓度检测,再以法尼基焦磷酸为底物进行酶促反应,结果发现纯化后的蛋白具有活性,能催化底物产生广藿香醇及其他副产物。本课题组前期获得了过表达和反义RNA沉默PTS基因的广藿香植株,但是未对其进行含量检测。本次研究对这两组广藿香进行含量测定,结果发现过表达植株的广藿香醇含量分别比对照组提高了87.6%、47.1%和35.7%（干重）,广藿香酮含量下降了59.2%,-20.4%和60.7%;干扰组广藿香醇含量降低了18.0%（干重）,广藿香酮含量上升了314.1%。因此推测广藿香醇和广藿香酮可能具有共同前体。同时将PTS基因导入烟草中,获得了转PTS基因的烟草,为后期进一步验证PTS基因功能提供材料。倍半萜合成途径中许多关键基因受到茉莉酸的调控,本研究通过在广藿香叶片上外施茉莉酸甲酯,在7个不同时间段采收叶片,提取RNA后对FPPS和PTS基因进行荧光定量分析,结果发现FPPS和PTS基因受茉莉酸甲酯调控。相对于FPPS,PTS基因表达量受茉莉酸甲酯调控作用更明显;两个基因在48 h时的表达量和对照组差异最显着,0.1 mM茉莉酸甲酯诱导下48 h时的FPPS基因的表达量与对照组相比上调2.53倍,而PTS基因上调4.81倍;0.25 mM茉莉酸甲酯诱导下48 h时的FPPS基因的表达量与对照组相比上调2.20倍,而PTS基因上调4.88倍;并且从FPPS基因的表达趋势可以推测高浓度的茉莉酸甲酯会抑制FPPS基因的表达,低浓度茉莉酸甲酯能促进FPPS基因的表达。
赵海莹[4]（2020）在《阳春砂萜类合酶及其启动子参与挥发性萜类合成的研究》文中认为1.目的春砂仁为姜科豆蔻属阳春砂（Amomum villosum Lour.）的干燥成熟果实,是我国着名的“四大南药”之一。其主要药效物质挥发油中富含樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯等萜类化合物。萜类合酶（terpene synthase,TPS）是萜类下游生物合成途径中的关键酶。前期研究已经从阳春砂转录组中筛选出了 22个TPS基因,并鉴定了其中部分为单萜合酶和倍半萜合酶。阳春砂中的萜类化合物十分丰富,尤其在药用部位果实中富含单萜和倍半萜及少量的二萜;并且随着果实的发育其萜类含量也有相应变化,但负责这些单萜、倍半萜和二萜化合物合成的TPS还有待全面挖掘。因此,本研究综合二代转录组和全长转录组数据挖掘更多的TPS基因,并对其进行克隆和功能鉴定,以期更全面地认识阳春砂挥发性萜类多样性及其在果实中积累的机制。启动子在植物基因表达调控中发挥着重要作用,萜类合酶基因的启动子调控基因的表达,进而影响植物萜类产物的合成。本论文也对阳春砂部分萜类合酶基因的启动子进行克隆,并分析其顺式调控元件,以期了解其调控相应萜类合成的机制。2.方法2.1阳春砂的全长转录组测序及TPS的挖掘以阳春砂叶、花、根、根状茎、45 DAF（Days after flowering）的种子团、75 DAF的种子团和果皮为材料,分别提取RNA,等量混合后进行全长转录组测序,对测序的质量和注释信息进行分析。根据已知的AvTPS1-22候选基因的序列在转录组数据中进行本地blast,再结合Pfam蛋白结构域,筛选出候选的AvTPS,进行生物信息学分析。2.2不同发育期果实中的挥发性萜类测定采用有机溶剂超声提取法,用正己烷提取30、45、60、75和90 DAF果皮和种子团中的挥发性萜类化合物,并用GC-MS对上述材料中的萜类化合物进行测定,用标准品制作标曲来对其进行定量。2.3基因的克隆与功能鉴定以目的基因表达量较高的组织部位cDNA为模板,克隆TPS基因,构建重组克隆载体,并以重组克隆载体为模板,采用In-fusion方法构建带有双His标签的pET32a或带有MBP标签的pMAL-c5X重组原核表达载体,转入Rosetta（DE3）表达菌株进行原核表达。利用IPTG诱导融合蛋白表达,用Ni-NTA柱或MBP柱纯化融合蛋白,并用底物GPP、FPP或GGPP进行体外酶促反应,GC-MS检测其催化产物。2.4荧光定量PCR使用primer premier 5.0设计用于qPCR的引物,以阳春砂不同发育期的果皮和不同发育期的种子团及叶、花、根状茎的cDNA为模板,进行荧光定量PCR。每个样品包含两个生物学重复,两次技术重复,基因表达水平以2-ΔΔCT进行归一化处理。2.5 AvBPPS和AvLIS/NES启动子克隆与分析提取阳春砂叶片的基因组DNA（genomic DNA,gDNA）,以其为模板,克隆AvBPPS和AvLIS/NES的gDNA序列。在获得的gDNA序列的基础上设计三条方向一致的特异引物,用融合引物与巢式聚合酶链式反应（fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR）扩增其启动子序列,并分析启动子的转录起始位点以及顺式作用调控元件。3.结果3.1阳春砂全长转录组数据分析及AvTPS挖掘全长转录组数据分析发现其组装质量较好,所获得的isoform序列普遍较长,在Nr数据库中注释率高达93.98%;在KEGG代谢通路中,次生代谢生物合成途径中注释到的isoform最多;在萜类骨架合成途径中,MEP途径注释到的isoform多于MVA途径。综合阳春砂前期的多个转录组数据,共筛选出了 24个候选的AvTPS。将24个候选基因构建系统发育树并聚类到7个不同的亚家族中,其中单萜合酶主要聚类到TPS-b亚家族,倍半萜合酶主要聚类到TPS-a亚家族,二萜合酶主要聚类到TPS-c和d亚家族。3.2 AvTPS基因的克隆及功能鉴定3.2.1七个AvTPS基因被克隆并成功获得11个AvTPS的纯化蛋白本研究从候选基因中成功克隆了其中7个AvTPS,包括3个预测为单萜合酶的基因—AvTPS12、AvTPS13、AvTPS23,2个预测为倍半萜合酶的基因一AvTPS14、AvTPS24和2个预测为二萜合酶的基因AvTPS20、AvTPS21,均构建了原核表达载体。对前人已克隆但未获得纯化蛋白的基因（AvTPS4、AvTPS8、AvTPS16和AvTPS17）更换表达载体来表达蛋白。其中AvTPS4、AvTPS8、AvTPS16、AvTPS17和AvTPS23在双His标签原核表达载体中表达蛋白时出现包涵体,随后构建到含MBP标签的原核表达载体中,增加蛋白的可溶性。最后,11个AvTPS均获得了纯化的蛋白。3.2.2成功鉴定了 9个AvTPS的酶功能单萜合酶AvTPS13和AvTPS23与GPP反应主产物均为β-Ocimene,分别命名为β-罗勒烯合酶1（β-Ocimene synthase l,AvOCSl）和β-罗勒烯合酶2（β-Ocimene synthase 2,AvOCS2）。倍半萜合酶 AvTPS4 与 FPP 反应产生单一产物 trans-Nerolidol,命名为反式-橙花叔醇合酶（trans-Nerolidol synthase,AvtNES）。AvTPS12、AvTPS14、AvTPS16和AvTPS24均被鉴定为双功能酶,它们在体外既能与GPP反应产生单萜类产物,也能与FPP反应产生倍半萜产物。AvTPS12与GPP反应的主产物为linalool以及若干副产物;与FPP反应产生单一产物nerolidol,命名为芳樟醇/橙花叔醇合酶（linalool/nerolidol synthase,AvLIS/NES）。AvTPS14与GPP和FPP反应的主产物分另为geranyl methyl ether和copaene,均含有若干副产物,命名为可巴烯合酶（copaene synthase,AvCOS）。AvTPS16与GPP和FPP反应的主产物分别为geranyl methyl ether和aristolochene,同时也生成若干副产物,命名为马兜铃烯合酶（aristolochene synthase,AvARS）。AvTPS24与 GPP 和 FPP 反应的主产物分别为 geranyl methyl ether 和 bicyclogermacrene,均产生若干副产物,命名为双环大牻牛儿烯合酶（bicyclogermacrene,AvBES）。AvTPS20和AvTPS21与GGPP反应产生单一产物柯巴基二磷酸（copalyl diphosphate）,脱磷酸后产生copalol,分别命名为柯巴醇合酶1（copalol synthase 1,AvCPS1）和柯巴醇合酶 2（copalol synthase 2,AvCPS2）。AvTPS8 和 AvTPS17与GPP和FPP反应均未检测到产物。本文发现4对AvTPS的催化产物相似,并且它们的序列比对相似度较高,分别为AvTPS2和AvTPS12,AvTPS13和AvTPS23,AvTPS14和AvTPS24,以及AvTPS20和AvTPS21。此外,所有的双功能合酶与GPP反应均生成了 geranyl methyl ether,且 AvTPS12 还产生了 linalool methyl ether,两者均为醇甲醚。3.3阳春砂果实中含有丰富且多样的挥发性萜类阳春砂不同发育时期果实中检测到的挥发性萜类的种类和含量均较丰富,共检测到了 49种萜类化合物,其中果皮共有31种挥发性萜类,包括19种单萜,9种倍半萜和3种二萜;种子团共含有48种挥发性萜类,包括24种单萜,22种倍半萜和2种二萜,比果皮中丰富。本文首次比较了5个不同发育期果实中的挥发性萜类,绝大部分种子团中的挥发性萜类含量高于其在果皮中的含量。随着果实的发育,果皮中的挥发性萜类总体变化不大,而种子团中的挥发性萜类逐步积累,并在75 DAF积累量达到最高。主要药效物质乙酸龙脑酯在种子团中富集,且从45DAF即开始富集。3.4 AvTPS表达模式与萜类产物的相关性分析将已鉴定功能的15个AvTPS在不同发育期果实和不同组织部位中的表达量与其萜类产物进行相关性分析。15个AvTPS在种子团中均有表达,其中AvBPPS表现出种子表达特异性,在45 DAF种子团中表达量最高,主要参与种子团中莰烯、龙脑以及乙酸龙脑酯、樟脑的合成。AvCOS和AvBIS均在45 DAF种子团中表达量最高,分别主要负责种子团中copaene和bicyclogermacrene的合成。AvLIS和AvLIS/NES功能相似,但表达模式不同,AvLIS主要在果皮中表达,且在45 DAF果皮中表达量最高,主要负责果皮中Linalool的合成,而AvLIS/NES在花中表达量最高,主要参与花中linalool的合成。AvOCSl和AvOCS2产物相似,而表达模式不同——AvOCS1在60DAF果皮中表达量最高,主要参与果皮中β-Ocimene的合成;AvOCS2在叶片中表达量最高,主要参与叶片中的β-Ocimene的合成。AvCPS1和AvCPS2在各组织部位均有表达,均在45 DAF果皮中表达量最高,AvCPS1的表达量高于AvCPS2的表达量。AvPIS在大部分组织部位（除根状茎）中均有表达,在60 DAF果皮中表达量最高,主要参与果皮中的蒎烯合成,且蒎烯普遍存在于各个组织部位中,AvPIS的表达量与蒎烯的积累相关。3.5获得AvBPPS和AvLIS/NES的启动子克隆获得的AvBPPS和AvLI/SNE的gDNA片段序列长度分别为2374 bp和2295 bp,均包含7个外显子和6个内含子及对应基因完整的开放阅读框（open reading frame,ORF）。