一、哺乳动物细胞去核过程及分离的胞质体和核体的电镜观察（论文文献综述）
迟大明[1]（2017）在《自噬对猪克隆早期胚胎中供体线粒体清除及重编程的影响初探》文中指出自噬是真核细胞内广泛存在的基本机制之一,它通过降解非必须蛋白以及功能障碍的细胞组分、满足细胞自身的代谢需求并实现细胞器的更新。已有研究表明自噬在线粒体清除以及细胞重编程方面发挥重要作用。而克隆胚恰恰由于其高发的线粒体功能障碍以及核不完全重编程而常常表现出发育异常、效率低下等诸多问题。因此,本研究通过观察猪克隆胚中供体线粒体和自噬随胚胎发育的分布变化,并分析调节自噬对供体线粒体分布以及一些与胚胎发育相关基因表达的影响,初步探索自噬在猪克隆胚早期发育过程中对供体线粒体的清除以及供体核重编程的可能作用。1典型依赖于LC3的自噬不参与猪克隆胚中供体线粒体的清除核移植前染色标记供体细胞线粒体,随后观察不同时期克隆胚中供体线粒体的分布变化。定义电激活完成的时间为Oh,结果显示克隆胚中的供体线粒体随胚胎发育而逐渐由核周附近散布于胞质（4 h）。在2细胞（28 h）以及4细胞（52 h）阶段,供体线粒体在不同卵裂球中存在不均等分布的现象。统计表明2细胞阶段以All（卵裂球中都有）、Half（部分有）、No（都没有）三种形式存在供体线粒体的胚胎的比例分别为51.22%、26.83%以及21.95%。而在某些克隆囊胚（148 h）中仍可观察到少量供体线粒体的存在。与此同时自噬标志蛋白LC3的荧光染色结果表明,克隆胚中的自噬出现于4 h并绕核分布。电镜观察显示该时期的克隆胚比孤雌胚展现出更多的双膜自噬泡以及异常形态的线粒体。荧光强度分析的结果显示,2细胞克隆胚中LC3荧光最强,4细胞显着降低（P<0.05）,而孤雌胚中最强的LC3荧光则出现在4细胞阶段。Western blot结果也表明2细胞克隆胚中LC3-II/LC3-I>1细胞（4 h）克隆胚>1细胞（4h）孤雌胚。尽管可以观察到LC3与溶酶体染料间的共定位（4 h,28 h）,但在各时期胚胎中均没有观察到LC3与供体线粒体信号间的重叠。同时电镜样本中也没有看到典型线粒体自噬的结构。而在化学激活过程中添加3-MA抑制自噬,2细胞阶段（28 h）含有供体线粒体的重构胚比例也未发生明显变化。2胞质排出现象的观察及其对供体线粒体清除特异性的初探染色观察时偶然发现～87.93%的2细胞克隆胚的两个卵裂球之间有部分胞质排出,并且在某些胚胎排出的胞质中可以观察到供体线粒体的存在。尽管微丝抑制剂CB（细胞松弛素B）处理可以抑制胞质分裂和排出,但携带供体线粒体的胚胎比例并没有明显改变。另外,孤雌胚中同样存在胞质排出的现象,并且在这部分排出的胞质中也能观察到母源线粒体的存在。因此初步的实验表明这种排出对于克隆胚中供体线粒体的清除不具有特异性。3自噬参与母源mRNA的降解以及对表观修饰的调节qRT-PCR检测2细胞以及4细胞克隆胚和孤雌胚中与自噬和重编程相关的部分基因表达情况。结果显示与同时期的孤雌胚相比,2细胞克隆胚中母源Bmp15、Hlfoo以及Dppa3的表达水平更高（P<0.05或P<0.01）,4细胞时LC3、Sox2以及胚胎基因组活化的标志基因eIF1A则更低（P<0.05）。当2细胞克隆胚中LC3被siRNA成功敲减后（P<0.01）,母源 基因 Cyclin B、Bmp15、Gdf9、c-mos、H1foo 以及 Dppa3的表达显着增加,同时DNA甲基转移酶Dnmt1、Dnmt3b以及转录因子StSt3的表达也被明显影响（P<0.05）。而当4细胞阶段克隆胚中的自噬被诱导时,eIF1A和Stat3的表达显着升高（P<0.05）。综上所述,本研究发现克隆胚中供体线粒体在早期分裂期间存在不均等分布以及随胞质排出的现象,但这种排出不是供体线粒体清除的特异性机制。而经典的LC3依赖型自噬主要发生在克隆胚2细胞阶段,尽管不直接参与供体线粒体的清除,但它可以通过参与母源mRNA的降解以及调节DNA甲基转移酶的表达而影响胚胎基因组活化。我们的结果将有助于进一步了解克隆胚中供体线粒体的存在状态,并为探究自噬在猪克隆胚早期发育过程中的精确作用、理解早期胚胎发育机理以及改善克隆胚较低的成功率提供参考。
