一、共受体信号传导与HIV（论文文献综述）
杜丽[1]（2021）在《嵌合抗原受体T细胞疗法的优化策略研究》文中提出背景:嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）是一种发展迅速的肿瘤免疫治疗策略,在癌症个体化免疫治疗方面表现出了巨大的前景。该技术是将抗体对抗原的高度特异性和T细胞对靶细胞的细胞毒活性相结合的一种方法。然而CAR-T细胞的广泛应用仍面临一些艰巨的挑战,T细胞慢病毒转染效率低、CAR-T细胞功能受到抑制、CAR-T细胞输注后缺乏持续性、肿瘤细胞抗原表达缺失引起免疫逃逸等。慢病毒载体能够通过整合到宿主基因组,稳定转染分裂或非分裂的细胞。此外,这些载体对人体无毒,可使转染的原代T细胞获得长期稳定的基因表达。但是,目前慢病毒介导的T细胞转染面临着低转染效率的局限性,如何提高慢病毒转染效率仍然是一个挑战。考虑到CAR-T细胞在患者体内持续性差,增加低分化CAR-T细胞的占比可有效提高CAR-T细胞持久抗瘤的效果。尽管低分化T细胞群具有明显的优势,但由于缺乏生产低分化CAR-T细胞的合适方法,目前大多数过继性细胞疗法仍依赖于终末分化型CAR-T细胞。因此,优化制备方法以获得高质量的CAR-T细胞非常重要。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原结合区、一个胞外铰链区、一个跨膜区和一个胞内信号区。单一的CAR骨架构成为其在临床应用中提供了很大的灵活性,但是,这种简单的结构并不能模拟真实、精密而复杂的TCR识别模式。天然状态下的T细胞能对抗原提呈细胞表面的单个抗原肽-MHC分子复合物做出反应,而在CAR-T细胞活化中,尽管抗原抗体识别具有很强的亲和力,但比天然状态下的T细胞需要更多更强的靶抗原表达才能有效激活CAR-T细胞。实验研究表明超过20%的病人在接受CD19-CAR-T细胞治疗后出现癌症复发,以及在最近的CD22-CAR临床试验中,超过50%的患者在获得完全缓解后出现疾病的复发,而复发的主要原因是肿瘤细胞的靶抗原表达降低,从而导致免疫逃逸。因此,如何根据天然状态下T细胞的识别程序来优化CAR-T细胞的结构设计,提高CAR-T细胞对靶抗原低表达的肿瘤细胞的识别和杀伤,有利于开发出更有效的CAR-T治疗方法。γC家族细胞因子在促进T细胞生长、对抗肿瘤和促使记忆性T细胞的生成以抵抗肿瘤转移或复发方面发挥关键作用。白介素-21（Interleukin-21,IL-21）主要激活的信号转导和转录激活因子不同于其他γC家族的细胞因子,使其在抗肿瘤免疫中有其独特的作用。本实验旨在探究在CAR-T制备过程中添加IL-21会对CAR-T的生产带来哪些影响,从而优化CAR-T细胞的制备过程。目前所知,最少有三种酪氨酸激酶参与了T细胞活化的早期磷酸化事件。其中淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(P56Lymphocyte-specific tyrosine kinase,P56LCK)主要表达在T细胞的细胞膜上和细胞质中。遗传学研究表明P56LCK对T细胞的活化十分重要,P56LCK的缺失突变可致T细胞的发育不良。在T细胞的免疫突触形成过程中,配体与受体结合引起膜受体位置和构型改变,膜受体发生交联。CD3、CD4或CD8分子的胞浆区尾部聚集在一起,CD4或CD8分子胞内区相连的蛋白酪氨酸激酶P56LCK发生磷酸化而激活,继而使CD3分子中的免疫受体酪氨酸激活基序（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM）发生酪氨酸磷酸化激活T细胞。而CD4和CD8分子与P56LCK结合的区域是一段相似的包含两个半胱氨酸的带负电荷区域。我们将设计的优化的半胱氨酸序列串联到CAR的胞内区,探究该优化结构对CAR-T细胞的抗肿瘤能力的影响。我们希望通过优化CAR-T细胞的制备过程和CAR结构提高CAR-T细胞抗肿瘤效果,为临床CAR-T细胞技术更好的应用提供参考。方法:（1）采用分子克隆构建人类表皮生长因子受体-2（Human epidermal growth factor receptor-2,HER-2）CAR质粒,和TR1419-28ξCAR（28CAR）、TR1419-BBξCAR（137CAR）、优化质粒TR1419-BBξLCK1CAR（137LCK1）、优化质粒TR1419-BBξLCK2CAR（137LCK2）及其他相关质粒,并进行酶切和测序验证。（2）设计8组细胞因子组合（不含IL-21:白介素-2（Interleukin-2,IL-2）、白介素-7（Interleukin-7,IL-7）、白介素-15（Interleukin-15,IL-15）、IL-7+IL-15;含IL-21:IL-2+IL-21、IL-7+IL-21、IL-15+IL-21、IL-7+IL-15+IL-21）,分别用于培养制备HER-CAR-T细胞,采用自动细胞计数仪计数不同细胞因子组合培养的T细胞数,流式细胞术检测不同细胞因子组合培养的T细胞的CAR转染率和HER-CAR-T细胞的表型。（3）流式细胞术检测几组构建成功的TR1419-CAR-T细胞亚型和抑制性分子程序性死亡受体1（Programmed cell death protein 1,PD-1）、淋巴细胞激活基因3（Lymphocyte activation gene 3,LAG-3）和T细胞膜蛋白3（T-Cell membrane protein 3,TIM-3）表达水平,并比较CAR的表达强度。（4）T细胞的干扰素-gamma（Interferon-γ,IFN-γ）检测。采用流式细胞术和酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,EIISA）检测在不同时间段不同细胞因子组合培养的活化T细胞的IFN-γ表达。（5）CAR-T细胞的杀伤功能检测。流式细胞术检测肿瘤细胞的靶抗原表达并选取表达阳性的的肿瘤细胞作为靶细胞,钙黄绿素释放试验检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果。ELISA检测杀伤上清中IFN-γ和颗粒酶B（Granzyme B,Gzms B）的含量。（6）各组TR1419-CAR-T细胞和肿瘤细胞共孵育培养7天,流式细胞术检测CAR-T细胞的增值、亚型分化和抑制性分子表达,确定137LCK2-T是否具有更好的持久性特征。结果:第一部分:（1）我们成功构建了HER-2-CAR相关质粒并建立慢病毒转染方法,可有效制备CAR-T细胞。（2）IL-21提高了T细胞的慢病毒转染率。4组不含IL-21的细胞因子组合培养的T细胞CAR转染率无显着差异,均在15%-30%之间。4组添加IL-21的细胞因子组合培养的T细胞CAR转染率也无明显差异,均在25%-40%之间。其中,添加IL-21的细胞因子组合培养的T细胞均比对应的不含IL-21的细胞因子组合培养的T细胞有更高的慢病毒转染率。（3）IL-21调控T细胞活化早期IFN-γ的表达。实验结果发现在T细胞活化后的前6小时,IL-2+IL-21、IL-7+IL-21和IL-15+IL-21组的T细胞比对应的IL-2、IL-7和IL-15组的T细胞表达更高水平的IFN-γ。在T细胞活化的24-48小时,添加IL-21的4组细胞因子组合培养的T细胞比不含IL-21的4组细胞因子组合培养的T细胞表达更低水平的IFN-γ。最后,我们发现CD8+T细胞转染效率与其在转染时刻IFN-γ表达呈显着负相关。（4）IL-21提高了T细胞的增殖。IL-7+IL-21、IL-15+IL-21和IL-7+IL-15+IL-21组的T细胞在转染后培养12天的增殖倍数显着高于对应的IL-7、IL-15和IL-7+IL-15组的T细胞增值倍数。其中,IL-21的添加尽管提高了IL-7组的T细胞的增殖,但协同IL-7介导的T细胞增值倍数仍显着低于其他细胞因子组合培养的T细胞增殖倍数。（5）IL-21提高初始T细胞（Na?ve T,Tn）在CAR-T细胞中的比例。八组细胞因子组合培养的CAR-T细胞的亚型均以Tn为主,占比50%-80%。其中,IL-7+IL-21组的CAR-T细胞的Tn占比最高,其次是IL-15+IL-21组。而IL-2组的CAR-T细胞的Tn占比最少,其次是IL-2+IL-21组。我们还发现添加了IL-21的细胞因子组合培养的CAR-T细胞的Tn占比均比对应的不含IL-21细胞因子组合培养的CAR-T细胞的Tn占比更高。（4）IL-21增强CAR-T细胞的特异性杀伤能力。8组细胞因子组合培养的HER-2 CAR-T细胞均对HER-2阳性的肿瘤细胞具有良好的杀伤能力并伴随着显着的INF-γ和Granzyme B的分泌。其中,添加了IL-21的细胞因子组合培养的HER-2 CAR-T细胞对HER-2阳性的肿瘤细胞具有更强的杀伤能力和更高的效应细胞因子的分泌。几组细胞因子组合培养的HER-2 CAR-T细胞对HER-2阴性的肿瘤细胞未表现出显着高于对照T细胞的杀伤能力和细胞因子分泌。第二部分:（1）完成了二代和半胱氨酸结构域优化的靶向TRAIL-R1的CAR质粒的构建工作,质粒测序结果和原始序列匹配。采用慢病毒转染Jurkat细胞和T细胞,均能成功转染表达CAR基因。（2）将137CAR以及优化设计的137LCK0、137LCK1和137LCK2转染Jurkat细胞,采用不同浓度的靶抗原（TRAIL-R1-Fc融合蛋白）刺激,检测几组CAR-Jurkat细胞的CD69表达,137LCK2-Jurkat在低浓度的靶抗原刺激下比其他组表达更高的CD69,因此筛选137LCK2用于后续实验。（3）28CAR、137CAR和137LCK2转染T细胞,几组CAR-T细胞的转染率均在30%-40%,且平均荧光强度无显着差异。几组CAR-T细胞的PD-1、LAG-3和TIM-3表达相当。其中,CD4+CAR-T细胞比CD8+CAR-T细胞表达更高水平的PD-1,而CD8+CAR-T细胞比CD4+CAR-T细胞表达更高水平的LAG-3和TIM-3。分析比较几组CAR-T细胞的亚型占比,均以初始T细胞（Na?ve T,Tn）为主,占比约50%,Tn在28CAR-T细胞中的比例略高于其他组。（4）采用不同浓度的靶抗原刺激几组CAR-T细胞,几组CAR-T细胞的CD137表达随靶抗原浓度的降低表达下降,其中137LCK2-T细胞在多种靶抗原浓度刺激下均比137CAR-T表达更高的CD137,而其他几组CAR-T细胞未表现出显着差异。我们根据肿瘤细胞表面TRAIL-R1的表达水平,选择HS578-T、和SW480作为杀伤试验的靶细胞,三组CAR-T细胞均能有效杀伤表达TRAIL-R1的肿瘤细胞,且三组CAR-T细胞对HS578-T和SW480的杀伤率无明显差异。（5）几组CAR-T细胞在靶抗原的刺激下培养7天后,几组CAR-T细胞均是以Tn为主。其中CD4+CAR-T细胞以中央记忆性T细胞（Central memory T,Tcm）为主,CD8+CAR-T细胞中以Tn为主。效应记忆型T细胞（Effect memory T,Tem）和效应T细胞（Effect T,Te）在几组CAR-T细胞中的比例无显着差异。同时,在137LCK2细胞中,有更多的Tn分化成Tcm。另一方面,CD4+137LCK2-T和CD8+137LCK2-T细胞的增殖速率均明显高于其他组的CAR-T细胞,且137LCK2细胞表达更低的LAG-3。结论:一方面,我们发现IL-21提高T细胞的慢病毒转染效率,并调控T细胞活化早期IFN-γ的表达,且IL-21对T细胞IFN-γ表达的调控可能是其提高慢病毒转染率的部分原因。我们证实IL-21提高了低分化CAR-T细胞的富集和扩增,增强CAR-T细胞的特异性杀伤能力。另一方面,我们通过在CAR的胞内段连接一段特定半胱氨酸序列模拟CD4/CD8共受体在T细胞活化信号转导中的作用,该优化方式提高了CAR-T细胞对靶抗原的灵敏度,增强了CAR-T细胞在靶抗原刺激下的增殖,促进了CAR-T细胞的Tcm分化,且降低了抑制性分子LAG-3的表达。本实验通过对CAR-T细胞的制备过程和CAR机构的优化为CAR-T细胞抗肿瘤治疗提供了新策略。