向 GenBank提交了 AvBPPS 和 AvLIS/NES的 gDNA序列,分别获得序列号MG763230和MN829545。用FPNI-PCR法克隆启动子,AvBPPS和AvLIS/NES在已获得其阳春砂叶片基因组的基础上进一步扩增其启动子,测序结果表明AvBPPS和AvLIS/NES与其gDNA 5’端有264 bp和156 bp的重叠序列,初步确认获得了 AvBPPS和AvLIS/NES的启动子序列。3.6 AvBPPS和AvLIS/NE启动子分别含有参与胚乳表达和涉及MeJA反应的顺式作用调控元件将获得的AvBPPS和AvLIS/NES的启动子序列进行生物信息学分析发现,AvBPPS启动子中包含GCN4-motif（TGAGTCA）——参与胚乳表达的顺式作用调控元件,还有G-Box——参与光响应的元件,此外,还含有参与脱落酸反应、低温响应、MYB结合等元件。本文发现AvBPPS启动子中含有GCN4-motif,荧光定量PCR和转录组数据分析结果表明AvBPPS在种子中特异表达,且其相应的萜类产物乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑等在种子中富集。AvLIS/NES启动子中含有涉及茉莉酸甲酯反应的顺式作用调控元件CGTCA-motif/TGACG-motif;还含有参与脱落酸反应的AAGAA-motif和ABRE以及参与光响应的G-box。结合MeJA处理的阳春砂数据发现,AvLIS/NE响应MeJA的诱导且其对应萜类产物芳樟醇的含量也受MeJA的调控。4.结论本文共筛选出了 24个候选的AvTPS,成功克隆并鉴定了 9个AvTPS,将阳春砂中所有已鉴定功能的AvTPS进行分析,发现绝大部分AvTPS均为多产物酶,预测为倍半萜合酶的基因均为双功能合酶基因。将所有已鉴定功能的AvTPS在不同发育期果实和不同组织部位中进行表达量分析,发现这些基因均在种子团中有表达;其中AvBPPS和AvCOS均在种子团中特异表达,AvBPPS是负责主要药效成分龙脑、乙酸龙脑酯等合成的关键酶,AvCOS是萜类产物多样性最高的酶。AvTPS的产物多样性及其在种子中的表达是阳春砂主要药效萜类在种子中富集及其多样性的基础。其中有3对AvTPS序列相似,催化产物也相似,而它们的表达模式不同,揭示了阳春砂TPS基因家族中的相似基因在不同的组织部位发挥功能。本文首次从药用植物阳春砂AvBPPS的启动子中发现了参与胚乳表达的顺式作用调控元件,为深入探究萜类合成关键酶的种子表达特异性的机制提供了基础,为萜类代谢的调控提供了操作元件。
陈秀珍[5]（2020）在《广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制研究》文中指出广藿香（Pogostemon cablin（Blanco）Benth.）是着名的岭南道地药材,十大广药之一,是临床常用的芳香化湿药。从广藿香中提取的广藿香油是医药工业和轻化工业的重要原料,市场需求量大。广藿香是获得广藿香油的唯一天然来源,其最主要的成分是广藿香醇（Patchoulol）,又称为“百秋李醇”,是一种代表性的倍半萜类物质,具有很好的神经保护、抗流感病毒、抗多种真菌、抗肿瘤、抗炎症等生物活性,更是我国历版药典中用于评价广藿香药材及广藿香油质量的指标成分。因此,广藿香醇的生物合成及其动态积累研究备受关注。随着功能基因组学、植物代谢检测分析技术和多组学技术的应用,广藿香萜类次生代谢模式和广藿香醇的生物合成途径被逐渐解析。研究表明,广藿香醇合酶（Patchoulol synthase,PatPTS）能直接催化法呢基焦磷酸（FPP）生成倍半萜类终产物广藿香醇,对于广藿香醇的合成积累最为关键。目前对广藿香的萜类合成在转录调控方面的研究尚没有报道,特别是缺乏直接剖析转录因子如何调控PatPTS的转录表达的研究,相关的转录调控机制和互作网络也未得到解析。因此,本研究率先开展了调控广藿香醇生物合成的转录因子的挖掘,采用三代测序技术构建了广藿香全长转录本数据库,结合酵母杂交技术,以PatPTS的启动子作为靶调控位点,通过文库筛选、分离克隆和体内外验证来获得一系列转录因子,并联合植物基因工程和代谢分析对其功能进行深入研究,以阐明广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制,为广藿香优良品种培养及广藿香醇合成研发工作提供理论支撑和技术参考。研究的技术方法和结果概况如下:1广藿香全长转录本数据库及酵母杂交文库的构建和分析1.1基于PacBio三代测序的转录本识别和分析采用PacBio单分子实时测序技术（Singlemolecular real-time,SMRT）构建了广藿香全长转录组参考图谱,重构获得了 82,335个全长转录本,共有65,826个转录本在Nr、Swissprot、GO、KEGG等数据库获得注释,注释率为79.95%。其中注释为萜类生物合成相关途径相关的转录本有103个,共包括广藿香醇合成相关关键酶基因16个,并分析获得3,176个转录因子序列,分别属于90个不同的家族。1.2酵母杂交cDNA文库的构建和质量分析利用 Invitrogen 的 CloneMiner Ⅱ cDNA Library Construction Kit 构建来广藿香高质量酵母杂交cDNA文库,其库容为8.6×106CFU,重组率为>95%,满足次级文库要求,可用于后续文库筛选试验。2 PatPTS启动子克隆及其转录调控因子的筛选2.1 PatPTS及其启动子的克隆分析从广藿香转录组数据库筛选获得PatPTS的全长转录本,设计引物克隆获得PatPTS基因1,659 bp ORF序列和3,392 bp gDNA序列,以及854 bp启动子序列。采用PlantCARE和New PLACE等数据库对该启动子进行顺式作用元件分析,发现该启动子含有转录起始核心元件TATABOX、增强子核心元件CAATBOX等必须元件,同时含有E-BOX、I-BOX等多种转录因子的结合元件,还含有JA、ABA、Ethylen（乙烯,ET）等激素响应元件。2.2结合PatPTS启动子的转录因子的初步筛选和鉴定通过酵母单杂交（Y1H）文库筛选以PatPTS的启动子为诱饵从广藿香cDNA文库中获得约200个候选基因片段。通过NCBI、Uniprot等数据库进行候选片段注释分析,从广藿香的全长转录本数据库提取候选基因的全长转录本进行分析及克隆;然后构建酵母AD载体,并与诱饵质粒共转至酵母Y187重复酵母单杂交验证,结果表明 PatDREB、PatERF061、PatSWC4、PatASIL2、PatGATA17和PatGIS2等6个蛋白在酵母体内可以结合PatPTS的启动子。3转录因子调节PatPTS基因表达参与广藿香醇合成调控的机制3.1广藿香MYC2转录因子的克隆及转录调控研究（1）据文献报道MYC2转录因子在植物萜类化合物的代谢合成中具有重要的调控作用,因此本研究还对广藿香中MYC2转录因子进行了克隆,并探究其对PatPTS的转录调控功能进行分析。从广藿香的全长转录组数据库筛选出1 1条注释为MYC的全长转录本,设计引物克隆获得8个MYC编码序列,对序列进行生物信息学分析表明PatMYC2a、PatMYC2b1和PatMYC2b2具有高度保守bHLH-MYC-N、bHLH-Zip和ACT-like功能域。这3个PatMYC2在拟南芥原生质体中均定位于细胞核,均具有转录激活活性,缺失表达实验表明PatMYC2a和PatMYC2b2的转录激活功能域为bHLH-MYC-N蛋白保守结构。RT-qPCR分析表明3个PatMYC2在不同组织部位均有表达,低温和光照处理后3个PatMYC2呈现相似的表达模式。（2）在本氏烟中进行的双荧光素酶（Dual-luc）实验和在广藿香叶片中瞬时过表达实验表明分别过表达PatMYC2a和PatMYC2b2能够激活PatPTS启动子的活性并促进PatPTS基因转录表达,同时可激活广藿香醇合成通路PatFPPS、PatIPPI、PatMVD、PatPMK、PatHMGS和PatAACT等多个关键酶基因的表达来促进叶片中广藿香醇的合成积累。3.2 DREB转录因子PatDREB和PatERF061介导的广藿香醇合成调控机制研究（1）Y1H实验中筛选得到的两个AP2/ERF家族转录因子均含有一段60个左右氨基酸构成的AP2保守结构域,均属于DREB亚家族,具有该亚家族的保守位点,其中PatDREB属于该亚族A-4组,PatERF061则属于A-6组。PatDREB在拟南芥原生质体的细胞核定位表达,而PatERF061则在细胞核和细胞质均有表达。两个DREB在不同组织均有表达,且转录表达水平受MeJA诱导,但表达模式有所差异。（2）酵母双杂交（Y2H）和荧光素酶互补（BiFC）实验结果表明,PatDREB和PatERF061分别能与茉莉酸信号通路的抑制蛋白PatJAZ4互作,而PatERF061能与PatJAZ4在拟南芥原生质体的细胞核共表达。Dual-luc实验进一步表明,PatDREB和PatERF061能显着激活PatPTS启动子的活性,它们的转录调控功能受PatJAZ4和MeJA水平影响,其中PatJAZ4通过与PatERF061结合而抑制其转录调控功能,而MeJA能够逆转这种抑制作用。外源MeJA能够抑制PatDREB转录调控功能,而PatJAZ4对PatDREB的转录功能影响不大。（3）广藿香叶片瞬时过表达实验表明,PatDREB和PatERF061均能通过激活广藿香醇合成途径的关键酶基因的表达,从而促进广藿香醇的合成积累。PatERF061与PatJAZ4共过表达则抑制广藿香醇的合成积累,与dual-luc结果一致。说明PatDREB和PatERF061是促进广藿香醇合成的重要转录因子,而且是茉莉酸信号通路的重要组分。3.3 MYBrelated转录因子PatSWC4调控广藿香醇合成机制研究（1）Y1H筛选获得的PatSWC4为MYBrelated家族转录因子,含有SANT/Myb-like domain of DAMP 1 和 DNA methyltransferase 1-associated protein 1（DMAP1）两个保守功能域。PatSWC4主要于细胞核定位表达,在广藿香各个组织部位均有表达,且其转录表达水平受MeJA诱导。Y2H和Dual-luc实验结果表明,PatSWC4能激活PatPTS启动子的活性,添加MeJA后,激活作用更显着提高;PatJAZ4通过与PatSWC4结合而抑制其转录激活功能,而施加MeJA则能逆转这种抑制作用。在广藿香叶片中瞬时过表达PatSWC4,能激活广藿香醇合成酶PatPTS和MVA途径PatFPPS等关键酶基因的表达;另外广藿香醇合成相关转录因子PatDREB、PatERF061和3个PatMYC2的表达也显着提高,从而促进了叶片中广藿香醇的合成和积累。（2）Y2H 和 Dual-luc 实验表明 PatSWC4 能分别与 PatDREB、PatERF061形成转录复合体,复合体能激活PatPTS的启动子活性,外源MeJA能抑制其激活作用。PatJAZ4能分别与PatSWC4、PatDREB、PatERF061结合,抑制转录复合体的形成,从而抑制PatPTS启动子的活性,这种作用在施加MeJA后可消除,甚至逆转。将PatSWC4分别与PatDREB、PatERF061在广藿香叶片中进行瞬时共过表达,也能显着促进广藿香醇的合成和积累。