黄雅琼[2]（2008）在《猪体细胞核移植相关技术研究》文中认为1.探讨了猪卵母细胞体外成熟过程中减数分裂进程和卵母细胞的发育潜力。（1）不同直径卵泡内的卵母细胞的成熟进程及各时相出现的时间存在差异。直径＞2mm的卵泡内的卵母细胞体外培养16 h,大部分发生GVBD（germinal vesicle breakdown）;卵母细胞GV期的比率由0h的68.00%下降到16h的15.38%;成熟培养20h时,终变期（diakinesis,DK）的比率达到峰值（27.06%）,而MⅠ的峰值（69.69%）出现在培养后28h;成熟培养32～44h时,Ana-Ⅰ/Tel-Ⅰ期的比率达到最高（53.33%）;成熟培养48h时,MⅡ期的比率达到最大值（63.64%）。（2）不同直径卵泡的卵母细胞体外成熟后的孤雌发育能力不同。直径＜2mm、直径2～6mm、直径＞6mm的卵泡的卵母细胞的成熟率分别为5.12%,66.63%和46.72%;分裂率分别为1.42%,72.19%和58.54%;囊胚率分别为0、28.76%和23.13%。直径＜2mm和＞6mm卵泡内的卵母细胞的卵裂率明显低于直径2～6mm卵泡的卵母细胞的卵裂率（P＜0.05）。直径2～6mm卵泡内的卵母细胞体外成熟较快,体外发育潜能较高。2.探讨了激素和生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果发现,在成熟液中添加0.1μg/mL FSH的卵母细胞成熟率显着高于添加0.01IU/mL人绝经期促性腺激素（hMG）的卵母细胞成熟率（P＜0.05）,但两组间的分裂率和囊胚率差异不显着（P＞0.05）。猪卵母细胞分别在添加有0、10、30、50、70或90ng/mL表皮生长因子（EGF）的成熟液中成熟培养后进行孤雌激活,50ng/mL EGF组的成熟率达到66.89%,孤雌激活的分裂率达到84.90%,囊胚率达到30.20%,成熟率显着高于其余各组,分裂率和囊胚率高于对照组。在成熟液中添加10ng/mL胰岛素样生长因子（IGF-I）显着提高猪卵母细胞的第一极体排出率。在成熟液中同时添加50ng/mL EGF和10ng/mL IGF-I显着提高猪卵母细胞的孤雌发育能力（P＜0.05）。分别使用以TCM-199、NCSU-23（North Carolina State University-23,北卡大学胚胎培养液）和PZM-3为基础液的成熟液进行成熟培养猪卵母细胞,各组间在分裂率,成熟率和囊胚率方面差异不显着（P＞0.05）,表明均可用于猪卵母细胞的体外成熟和体外培养。3.系统探讨了孤雌激活方法对猪卵母细胞孤雌发育效果的影响。结果发现:（1）浓度为9%的乙醇（EH）激活处理10min效果好于15min;（2）用9%EH激活处理10min后,再用2μmol/L 6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）培养处理3～4h的卵母细胞分裂率及囊胚率分别为82.86%和22.86%,显着高于再用10μg/mL放线菌酮（CHX）+10mmol/L SrCL2(Sr2+)、10 mmol/L Sr2++2μmol/L 6-DMAP、10μ/mL CHX+2μmol/L6-DMAP或10μg/mL CHX+2μmol/L 6-DMAP+10 mmol/L Sr2+培养处理3～4h的卵母细胞。