陆晓婷[2]（2020）在《多肽激素RGF1及其受体RGI1通过MAPK信号途径调控拟南芥根分生组织的发育》文中研究表明根的生长需要根尖分生组织细胞的连续分裂。ROOT MERISTEM GROWTH FACTORs（RGFs）是维持根尖干细胞微环境的一类关键多肽类激素。我们实验室和其他实验室前期的研究发现了五个进化关系相近的富含亮氨酸重复序列的类受体激酶（LRR-RLKs）,将其命名为RGF1 INSENSITIVES（RGIs）或者RGF1RECEPTORS（RGFRs）。这五个蛋白在感知RGF1的信号并调控拟南芥根尖干细胞微环境的维持方面具有功能冗余性。RGF1主要通过两个下游转录因子PLETHORA 1（PLT1）和PLT2调节根分生组织的活性。然而,连接细胞表面配体-受体复合体RGF1-RGI1和核内转录因子PLT1/PLT2的中间组分尚未被发现。为了寻找RGIs介导的信号通路中的新的调控蛋白,我们建立了35S::RGI1-FLAG的转基因植物,通过免疫共沉淀及蛋白组学方法鉴定了与RGI1-FLAG有直接或间接作用的蛋白。有趣的是,我们发现丝裂原活化蛋白激酶MKK4和MPK3只有在用RGF1处理后的转基因拟南芥幼苗中能鉴定到存在于RGI1-FLAG复合体中。已有的报道表明多个类受体激酶通过MAPK途径向下游传递信号,因此,我们检测了MAPK途径是否也参与了RGIs介导的信号转导通路。我们发现由RGI1启动子驱动的持续激活形式的MKK4和MKK5,即MKK4DD和MKK5DD,其表达能够部分恢复rgi1/2/3/4四突和rgi1/2/3/4/5五突的根发育缺陷的表型。MKK4/MKK5或MPK3/MPK6的功能缺失突变体展现出与rgi1/2/3/4或rgi1/2/3/4/5类似的根短表型。我们通过遗传学证明YDA作为RGF1-RGI1信号通路中MKK4/MKK5上游的MAPKKK发挥功能。同时,生物化学数据表明RGF1可以诱导MPK3/MPK6的磷酸化,而RGF1对MPK3/MPK6的激活依赖于RGIs及其下游MKK4/MKK5的功能。最后,下游转录因子PLT1和PLT2的表达很大程度上受RGF1-RGI1信号通路的调控,在mkk4 mkk5突变体中,PLT1和PLT2的表达量也显着降低。综合本研究和其他研究的结果,我们提出了一个信号通路,该信号从配体RGF1,到受体RGI1,再到YDA-MKK4/MKK5-MPK3/MPK6信号级联反应,调节了转录因子如PLT1和PLT2的表达,最终调控了拟南芥根分生组织的发育。
王维文[3]（2020）在《CXCR4在EBV相关胃癌中的表达和调控作用研究》文中认为EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）是一种双链DNA病毒,与多种肿瘤的发生相关。约有90%以上的健康人群在幼儿时期曾感染EBV,呈持续性潜伏感染状态,且在其体内均可检测到EBV抗体。EBV相关胃癌（EBV associated gastric carcinoma,EBVaGC）约占胃癌总数的3%-8%,临床病理学特征与其他胃癌不同,其发病机制尚未明了。CXCR4属于高度保守的7次跨膜G蛋白偶联受体,已有研究发现CXCR4在多种肿瘤组织中表达升高,可影响多种肿瘤的发生发展过程,如促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、诱导细胞迁移和侵袭以及上皮间质转化等多种生物学活性。CXCR4与病毒感染密切相关,如CXCR4可作为共受体辅助HIV感染并进入宿主细胞。CXCL12可与CXCR4的N端特异性结合,并与CXCR4的第2胞外环相互作用后启动下游信号通路,调控相关肿瘤的发生和发展。目的:明确CXCR4在EBVaGC组织中的表达及其调控机制,并探讨CXCR4在EBVaGC发生发展中的作用以及可能的作用机制,为进一步阐明EBV在EBVaGC发生发展过程中的作用提供理论基础。材料和方法:（1）实时荧光定量PCR检测EBV阳性和EBV阴性胃癌细胞系中CXCR4及相关microRNA的表达。（2）Western blot检测细胞系中CXCR4及相关蛋白的表达;免疫组化检测EBV阳性和EBV阴性胃癌组织中CXCR4表达。（3）亚硫酸氢盐基因组测序法检测CXCR4基因启动子和第1外显子甲基化状态。（4）在EBV阴性胃癌细胞系中分别过表达LMP1或LMP2A,检测microRNA-146a,PI3K/AKT和CXCR4的表达水平。（5）在EBV阳性胃癌细胞系中分别敲减LMP1或LMP2A的表达,检测microRNA-146a,PI3K/AKT和CXCR4表达水平的变化。（6）通过转染microRNA-146a的模拟物和抑制物,提取不同作用条件处理的蛋白,检测CXCR4蛋白表达的变化。（7）PI3K抑制剂LY294002处理细胞,检测CXCR4蛋白表达的变化。（8）采用小干扰RNA靶向沉默CXCR4表达,Western blot检测细胞自噬蛋白LC3B表达的变化,透射电镜和荧光共聚焦显微镜检测自噬小体的形成。（9）流式细胞分析检测靶向沉默CXCR4和自噬激活剂作用对细胞表型的影响。（10）采用小干扰RNA靶向沉默CXCR4表达和自噬激活剂诱导细胞自噬,检测EBV即刻早期基因BZLF1的表达。结果:（1）EBV阳性胃癌细胞系（GT38和GT39）中CXCR4 mRNA和蛋白水平均低于EBV阴性胃癌细胞系（BGC823和SGC7901）（P<0.05）;AGS-EBV细胞系中CXCR4 mRNA转录和蛋白表达水平则明显高于AGS细胞系（P<0.05）;EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中CXCL12和CXCR7 mRNA转录水平无明显差异;EBVaGC组织中CXCR4表达率较高（与AGS-EBV细胞系的潜伏类型一致）。（2）EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中CXCR4基因启动子和第一外显子均呈现低甲基化状态。（3）EBV阳性胃癌细胞系（GT38和GT39）microRNA-146a的表达水平高于EBV阴性胃癌细胞系（BGC823,SGC7901,AGS）。（4）转染LMP1重组表达质粒可上调EBV阴性胃癌细胞系microRNA-146a的表达,同时下调CXCR4的表达;且干扰EBV阳性胃癌细胞系LMP1表达后可表现出相反的调控模式。（5）microRNA-146a可通过结合CXCR4的3’-UTR区,随着模拟物转染浓度的增加,CXCR4表达水平依次下降,且作用48h的抑制效果明显强于24h（P<0.05）。（6）转染LMP2A重组表达质粒可诱导AKT发生磷酸化,并上调CXCR4的表达;且敲减LMP2A后可表现出相反的调控模式。（7）以不同浓度的PI3K抑制剂LY294002处理AGS-EBV细胞,发现PI3K/AKT通路可以剂量依赖的方式诱导CXCR4的表达。（8）干扰CXCR4蛋白表达,可降低LC3B蛋白表达,同时抑制自噬小体的形成。（9）CXCR4可诱导细胞发生自噬,增加细胞进入G2/M期,促进细胞增殖,同时减少细胞发生凋亡的数量。（10）CXCR4可抑制BZLF1mRNA和蛋白的表达,参与EBV持续性潜伏感染的过程,但细胞自噬并不介导CXCR4-BZLF1-EBV潜伏感染的调控过程。结论:（1）LMP1可通过上调microRNA-146a的表达,抑制靶基因CXCR4的表达。（2）LMP2A可通过PI3K/AKT通路上调CXCR4的表达。（3）LMP1和LMP2A可在不同阶段调控CXCR4的表达,参与EBVaGC的发生和发展过程。
刘想梅[4]（2020）在《基因沉默Neuropilin-1对胃癌HGC-27细胞侵袭、转移及上皮间质转化的影响》文中认为目的研究基因沉默Nueropilin-1对胃癌HGC-27细胞迁移、侵袭及上皮间质转化的影响。方法以胃癌HGC27细胞作为研究对象,采用TGF-β1刺激诱导细胞EMT模型;将靶向NRP1-si RNA稳定转染至HGC-27细胞;划痕和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭;实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）和Western blot检测NRP1和EMT相关标记物（E-cadherin,vimentin,snail）的表达水平。结果1 TGF-β1诱导胃癌HGC-27细胞EMT模型:5 ng/m LTGF-β1刺激组细胞形态由卵圆石样转变为长梭形、纺锤体状,细胞间隙增大。划痕显示刺激组划痕愈合面积较空白组明显增加（P<0.05）。Transwell结果显示刺激组细胞穿透小室细胞数较空白组明显增多（P<0.05）。q RT-PCR结果显示TGF-β1刺激细胞后,E-cadherin的m RNA相对表达量明显降低,Vimentin、Snail以及NRP1的m RNA相对表达量显着升高（P<0.05）。Western blot结果显示刺激组E-cadherin蛋白明显减少,Vimentin、Snail及NRP1蛋白表达显着升高（P<0.05）。验证成功建立EMT模型。2 NRP1在胃癌HGC-27细胞中的表达及沉默:空白对照组（CON）:转染PBS;无意义序列组（NC）:转染NC-si RNA;转染组（si NRP1）转染NRP1-si RNA,验证转染效率。q RT-PCR结果及Western blot结果显示,与NC和CON组相比,靶向si NRP1转染组中胃癌HGC-27细胞的NRP1 m RNA及蛋白相对表达表达水平显着降低（0.47倍）（P<0.05）。验证转染沉默效果满意。3基因沉默NRP1后可以抑制胃癌HGC-27细胞的迁移和侵袭:转染实验中,在划痕后24和48 h,si NRP1组的伤口愈合面积较CON组和NC组的显着减少（P<0.05）。Transwell实验显示,si NRP1组细胞跨膜迁移及侵袭的细胞数较CON和NC组明显减少（P<0.05）。4沉默NRP1可以抑制TGF-β1诱导胃癌HGC-27细胞EMT模型后细胞的侵袭、迁移和逆转EMT过程:在划痕24和48 h后,TGF-β1+si NRP1组较其他各组的伤口愈合小（P<0.05）;Transwell结果显示,TGF-β1+si NRP1组的迁移和侵袭细胞数较其他组显着减少（P<0.05）。在胃癌EMT基础上转染si NRP1沉默NRP1,分为四组:Blank组（未经处理）;TGF-β1+CON组（TGF-β刺激+转染PBS）;TGF-β1+NC组（TGF-β1刺激+转染si NC）;TGF-β1+si NRP1组（TGF-β1刺激+NRP1-si RNA转染）,q RT-PCR结果及Western blot结果显示,各组间比较,TGF-β1+si NRP1组的E-cadherin表达显着升高,Vimentin和Snail表达量呈显着下调（P<0.05）。结论TGF-β1诱导建立胃癌EMT条件下,沉默NRP1可以抑制细胞的迁移、侵袭,可以逆转TGF-β1诱导的胃癌EMT过程。图4幅;表2个;参147篇。