3.4 Trihelix转录因子PatASIL2调控广藿香醇合成机制研究（1）是Trihelix家族SIP1亚家族转录因子,N端有一个Trihelix保守结构域和一个第四α螺旋结构域,C端有一个卷曲螺旋结构域。预测发现在蛋白序列的中、下游共有两个核定位信号（NLS）,PatASIL2在拟南芥原生质体亚细胞定位于细胞核,与预测一致。PatASIL2在不同的组织均有表达,且转录表达水平受MeJA的诱导。Dual-luc实验表明PatASIL2能抑制PatPTS启动子活性,施加MeJA后,PatASIL2则激活PatPTS启动子转录活性。广藿香叶片瞬时过表达PatASIL2能促进广藿香醇的合成和积累,激活广藿香醇合成途径PatFPPS、PatMVD等多数关键酶基因的表达,但抑制PatPTS的表达。（2）Y2H 和 BiFC 实验,表明 PatASIL2 能分别与 PatDREB、PatERF061 在细胞核形成转录复合体。PatASIL2分别与两个DREB瞬时共过表达都能促进广藿香叶片中广藿香醇的合成和积累。说明PatASIL2为广藿香醇合成的重要调控因子,且能与两个DREB形成转录调控复合体。3.5两个锌指蛋白可能调控广藿香醇的合成酵母单杂交筛选获得的PatGATA17和PatGIS2均为锌指蛋白。PatGATA17属于Zf-GATA转录因子家族,主要于细胞核表达;具有转录激活活性。该基因在广藿香根和成熟叶表达量较高,且受MeJA和低温诱导。PatGATA17能够结合PatPTS的启动子并激活其转录活性,进而促进广藿香醇的合成积累。而PatGIS2属于Zf-CCHC基因家族,通过结合PatPTS的启动子并抑制其转录活性,进而抑制广藿香醇的合成积累。综上所述,为挖掘鉴定广藿香醇生物合成的转录调控因子,本研究首先构建了广藿香的全长转录组和酵母杂交文库,根据转录组注释分离克隆了广藿香MYC2转录因子,并研究其在广藿香醇生物合成中的重要作用,以PatPTS的启动子为诱饵筛选并首次鉴定了 6个特异性调控PatPTS基因表达进而参与调控广藿香醇生物合成的转录因子,并利用瞬时过表达对其功能进行验证分析。PatDREB、PatERF061、PatSWC4和PatASIL2的基因表达和转录调控功能受外源MeJA诱导,可能为JA信号通路的下游响应转录因子。蛋白互作结果还表明两个DREB转录因子能够与MYB-like转录因子（PatSWC4、PatASIL2）形成转录复合体调控广藿香醇的合成。同时PatGATA17和PatGIS2作为调控广藿香醇合成的候选转录因子开展初步鉴定。本研究首次筛选获得多个转录因子,功能分析揭示了其调控广藿香醇生物合成的可能模型,不仅促进从转录调控上揭示广藿香醇的生物合成分子机制,在广藿香响应激素诱导的分子调控网络机理的解析取得突破,而且有助于广藿香及广藿香挥发油的质量控制,为利用代谢调控手段提高药用植物活性成分合成提供理论基础和应用借鉴。
黄伟展[6]（2019）在《广藿香醇合酶的克隆、过表达和反义RNA沉默》文中进行了进一步梳理唇形科刺蕊草属植物广藿香Pogostemon cablin（Blanco）Benth为“十大广药”之一,作为传统的芳香化湿药,其挥发油由于具有调节胃肠道、抗炎、抗病原微生物等生物活性而被作为医药领域的重要原料。此外,还被广泛应用于食品、化妆品领域。广藿香油的组分多为倍半萜类化合物,数量超过24种,广藿香醇是其中的主要成分之一。研究广藿香中倍半萜类化合物生物合成机制,从而提高药材中广藿香油,尤其是广藿香醇的产量,对广藿香药用资源的开发和利用具有重要意义。广藿香醇合酶（Patchoulol synthase,PTS）是广藿香中合成广藿香醇的关键酶,能催化倍半萜的前体法呢基焦磷酸（Farnesyl diphosphate,FDP）生成广藿香醇等倍半萜类化合物。本课题采用一步法RT-PCR从海南儋州广藿香中获得PTS基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明广藿香PTS基因的cDNA全长为1659bp,为一个完整的开放阅读框（ORF）,编码552个氨基酸,该蛋白分子量为64.1 kD,等电点为5.39,具有两个倍半萜合酶结构域,C末端结构域268个氨基酸残基可能涉及线性萜烯的环化,该结构域中含有DDxxD、RxR和RRx8W三个保守序列。用环形聚合酶延伸克隆（CPEC）法将得到的PTS基因构建到原核表达载体pET28a、pET32b和植物表达载体pRI101-AN上,得到pET28a-PTS、pET32b-PTS原核表达载体和pRI101-PTS（GBD）植物过表达载体。此外,克隆PTS基因上500 bp作为反义序列,同样构建到pRI101-AN载体上,得到反义RNA沉默载体pRI101-PTS（GR）。构建完成后的pET28a-PTS、pET32b-PTS表达载体在BL 21（DE 2）菌株中诱导表达,结果发现广藿香醇合酶在大肠杆菌中表达时有强烈的形成包涵体倾向,即使与能增强蛋白可溶性的硫氧还蛋白（TRX）融合,在较低的温度和IPTG浓度下（20℃和0.25 mM）,仍然不能观察到可溶性表达。对pET32b-PTS菌株进行诱导条件优化,但可溶性蛋白依然不可见。在25℃,0.5 mM IPTG时,目的蛋白表达量达到最高。以该条件进行TRX-PTS的大量表达,并对包涵体进行复性,以含6 M盐酸胍的复性液溶解包涵体,依次用含3 M、2 M、1 M、0 M、0 M盐酸胍的复性液的顺序进行透析,最终转移至10 mM HEPES缓冲液中透析。SDS-PAGE检视结果表明复性成功且得到较纯的TRX-PTS融合蛋白。将过表达载体pRI101-PTS（GBD）和反义RNA沉默载体pRI101--PTS（GR）用冻融法转化LBA 4404根癌农杆菌。将预培养基中培养3天的广藿香叶盘作为外植体,分别用过表达和反义RNA沉默菌株进行侵染。经34天共培养后将叶盘转入筛选培养基中,共得到过表达组和反义RNA沉默组各250瓶左右,每瓶34个叶盘。筛选过程中,未转化的外植体逐渐褐化死亡,成功转化的叶盘逐渐在切口处长出愈伤,但由于广藿香对Kan较为敏感,所以较难分化出芽。在暂时解除Kan压力之后,抗性愈伤开始分化出芽。在芽长至1.5-2 cm时切下生根。共得到过表达组广藿香再生苗58棵,反义RNA沉默再生苗104棵。最终,由PCR鉴定得到转基因PTS过表达广藿香植株3棵,反义RNA沉默植株5棵。
褚丽华[7]（2019）在《灵芝挥发性萜类组研究》文中研究指明灵芝（Ganoderma lucidum）为担子菌门的模式药用真菌,已有2000多年的应用历史,具有显着的抗肿瘤、抗衰老、降血糖、抗高血压、免疫调节和改善记忆力等作用。目前对于灵芝有效成分的研究主要集中于多糖和三萜类化合物,而对于灵芝中挥发性萜类研究非常匮乏。通过对灵芝基因组数据进行挖掘,发现赤芝（Ganoderma lucidum）编码23 个倍半萜合酶,紫芝（Ganoderma sinense）编码 26 个倍半萜合酶。本论文对所有的赤芝倍半萜合酶和5个紫芝倍半萜合酶进行了研究。首先对灵芝倍半萜合酶进行系统进化分析,发现灵芝倍半萜合酶可以分为5个进化分枝。多重序列比对分析发现,所有灵芝倍半萜合酶都含有保守的NES/DET基序,进化分支Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ中的灵芝倍半萜合酶含有保守的DDXXD基序,该基序在进化分Ⅴ中的保守性不强,在11个灵芝倍半萜合酶中有两个含有DDXXD,6个含DDXXXXD序列,3个含有DDXXXXXD序列。赤芝倍半萜合酶基因分布在12条染色体中的9条,其中在4,7和8号染色体上分布较多,串联重复是这些灵芝倍半萜合酶基因家族扩增的主要方式。在酵母表达体系中对23个赤倍半萜合酶基因进行诱导表达,利用固相微萃取收集挥发性物质,并通过GC-MS对其催化产物进行检测,发现其中16个赤芝倍半萜合酶具有催化活性,其中GL22395仅催化合成两种产物;GL20791的产物最多,可催化合成24种不同的倍半萜。16个赤芝倍半萜合酶共催化产生80种倍半萜物质,高丰度产物有25种,通过与标准品比对确定了 8个物质的结构。这些倍半萜大多是在灵芝中首次报道,其中9种倍半萜化合物已报道具有显着的药理活性。在大肠杆菌中对5个紫芝倍半萜合酶基因进行异源表达,通过SDS-PAGE对其蛋白表达情况进行检测。GC-MS分析发现,仅有3个酶具有催化活性,共合成15种倍半萜类化合物。在大肠杆菌中表达赤芝倍半萜合酶GL26009和GL25909,并分离纯化蛋白进行体外酶活性检测。结果表明GL26009和GL25909在体外酶活检测体系中合成的产物与其在酵母或大肠杆菌体内的催化产物大致相同,但产物的丰度会有所变化。GL26009在三种体系中合成的高丰度产物都含有a-Cadinol,此外,在体外反应体系中,GL26009还催化产生另外两种高丰度倍半萜δ-cadinene和Nerolidol。GL25909在大肠杆菌和酵母体内体系中合成的高丰度产物为T-Muurolol,但在体外反应体系中合成的高峰度产物为α-Cadinol。上述研究结果表明反应的微环境会对倍半萜合酶的产物特异性产生影响。从合成机制角度来看,灵芝倍半萜合酶主要涉及C1-C6,C1-C10,Cl-C11环化。进化枝Ⅰ和Ⅱ的灵芝倍半萜合酶主要通过1-10环化机制生成单环或双环的倍半萜化合物。进化枝Ⅲ灵芝倍半萜合酶均能产生经由Cl-C11环化机制形成的运-Caryophyllen,该进化枝高丰度产物的催化机制尚不明确。进化枝Ⅳ的灵芝倍半萜合酶被认为是γ-Cadinene合酶,该产物被认为是FPP经由C1-C10或C1-C6环化机制形成。进化枝V涉及C1-C6和C1-C10等环化机制。灵芝倍半萜合酶的功能鉴定将推动灵芝倍半萜合酶的结构和功能的相关性研究,揭示其催化活性的分子机制和产物多样性的形成机制,为通过酶工程技术改良酶的催化活性生产稀有或新型倍半萜类化合物奠定基础,从而促进灵芝倍半萜类药物的研发。
李帆[8]（2018）在《无忧树（Saraca dives Pierre）法尼烯合酶基因克隆与表达》文中认为法尼烯（farnesene）是植物果实和花香的主要挥发成分中的一种倍半萜类次生代谢产物,在化妆品、香料等领域被广泛应用。法尼烯的氢化物法尼烷是一种新型清洁燃料,在生物柴油开发中有巨大潜力。在甲羟戊酸途径（MVA）中,法尼烯合酶（farnesene synthase,FPS）具有将底物法尼烯焦磷酸（farnesyl pyrophosphate,FPP）转化成为法尼烯的作用,是该途径中的限速酶。目前在多种植物中发现FPS,但是无忧树（Saraca dives Pierre）FPS基因有待研究。本文尝试从S.dives中克隆FPS基因完整序列,并进行异源表达及酶活性检测,期望得到S.dives来源的法尼烯合酶基因。利用RT-PCR技术从S.dives成年叶片获得了S.dives的cDNA,并将其克隆到TA载体中。根据其他来源的FPS基因的保守区域设计并合成保守引物,通过PCR技术获得了S.dives FPS基因,经过测序分析表明该基因大小为1593 bp,GC含量为38%,蛋白大小约为58.4KDa。但是与其他物种的FPS序列比较,该基因并不完整,3’与5’端各缺少部分序列以及起始密码子和终止密码子。与香脂树萜烯合酶基因序列同源性为87%。与其他物种的FPS相似度较小,推测可能是由于物种差异所致。为了保证克隆到的ORF结构能表达蛋白,在序列上添加起始密码子ATG和终止密码子TAG后,将该基因序列分别克隆到原核表达载体pCold TF和真核表达载体605ADH1上,并在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY4742中表达,经过SDS-PAGE检测目的蛋白大小与预期大小一致。蛋白与底物FPP反应后经过GC-MS检测,产物为法尼烷（farnesane）,该产物是法尼烯的氢化物。推测原因可能有蛋白未经过纯化、由于基因序列不完整导致酶结构和功能发生变化等,后续研究还需要进一步探索。