（3）比较几种激活方法（5μmol/L Ion激活处理5min,9%乙醇激活处理10min,50 v/mm和50μs的电脉冲2次）的猪卵母细胞孤雌激活效果发现,离子霉素（Ion）的猪卵母细胞孤雌激活效果最好,囊胚率达到37.50%。（4）卵母细胞周围的卵丘细胞层数对其成熟后的孤雌发育有显着影响,4～6层和6层以上卵丘-卵母细胞复合体成熟后的孤雌激活分裂率（68.99%和75.36%）和囊胚率（32.56%和37.68%）显着高于其它组（p＜0.05）。4.对猪卵丘细胞、胎儿成纤维细胞和睾丸间质细胞的分离和传代培养进行了系统研究。结果发现,猪卵丘细胞单层的生长需要5～6d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10～11d和8～9d。酶消化法和钢网过滤筛选法可获得猪睾丸间质细胞,猪睾丸间质细胞单层生长需要3～5d。猪胎儿成纤维细胞冷冻解冻后,复苏率为68.36%。通过培养和观察,猪胎儿成纤维细胞的生长形成有规则的生长曲线。5.对猪体细胞核移植的方法及影响因素进行了探索。（1）猪卵母细胞体外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h后,分别进行去核构建重构胚,结果发现,成熟44h和48h的卵母细胞核移植后的融合率（58.99%和56.51%）、卵裂率（67.52%和65.73%）和囊胚率（22.78%和15.96%）较高,其中卵龄为44h的分裂率与囊胚率显着高于卵龄为40h、36h、32h、28h的卵母细胞（P＜0.05）。卵龄为48h的融合率高于卵龄为52h的卵母细胞（P＜0.05）。（2）盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view系统去核法的去核率分别为76.33%,100.00%,98.40%,前者低于后两者（P＜0.05）;三种去核方法去核的卵母细胞核移植后,分裂率以Hoechest染色法较低（P＜0.05）,但融合率和囊胚率差异不显着（P＞0.05）。（3）不同注核方法（细胞质内注射法和透明带下注射法）的核移植效果研究结果显示,细胞质内注射和透明带下注射法的分裂率为（68.13%和60.37%）与囊胚率（6.44%和8.08%）差异均不显着（P＞0.05）。6.探讨了供体细胞种类及其培养处理方法对猪体细胞核移植效果的影响。（1）比较胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和卵丘细胞的核移植效果发现,胎儿成纤维细胞的融合率（64.74%）高于颗粒细胞（51.05%）和卵丘细胞（56.89%）,但三种细胞的卵裂率及囊胚率差异不显着（P＞0.05）。（2）不同代数的胎儿成纤维细胞的核移植效果的研究发现,6～9代的融合率显着高于3～5代和＞10代的成纤维细胞（P＞0.05）,但卵裂率和囊胚率差异不显着（P＞0.05）。（3）不同性别猪胎儿成纤维细胞核移植效果的研究发现:雄性胎儿成纤维细胞核移植的融合率和分裂率与雌性胎儿成纤维细胞相比差异不显着（P＞0.05）,但囊胚率显着低于雌性胎儿成纤维细胞（P＜0.05）。（4）100%长满汇合的胎儿成纤维细胞的核移植融合率高于70～80%汇合的胎儿成纤维细胞（P＜0.05）,分裂率高于血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞（P＜0.05）,但囊胚率差异不显着。（5）猪胎儿成纤维细胞冷冻解冻后的核移植分裂率和囊胚率均显着低于新鲜和4℃冷藏的细胞（P＜0.05）,虽然融合率无显着差异（P＞0.05）,表明猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植。