杨静[5]（2020）在《LncRNA NKILA通过抑制NF-κB信号传导调节HIV-1复制及潜伏》文中研究表明人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）是获得性免疫缺陷综合症——艾滋病（AIDS）的主要病原体。目前,全球约有3790万人感染艾滋病病毒,仍然是严重威胁人类健康的重大传染病,经过科学家的不断努力,通过抗病毒疗法,已经能够控制病情,使之成为慢性病,但是仍未开发出能完全治愈艾滋病的方法。近年来,科学家们发现部分在人体中存在的长链非编码RNA（LncRNA）具有广泛的生物学作用,包括对癌症、病毒感染等疾病的重要调控作用,尽管一些长链非编码RNA被报道在HIV-1感染复制过程中发挥重要的作用,但关于长链非编码RNA对HIV调控作用的研究仍然很少。随着研究的深入,LncRNA NKILA最近被确定为NF-κB信号的负调节剂,并且在多种癌症的发展过程中起着重要作用;众所周知,在HIV-1的生命周期中,其转录和潜伏期重新激活均需要NF-κB介导的HIV-1 LTR驱动基因表达的激活。但是,LncRNA NKILA是否在HIV-1复制和潜伏中起重要作用,它的作用是否通过对NF-κB信号通路的调控实现的?目前尚未见报道。因此,我们针对这一重要科学问题,开展了NKILA对HIV-1复制的影响及其作用机制的研究。本研究中,我们首先证明lncRNA NKILA在调节HIV-1转录和复制中起关键作用。我们发现NKILA以剂量依赖的方式强烈抑制了HIV-1的复制及其感染性;进一步研究发现NKILA以梯度依赖的方式抑制HIV-1 LTR活性;我们知道HIV-1 LTR上含有NF-κB的结合位点,本研究证实NKILA通过自身的发夹结构与NF-κB的亚基P65结合,从而结合到P65:P50:l?Bα复合物上并进一步掩盖l?Bα的磷酸化位点,进而抑制NF-κB信号,最终抑制LTR活性。并且在这一过程中,NKILA不仅抑制LTR活性,而且抑制Tat单独诱导的LTR活性以及P65和Tat共同诱导的LTR活性。另外,为证明NKILA是否可以作为一种针对HIV复制的新型广谱抗病毒分子,我们对其进行了更加深入的研究。研究发现,NKILA可以抑制不同细胞嗜性的HIV-1亚型的复制,例如巨噬细胞嗜性AD8株,来自大脑的YU2株以及R5X4-tropic 89.6株。因此我们认为LncRNA NKILA是一种具有广谱抗病毒作用的HIV抑制剂。此外,本研究还发现HIV-1复制或重新激活显着下调了包括Jurkat,H9,分离的原代CD4+T细胞和HIV-1潜伏细胞在内的T细胞以及感染HIV-1的患者的PBMC中NKILA的表达,这些结果表明HIV-1为了克服NIKLA的抑制作用,下调了NKILA的表达,从而实现HIV-1复制。这些发现加强了我们对lncRNA NKILA通过NF-κB信号传导对HIV-1复制和潜伏期的功能抑制的理解,为HIV-1提供了有希望的治疗策略。
王文强[6]（2020）在《哺乳动物病毒受体的进化研究》文中研究指明病毒与宿主间的遗传冲突会导致循环往复的进化军备竞赛。病毒需结合宿主细胞表面上的受体分子（绝大多数为蛋白）来感染宿主细胞。病毒受体蛋白是具有正常生物学功能的宿主蛋白,但被病毒“挟持”用来辅助入侵宿主细胞。病毒受体在进化上受到两个相互冲突的作用力,即由于功能限制而导致的负选择和因宿主病毒军备竞赛而引起的正选择。尚不清楚病毒受体在多重选择压力下是如何进化的。本研究系统地整理了目前已知的96个哺乳动物病毒受体的信息,并通过比较基因组学和分子进化分析的方法来研究哺乳动物病毒受体基因在灵长类动物中发生的进化模式。研究发现52.1%的病毒受体基因在灵长类动物进化过程中经历了适应性进化。位点分析表明42.7%病毒受体基因中存在受正选择的氨基酸位点。本研究将受正选择的氨基酸位点与病毒和受体互作界面进行了关联分析,发现病毒受体中许多受选择的氨基酸位点位于病毒和受体互作界面。本研究通过对灵长目动物病毒受体基因以及对照基因进行比较分析发现病毒受体基因的d N/d S显着高于对照基因,病毒受体基因中受正选择的基因比例显着高于对照基因,病毒受体基因中受正选择的支系以及正选择位点比例显着高于对照基因。这些结果表明宿主与病毒的进化军备竞赛驱动了病毒受体蛋白在灵长类中的适应性进化。本研究通过使用基于位点频率谱和连锁不平衡等原理的群体遗传学方法来解析病毒受体基因在人类群体中的主要进化模式。我们发现有58个病毒受体基因在群体中具有受到自然选择的信号,其中5个经历平衡选择,53个经历了选择性清除。此外,本研究发现一些病毒受体基因在不同人群中经历了不同的选择压力,表明病毒可能是人类的局部适应的重要驱动力。由病毒驱动的选择性清除可能导致人群中抗性等位基因的固定,这可能会增加与抗性等位基因具有高度亲和力的其他病毒感染的风险,从而增加人群中流行病的爆发风险。本研究对于理解病毒与宿主间的进化军备竞赛、病毒感染宿主的特异性以及新发流行病的爆发具有十分重要的意义。
董晋秀[7]（2020）在《金属蛋白酶TRABD2A限制HIV-1在静息CD4+T细胞复制的研究》文中指出目的:人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）是引起获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS）的病原体,艾滋病现已成为有史以来最严重的全球流行病之一。静息CD4+T细胞对HIV-1复制具有高度的抵抗力,HIV-1在静息CD4+T细胞中难以复制与静息CD4+T细胞特异宿主限制因子相关。实际上,宿主在与病毒的长期斗争中逐渐进化形成一些特异的宿主细胞因子以对抗HIV-1等病原体的侵犯。这些宿主限制因子通过干扰病毒生命周期的特定步骤,形成宿主细胞对病毒复制的天然屏障。目前已经由很多限制因子的相关报道,如TRIM5α（tripartite motif-containing protein 5α）、Mx2（myxovirus resistance protein 2）、SAMHD1（SAM And HD Domain Containing Deoxynucleoside Triphosphate Triphosphohydrolase 1）和 APOBEC3G（apolipoprotein B-editing catalytic polypeptide 3G protein）是 HIV-1 复制的早期靶点,而 Tetherin 阻止了 HIV-1 感染细胞子代的释放。值得注意的是,SAMHD1作为静息CD4+T细胞中HIV-1逆转录过程的限制因子,在限制HIV-1感染静息CD4+T细胞发挥重要作用。其他宿主因子TRIM5α、Mx2、Tetherin和APOBEC3G尚无报道在静息CD4+T细胞中有限制作用。总之,限制因子作为固有抗病毒反应的一个组成部分,甚至是在固有抗病毒反应之前提供了抵抗感染的初始防线,而确定这些限制因子作用机制是HIV研究中的一个重点。CD4+T细胞是HIV的主要靶细胞。活化的CD4+T细胞是人体内HIV-1进行复制的主要场所,而人体中的大多数CD4+T细胞（约95%）处于静息状态。目前许多研究证明,静息CD4+T细胞在体内可以被HIV直接感染,其构成了宿主潜伏感染的主要细胞。由于受感染的静息CD4+T细胞无法被机体免疫系统识别杀伤而长期存在;一旦被激活则会引起病毒的急剧反弹。因此,HIV-1潜伏感染的静息CD4+T细胞被认为是体内最重要的病毒储存库。储存库的存在是HIV不能被彻底治愈的根本原因。研究静息CD4+T细胞中HIV复制机制对于彻底清除储存库,彻底治愈艾滋病至关重要。储存库的研究现状:以前研究认为被HIV潜伏感染的储存库完全静止状态,不能转录翻译。现在,一些研究者指出,至少一部分储存库是转录活跃的,甚至是翻译活跃的。目前为止,尚未发现有能产生HIV子代的储存库。如何识别、定量储存库以及寻找储存库生物标志是HIV治愈研究领域重要命题。体内的静息CD4+T细胞是最主要的储存库,静息CD4+T细胞对产生感染性HIV子代同样也具有高度抵抗。然而,静息CD4+T细胞在HIV-1复制阶段后期病毒的限制机制目前尚不明确。本研究旨在对静息CD4+T细胞与HIV-1 Gag相互作用的宿主因子谱进行研究,从中找到关键的宿主因子并研究其对HIV-1复制影响,以及其对HIV-1感染静息CD4+T细胞作用机制和应用,更好理解静息CD4+T细胞在感染HIV-1后的分子和病理生理学效应,从而为进一步清除HIV-1储存库提供新思路和新方法。研究方法:1.研究对象静息CD4+T细胞:Ficoll密度梯度离心法从外周血提取PBMCs,磁珠法分选静息CD4+T细胞（CD3+CD4+CD8-CD25-CD69-HLA-DR-）。本研究课题通过中国医科大学附属第一医院研究伦理委员会批准,志愿者均签署了知情同书。健康献血者入选标准:健康成年,HIV阴性,乙丙肝阴性,梅毒阴性,无肿瘤及其他代谢性疾病和自身免疫疾病;HIV未治疗患者入选标准:HIV感染明确诊断,未接受过cART治疗;HIV经cART治疗患者入选标准:HIV感染明确诊断,cART长期治疗大于1年,病毒载量低于50copies/ml。2.HIV-1 Pr55-Gag在静息CD4+T细胞中免疫共沉淀从10名健康献血者分离静息CD4+T细胞并电转Myc标记Gag表达质粒（每次电转4×106个细胞）,6h后离心感染HIV-1NL4-3。感染后5天,用IP缓冲液（50 mM Tris-HCl,pH 7.2,50 mM NaCl,1%NP-40,1 mM EDTA,2%glycerol,1×HaltTMProtease Inhibitor Cocktail）裂解细胞。裂解产物在冰上孵育30 min,12,000 rpm 4℃离心10 min。离心后将上清液转移到新试管中,残余的沉淀物与预冷的IP裂解液充分混匀并进行超声处理。12,000 rpm 4℃离心10 min。将以上两个提取步骤中获得的上清液混合并与Dynabead protein A和Dynabead protein G（Invitrogen）在1.5mLEP管中一起孵育,免疫沉淀产物用预冷的IP缓冲液和PBS洗涤5-10次（每次用0.5ml洗涤）。3.HIV-1NL4-3离心感染静息CD4+T细胞将1-2×106静息CD4+T细胞与100 ng p24HIV-1NL4-3悬液充分混匀;25℃转速为1200 g离心感染2 h。4.静息CD4+T细胞中RNA干扰为了实现siRNA介导的敲减,将分离的静息CD4+T细胞3 ×106（每次处理）用 Human T Cell Nucleofector Solution 中选择程序 U-014 进行电转（Amaxa）。