陈晓明[9]（2018）在《马尾松产脂相关基因挖掘及表达规律研究》文中研究表明马尾松（Pinus massoniana Lamb.）是我国主要的采脂用松树品种,目前有70%的松脂采自马尾松,但松脂单产较低是制约松脂产业发展的主要因素,选育高产脂品种、营建人工高产脂原料林是解决这个问题的有效措施,因此,深入认识马尾松产脂力形成机制,对加快我国马尾松高产脂良种选育进程有重要意义。论文以1993年营建的马尾松采脂林为研究材料,根据连续3年的生长状况和松脂产量调查数据,筛选生长性状基本一致,松脂产量稳定但产脂力不同的90个健康单株为最终研究对象,在系统了解不同产脂力马尾松树脂含量和生理差异的基础上,选择其中产脂力最高的3个单株组成转录组研究材料,进行转录组测序分析,挖掘马尾松松脂萜类合成代谢途径中相关的酶基因,同时研究这些酶基因的表达规律;筛选在不同产脂力马尾松中表达水平差异最大的基因PmGGPPS2为重点研究对象,研究该基因与产脂力的关系,并基于转录组信息设计特异引物克隆基因进行功能分析。以期深入了解马尾松产脂力形成的机制,为高产脂马尾松良种早期选育、分子辅助育种技术体系的建立和产脂力的生物调控奠定理论基础。取得的主要研究结果如下:1.马尾松针叶和嫩茎所含树脂以挥发油形式存在,针叶和嫩茎挥发油主要由单萜和倍半萜组成。挥发油中单萜类化合物含量占80%左右,倍半萜类化合物含量约占16%,挥发油以单萜类物质α-蒎烯含量最高,含量占比接近50%。树干所含的松脂主成分含量超过1%的有13种单萜、7种倍半萜和8种二萜类树脂酸,其中二萜成分占比最高,约占松脂总量的7580%。产脂力不同的马尾松松脂各种萜类物质的化学组成基本相同,且各化学组分之间的比例差异不显着,产脂力高的马尾松表现在其松脂各个化学组分在含量上整体性提高。2.总萜类合成酶、单萜合成酶、倍半萜合成酶、二萜合成酶和ATP合酶等与马尾松萜类合成相关的酶活性均以高产脂力马尾松植株显着高于低产脂力植株,产脂力越高的植株其萜类合成相关的酶活性越高。3.马尾松RNA经测序、过滤后,获得34 750 291条高质量的clean reads,数据量为4.34G。序列片段组装后获得获得Unigene序列148 186条,Unigene序列长度在20117928bp之间,平均长度617bp。Unigene序列通过与GO和KEGG等七大数据库进行进行比对,81 783条（55.18%）Unigene获得了功能注释。根据功能注释信息,在马尾松转录本中挖掘到覆盖马尾松萜类骨架生物合成的各个步骤的相关酶基因23条,73.91%的酶基因在高产脂马尾松上的表达水平高于低产脂力马尾松,其中表达差异最大的是GGPPS2基因,该基因的表达量是低产组的9.06倍。萜类合成相关酶基因表达差异是马尾松产脂力高低形成的内在原因之一。4.利用转录组序列信息设计特异引物,克隆得到编码区为1136bp的PmGGPPS2基因,该基因编码378个氨基酸。在成年树和幼年树的根、茎和叶器官中,PmGGPPS2均在针叶上的表达水平最高,在根系中最低。PmGGPPS2基因表达水平与产脂量相关程度较高,相关系数为0.73,基因的表达水平与产脂量呈正相关关系。5.构建了植物正义表达载体pGFP-PmGGPP2（+）和反义表达载体pGFP-PmGGPP2（-）,通过农杆菌介导分别将带正义和反义片段的重组质粒转入拟南芥中,获得了转基因植株。检测发现转化正义片段的拟南芥植株中可检测到外源PmGGPPS2基因表达,并且叶片中6种主要的二萜组分含量较野生型显着提高。转化反义片段的植株中,拟南芥内源GGPPS基因表达则受到显着抑制,8种二萜组分含量显着降低。拟南芥转化结果表明PmGGPPS2是二萜组分合成过程中的重要基因。6.环境因子变化对萜类合成关键基因表达有显着影响。温度对马尾松5个萜类合成关键基因DXS1、DXR、GPPS、FPPS和GGPPS2的表达水平影响最大,基因表达量最大可相差70多倍,而光照和土壤水分对基因表达的影响相差均在2倍之内。温度中以低温对基因表达的影响最大,低温制约了马尾松萜类合成关键基因的表达。马尾松萜类合成关键基因在200Lx的弱光条件下最有利于其基因的表达。土壤水分过多或过于干旱均不利于马尾松萜类合成关键基因的表达,土壤含水量处在12.85%时,基因的表达水平最高。
樊婧婧[10]（2018）在《强化酿酒酵母乙酰辅酶A途径的β-香树脂醇合成》文中研究说明β-香树脂醇是一种五环三萜化合物,也是其它齐墩果烷型三萜,如甘草次酸、大豆皂甙等生物合成的骨架,具有抗炎、抗菌、抗病毒等良好的药学特性。通过代谢工程与合成生物学的方法已在酿酒酵母中成功实现了β-香树脂醇的合成,但由于前体物供应不足、有毒中间代谢产物的积累及反馈调节等因素导致产量较低,大大限制了其规模化生产和广泛应用。针对酿酒酵母合成β-香树脂醇中重要起始前体物乙酰辅酶A的供应问题,本研究采用代谢工程策略,强化细胞质乙酰辅酶A供应,同时过表达3-羟-3-甲基-戊二酰辅酶还原酶和合成β-香树脂醇所涉及的ERG系列基因以提高鲨烯合成,从而达到β-香树脂醇在酿酒酵母体内的高效合成。研究结果如下:（1）在增加酿酒酵母细胞质乙酰辅酶A含量提高终产物β-香树脂醇产量方面,主要从强化酿酒酵母内源乙酰辅酶A途径和构建外源乙酰辅酶A途径两方面入手。强化酿酒酵母内源乙酰辅酶A途径包括:（1）采用质粒表达方式,过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶基因ADH2,使乙醇更多地流向乙酰辅酶A合成途径,以用于终产物β-香树脂醇合成,单位细胞β-香树脂醇产量达3.97mg/g,为出发菌株的1.52倍;（2）在酿酒酵母基因组HO位点过表达乙醛脱氢酶基因和乙酰辅酶A合酶基因ACS1和ACS2,强化细胞质丙酮酸脱氢酶支路,β-香树脂醇产量分别达到30.4和31.24mg/L,分别为出发菌株的1.3倍和1.34倍。但以1分子葡萄糖为底物,通过丙酮酸脱氢酶支路合成2分子乙酰辅酶A,净消耗2分子ATP,影响了以乙酰辅酶A为前体的β-香树脂醇的生产效率;由于酿酒酵母细胞质乙酰辅酶A合成途径需要消耗较多的ATP,导致乙酰辅酶A合成效率低,为了减少或消除细胞质乙酰辅酶A合成的ATP消耗,研究者开始在酿酒酵母中引入外源乙酰辅酶A合成途径。在酿酒酵母基因组构建的外源乙酰辅酶A合成途径包括:（1）通过引入丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酰转乙酰基酶和二轻硫辛酸脱氢酶三个外源基因,在酿酒酵母中成功构建丙酮酸脱氢酶途径,结合敲除戊糖磷酸途径（主要生成NAPDH）的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,使NADP+更多地被丙酮酸脱氢复合体利用,有效提高了β-香树脂醇的产量,达到33.2mg/L,为出发菌株的1.49倍;（2）通过引入构巢曲霉密码子优化的柠檬酸裂解酶基因,在酿酒酵母中成功构建柠檬酸裂解酶途径,直接催化细胞质柠檬酸合成乙酰辅酶A。外源补加柠檬酸,有效提高了β-香树脂醇的产量,达到31.05mg/L,为出发菌株的1.53倍;（3）通过引入分别来自大肠杆菌、肠膜明串珠菌和克氏梭菌的乙酰乙醛脱氢酶、木酮糖特异性磷酸转酮酶和磷酸转乙酰酶,在酿酒酵母中成功构建了两条异源乙酰辅酶A合成途径,并通过表达来自玫瑰杆菌属细菌消耗NADH的和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶还原酶提升了途径的NADH平衡,结果有效提高了β-香树脂醇的产量,达到39.49mg/L,为出发菌株的1.95倍。结合进一步敲除柠檬酸合酶以阻止细胞质乙酰辅酶A流失,进一步提高了β-香树脂醇产量,达到69.64mg/L,为出发菌株的3.34倍;（2）强化鲨烯合成方面:过表达甲羟戊酸途径的限速酶基因t HMG1强化鲨烯合成,单位细胞β香树脂醇产量达4.19mg/g,为出发菌株的1.7倍;最后,同时过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶ADH2和t HMG1有效提高了β-香树脂醇的产量,达到32.01mg/L,为出发菌株的1.37倍;（3）发酵优化方面,将高产β-香树脂醇的菌株BA40进行葡萄糖补料发酵,β-香树脂醇产量达到272.42mg/L,为摇瓶发酵的3.91倍,为目前报道的运用酿酒酵母合成β-香树脂醇的最高产量。
二、Cloning and enzymology analysis of farnesyl pyrophosphate synthase gene from a superior strain of Artemisia annua L.（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Cloning and enzymology analysis of farnesyl pyrophosphate synthase gene from a superior strain of Artemisia annua L.（论文提纲范文）
（1）代谢工程改造酿酒酵母生产萜类化合物（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号和缩略词说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 酿酒酵母细胞工厂 |
| 1.1.1 酿酒酵母代谢工程 |
| 1.1.2 酿酒酵母合成生物学工具的应用 |
| 1.1.2.1 CRISPR-Cas9 技术在细胞工厂中的应用 |
| 1.1.2.2 单碱基编辑技术 |
| 1.1.2.3 重组蛋白表达技术 |
| 1.2 酿酒酵母中的脂类代谢和脂滴 |
| 1.2.1 脂类代谢 |
| 1.2.2 脂滴组分 |
| 1.3 萜类化合物 |
| 1.3.1 酿酒酵母的甲羟戊酸途径 |
| 1.3.2 萜类化合物在酿酒酵母中的合成 |
| 1.3.3 萜类化合物的存储和发酵培养 |
| 1.4 酿酒酵母的发酵底物 |
| 1.4.1 碳源的来源与应用 |
| 1.4.2 蔗糖转化酶 |
| 1.5 本论文研究背景、意义及内容 |
| 1.5.1 研究背景和意义 |
| 1.5.2 研究的主要内容 |
| 第二章 异源生物合成β-胡萝卜素的酵母工程菌株构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 菌株,质粒和引物 |
| 2.2.2 生化试剂与药品 |
| 2.2.3 仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 培养基和培养条件 |