（6）表面光滑的猪卵丘细胞做供体细胞的核移植后的分裂率和囊胚率均显着高于表面粗糙的猪卵丘细胞做供体细胞的核移植后的分裂率和囊胚率（P＜0.05）,虽然融合率差异不显着（P＞0.05）。（7）直径＜15μm的供体细胞核移植后的融合率显着低于直径＞30μm的供体细胞（P＜0.05）,直径20～3μm供体细胞核移植后的分裂率与囊胚率（63.73%和21.54%）较高。（8）组织块法和酶消化法分离得到的供体细胞所构建的重构胚在融合率、分裂率和囊胚率方面没有显着差异（P＞0.05）。
丁向彬[3]（2008）在《牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究》文中研究表明体细胞核移植的成功说明了高度分化的细胞仍具有支持发育的全能性,卵母细胞胞质中存在着将分化体细胞重编程至多能胚胎细胞状态的全部因子。但是,体细胞核移植的成功率却非常低,而且克隆动物存在不同程度的发育缺陷。目前普遍认为,体细胞核移植的低成功率以及发育异常和供体细胞核的不完全表观遗传重编程有关。DNA甲基化和组蛋白乙酰化是哺乳动物主要的表观遗传修饰形式,是调节基因组功能的重要手段,在胚胎的正常发育过程中具有显着的调控作用。本文对牛体外受精（IVF）胚胎和体细胞核移植（SCNT）胚胎附植前各个发育阶段的DNA甲基化和组蛋白乙酰化状态进行分析,找出体细胞克隆胚胎在基因组甲基化和组蛋白乙酰化水平上与IVF胚胎的差异,研究表观遗传状态对克隆胚体外发育能力的影响。1.研究卵母细胞成熟培养液中添加表皮生长因子（EGF）和胰岛素（Insulin）对其体外发育的影响,精子的不同处理方法对卵泡卵母细胞体外受精的影响以及细胞共培养系统对体外受精胚胎体外发育的影响。结果表明,成熟培养液中添加30 ng/mL EGF可以显着提高卵母细胞的成熟率和受精后的卵裂率;精子经上浮法处理后可以得到较高的卵裂率和囊胚发育率;输卵管上皮细胞共培养可以显着提高受精后的囊胚发育率,可以用于牛IVF胚胎的体外培养。2.探讨了不同激活方法对牛核移植胚胎激活效果和体外发育的影响,以及细胞共培养体系对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,5μmol/L离子霉素联合2mmol/L 6-DMAP激活牛核移植胚胎的效果比较好,可以得到较高的卵裂率和囊胚发育率;输卵管上皮细胞饲养层共培养可以显着提高重构胚的囊胚发育率,比较适合作为体细胞核移植胚胎发育的共培养体系。3.采用免疫荧光染色技术,对牛IVF胚胎和SCNT胚胎附植前各个发育阶段的DNA甲基化和组蛋白乙酰化状态进行检测,研究克隆胚胎在基因组甲基化和组蛋白乙酰化水平上与IVF胚胎的差异。结果表明,克隆胚胎各个发育阶段DNA甲基化水平均高于体外受精胚胎,其中2-细胞到桑椹胚阶段甲基化水平显着高于IVF胚胎,从头甲基化时间提前;克隆胚胎4-细胞到囊胚阶段乙酰化水平低于体外受精胚胎,其中8-细胞阶段乙酰化水平显着低于体外受精胚胎。与体外受精胚胎相比,牛核移植胚胎附植前各阶段存在异常的DNA甲基化和组蛋白乙酰化模式。4.用DNA甲基化酶抑制剂（5-aza-dC）处理牛供体细胞和克隆胚胎,探讨DNA甲基化水平变化与克隆胚胎体外发育之间的关系。结果表明,低浓度的5-aza-dC（20nM,72h）处理供体细胞或者重构胚不能显着提高克隆胚胎的体外发育率,对克隆胚的表观遗传状态没有明显影响;而供体细胞和重构胚均用低浓度5-aza-dC（20nM,72h）处理可以显着提高囊胚发育率和囊胚细胞数,2-细胞阶段DNA甲基化水平降低,8-细胞阶段的DNA甲基化水平显着降低且与IVF胚胎相比差异不再显着,但组蛋白乙酰化水平没有明显改变。