原代细胞的分离和培养CD4+T细胞的分离培养:Ficoll-Hypaque密度梯度分离健康献血者PBMCs。用 Human CD4+T cells Enrichment Cocktail（STEMCELL Technologies）负选得到CD4+T 细胞。静息 CD4+T 细胞由 Resting CD4+T cells Isolation Kit（STEMCELL Technologies）分离,并以 2 × 106 cells ml-1 在 RPMI 1640 培养基进行培养。RPMI 1640培养基含10%热灭活FBS、谷氨酰胺（2mM）、100Uml-1青霉素和100 mg ml-1 链霉素。活化 CD4+T 细胞由 CD3/CD28（Invitrogen）与 IL-2（50 U ml-1）（Biomol）刺激CD4+T细胞培养2 d。单核细胞、MDMs和MDDCs细胞的分离培养:Ficoll-Hypaque密度梯度分离健康献血者 PBMCs。用 Human CD14+T cells Enrichment Cocktail（STEMCELL Technologies）阳选单核细胞。MDMs由PBMCs中阳选的单核细胞在50ngml-1 GM-CSF（R&D Systems）刺激7天得到。MDDCs由PBMCs中阳选的单核细胞在 IMDM 培养基（10%FCS、2 mM L-1 谷氨酰胺、100 IU ml-1青霉素、100 mg ml-1链霉素、10mM HEPES、1%非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、10ng ml-1 GM-CSF、50ngml-1 IL4）中培养。第4天,用含有GM-CSF和IL4的新鲜培养基替换三分之二的原培养基。第6天,收集MDDCs进行实验。6.p24 ELISA 检测用 ELIS A（Advanced BioScience Laboratories）测定细胞培养物中 p24 水平。HIV-1RNA 用 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test v.2.0（Roche）测定。为了测量静息 CD4+T 细胞中 HIV-1 子代,先用 HIV Isolation Kit（Miltenyi Biotec）纯化和富集HIV-1。7.免疫荧光用 Image-iT Fixation/Permeabilization Kit（Invitrogen）试剂盒进行固定破膜。健康献血者和患者的静息和活化的CD4+T细胞固定破膜后用TRABD2A抗体（R&D Systems）;FITC 标记二抗进行荧光染色。使用 EVOS FL Imaging System（Thermo Fisher Scientific）观察图像。8.Luciferase报告基因的检测细胞裂解后用荧光素酶检测试剂盒测量荧光素酶活性（Promega）。9.静息CD4+T细胞膜相关蛋白的分离和提取试剂盒 Mem-PER Plus Membrane Protein Extraction Kit（Thermo Fisher Scientific）提取膜相关蛋白。细胞悬液300g离心5 min收集细胞。获得的细胞沉淀用3 mL Cell Wash Solution（Thermo Fisher Scientific）洗涤并 300g 离心 5 min。移除上清液后,用1.5 mL的Cell Wash Solution重悬细胞,并转移到新的试管中。300g离心5 min后弃掉上清液。所得细胞中加入0.75 ml permeabilization buffer中,获得均匀的细胞悬浮液并在4℃孵育10 min。经渗透处理的细胞16000g离心15 min;所得上清液中含有细胞溶质蛋白,并转移到新的试管中进行后续检测。留下的沉淀物中加入0.5 ml solubilization buffer中,通过移液管上下吹打使得沉淀再悬浮,并在4℃持续混合孵育30 min。将试管中的所得溶液在4℃ 16000g离心15 min。离心后溶液上清包含可溶性膜以及细胞膜相关蛋白,将其转移到新试管中进行后续检测。10.流式细胞术测定 CD4+T 细胞增殖按照 CellTrace Proliferation Kit（Invitrogen）方法。表面染色时,FACS buffer 加入 αCD69-PE（BD Biosciences）,αCD25-BB515（BD biosciences）和 HLA-DR-APC（BioLegend）染色。HIV-1 胞内 p24检测时,先用1%多聚甲醛固定并在 FACS buffer 中用 anti-p24-FITC（Beckman Coulter）HIV-1克隆 KC57（BD Cytofix;BD Biosciences）进行染色。用细胞流式仪 FACS LSRII（BD Biosciences）和 FlowJo 软件分析结果。11.TRABD2A单克隆阻断抗体的制备及筛选为了制备TRABD2A封闭抗体,对人TRABD2A-201蛋白进行原核表达并纯化（纯度>90%）。免疫程序如下:用完全弗氏佐剂对BALB/c小鼠进行初免,并用不完全弗氏佐剂加强免疫。将等量的抗原和佐剂混合成乳剂,皮下注射到小鼠体内。共3次免疫,每次免疫间隔为20天。14天后用ELISA检测血清效价。在血清滴度超过1:16000后,选择免疫应答最好的小鼠,分离其脾脏。小鼠脾细胞与SP2/0细胞以5:1的比例与PEG 1500（Sigma-Aldrich）混合。经筛选、克隆,间接ELISA法获得阳性单克隆细胞株。对细胞培养上清进行中和试验和免疫印迹以验证阳性克隆。选择阳性克隆刺激腹液产生并纯化抗体。将筛选出的阳性克隆经腹腔注射接种小鼠产生腹水。经ELISA确认后,用蛋白G亲和层析法进一步纯化获得抗体IgG。12.qPCR总RNA使用TRIzol（Invitrogen）从细胞中进行提取。将所提取的RNA溶解于 100μl DEPC-H2O 中;1 μg RNA 室温下用 DNase Ⅰ（Amplification grade;Invitrogen）纯化处理 10-15 min。纯化的 RNA 用 Superscript Ⅲ Reverse Transcriptase（Invitrogen）进行逆转录。rtPCR的结果用ΔΔCT进行分析,结果用内参GAPDH标化。13.HIV感染者病毒载量检测血浆 HIV-1 RNA 采用 rtPCR,COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 进行 HIV-1检测。检测范围为 20-10,000,000 copies ml-1。14.HIV患者CD4+T细胞产生子代的测定Ficoll-Hypaque梯度离心法从患者分离PBMCs并用CD4+T细胞负选试剂盒分离CD4+T细胞。提取的CD4+T细胞用预冷的PBS洗涤三次并用培养基洗一次,尽可能除去HIV-1污染。最后一次洗涤培养基作为感染TZM-bl报告细胞control 1（background 1）。洗涤后的 CD4+T 细胞调整细胞密度为 0.8×106-1.2×106 ml-1,并分别用TRADBD2A抑制剂、TRADBD2A阻断抗体或是CD3/CD28加IL-2刺激处理。细胞培养液上清用来感染TZM-bl报告细胞以测定产生的病毒后代水平;未经细胞培养上清感染的TZM-bl报告细胞作为control 2（background 2）。测得的数据点均减去 background 1 的值作为该点 RLUs（Relative Luminescence Units）。15.免疫印迹RIPA中按比例加入蛋白酶抑制剂,置于4℃冰上预冷;细胞弃去培养液并用PBS洗涤1-2次;弃去PBS,加入预冷RIPA buffer充分混匀并在冰上裂解细胞30min;将样品转移入EP管中4℃,12000g离心10min。离心后上清液转移到新的EP管,沉淀物加入RIPA buffer超声后12000g离心10min,将两次离心获得的上清液混合。从原液中抽出3μl,再加27μl PBS,稀释10倍使用BCA法测蛋白浓度。蛋白样品与loading buffer混合95℃煮5min。-20℃保存备用。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜后5%BSA的PBST封闭1h。一抗孵育过夜,PBST洗涤三次,每次10min;二抗孵育一 h,PBST洗涤三次,每次10min。膜在发光液中浸10s后进行检测。16.统计方法用GraphPad Prism 8.3.0和SPSS 25.0对结果进行作图和统计学相关分析。用IGV软件分析RNA-Seq不同蛋白转录水平。细胞流式结果使用Flowjo 10.5分析和作图。统计学分析比较分析采用非配对t检验。p<0.05有统计学差异。相关性分析采用Spearman相关。结果:1.宿主因子金属蛋白酶TRABD2A在静息CD4+T细胞中的鉴别发现1.1 TRABD2A与HIV-1 Gag蛋白在静息CD4+T细胞中相互作用。在静息CD4+T细胞中通过采用免疫共沉淀方法,发现有25种细胞蛋白能与Gag特异性结合,其中包括宿主蛋白TRABD2A。1.2 TRABD2A主要表达在静息CD4+T细胞。RNA-seq和荧光实时定量PCR结果显示:在25种能与Gag特异性结合蛋白中,只有TRABD2A在静息和活化CD4+T细胞差异表达且TRABD2A在静息CD4+T细胞高表达。1.3 TRABD2A主要分布在静息CD4+T细胞膜上且随CD4+T细胞激活而减少。免疫荧光中对健康献血者和经cART长期治疗的HIV感染者内源TRABD2A进行染色,发现TRABD2A分布在静息CD4+T细胞膜上;TRABD2A含量在激活24h、48h后迅速减少。1.4与cART治疗HIV患者或健康献血者相比,未治疗HIV患者的PBMCs（p<0.0001）和CD4+T细胞（p<0.0001）中TRABD2A转录水平显着降低。此外,HIV患者在cART治疗后,TRABD2A转录水平恢复到与健康献血者相似的水平。1.5 TRABD2A含量与未治疗HIV感染者病毒载量呈反比。未经治疗患者PBMCs中TRABD2A转录水平与其体内的血浆病毒载量成反比（r=-0.764 p=0.0014）;未经治疗患者总CD4+T细胞中TRABD2A转录水平与其体内的血浆病毒载量成反比（r=-0.743 p=0.001）。2.TRABD2A对静息CD4+T细胞HIV-1复制影响以及机制探索2.1 TRABD2A在静息CD4+T细胞中限制HIV-1子代生成。在静息CD4+T细胞敲减TRABD2A,使感染HIV-1的静息CD4+T细胞可以产生子代,同时HIV-1 Gag转录水平不变。2.2 Ni2+、Co2+、1,10-phenanthroline 通过抑制 TRABD2A 金属蛋白酶活性促进静息 CD4+T 细胞 HIV-1 子代产生。Ni2+、Co2+、1,10-phenanthroline 均剂量依赖性抑制TRABD2A的抗HIV-1活性,但不影响TRABD2A和病毒Gag转录水平。2.3金属蛋白酶TRABD2A抗HIV-1作用可被其阻断抗体限制。