| 2.3.2 PCR扩增基因片段 |
| 2.3.3 同源重组整合β-胡萝卜素合成途径 |
| 2.3.3.1 YZ01 菌株的构建 |
| 2.3.3.2 YZ02 菌株的构建 |
| 2.3.3.3 YZ03 菌株的构建 |
| 2.3.4 PCR扩增构建p2CRT质粒的基因片段 |
| 2.3.5 β-胡萝卜素的提取与定量分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 pMRI21-P_(TDH3)-P_(TEF1)质粒和pMRI31-P_(TDH3)-P_(TEF1)质粒的构建 |
| 2.4.2 酿酒酵母β-胡萝卜素合成途径的引入 |
| 2.4.3 产β-胡萝卜素的酵母工程菌株构建 |
| 2.4.4 高拷贝p2CRT质粒的构建 |
| 2.4.5 游离型质粒对β-胡萝卜素生产的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 脂类代谢途径改造对萜类化合物积累的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 菌株,质粒和引物 |
| 3.2.2 生化试剂与药品 |
| 3.2.3 仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 培养基和培养条件 |
| 3.3.2 CRISPR质粒的构建和供体的制备 |
| 3.3.3 酿酒酵母电转化与基因型验证 |
| 3.3.4 产α-葎草烯的异源代谢途径引入 |
| 3.3.5 强启动子表达限速酶基因 |
| 3.3.6 ERG1 启动子控制ERG9 基因的表达 |
| 3.3.7 β-胡萝卜素的提取和HPLC-UV定量分析 |
| 3.3.8 酵母细胞中β-胡萝卜素分布的显微镜观察 |
| 3.3.9 磷脂类的提取和LC-MS定量分析 |
| 3.3.10 α-葎草烯的定量分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 重新定向脂类代谢网络影响β-胡萝卜素的积累 |
| 3.4.2 磷脂酸磷酸酶缺失增加了β-胡萝卜素的产生 |
| 3.4.3 甾醇酰基转移酶的过表达增加β-胡萝卜素的积累 |
| 3.4.4 组合多种策略进一步增加β-胡萝卜素的积累 |
| 3.4.5 α-葎草烯工程菌株的成功构建 |
| 3.4.6 工程改造α-葎草烯生产菌株的代谢网络 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 酿酒酵母中蔗糖转化酶突变体的构建与应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 菌株,质粒和引物 |
| 4.2.2 生化试剂与药品 |
| 4.2.3 仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 培养基与培养条件 |
| 4.3.2 Golden Gate克隆反应系统和程序 |
| 4.3.3 质粒构建 |
| 4.3.4 重组蛋白的表达和纯化 |
| 4.3.5 酵母电转化与突变位点验证 |
| 4.3.6 突变体重组蛋白的动力学分析 |
| 4.3.7 突变体菌株的酶活力和发酵力测定 |
| 4.3.8 突变体菌株的β-胡萝卜素提取和HPLC-UV定量检测 |
| 4.3.9 突变体菌株中的乙醇测定 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 蔗糖底物有利于增加β-胡萝卜素产量 |
| 4.4.2 ScInV重组蛋白的表达与纯化 |
| 4.4.3 ScInV的结构分析 |
| 4.4.4 ScInV突变重组蛋白的表达与纯化 |
| 4.4.5 ScInV突变体蛋白的动力学分析 |
| 4.4.6 酿酒酵母突变体重组菌株酶活力分析 |
| 4.4.7 ScInV活性对β-胡萝卜素积累的影响 |
| 4.4.8 酿酒酵母中ScInV突变体菌株的发酵力测定 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 本论文的主要结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 作者和导师简介 |
| 附件 |
（2）广藿香PatPTS启动子功能及G-box结合因子参与的转录调节研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 萜类化合物的生物合成 |
| 1.2 广藿香有效成分广藿香醇及其生物合成 |
| 1.3 药用植物基因启动子研究现状 |
| 1.4 光诱导表达启动子 |
| 1.5 G-box |
| 1.6 G-box结合因子 |
| 1.7 b ZIP转录因子 |
| 2 研究目的与意义 |
| 第一章 广藿香PatPTS基因启动子的克隆及分析 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器及常用生物学软件 |
| 1.4 试剂及培养基的配制方法 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 广藿香基因组DNA的提取 |
| 2.2 FPNI-PCR法克隆PatPTS启动子序列 |
| 2.3 PatPTS基因5’上游序列的测定 |
| 2.3.1 PCR产物的回收 |
| 2.3.2 目的片段与pLB载体的连接 |
| 2.3.3 连接产物转化大肠杆菌 |
| 2.3.4 阳性克隆的鉴定 |
| 2.3.5 启动子序列信息学分析 |
| 2.3.6 质粒提取 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 广藿香基因组DNA的提取 |
| 3.2 FPNI-PCR法克隆PatPTS基因启动子序列 |
| 3.3 PatPTS基因启动子的生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 第二章 广藿香PatPTS基因启动子的功能分析 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组表达载体的构建 |
| 2.1.1 不同长度PatPTS基因启动子片段的扩增 |
| 2.1.2 pCAMBIA1304 质粒的提取 |
| 2.1.3 pCAMBIA1304 载体质粒的双酶切处理 |
| 2.1.4 重组表达载体质粒的连接及转化 |
| 2.1.5 重组质粒的提取 |
| 2.1.6 农杆菌EHA105 感受态细胞的转化 |
| 2.1.7 阳性农杆菌的鉴定 |
| 2.2 农杆菌介导的瞬时表达试验 |
| 2.2.1 本氏烟草的培养 |
| 2.2.2 农杆菌注射侵染烟草 |
| 2.2.3 光照处理 |
| 2.3 GUS组织染色 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组表达载体的构建及检验 |
| 3.2 GUS报告基因瞬时表达检测启动子的活性 |
| 4 讨论 |
| 第三章 广藿香GBF转录因子的克隆与分析 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 广藿香总RNA的提取 |
| 2.2 cDNA的合成 |
| 2.3 广藿香GBF基因克隆 |
| 2.4 广藿香GBF基因序列分析 |
| 2.5 广藿香GBF基因在不同组织的表达分析 |
| 2.5.1 RNA反转录 |
| 2.5.2 荧光定量PCR |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 广藿香GBF基因全长序列的克隆 |
| 3.2 序列分析 |
| 3.3 广藿香GBF在不同组织中的表达特性 |
| 4 讨论 |
| 第四章 GBF转录因子在广藿香中的过表达试验 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组表达载体的构建 |
| 2.1.1 广藿香GBF基因的扩增 |
| 2.1.2 pCAMBIA1304 载体质粒的双酶切处理 |
| 2.1.3 重组表达载体质粒的连接及转化 |
| 2.1.4 重组质粒的提取 |
| 2.1.5 农杆菌EHA105 感受态细胞的转化 |
| 2.1.6 阳性农杆菌的鉴定 |
| 2.2 农杆菌介导的瞬时过表达试验 |
| 2.2.1 农杆菌注射侵染广藿香 |
| 2.2.2 组织染色 |
| 2.3 广藿香醇合成途径关键酶基因相对表达分析 |
| 2.3.1 广藿香总RNA的提取 |
| 2.3.2 RNA反转录 |
| 2.3.3 荧光定量PCR |
| 2.4 广藿香醇含量的测定 |
| 2.4.1 供试品溶液的制备 |
| 2.4.2 GC-MS检测 |
| 2.5 统计学分析方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组表达载体的构建 |
| 3.2 广藿香GBF瞬时过表达组织化学染色 |
| 3.3 广藿香醇合成途径关键酶基因相对表达分析 |
| 3.4 广藿香醇含量的测定 |
| 4 讨论 |
| 第五章 GBF转录因子结合广藿香PatPTS启动子的检测分析 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 酵母单杂交载体构建 |
| 2.1.1 诱饵载体构建 |
| 2.1.2 猎物载体构建 |
| 2.2 LiAc/ssDNA/PEG法转化酵母 |
| 2.2.1 酵母感受态细胞制备 |
| 2.2.2 转化酵母 |
| 2.2.3 酵母单杂交 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组载体的构建 |
| 3.2 酵母单杂交分析 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件1：统计学处理合格证明 |
（3）广藿香法尼基焦磷酸合酶和倍半萜合酶的基因功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 法尼基焦磷酸合酶的研究进展 |
| 1.1.1 类异戊二烯的生物合成途径的研究 |
| 1.1.2 FPPS生长发育中的作用 |
| 1.1.3 FPPS蛋白催化活性的影响因素 |
| 1.1.4 FPPS在植物组织中的定位 |
| 1.1.5 FPPS蛋白的调控作用 |
| 1.1.6 FPPS蛋白的结构分析 |
| 1.1.7 FPPS蛋白作为药物开发的分子靶标 |
| 1.2 倍半萜合酶的研究进展 |
| 1.2.1 倍半萜合酶催化机理 |
| 1.2.2 倍半萜合酶催化影响因素 |
| 1.2.3 倍半萜合酶的定点突变 |
| 1.2.4 倍半萜合酶的应用 |
| 1.3 广藿香倍半萜化合物合成的影响因素 |
| 1.4 广藿香醇的研究概况 |
| 1.4.1 广藿香醇的合成 |
| 1.4.2 广藿香醇的药理作用 |