说明克隆胚胎DNA甲基化水平影响其体外发育,降低2-细胞和8-细胞阶段的DNA甲基化水平可以提高克隆胚胎的体外发育能力。5.用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（TSA）处理牛供体细胞和克隆胚胎,探讨组蛋白乙酰化变化与克隆胚胎体外发育的关系。结果表明,供体细胞经50nM TSA处理12h可以显着提高克隆胚胎的囊胚发育率,而且2-细胞阶段的组蛋白乙酰化水平升高;TSA处理重构胚不能显着提高克隆胚胎的体外发育率,对重构胚的表观遗传状态没有显着影响;供体细胞和重构胚均用低浓度TSA（50nM,12h）处理可以显着提高克隆胚胎的囊胚发育率,8-细胞阶段的组蛋白乙酰化水平显着增加且与IVF胚胎相比差异不再显着,但TSA处理对DNA甲基化水平没有明显影响。说明克隆胚胎组蛋白乙酰化水平影响其体外发育,增加2-细胞和8-细胞阶段组蛋白乙酰化水平可以提高克隆胚胎的体外发育能力。6.联合应用5-aza-dC和TSA处理牛供体细胞和重构胚,研究两种试剂联合处理对重构胚发育的影响,以及对重构胚甲基化水平和乙酰化水平的影响。结果表明,5-aza-dC（20nM, 72h）联合TSA（50nM, 12h）处理供体细胞和重构胚可以更明显的提高克隆胚胎的体外发育能力,联合处理不但显着降低了2-细胞和8-细胞阶段DNA甲基化水平,而且显着增加了组蛋白的乙酰化水平,从而使克隆胚附植前各发育阶段的表观遗传状态更接近与体外受精胚胎。说明异常的DNA甲基化和组蛋白乙酰化模式不利于克隆胚的体外发育,消除这种异常可以提高克隆胚的体外发育能力。进一步的实验表明,5-aza-dC和TSA对核移植胚胎体外发育的影响没有供体细胞特异性。
万敏[4]（2008）在《手工核移植技术在牛体细胞克隆中的应用研究》文中进行了进一步梳理本试验以牛卵母细胞为实验材料,对脱羰秋水仙碱辅助牛卵母细胞去核的相关条件进行优化。在此基础之上进行了牛手工核移植（又称手工克隆）技术的相关工作,尝试无透明带核移植方法,WOWs培养体系等。目的在于建立适合本试验室条件的手工核移植体系,并优化该体系,为进一步简化牛核移植技术,降低实验成本完成基础性的工作。1.脱羰秋水仙碱（Deme）诱导牛卵母细胞显核。比较不同显核时间、Deme浓度以及极体形成等因素对牛卵母细胞显核的影响。结果显示:（1） 0.5μg/mL Deme处理卵母细胞,诱导1 h时获得最高显核率（76.00%）,高于0.5 h（61.18%）、1.5 h（64.10%）和2 h（63.46%）组;（2）不同浓度Deme处理成熟卵母细胞1 h,0.4μg/mL和0.5μg/mL Deme组显核率（分别为75.24%和77.31%）较高,显着高于0.3μg/mL组（46.54%）与0.6μg/mL（60.66%）组;（3）0.4μg/mL Deme处理卵母细胞1 h,有极体组显核率（83.24%）与无极体组（77.54%）无显着性差异。研究表明, 0.4μg/mL Deme处理卵母细胞1h能更好地诱导牛卵母细胞显核。2.分别以传统和手工两种方法对牛卵母细胞进行核移植。（1）比较两种核移植技术涉及的技术步骤及所需的时间;（2）比较盲吸法和脱羰秋水仙碱辅助去核法的去核率;（3）比较传统核移植与手工核移植重构胚的发育情况。结果表明:以100个牛卵母细胞为基准,手工核移植（263～360 min）比传统核移植所需的时间（345～450 min）至少短60 min。从去核的准确性来讲,脱羰秋水仙碱辅助去核法（98.57%）远高于盲吸法（63.21%）;从总体去核率来看,切割去核法（45.48%）仍高于盲吸法（33.00%）,但两者间无显着性差异。手工核移植的重构胚的卵裂率和囊胚发育率（78.79%和39.51%）均高于传统核移植组（72.00%和27.78%）,但二者间并无显着性差异。