用TRABD2A抗体8B6、9E7、18B6分别处理离心感染HIV-1NL4-3离心感染的静息CD4+T细胞。结果发现,TRABD2A阻断抗体8B6、18B6可上调HIV-1 Gag蛋白水平。2.4 TRABD2A在静息CD4+T细胞膜上降解Gag。通过纯化感染HIV-1静息CD4+T细胞膜的相关蛋白,并采用免疫共沉淀结合Gag蛋白。结果显示:TRABD2A能有效降解细胞膜上静息的CD4+T细胞中的HIV-1 Gag蛋白。2.5 TRABD2A能有效抑制HIV感染者体内CD4+T细胞中HIV-1子代的产生。从未治疗HIV感染者中分离PBMCs和CD4+T细胞,用TRABD2A抑制剂或其阻断抗体处理。结果显示:与未处理组相比,Ni2+、Co2+、1,10-phenanthroline和阻断性抗体8B6可增强PBMCs、CD4+T细胞HIV-1子代产生。2.6活化CD4+T细胞中过表达TRABD2A后显着抑制HIV-1子代的组装和产生。3.通过抑制金属蛋白酶TRABD2A活性可促进HIV-1在CD4+T细胞中的应用研究3.1仅当膜金属蛋白酶TRABD2A被抑制时,克服SAMHD1障碍可促进静息CD4+T细胞中HIV-1子代产生。使用Vpx降解静息CD4+T细胞中的SAMHD1使TRABD2A抑制剂和阻断抗体增加HIV子代的现象更加明显。3.2通过抑制膜金属蛋白酶TRABD2 A活性联合RNA干扰技术可筛选出静息CD4+T细胞中参与HIV-1复制的相关因子。通过抑制TRABD2A为识别静息CD4+T细胞中HIV-1复制相关的宿主细胞因子提供了一种有效方法。结论:1.金属蛋白酶TRABD2A主要表达在静息CD4+T细胞;在静息CD4+T细胞中TRABD2A与HIV-1 Gag相互作用;TRABD2A在HIV未治疗患者和健康人差异表达具有统计学意义、且与未治疗患者病毒载量呈负相关。TRABD2A在静息CD4+T细胞与HIV-1复制后期高度相关。2.金属蛋白酶TRABD2A在静息CD4+T细胞中限制HIV-1子代生成。TRABD2A通过靶向降解静CD4+T细胞质膜上的病毒Gag蛋白从而抑制HIV-1子代组装和生成。TRABD2A依赖其金属蛋白酶活性发挥抗HIV-1作用,Co2+、Ni2+、1,10-phenanthroline和TRABD2A阻断抗体可以抑制其活性,Mn2+通过增强TRABD2A蛋白酶活性而增强其抗HIV-1作用。3.通过抑制TRABD2A蛋白酶活性结合siRNA技术,可提供一种有效的方法来识别静息CD4+T细胞中HIV-1复制相关的宿主细胞因子;通过抑制TRABD2A活性可形成研究静息CD4+T细胞HIV-1复制的一项实验新技术。
郑立传[8]（2020）在《膀胱癌中Wnt信号通路异常对组蛋白乙酰化表达水平的影响》文中提出背景膀胱癌是男性第四大多发的恶性癌症,在全世界女性中位居第九位。膀胱内免疫或化疗和手术切除是治疗非肌层浸润性膀胱癌和局部晚期膀胱癌的常用方法,然而,这些膀胱癌容易复发进展并转移,大约有25%的患者,结局发展为肌层浸润性膀胱癌,因此这些患者会考虑根治性膀胱切除术来治疗。Wnt信号通路与膀胱癌的发生关系密切,乙酰化是表观遗传学的主要内容,其中组蛋白乙酰化又是表观遗传修饰的常见类型。膀胱癌是一种高度恶性的肿瘤,临床特征的差异、免疫表型都存在较大差别,从而影响肿瘤的复发与转移。膀胱癌的发生与Wnt信号通路异常关系密切,Kastritis等发现Wnt信号通路异常参与膀胱癌的发生,Hirata等发现β-catenin在膀胱癌中表达明显增加,β-catenin是经典Wnt信号通路中调控靶基因的关键蛋白。乙酰化是表观遗传学的主要内容,其中组蛋白乙酰化又是表观遗传修饰的常见类型,组蛋白乙酰化受两种酶的动态调控,一般是由组蛋白乙酰基转移酶以及组蛋白去乙酰基转移酶一同配合调控的,如果这两种酶失衡发生紊乱就会导致肿瘤的发生,组蛋白H3、H4赖氨酸残基N段乙酰化修饰是组蛋白修饰的主要方式。本实验重点观察Wntl、β-catenin、H3K9ac相对蛋白量的表达和mRNA的表达在膀胱肿瘤组织与正常癌旁组织中的表达,并分析组蛋白乙酰化表达量的高低与Wnt、β-catenin表达的相关性,探讨Wnt信号通路异常对组蛋白乙酰化表达程度水平的影响。Wnt信号通路异常在膀胱肿瘤的发生、发展中起重大作用,了解Wnt信号通路异常与组蛋白乙酰化的关系,为后续组蛋白乙酰化在膀胱癌中的深入研究做好实验基础。目的观察Wntl、β-catenin、H3K9ac在膀胱肿瘤组织与正常癌旁组织的表达,并分析组蛋白乙酰化表达量的高低与Wntl、β-catenin表达的相关性,探讨Wnt信号通路异常对组蛋白乙酰化表达水平的影响。方法收集来自我院泌尿外科膀胱肿瘤全切标本,分别取肿瘤组织与正常癌旁组织各32例,然后通过Western blot检测Wntl、β-catenin、H3K9ac相对蛋白量的表达;RT-qPCR检测Wntl、β-catenin、H3K9ac mRNA的表达量。统计学分析肿瘤组织与正常癌旁组织之间的差异;组蛋白乙酰化与Wnt、β-catenin表达量的相关性。结果1、Western Blot检测不同组别样本中Wntl、β-catenin、H3K9ac相对蛋白量的表达:结果显示,肿瘤组织与正常癌旁组织相比,Wnt1、β-catenin在肿瘤组织中高表达,差异有统计学意义（P<0.05）;H3K9ac在肿瘤组织中低表达,差异有统计学意义（P<0.05）。2、RT-qPCR检测不同组别样本中Wnt1、β-catenin及H3K9ac mRNA的表达:结果显示,肿瘤组织与正常癌旁组织相比,Wnt1、β-catenin mRNA在肿瘤组织中表达水平高,差异有统计学意义（P<0.05）;H3K9ac mRNA在肿瘤组织中表达水平低,差异有统计学意义（P<0.05）。3、Wnt1、β-catenin与H3K9ac蛋白表达量在肿瘤组织中的相关性检验:Wnt1与H3K9ac两变量的Pearson相关系数r=0.013,P=0.943,经检验相关系数无统计学意义（P>0.05）;H3K9ac与β-catenin两变量的Pearson相关系数r=0.123,P=0.501,经检验相关系数无统计学意义（P>0.05）。4、Wnt1、β-catenin与H3K9ac mRNA表达量在肿瘤组织中的相关性检验:Wnt1与H3K9ac两变量的Pearson相关系数r=0.088,P=0.634,经检验相关系数无统计学意义（P>0.05）;H3K9ac与β-catenin两变量的Pearson相关系数r=0.172,P=0.348,经检验相关系数无统计学意义（P>0.05）。结论Wnt1、β-catenin在膀胱肿瘤组织中高表达,H3K9ac低表达;组蛋白乙酰化与Wnt、β-catenin的表达量没有相关性,膀胱癌的发生发展可能与组蛋白乙酰化修饰水平降低相关。乙酰化组蛋白的低表达参与膀胱癌的发生与发展,但与Wnt信号通路的异常并没有相关性;Wnt信号通路的异常可能通过调节其他表观遗传学的内容影响肿瘤的发生发展,在膀胱癌中,乙酰化的组蛋白可能由其他信号通路的分子进行调控,乙酰化组蛋白新的通路发现以及如何减低乙酰化的组蛋白,可能为膀胱癌的治疗及患者的预后提供新思路。
董德[9]（2019）在《人源TCR-CD3复合物结构与组装机制研究》文中研究表明T细胞是人体适应性免疫系统中的重要组成部分,在病原体感染、恶性肿瘤以及自身免疫疾病中扮演着关键性作用。T细胞受体TCR是表达于T细胞表面的抗原受体,通过识别结合有抗原肽的组织相容性复合物p MHC来启动T细胞介导的免疫应答。但是TCR本身不具备信号传导的功能,而是通过其共受体CD3信号分子进行下游的信号传递,TCR与CD3共受体之间通过非共价连接形成TCR-CD3复合物。TCR-CD3复合物中包括抗原识别受体TCRαβ二聚体以及由CD3γε、CD3δε、CD3ζζ二聚体组成的CD3信号分子。TCR在识别并结合特定p MHC后能够引起TCR信号通路的激活,经过一系列的信号传导引起激活蛋白1（AP-1）,核转录因子κB（NF-κB）以及T细胞激活核因子（NFAT）等转录因子表达的上升。这些信号传递最终可以引起T细胞激活、增殖、产生细胞因子以及对感染了病原体的细胞进行杀伤。在近二十年中,提出了多种TCR-CD3信号的激活模型,但是其具体的激活机制并不清楚。同时有大量关于TCR-CD3复合物胞外区域的结构研究,但是TCR-CD3复合物整体是如何进行组装,复合物中各个亚基的化学计量比以及信号传递过程中是否发生了构象的变化等关键问题仍未得到解决。本研究中首先解决了TCR-CD3复合物难以表达、纯化得到均一稳定的复合物等难题,从人源c DNA文库中扩增得到组成TCR-CD3复合物的6个亚基全长基因序列,TCRα、β亚基之间通过E2A短肽连接并克隆至p CAG载体,CD3共受体的各个亚基通过P2A短肽连接并克隆至pc DNA3.4载体。利用哺乳动物细胞表达体系对组成TCR-CD3复合物的6种亚基进行共表达,筛选得到表达量高且具有生物活性的TCR-CD3复合物,利用链霉亲和素标签进行蛋白纯化,使用免疫印迹实验对各个亚基进行验证。通过化学交联剂戊二醛对TCR-CD3复合物进行交联,负染样品观察结果显示戊二醛交联后的TCR-CD3复合物颗粒大小均一,而未交联的TCR-CD3复合物的颗粒不均一,说明该复合物发生了解聚。戊二醛交联对于TCR-CD3复合物的热稳定性以及结合特异抗体的亲和力未产生影响,意味着戊二醛交联后的TCR-CD3复合物构象未发生变化,所以使用戊二醛交联后的TCR-CD3复合物进行冷冻电镜数据的收集。本研究通过冷冻电镜技术解析了包括全部8个亚基的人源TCR-CD3复合物3.7?分辨率的三维结构。结构中包括TCR-CD3复合物完整的胞外区以及跨膜区,整体结构呈现冰淇淋甜筒形状。三维结构显示TCR-CD3复合物中各个亚基的化学计量比为TCRαβ:CD3γε:CD3δε:CD3ζζ=1:1:1:1。TCR-CD3复合物胞外区相互作用由各个亚基的恒定区以及连接短肽所介导,TCRαβ二聚体的恒定区同时与CD3γε、CD3δε二聚体存在相互作用,同时CD3δε、CD3γε二聚体之间也存在相互作用,胞外区整体呈现类似三次对称结构,TCRβ亚基处于中心位置。各个亚基近膜区的连接短肽之间形成二硫键,对于维持TCR-CD3复合物构象的稳定起到了重要作用。TCR-CD3复合物的跨膜区形成由8个跨膜螺旋组成的桶状结构,TCRαβ亚基的跨膜螺旋位于筒状结构的中心位置,各个跨膜螺旋之间通过大量的疏水作用以及静电相互作用形成稳定的结构,两条CD3ζ链的跨膜区分别与CD3δε、CD3γε的跨膜区相结合。通过将TCR-CD3复合物结构与p MHC-TCRαβ、OKT3-CD3γε复合物结构比对可以发现p MHC、OKT3同TCRCD3复合物的结合并未引起成明显的结构变化,并且二者所结合的位置完全不同,同时发现了OKT3与TCR-CD3复合物的潜在作用位点。综上所述,本研究通过解析TCR-CD3复合物的高分辨率三维结构,对TCRCD3复合物的组装机制有了深度的理解,并且对解释TCR与配体结合后如何启动免疫应答的分子机制提供了关键信息,对基于TCR-CD3复合物的免疫疗法开发提供了结构基础。