| 1.5 本文的研究目的及意义 |
| 第二章 广藿香FPPS基因的克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 FPPS基因相关引物设计 |
| 2.2.2 RNA的提取和c DNA的合成 |
| 2.2.3 FPPS基因的T-A克隆 |
| 2.2.4 无缝克隆构建p ET-28a-FPPS和 p ET-32b-FPPS原核表达载体 |
| 2.2.5 广藿香FPPS基因的生物信息学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 广藿香总RNA的提取和c DNA的合成 |
| 2.3.2 广藿香FPPS基因的T-A克隆 |
| 2.3.3 无缝克隆构建原核表达载体 |
| 2.3.4 生物信息学分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 广藿香FPPS蛋白的纯化和功能验证 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 仪器与试剂 |
| 3.2.1 仪器 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 两个FPPS融合表达载体蛋白的小量表达 |
| 3.3.2 FPPS蛋白的SDS-PAGE电泳 |
| 3.3.3 FPPS蛋白的大量表达 |
| 3.3.4 FPPS蛋白的纯化 |
| 3.3.5 蛋白的浓度检测 |
| 3.3.6 FPPS的酶促反应 |
| 3.3.7 HPLC-MS检测反应物 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 FPPS小量表达条件优化 |
| 3.4.2 FPPS的大量表达及纯化 |
| 3.4.3 FPPS的蛋白浓度检测 |
| 3.4.4 FPPS蛋白酶促反应 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 广藿香醇合酶基因的蛋白表达、纯化和验证 |
| 4.1 仪器及试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 IPTG诱导和自诱导表达广藿香PTS蛋白 |
| 4.2.2 蛋白的纯化和浓度检测 |
| 4.2.3 PTS蛋白的催化 |
| 4.2.4 溶液配制 |
| 4.2.5 方法学考察 |
| 4.2.6 色谱条件 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PTS蛋白的表达情况 |
| 4.3.2 PTS蛋白的纯化及浓度检测 |
| 4.3.3 方法学考察结果 |
| 4.3.4 PTS蛋白的催化结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 广藿香醇合酶基因转化烟草及过表达和反义RNA沉默广藿香植株的鉴定 |
| 5.1 材料和试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 烟草叶盘的预培养 |
| 5.2.2 LBA4404农杆菌介导转化烟草 |
| 5.2.3 阳性烟草植株的鉴定 |
| 5.2.4 过表达和反义RNA沉默广藿香的GC-MS验证 |
| 5.2.5 方法学考察 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 烟草叶盘生长情况 |
| 5.3.2 转基因烟草的培养 |
| 5.3.3 烟草植株验证 |
| 5.3.4 方法学考察结果 |
| 5.3.5 过表达和反义RNA广藿香的GC-MS验证 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 茉莉酸甲酯对FPPS和 PTS表达量的影响 |
| 6.1 仪器与试剂 |
| 6.1.1 主要仪器和试剂 |
| 6.2 材料与溶液配制 |
| 6.3 方法 |
| 6.3.1 材料的选取及处理 |
| 6.3.2 RNA的提取及c DNA第一链的合成 |
| 6.3.3 引物设计及验证 |
| 6.3.4 荧光定量PCR反应 |
| 6.3.5 数据统计与分析 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 茉莉酸甲酯对FPPS基因表达量的影响 |
| 6.4.2 茉莉酸甲酯对PTS基因表达量的影响 |
| 6.5 讨论 |
| 第七章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（4）阳春砂萜类合酶及其启动子参与挥发性萜类合成的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 药用植物阳春砂及其挥发性萜类 |
| 1.2 萜类合酶及其参与萜类生物合成途径的研究进展 |
| 1.3 启动子的研究进展 |
| 2 课题前期研究基础、本课题的研究思路及预期结果 |
| 第一章 阳春砂全长转录组测序及萜类合酶基因的克隆和功能鉴定 |
| 1 材料、主要试剂与仪器 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 转录组测序分析 |
| 2.2 候选TPS基因的克隆 |
| 2.3 生物信息学分析 |
| 2.4 AvTPS基因原核表达载体的构建 |
| 2.5 原核表达 |
| 2.6 蛋白纯化 |
| 2.7 酶功能鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 三代全长转录组测序结果与分析 |
| 3.2 基于二代及三代全长转录组测序结果筛选AvTPS(terpene synthase，TPS) |
| 3.3 AvTPS的克隆及生物信息学分析 |
| 3.4 AvTPS蛋白原核表达 |
| 3.5 AvTPS酶功能鉴定 |
| 3.6 已鉴定功能的AvTPS催化产物百分含量比较及其产物相似性分析 |
| 3.7 双功能合酶在GPP和FPP同时存在条件下的产物 |
| 4 小结与讨论 |
| 第二章 阳春砂AvTPS在不同发育期果实中的表达模式与其对应产物的相关性分析 |
| 1 材料、主要试剂与仪器 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 阳春砂果实的挥发性萜类提取与检测 |
| 2.2 总RNA的提取及其反转录 |
| 2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.4 热图分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 阳春砂不同发育期果实的挥发性萜类分析 |
| 3.2 AvTPS在不同发育期果皮中的表达模式及其与对应萜类产物的相关性 |
| 3.3 AvTPS在不同发育期种子团中的表达模式及其与对应萜类产物的相关性 |
| 3.4 AvTPS在不同组织部位的表达模式及其与对应萜类产物的相关性 |
| 4 小结与讨论 |
| 第三章 AvBPPS和AvLIS/NES启动子克隆和分析 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 阳春砂叶片基因组DNA的提取 |
| 2.2 AvBPPS和AvLIS/NES基因组序列扩增、分析及提交 |
| 2.3 AvBPPS和AvLIS/NES启动子克隆 |
| 2.4 启动子的生物信息学分析 |
| 2.5 AvLIS/NES在茉莉酸甲酯诱导的转录组中的表达量分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 AvBPPS和AvLIS/NES基因组的克隆和分析 |
| 3.2 AvBPPS和AvLIS/NES基因启动子克隆 |
| 3.3 启动子的顺式作用调控元件分析 |
| 3.4 AvBPPS在种子中的表达特异性及其对应萜类产物的比较 |
| 3.5 MeJA处理后的AvLIS/NES表达量及其对应的萜类产物的分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 1.总结 |
| 2.展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 发表论文及参与课题情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（5）广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 广藿香和广藿香油 |
| 1.2 广藿香萜类生物合成的研究概况 |
| 1.3 植物萜类次生代谢的转录调控研究概况 |
| 1.4 转录因子调控药用植物萜类代谢物合成的研究进展 |
| 2 立题依据及研究思路 |
| 2.1 立题依据 |
| 2.2 研究思路 |
| 2.3 技术路线 |
| 第二章 广藿香全长转录本数据库及酵母杂交文库的构建和分析 |
| 1 基于PacBio三代测序的转录本识别和分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 小结与讨论 |
| 2 酵母杂交cDNA文库的构建和质量分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 广藿香醇合酶(PatPTS)启动子克隆及其转录调控因子的初步筛选和鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2. 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 广藿香醇合酶(PatPTS)及其启动子的克隆分析 |
| 2.2 结合PatPTS启动子的转录因子的初步筛选和鉴定 |
| 3 小结与讨论 |
| 第四章 调控广藿香醇生物合成的转录因子的表达及功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2. 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 广藿香MYC2转录因子的克隆及转录调控研究 |
| 2.2 DREB转录因子PatDREB和PatERF061介导的广藿香醇合成调控机制研究 |
| 2.3 MYB related转录因子PatSWC4调控广藿香醇合成机制研究 |
| 2.4 Trihelix转录因子PatASIL2调控广藿香醇合成机制研究 |
| 2.5 两个参与调控广藿香醇合成的锌指蛋白 |
| 第五章 总结与讨论 |
| 1 结论 |
| 2 综合讨论 |
| 2.1 两个DREB功能和调控机制差异 |
| 2.2 广藿香MYC2转录因子的结构与功能 |
| 2.3 转录复合体在广藿香醇生物合成的复杂调控机制 |
| 2.4 茉莉酸信号介导的广藿香醇合成转录调控机制探讨 |
| 2.5 参与调控广藿香醇合成转录因子在植物代谢工程的利用 |
| 3 创新点 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 miRNA前体预测结果 |
| 附录2 萜类合成通路相关转录本汇总表 |
| 附录3 本研究所用引物列表 |
| 附录4 全长转录组中PatPTS全长转录本 |
| 附录5 MYC转录因子同源比对 |
| 附录6 GIS2的同源蛋白 |
| 附录7 图表目录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 参与课题 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 详情摘要 |
（6）广藿香醇合酶的克隆、过表达和反义RNA沉默（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 序言 |
| 1.1 广藿香化学成分研究概况 |
| 1.1.1 广藿香挥发性成分的研究现状 |
| 1.1.2 广藿香非挥发性成分的研究 |
| 1.2 广藿香药理药效研究概况 |
| 1.2.1 调节胃肠道作用 |
| 1.2.2 抗菌作用 |
| 1.2.3 抗病毒 |
| 1.2.4 抗炎抗氧化 |
| 1.2.5 其他药理作用 |
| 1.3 广藿香组织培养的研究概况 |
| 1.4 广藿香遗传转化体系的研究概况 |
| 1.5 植物倍半萜的生物合成途径 |
| 1.6 广藿香醇合酶的研究现状 |
| 1.7 本课题研究的主要内容和意义 |
| 第二章 广藿香PTS基因的克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 广藿香总RNA的提取及质量检查 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 广藿香PTS基因CDMA的合成 |
| 2.2.4 广藿香PTS基因的T-A克隆 |
| 2.2.5 环形聚合酶延伸克隆(CPEC)构建PET28A-PTS和 PET32B-PTS原核表达载体 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 广藿香总RNA的提取及CDNA的合成 |
| 2.3.2 广藿香PTS基因T-A克隆 |
| 2.3.3 CPEC法构建PET28A-PTS和 PET32B-PTS原核表达载体 |
| 2.3.4 广藿香PTS基因及其编码蛋白的生物信息学分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 CPEC法构建表达载体的关键因素 |
| 2.4.2 PTS蛋白结构和功能预测 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 广藿香PTS蛋白的纯化和鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 试剂与仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 PTS的小量表达 |
| 3.2.2 PTS的大量表达 |
| 3.2.3 PTS蛋白包涵体的复性 |
| 3.2.4 PTS蛋白氨基酸序列测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PTS的小量表达诱导条件优化 |
| 3.3.2 PTS蛋白的大量表达 |
| 3.3.3 包涵体复性与氨基酸序列测定 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 广藿香PTS基因过表达和反义RNA沉默载体的构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 试剂与仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 环形聚合酶延伸克隆(CPEC)构建PRI101-PTS(GBD)过表达载体 |
| 4.2.3 环形聚合酶延伸克隆(CPEC)构建PRI101-PTS(GR)反义RNA载体 |
| 4.2.4 环化产物转化克隆菌株 DH5α及阳性克隆验证 |
| 4.2.5 PRI101-PTS(GBD)和PRI101-PTS(GR)重组质粒转化农杆菌LBA4404及阳性克隆验证 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PTS片段及反义PTS片段同源臂的引入 |
| 4.3.2 PRI101-AN载体线性化及同源臂的引入 |
| 4.3.3 环化产物的琼脂糖凝胶电泳检视 |
| 4.3.4 克隆菌株的阳性克隆验证 |
| 4.3.5 农杆菌转化子的鉴定 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第五章 叶盘法转染广藿香 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 广藿香叶盘的预培养 |
| 5.2.2 LBA4404 重组菌株的活化和菌液的制备 |
| 5.2.3 过表达和反义RNA菌株转染广藿香叶盘 |
| 5.2.4 阳性转基因植株的鉴定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 广藿香叶盘对KAN选择压力的筛选 |
| 5.3.2 筛选培养阶段广藿香的生长状态 |
| 5.3.3 广藿香再生苗的生根培养 |
| 5.3.4 阳性转基因植株的鉴定 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（7）灵芝挥发性萜类组研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 萜类化合物及其生物合成途径 |
| 1.2 萜类合酶分类及其特点 |
| 1.3 真菌萜类合酶 |
| 1.3.1 真菌倍半萜合酶 |
| 1.3.2 真菌二萜合酶 |
| 1.3.3 真菌三萜合酶 |
| 1.4 灵芝萜类合酶研究目的与意义 |
| 第二章 研究材料与方法 |
| 2.1 材料、试剂与设备 |
| 2.1.1 灵芝材料以及数据来源 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 主要设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 倍半萜合酶生物信息学分析 |
| 2.2.2 倍半萜合酶基因的亚克隆 |
| 2.2.3 倍半萜合酶酵母表达载体的构建 |
| 2.2.4 倍半萜合酶酵母表达系统的诱导表达 |
| 2.2.5 倍半萜合酶原核表达系统的诱导表达 |
| 2.2.6 蛋白SDS-PAGE检测 |
| 2.2.7 蛋白纯化 |
| 2.2.8 蛋白换液 |
| 2.2.9 蛋白浓度检测 |
| 2.2.10 体外酶活反应 |
| 2.2.11 固相微萃取法收集挥发性萜类 |
| 2.2.12 气质联用检测催化产物 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 灵芝倍半萜合酶的生物信息学分析 |
| 3.1.1 灵芝倍半萜合酶的序列分析 |
| 3.1.2 灵芝倍半萜合酶的系统进化分析 |
| 3.1.3 赤芝倍半萜合酶染色体分布 |
| 3.2 赤芝倍半萜合酶酵母表达载体的构建 |
| 3.3 赤芝倍半萜合酶的酵母表达及其催化产物的鉴定 |
| 3.3.1 赤芝倍半萜合酶的酵母表达 |
| 3.3.2 赤芝倍半萜合酶酵母表达系统催化产物的鉴定 |
| 3.4 赤芝倍半萜合酶原核表达和酵母表达催化产物比较分析 |
| 3.5 部分赤芝倍半萜合酶的体外酶活鉴定 |
| 3.5.1 赤芝倍半萜合酶的原核诱导表达 |
| 3.5.2 赤芝倍半萜合酶的蛋白纯化 |
| 3.5.3 赤芝倍半萜合酶蛋白的体外酶活反应产物检测 |
| 3.6 紫芝倍半萜合酶的功能鉴定 |
| 3.6.1 紫芝倍半萜合酶的原核诱导表达 |
| 3.6.2 紫芝倍半萜合酶催化产物检测 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 基于组学的挥发性倍半萜组的研究策略 |
| 4.2 灵芝倍半萜合酶的分子多样性 |
| 4.3 灵芝倍半萜合酶的系统进化与其功能多样性的关系 |
| 4.4 灵芝倍半萜合酶催化产生的倍半萜化合物的多样性 |
| 4.5 灵芝倍半萜合酶催化产生多种具有药理活性的倍半萜化合物 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）无忧树（Saraca dives Pierre）法尼烯合酶基因克隆与表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 法尼烯简介 |
| 1.2 法尼烯结构 |
| 1.3 法尼烯的生物学功能 |
| 1.4 法尼烯的应用 |
| 1.5 FPS的代谢途径 |
| 1.6 FPS的来源 |
| 1.7 FPS的酶学性质 |
| 2 FPS的研究现状 |
| 2.1 FPS克隆与表达研究 |
| 2.2 FPS在微生物工程菌的生产 |
| 3 FPS的研究意义 |
| 4 本课题研究内容与技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 主要仪器设备 |
| 2 实验材料及试剂 |
| 2.1 菌株与质粒 |
| 2.2 酶与试剂 |
| 2.3 培养基与储存液 |
| 3 菌株培养方法 |
| 3.1 大肠杆菌培养 |
| 3.2 酿酒酵母培养 |
| 4 无忧树FPS RT-PCR |
| 4.1 无忧树总RNA的提取 |
| 4.2 无忧树cDNA的制备 |
| 4.3 FPS的引物设计 |
| 4.4 无忧树FPS的反转录PCR |
| 4.5 PCR产物纯化回收 |
| 4.6目的基因转化大肠杆菌Trans1-T1 |
| 4.7 阳性重组子的筛选验证 |
| 4.8 目的基因的测序验证与分析 |
| 5 无忧树FPS基因的原核表达 |
| 5.1 构建原核重组表达载体pCold TF-FPS |
| 5.2 构建原核重组表达菌株BL21-pCold TF-FPS |
| 5.3 重组菌株BL21-pCold TF-FPS蛋白检测 |
| 6 FPS基因的真核表达 |
| 6.1 构建真核重组表达载体605ADH1-FPS |
| 6.2 构建真核重组菌株BY4742-FPS |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 FPS的克隆 |
| 1.1 无忧树总RNA的提取 |
| 1.2 RT-PCR获得FPS基因cDNA |
| 1.3 目的基因片段TA克隆 |
| 1.4 测序验证与分析 |
| 2 FPS基因原核表达 |
| 2.1 原核重组表达载体pCold TF-FPS的构建 |
| 2.2 重组菌株BL21(DE3)的诱导 |
| 2.3 FPS的活性检测 |
| 3 FPS基因真核表达 |