魏丽雯[10]（2019）在《肝癌特异性分子GPC3与Wnt3a的互作机制研究》文中指出肝癌是全球发病率第六,致死率第四的恶性癌症,目前缺乏有效的治疗手段。由于肝脏特有的代谢解毒功能,小分子化学药物应用于肝癌治疗通常效果不佳。因此,探索抗体等大分子蛋白药物和免疫细胞疗法并应用于肝癌临床治疗具有重要意义。90%以上的肝细胞癌病人中存在Wnt信号通路的病理性激活。多种Wnt共受体在Wnt信号的激活过程中发挥了重要的调控作用。因此,靶向肿瘤特异性的Wnt共受体也是阻断Wnt信号通路的可行性手段。Glypican-3（GPC3）是肝细胞癌特异性表达的细胞膜表面分子。GPC3作为Wnt的共受体,在调控肝细胞癌发展过程中起到重要作用。GPC3能够在细胞膜表面招募并富集Wnt,促进肝癌的增殖。靶向GPC3能阻断Wnt信号活化、抑制肝癌增殖。然而,GPC3与Wnt的互作方式、以及GPC3与Wnt/FZD复合物协同作用起始Wnt信号激活的分子机制尚未明确,制约了靶向GPC3的肝癌治疗策略的开发。GPC家族的蛋白结构保守,根据已知的GPC1结构能够建立可信度较高的GPC3蛋白质结构模型。并且,Wnt/FZD-CRD复合物的蛋白质结构已经解析。上述结构信息为我们深入了解GPC3与Wnt互作的分子机制提供了重要的结构依据。我们前期的工作发现,GPC3结构模型中存在一个类似FZD-CRD的结构域,可能是GPC3与Wnt相互作用的关键区域。我们以此作为研究的切入点,旨在利用结构生物学,分子生物学等手段,对GPC3与Wnt的互作机制进行探究。本课题得到的主要研究结果如下:1.GPC3通过能够与Wnt分子上的保守结构域结合,促进Wnt信号活化。2.分别建立了人源GPC3和Wnt3a的结构模型;发现在GPC3的N端存在一个富含半胱氨酸的区域（cysteine-rich domain,CRD）,该结构域与FZD-CRD类似,可能介导了GPC3与Wnt的相互作用。3.通过蛋白疏水性分析,预测得到了GPC3-CRD上两个潜在的Wnt结合位点（site1和site2）。将site1和site2区域的关键氨基酸进行点突变,发现site2对于GPC3与Wnt的结合以及Wnt信号活化至关重要。4.使用CRISPR-Cas9技术构建了内源性GPC3敲除的Hep3B细胞系,在此基础上使用慢病毒转染技术分别构建了GPC3和GPC3 site2突变回转细胞系。利用这些HCC细胞系,我们发现,GPC3 site2突变能够抑制HCC细胞的Wnt信号激活延缓小鼠体内肿瘤增殖并且延长小鼠的生存期。5.利用GPC3的单域抗体HN3特异性封闭GPC3的site2区域能够有效地阻断Wnt信号激活。综上,我们通过结构分析和功能评估鉴定出了GPC3上Wnt3a分子的结合区域,该区域在体外介导了Wnt活化并能调节小鼠中的HCC肿瘤生长,利用抗体特异性封闭该区域能够抑制Wnt信号的激活。研究结果揭示了GPC3的核心蛋白作为Wnt共受体激活Wnt信号、调控肝细胞癌增殖的新机制。上述发现将有助于我们进一步了解GPC3的生物学功能,为精确阻断GPC3的关键功能区域、设计高效的靶向药物提供药物靶点和设计依据,对于我们理解肝癌发生机制,推动肝癌临床治疗具有重要的理论及临床转化价值。
二、共受体信号传导与HIV（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、共受体信号传导与HIV（论文提纲范文）
（1）嵌合抗原受体T细胞疗法的优化策略研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分:IL-21增强T细胞的慢病毒转染和CAR-T细胞的抗肿瘤杀伤作用研究 |
| 第一节 IL-21 增强T细胞的慢病毒转染 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二节 IL-21 增强CAR-T细胞的抗肿瘤杀伤 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分:CD4/CD8 独特的半胱氨酸结构域增强CAR-T细胞的抗肿瘤杀伤 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 嵌合抗原受体 T 细胞在实体肿瘤免疫治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间发表的论文和参与的科研项目 |
（2）多肽激素RGF1及其受体RGI1通过MAPK信号途径调控拟南芥根分生组织的发育（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 拟南芥根的发育 |
| 1.1.1 拟南芥根尖的结构 |
| 1.1.2 拟南芥根尖分生组织的调控 |
| 1.2 植物类受体激酶 |
| 1.2.1 拟南芥类受体激酶的结构 |
| 1.2.2 类受体激酶参与植物根的发育 |
| 1.2.3 SERKs和 CIKs常作为共受体参与众多生物学过程 |
| 1.3 MAPK级联反应 |
| 1.3.1 MAPK的组成 |
| 1.3.2 RLKs-MAPK介导的拟南芥生长发育过程 |
| 1.4 本研究的意义 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 相关载体 |
| 2.1.3 相关菌种 |
| 2.1.4 试剂及仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 植物培育 |
| 2.2.2 培养基的配制 |
| 2.2.3 感受态细胞的制备 |
| 2.2.4 Gateway体外重组技术克隆以及构建表达载体 |
| 2.2.5 基因点突变形式的构建 |
| 2.2.6 浸花法转化拟南芥 |
| 2.2.7 转基因植物筛选及鉴定 |
| 2.2.8 拟南芥总蛋白质粗提法 |
| 2.2.9 Western Blot检测蛋白质 |
| 2.2.10 拟南芥DNA简易提取法 |
| 2.2.11 突变体基因型鉴定 |
| 2.2.12 拟南芥遗传杂交构建高阶突变体 |
| 2.2.13 质谱鉴定RGI1互作蛋白 |
| 2.2.14 RNA的提取与逆转录 |
| 2.2.15 共聚焦显微镜观察根尖 |
| 2.2.16 MAPK激活实验 |
| 2.2.17 GUS染色实验 |
| 2.2.18 Clontech酵母双杂交实验 |
| 2.2.19 荧光双分子互补实验 |
| 2.2.20 体外Pull-Down实验 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 蛋白组学分析RGI1复合体中的蛋白 |
| 3.2 MKK4和MKK5在RGIs的下游调控根分生组织发育 |
| 3.2.1 MKK4~(DD)/MKK5~(DD)部分恢复rgis根缺陷表型 |
| 3.2.2 MKK4~(DD)或MKK5~(DD)能够增强MPK3和MPK6 的磷酸化水平 |
| 3.2.3 MKK4~(DD)/MKK5~(DD)部分恢复rgis根缺陷表型是特异的 |
| 3.2.4 mkk4 mkk5 根尖分生组织发育缺陷并对RGF1 敏感性降低 |
| 3.3 MKK4/MKK5与RGIs处于同一通路调控根尖分生区发育 |
| 3.4 MPK3和MPK6在RGIs-MKK4/MKK5 的下游调控根分生组织发育 |
| 3.4.1 mpk6对RGF1 敏感性降低 |
| 3.4.2 mpk3 mpk6 根尖分生组织发育缺陷并对RGF1 敏感性降低 |
| 3.5 YDA在 RGIs的下游调控根分生组织发育 |
| 3.5.1 持续激活型YDA可以部分恢复rgis根缺陷表型 |
| 3.5.2 yda-Y295 根尖分生组织发育缺陷并对RGF1 敏感性降低 |
| 3.6 RGF1 可以诱导MPK3/MPK6 磷酸化 |
| 3.7 RGIs与 MAPK成员在根尖表达模式相似 |
| 3.8 YDA,MKK4/5和MPK3/6 调控PLT1/2 的表达 |
| 3.8.1 MKK4/5和MPK3/6 调控PLT1和PLT2 的转录水平 |
| 3.8.2 MKK4/5和MPK3/6 调控PLT1和PLT2 的蛋白水平 |
| 3.8.3 p RGI1::YDA-CA能部分恢复rgi1/2/3/4/5中PLT1和PLT2 的表达. |
| 3.9 MPK3/6与PLT1/2 存在相互作用 |
| 3.10 RGF1信号通路调控拟南芥根分生组织发育分子模型 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 4.1 RGIs下游完整的MAPK级联信号调控根分生组织发育 |
| 4.1.1 RGI1 启动子较弱导致未能更好的恢复rgis突变体根缺陷表型 |
| 4.1.2 mkk4 mkk5 TILLING突变体中信号并非完全阻断 |
| 4.1.3 MPK3与MPK6 功能冗余且MPK6 在此信号通路中作用更大 |
| 4.1.4 未磺酸化修饰的多肽还有较低的活性 |
| 4.1.5 在此通路研究中NA-PP1对MPK3SR/MPK6SR的抑制是特异的 |
| 4.2 RGF1信号通路的信号强度 |
| 4.3 MPK3/MPK6 级联在不同的生物学过程中的信号特异性 |
| 4.4 MPK3/MPK6对PLT1和PLT2 的调控方式 |
| 4.5 展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）CXCR4在EBV相关胃癌中的表达和调控作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.1.3 常用试剂配制 |
| 1.2 细胞系及胃癌组织标本的选择 |
| 1.2.1 细胞系的选择 |
| 1.2.2 胃癌组织标本的选择 |
| 1.3 细胞处理 |
| 1.3.1 实验前准备 |
| 1.3.2 细胞复苏 |
| 1.3.3 培养液的更换 |
| 1.3.4 细胞传代 |
| 1.4 CXCR4 及相关基因m RNA检测 |
| 1.4.1 细胞系RNA提取 |
| 1.4.2 cDNA合成 |
| 1.4.3 实时荧光定量PCR(Real-time qPCR) |
| 1.4.4 microRNA逆转录 |
| 1.4.5 microRNA表达水平检测 |
| 1.4.6 Real-time qPCR结果数据分析 |
| 1.5 CXCR4及相关蛋白检测 |
| 1.5.1 细胞系总蛋白的提取 |
| 1.5.2 蛋白浓度的测量 |
| 1.5.3 Western blott 检测细胞系中蛋白的表达 |
| 1.5.4 PI3K通路抑制剂LY294002作用后检测蛋白表达变化 |
| 1.5.5 免疫组织化学染色(SP法)检测胃癌组织中CXCR4 蛋白的表达 |
| 1.5.6 免疫荧光检测胃癌细胞中蛋白亚定位 |
| 1.6 CXCR4甲基化状态检测 |
| 1.6.1 细胞系DNA提取 |
| 1.6.2 DNA样本的焦亚硫酸盐修饰 |
| 1.6.3 亚硫酸盐基因组测序 |
| 1.7 细胞转染 |
| 1.7.1 LMP1 和 LMP2A 过表达细胞模型的建立 |
| 1.7.2 siRNA转染 |
| 1.8 细胞生物学表型实验的检测 |
| 1.8.1 细胞凋亡实验 |
| 1.8.2 细胞周期实验检测 |