| 3.1 真核重组表达载体605ADH1-FPS的构建 |
| 3.2 重组菌株BY4742的发酵 |
| 3.3 FPS的活性检测 |
| 结论与讨论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）马尾松产脂相关基因挖掘及表达规律研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 国内外研究现状及评述 |
| 1.2 研究目标和主要研究内容 |
| 1.2.1 关键的科学问题与研究目标 |
| 1.2.2 主要研究内容 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 第二章 马尾松产脂力与萜类组分和相关酶活性的关系 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 采样地基本情况 |
| 2.1.2 试验材料 |
| 2.1.3 试验方法 |
| 2.1.4 酶活测定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 马尾松松针挥发油的主要组分及含量 |
| 2.2.2 马尾松嫩茎挥发油的主要组分及含量 |
| 2.2.3 马尾松松脂中松节油的主要组分及含量 |
| 2.2.4 马尾松松脂中松香的主要组分及含量 |
| 2.2.5 不同产脂力马尾松针叶和嫩茎挥发油主要组分比较 |
| 2.2.6 不同产脂力马尾松松脂含油率与含油量 |
| 2.2.7 不同产脂力马尾松松脂主要组分比较 |
| 2.2.8 不同产脂力马尾松萜类合成酶活性 |
| 2.2.9 不同产脂力马尾松3种萜类合成酶活性比较 |
| 2.2.10 不同产脂力马尾松针叶ATP合成酶活性 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 基于转录组测序的马尾松萜类合成相关基因分析及SSR遗传标记分析 |
| 3.1 试验材料与方法 |
| 3.1.1 采样地基本情况 |
| 3.1.2 试验材料 |
| 3.1.3 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 RNA质量检测 |
| 3.2.2 测序及序列片段组装 |
| 3.2.3 Unigene基因注释 |
| 3.2.4 萜类合成相关酶基因 |
| 3.2.5 萜类骨架生物合成相关酶在不同产脂力马尾松的表达分析 |
| 3.2.6 马尾松转录组中SSR的分布及结构特点 |
| 3.2.7 马尾松转录组中含SSR的Unigene的GO分类 |
| 3.2.8 含SSR的Unigene的KEGG代谢通路分析 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 马尾松GGPPS2基因表达模式及功能分析 |
| 4.1 试验材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 引物 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 马尾松GGPPS2基因克隆及分析 |
| 4.2.2 马尾松GGPPS2基因表达分析 |
| 4.2.3 马尾松GGPPS2基因功能分析 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 主要环境因子对马尾松萜类合成关键基因的影响 |
| 5.1 试验材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.1.3 指标测定 |
| 5.1.4 数据处理 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 5个萜类合成关键基因在马尾松体内表达模式 |
| 5.2.2 不同温度处理对马尾松萜类合成关键基因表达的影响 |
| 5.2.3 不同光照处理对马尾松萜类合成关键基因表达的影响 |
| 5.2.4 土壤含水分量对马尾松萜类合成关键基因表达的影响 |
| 5.3 小结 |
| 第六章 结论与讨论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 讨论 |
| 6.2.1 马尾松萜类化合物组分和含量 |
| 6.2.2 马尾松萜类合成相关酶活性对产脂力的影响 |
| 6.2.3 马尾松转录组分析 |
| 6.2.4 马尾松萜类化合物关键酶基因表达分析 |
| 6.2.5 马尾松萜类共同前体IPP的生物合成途径 |
| 6.2.6 基于转录组测序的马尾松SSR遗传标记分析 |
| 6.2.7 马尾松GGPPS2基因与产脂相关性研究及转化拟南芥研究 |
| 6.2.8 主要环境因子对马尾松萜类化合物合成关键酶的影响 |
| 6.3 本论文研究创新及应用 |
| 6.4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间的学术研究 |
| 致谢 |
（10）强化酿酒酵母乙酰辅酶A途径的β-香树脂醇合成（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 酿酒酵母合成萜类化合物 |
| 1.1.1 酿酒酵母萜类化合物合成途径 |
| 1.1.2 酿酒酵母萜类化合物合成的调控策略 |
| 1.1.3 酿酒酵母合成β-香树脂醇现状 |
| 1.2 酿酒酵母乙酰辅酶A的合成与分解代谢 |
| 1.3 酿酒酵母线粒体乙酰辅酶A穿梭系统 |
| 1.3.1 乙醛酸支路系统 |
| 1.3.2 柠檬酸裂解酶系统 |
| 1.3.3 肉毒碱穿梭系统 |
| 1.4 酿酒酵母乙酰辅酶A合成萜类化合物的调控策略 |
| 1.4.1 酿酒酵母细胞质乙酰辅酶A调控 |
| 1.4.2 酿酒酵母线粒体直接合成萜类化合物 |
| 1.4.3 强化酿酒酵母辅酶A合成 |
| 1.5 本课题研究的内容与意义 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种与质粒 |
| 2.1.2 药品与试剂 |
| 2.1.3 实验溶液配制 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 酿酒酵母的培养 |
| 2.2.2 菌体生物量的测定 |
| 2.2.3 目的基因的扩增 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶DNA回收 |
| 2.2.5 大肠杆菌热激转化 |
| 2.2.6 酿酒酵母载体表达盒的构建 |
| 2.2.7 大肠杆菌质粒提取 |
| 2.2.8 大肠杆菌基因组提取 |
| 2.2.9 酵母化学转化法 |
| 2.2.10 酿酒酵母基因组提取 |
| 2.2.11 酿酒酵母质粒提取 |
| 2.2.12 酿酒酵母总RNA的提取与反转录 |
| 2.2.13 基因表达水平检测 |
| 2.2.14 β-香树脂醇及其他代谢产物的提取与鉴定 |
| 2.2.15 酿酒酵母生理参数的测定 |
| 2.2.16 发酵罐的培养 |
| 第3章 强化酿酒酵母乙酰辅酶A途径的β-香树脂醇合成 |
| 引言 |
| 3.1 酿酒酵母中途径的构建策略与方法 |
| 3.1.1 过表达乙醇脱氢酶基因ADH2工程菌的构建 |
| 3.1.2 内源丙酮酸脱氢酶支路在酿酒酵母中的构建 |
| 3.1.3 外源丙酮酸脱氢酶途径在酿酒酵母中的构建 |
| 3.1.4 外源柠檬酸裂解酶途径在酿酒酵母中的构建 |
| 3.1.5 外源PK/PTA途径和A-ALD途径在酿酒酵母中的构建 |
| 3.1.6 敲除酿酒酵母苹果酸合酶和柠檬酸合酶 |
| 3.1.7 强化酿酒酵母辅酶A合成在酿酒酵母中的构建 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 过表达乙醇脱氢酶基因ADH2对β-香树脂醇合成的影响 |
| 3.2.2 强化酿酒酵母内源丙酮酸脱氢酶支路对β-香树脂醇合成的影响 |
| 3.2.3 构建外源丙酮酸脱氢酶途径对β-香树脂醇合成的影响 |
| 3.2.4 构建外源柠檬酸裂解酶途径对β-香树脂醇合成的影响 |
| 3.2.5 构建外源PK/PTA途径和A-ALD途径对β-香树脂醇合成的影响 |
| 3.2.6 强化酿酒酵母辅酶A合成对β-香树脂醇合成的影响 |
| 3.3 小结 |
| 第4章 强化酿酒酵母鲨烯合成途径的β-香树脂醇合成 |
| 引言 |
| 4.1 酿酒酵母中途径的构建与方法 |
| 4.1.1 过表达3-羟-3-甲基戊二酰辅酶还原酶tHMG1工程菌的构建 |
| 4.1.2 共表达ADH2和t HMG1 工程菌的构建 |
| 4.1.3 过表达ERG系列基因工程菌的构建 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 过表达3-羟-3-甲基戊二酰辅酶还原酶对β-香树脂醇合成的影响 |
| 4.2.2 共表达ADH2和t HMG1对β-香树脂醇合成的影响 |
| 4.2.3 过表达ERG系列基因对β-香树脂醇合成的影响 |
| 4.3 小结 |
| 第5章 高产β-香树脂醇酵母工程菌的发酵优化 |
| 引言 |
| 5.1 乙醇补料发酵 |
| 5.2 葡萄糖补料发酵 |
| 5.3 小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文与研究成果清单 |
| 致谢 |
四、Cloning and enzymology analysis of farnesyl pyrophosphate synthase gene from a superior strain of Artemisia annua L.（论文参考文献）
- [1]代谢工程改造酿酒酵母生产萜类化合物[D]. 赵一瑾. 北京化工大学, 2021(02)
- [2]广藿香PatPTS启动子功能及G-box结合因子参与的转录调节研究[D]. 刘彦婷. 广州中医药大学, 2020
- [3]广藿香法尼基焦磷酸合酶和倍半萜合酶的基因功能研究[D]. 卢昌华. 广东药科大学, 2020(01)
- [4]阳春砂萜类合酶及其启动子参与挥发性萜类合成的研究[D]. 赵海莹. 广州中医药大学, 2020(06)
- [5]广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制研究[D]. 陈秀珍. 广州中医药大学, 2020(06)
- [6]广藿香醇合酶的克隆、过表达和反义RNA沉默[D]. 黄伟展. 广东药科大学, 2019(02)
- [7]灵芝挥发性萜类组研究[D]. 褚丽华. 北京协和医学院, 2019(02)
- [8]无忧树（Saraca dives Pierre）法尼烯合酶基因克隆与表达[D]. 李帆. 云南大学, 2018(01)
- [9]马尾松产脂相关基因挖掘及表达规律研究[D]. 陈晓明. 中国林业科学研究院, 2018(12)
- [10]强化酿酒酵母乙酰辅酶A途径的β-香树脂醇合成[D]. 樊婧婧. 北京理工大学, 2018(07)