| 1.9 细胞自噬的检测 |
| 1.9.1 透射电镜检测自噬体的形成 |
| 1.9.2 共聚焦显微镜检测自噬体的形成 |
| 1.10 统计学和图像分析 |
| 结果 |
| 2.1 GSE51575 数据集中CXCR4 的转录表达 |
| 2.2 胃癌细胞系中CXCR4及相关基因的转录表达 |
| 2.3 胃癌细胞系及组织中 CXCR4 蛋白表达 |
| 2.4 CXCR4 启动子和第 1 外显子甲基化状态检测结果 |
| 2.5 LMP1对CXCR4 表达的调控作用 |
| 2.6 EBV相关胃癌细胞中microRNA-146a的转录表达 |
| 2.7 microRNA-146a潜在靶基因的预测 |
| 2.8 microRNA-146a对 CXCR4 表达的调控作用 |
| 2.9 AGS 和 AGS-EBV 细胞系中 PI3K/AKT 表达 |
| 2.10 LY294002 通路抑制剂作用后CXCR4 蛋白表达变化 |
| 2.11 LMP2A对 CXCR4 表达的调控作用 |
| 2.12 CXCR4蛋白对细胞自噬的调控作用 |
| 2.13 CXCR4对细胞凋亡和周期的影响 |
| 2.14 CXCR4 和自噬在EBV潜伏期的作用 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 附录或缩略词表 |
| 致谢 |
（4）基因沉默Neuropilin-1对胃癌HGC-27细胞侵袭、转移及上皮间质转化的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 研究方案 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 相关材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 统计学处理 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 TGF-β1 诱导胃癌HGC-27 细胞EMT模型 |
| 1.2.2 NRP1 在胃癌HGC-27 细胞系中的表达及沉默 |
| 1.2.3 基因沉默NRP1 后可以抑制胃癌HGC-27 细胞的迁移和侵袭 |
| 1.2.4 沉默NRP1 可以抑制TGF-β1 诱导胃癌HGC-27 细胞EMT后细胞的迁移、侵袭和逆转EMT过程 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第2章 综述 Neuropilins在肿瘤中的多功能作用机制 |
| 2.1 NRPs的特性及对肿瘤的影响 |
| 2.2 TGF-β1信号通路在肿瘤中的作用机制 |
| 2.3 NRP在肿瘤EMT过程中的作用机制 |
| 2.4 NRP/CSC在肿瘤中的关系 |
| 2.5 NRP在癌症治疗中的意义 |
| 2.6 展望与前景 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（5）LncRNA NKILA通过抑制NF-κB信号传导调节HIV-1复制及潜伏（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 人类免疫缺陷病毒及抗病毒因子 |
| 1.1.1 HIV简介 |
| 1.1.2 抗病毒因子及其与HIV-1 的相互作用 |
| 1.2 NF-κB简介及其在HIV-1 生命周期中的作用 |
| 1.3 长链非编码RNA及其抗HIV-1 病毒作用 |
| 1.3.1 长链非编码RNA及其与HIV的相互作用 |
| 1.3.2 LncRNA NKILA及其研究现状 |
| 1.4 创新点 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 仪器、材料与试剂 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要试剂与材料 |
| 2.1.3 质粒与细胞系 |
| 2.1.4 引物合成与质粒测序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒构建 |
| 2.2.2 细胞复苏、细胞传代及细胞转染 |
| 2.2.3 短干扰RNA(siRNA)的化学合成 |
| 2.2.4 PBMC分离及CD4+T 细胞分离 |
| 2.2.5 RNA提取与实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 HIV-1 的产生,感染及检测 |
| 2.2.7 核质分离 |
| 2.2.8 Western Blot实验 |
| 2.2.9 荧光素酶报告系统实验 |
| 2.2.10 Ch IP-qPCR |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 NKILA有效地抑制了HIV-1 病毒复制 |
| 3.1.1 过表达NKILA对 HIV-1 复制具有显着的抑制作用 |
| 3.1.2 敲低NKILA促进了HIV-1 复制 |
| 3.1.3 NKILA对 HIV-1 的抑制作用于PMEPA1 无关 |
| 3.1.4 过表达NKILA能有效抑制HIV-1对T细胞的感染 |
| 3.1.5 敲低NKILA促进了HIV-1对T细胞的感染 |
| 3.2 NKILA通过抑制HIV-1 LTR活性抑制HIV-1 转录起始和延伸 |
| 3.2.1 NKILA对 NF-κB活性具有抑制作用 |
| 3.2.2 NKILA显着抑制HIV-1 的转录起始和延伸 |
| 3.2.3 过表达NKILA显着抑制HIV-1 LTR活性并具有广谱性 |
| 3.2.4 敲低NKILA会增加LTR驱动的基因表达 |
| 3.3 NKILA对 HIV-1 的抑制作用需要HIV-1 LTR的 NF-κB位点 |
| 3.4 NKILA干扰NF-κB的功能区对HIV-1 的限制作用是必须的 |
| 3.5 NKILA能抑制不同HIV-1 亚型的复制 |
| 3.5.1 过表达NKILA抑制了不同亚型HIV-1 毒株的复制 |
| 3.5.2 NKILA突变体失去了对不同亚型HIV-1 病毒的抑制能力 |
| 3.6 HIV-1 复制能够下调NKILA的表达 |
| 3.6.1 NKILA的表达与HIV-1 感染和复制呈负相关 |
| 3.6.2 不同亚型的HIV-1 病毒均可引起NKILA表达下调 |
| 3.6.3 HIV-1 潜伏细胞系中NKILA表达量高于急性感染HIV-1 的细胞 |
| 3.7 NKILA与 HIV-1 激活负相关 |
| 3.7.1 NKILA与 HIV-1 激活呈负相关 |
| 3.7.2 NKILA有助于维持HIV-1 潜伏期 |
| 3.7.3 在临床中NKILA与治疗前呈负相关 |
| 3.8 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）哺乳动物病毒受体的进化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1 病毒入侵 |
| 1.1 病毒受体 |
| 1.2 病毒入侵机制 |
| 2 病毒与宿主进化 |
| 2.1 进化军备竞赛 |
| 2.2 病毒-宿主军备竞赛研究进展 |
| 3 正选择检测 |
| 4 群体遗传学分析 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第2章 病毒受体基因在灵长类的进化研究 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 灵长类基因组的获取 |
| 1.2 病毒受体信息收集 |
| 1.3 病毒受体基因GO富集分析 |
| 1.4 病毒受体基因同源序列识别 |
| 1.5 病毒受体基因的进化分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒受体基因信息 |
| 2.2 病毒受体GO富集分析 |
| 2.3 病毒受体选择压力分析 |
| 2.4 病毒与受体互作界面的正选择位点 |
| 3 讨论 |
| 第3章 病毒受体基因与对照基因进化的比较研究 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 病毒受体对照基因的选取 |
| 1.2 统计学检验 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒受体与对照基进化的对比研究 |
| 2.2 病毒受体与对照基GO富集的对比研究 |
| 2.3 病毒受体间的进化的对比研究 |
| 3 讨论 |
| 第4章 病毒受体基因在人群中的进化研究 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 人类群体遗传变异数据提取 |
| 1.2 中性检验 |
| 1.3 单倍型纯合度检验 |
| 1.4 群体差异分析 |
| 1.5 受体基因疾病关联 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒受体的群体遗传分析 |
| 2.2 病毒受体疾病关联 |
| 3 讨论 |
| 第5章 总结 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
| 附录A |
（7）金属蛋白酶TRABD2A限制HIV-1在静息CD4+T细胞复制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分: 宿主因子TRABD2A膜金属蛋白酶在静息CD4~+T细胞中的鉴别发现 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 感染性克隆的制备 |
| 2.3.2 HIV-1_(NL4-3)离心感染静息CD4~+T细胞 |
| 2.3.3 静息CD4~+T细胞Myc-Gag质粒的电转 |
| 2.3.4 HIV-1 Pr55-Gag在静息CD4~+T细胞中免疫共沉淀 |
| 2.3.5 细胞的分离和培养 |
| 2.3.6 RNA提取 |
| 2.3.7 qPCR |
| 2.3.8 HIV感染者病毒载量检测 |
| 2.3.9 免疫荧光检测TRABD2A在静息CD4~+T细胞中的表达 |
| 2.3.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 TRABD2A与HIV-1 Gag蛋白在静息CD4~+T细胞中相互作用 |
| 3.2 金属蛋白酶TRABD2A主要表达在静息CD4~+T细胞 |
| 3.3 TRABD2A主要分布在静息CD4~+T细胞膜且随细胞激活而减少 |
| 3.4 健康献血者与HIV感染者PBMCs、CD4~+T细胞中TRABD2A含量不同 |
| 3.5 TRABD2A含量与未治疗HIV感染者病毒载量呈反比 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分: TRABD2A对静息CD4~+T细胞HIV-1复制影响以及机制探索 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 静息CD4~+T细胞TRABD2A siRNA的电转 |
| 2.3.2 ELISA检测子代病毒 |
| 2.3.3 Luciferase报告基因的检测 |
| 2.3.4 TRABD2A单克隆阻断抗体的制备及筛选 |
| 2.3.5 TRABD2A抗体对HIV-1影响的荧光免疫 |
| 2.3.6 静息CD4~+T细胞内p24的流式检测 |
| 2.3.7 静息CD4~+T细胞活化、增殖影响的流式检测 |
| 2.3.8 静息CD4~+T细胞膜相关蛋白的分离和提取 |
| 2.3.9 免疫印迹检测细胞相关蛋白 |
| 2.3.10 HIV患者CD4~+T细胞产生子代的测定 |
| 2.3.11 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 TRABD2A在静息CD4~+T细胞中限制HIV-1子代生成 |
| 3.2 Ni~(2+),Co~(2+),1,10-phenanthroline通过抑制TRABD2A酶活性促进静息CD4~+T细胞HIV-1子代产生 |
| 3.3 TRABD2A抗HIV-1作用可被其阻断抗体限制 |
| 3.4 TRABD2A在静息CD4~+T细胞膜上降解Gag |
| 3.5 TRABD2A限制感染者体内CD4~+T细胞中HIV-1子代病毒的产生 |
| 3.6 TRABD2A抗HIV-1的机制 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分: 抑制膜金属蛋白酶TRABD2A活性可促进HIV-1在静息CD4~+T细胞中的应用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 VLP-Vpx的制备 |
| 2.3.2 VLP-Vpx处理并感染静息CD4~+T细胞 |
| 2.3.3 金属离子或1,10-处理HIV-1NL4-3感染的静息CD4~+T细胞及流式检测 |
| 2.3.4 感染HIV-1NL4-3的静息CD4~+T细胞中电转筛选因子siRNA |
| 2.3.5 静息CD4~+T细胞子代的ELISA检测 |
| 2.3.6 静息CD4~+T细胞子代感染力的检测 |
| 2.3.7 静息CD4~+T细胞RNA的提取 |
| 2.3.8 逆转录 |
| 2.3.9 qPCR |
| 2.3.10 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 仅TRABD2A蛋白酶被抑制时,克服SAMHD1限制可促进静息CD4~+T细胞中HIV-1子代产生 |
| 3.2 通过RNA-Seq评估筛选因子在静息CD4~+T细胞中表达情况 |
| 3.3 通过抑制膜金属蛋白酶TRABD2A联合RNA干扰技术筛选参与静息CD4~+T细胞HIV-1复制的相关因子 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附录 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）膀胱癌中Wnt信号通路异常对组蛋白乙酰化表达水平的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Wnt信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）人源TCR-CD3复合物结构与组装机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究的目的和意义 |
| 1.2 适应性免疫系统概述 |
| 1.2.1 适应性免疫系统 |
| 1.2.2 T细胞发育过程 |
| 1.2.3 TCR的基因重排 |
| 1.3 T细胞受体与CD3信号分子的组装机制 |
| 1.3.1 TCRαβ二聚体与CD3 复合物的结构 |
| 1.3.2 TCR-CD3复合物的化学计量比 |
| 1.3.3 指导TCR-CD3复合物组装的机制 |
| 1.3.4 TCR-CD3复合物组装、运输和降解之间的协调互作 |
| 1.4 TCR-CD3信号传导方式 |
| 1.4.1 MHC的结构信息 |
| 1.4.2 抗原识别机制 |
| 1.4.3 TCR信号触发模型 |
| 1.4.4 TCR信号胞内传递机制 |
| 1.5 本文主要研究内容以及技术路线 |
| 1.5.1 本文主要研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验化学药品与试剂配制 |
| 2.1.2 实验仪器与软件程序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的基因表达载体构建 |
| 2.2.2 TCR-CD3复合物的表达 |
| 2.2.3 TCR-CD3复合物的纯化 |
| 2.2.4 生物分子间相互作用分析 |
| 2.2.5 蛋白质热稳定性分析 |
| 2.2.6 负染样品的制备与观察 |
| 2.2.7 冷冻电镜数据收集 |
| 第3章 TCR-CD3复合物的表达与纯化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 TCR-CD3复合物的克隆与表达 |
| 3.3 TCR-CD3复合物的纯化 |
| 3.4 TCR-CD3复合物的化学交联 |
| 3.5 TCR-CD3复合物热稳定性检测 |
| 3.6 TCR-CD3复合物与相关抗体亲和力测定 |
| 3.7 本章小结 |
| 第4章 TCR-CD3复合物的电镜数据处理与结构解析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 TCR-CD3复合物负染样品的观察 |
| 4.3 TCR-CD3复合物冷冻电镜观察与数据收集处理 |
| 4.3.1 TCR-CD3复合物冷冻样品的检查 |
| 4.3.2 TCR-CD3复合物冷冻样品数据收集与处理 |
| 4.4 模型搭建以及结构修正 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 TCR-CD3复合物的三维结构 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 TCR-CD3复合物的整体结构 |
| 5.3 TCRαβ 与 CD3 各个亚基的结构 |
| 5.3.1 TCRαβ二聚体的结构 |
| 5.3.2 CD3各亚基之间的相互作用 |
| 5.4 TCR-CD3复合物胞外组装机制 |
| 5.5 TCR-CD3复合物膜内组装机制 |
| 5.6 TCR-CD3复合物与配体结合后的结构比对 |
| 5.7 TCR-CD3复合物结构分析 |
| 5.8 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）肝癌特异性分子GPC3与Wnt3a的互作机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 肝癌的治疗现状 |
| 1.3 肝癌特异性分子GPC3 的研究进展 |
| 1.4 Wnt信号通路与癌症 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 引物序列 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.1.5 主要化学药品、生物试剂及试剂盒 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分子实验 |
| 2.2.1.1 表达载体的构建 |
| 2.2.1.2 点突变质粒的构建 |
| 2.2.1.3 目的基因RNA表达水平检测 |
| 2.2.1.4 敲除(Knockout)质粒的构建 |
| 2.2.1.5 ELISA |
| 2.2.1.6 SDS-PAGE凝胶电泳及考马斯染色 |
| 2.2.1.7 Western Blotting |
| 2.2.1.8 CO-IP |
| 2.2.1.9 双荧光素酶基因表达检测 |
| 2.2.1.10 蛋白纯化 |
| 2.2.2 细胞实验 |
| 2.2.2.1 细胞传代 |
| 2.2.2.2 细胞冻存及复苏 |
| 2.2.2.3 细胞转染 |
| 2.2.2.4 稳转细胞系的构建 |
| 2.2.2.5 敲除细胞系的构建 |
| 2.2.2.6 流式细胞术 |
| 2.2.2.7 流式细胞分选 |
| 2.2.3 动物实验 |
| 2.2.3.1 裸鼠成瘤 |
| 2.2.3.2 免疫组化 |
| 2.2.4 数据收集及处理 |
| 2.2.4.1 数据下载 |
| 2.2.4.2 软件使用 |
| 2.2.4.3 分析方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 GPC3 能与Wnt蛋白互作并促进Wnt信号激活 |
| 3.2 GPC3与Wnt3a结构模型的建立及分析 |
| 3.3 GPC3与Wnt3a结合位点的预测 |
| 3.4 GPC3与Wnt3a结合位点的鉴定 |
| 3.5 GPC3 site2 突变对HCC细胞Wnt信号激活有显着影响 |
| 3.6 GPC3 site2 突变对小鼠体内肿瘤增殖有显着影响 |
| 3.7 干预GPC3的Wnt3a结合位点能抑制Wnt信号激活 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ主要溶液的配置 |
| 附录 Ⅱ个人简历与成果 |
| 致谢 |
四、共受体信号传导与HIV（论文参考文献）
- [1]嵌合抗原受体T细胞疗法的优化策略研究[D]. 杜丽. 重庆医科大学, 2021(01)
- [2]多肽激素RGF1及其受体RGI1通过MAPK信号途径调控拟南芥根分生组织的发育[D]. 陆晓婷. 兰州大学, 2020(04)
- [3]CXCR4在EBV相关胃癌中的表达和调控作用研究[D]. 王维文. 青岛大学, 2020(01)
- [4]基因沉默Neuropilin-1对胃癌HGC-27细胞侵袭、转移及上皮间质转化的影响[D]. 刘想梅. 华北理工大学, 2020(02)
- [5]LncRNA NKILA通过抑制NF-κB信号传导调节HIV-1复制及潜伏[D]. 杨静. 吉林大学, 2020(08)
- [6]哺乳动物病毒受体的进化研究[D]. 王文强. 南京师范大学, 2020(03)
- [7]金属蛋白酶TRABD2A限制HIV-1在静息CD4+T细胞复制的研究[D]. 董晋秀. 中国医科大学, 2020
- [8]膀胱癌中Wnt信号通路异常对组蛋白乙酰化表达水平的影响[D]. 郑立传. 郑州大学, 2020(02)
- [9]人源TCR-CD3复合物结构与组装机制研究[D]. 董德. 哈尔滨工业大学, 2019
- [10]肝癌特异性分子GPC3与Wnt3a的互作机制研究[D]. 魏丽雯. 华中农业大学, 2019(02)