苗婷婷[5]（2007）在《不同成熟因素对延边黄牛卵母细胞体外成熟及核移植后胚胎早期发育的影响》文中指出本实验将屠宰后延边黄牛的卵巢取回，用抽吸法回收卵母细胞，在不同条件下进行卵母细胞的体外成熟培养，然后对成熟卵母细胞进行核移植、融合、激活以及胚胎的体外培养。实验分别比较了在不同季节、不同的卵巢保存温度、不同的操作时间、成熟培养时间以及有无黄体和卵泡直径大小对牛卵母细胞体外成熟率、卵裂率、4-6C发育率和8-16C发育率的影响。得出的实验结果如下：1、分别在四个季度进行实验，我们可以看出：秋季的成熟率、卵裂率、及4-6C发育率均最高，与其它组之间存在显着差异。所以秋季的实验效果最好，是适宜延边黄牛体细胞克隆的最佳季节。2、卵巢保存温度为20-29℃组的成熟率为47.25％，卵裂率为40.82％；30-39℃组的成熟率为46.60％，卵裂率为44.63％；4-6C发育率分别是37.04％和45.00％。各项数据在两组间的差异均不显着。结果表明：运输时间在6h以内时，20-39℃间的卵巢保存温度对牛卵母细胞体外成熟率和核移植后早期胚胎发育率不存在显着差异。3、在实验三中我们将操作时间分为1h、2h、3h。其中，操作2h组的成熟率最高，为74.45％，显着高于1h（62.95％）组；三组的卵裂率分别是55.87％、55.16％和49.84％；4-6C发育率为42.86％、41.46％、35.85％；8-16C发育率分别是30.25％、24.39％和23.90％。三个处理组之间都没有显着差异。说明3h的操作时间可能对卵母细胞产生了不良影响，不利于牛卵母细胞的体外成熟，所以实验操作应尽量在2h内完成。4、将成熟时间分成18-20h、20-22h和22-24h三个时间段，三组的成熟率分别为69.33％、77.35％和81.52％，其中18-20h的成熟率最低，22-24h的成熟率最高；卵裂率与成熟率相反，最高的是18-20h组，53.38％，最低的是22-24h组，49.07％，差异均不显着；4-6C发育率为42.25％、43.64％、37.74％；8-16C发育率为16.90％、18.18％和26.42％，三组间都不存在差异。说明18-24h的成熟时间对牛卵母细胞体外成熟和核移植后早期胚胎发育的影响不大。5、根据卵巢表面的黄体将实验分为有黄体组（+）和无黄体组（-）。两组的成熟率为60.63％和62.75％，4-6C发育率为34.41％和37.23％，8-16C发育率为26.89％、17.52％，不存在显着差异；无黄体组的卵裂率（80.12％）高于有黄体组（58.86％），但没有显着差异。结果表明卵巢表面有无黄体对延边黄牛卵母细胞的体外成熟和核移植后胚胎的早期发育没有显着影响。6、根据卵巢表面卵泡的直径将实验分成三组：小于4mm组，4-6mm组和大于6mm组。三组的成熟率分别是60.74％、59.34％、69.17％，卵裂率为62.42％、71.11％、49.06％，4-6C发育率为36.56％、57.81％和53.85％，8-16C发育率为20.43％、21.88％和23.08％，各组数据间都没有显着差异，结果表明：卵泡直径对延边黄牛卵母细胞的体外成熟率和核移植后早期胚胎发育率的影响差异不显着。
田国富[6]（2007）在《牛HMC法体细胞克隆技术的研究》文中指出本研究主要是对手工克隆（HMC）法在牛体细胞核移植中应用的各个技术环节进行探讨尝试。研究发现，利用切割半卵法去核，徒手切割卵母细胞的存活率与机械切割的差异不显着（85.6％vs 90.3％，P＞0.05）。采用聚乙二醇（PEG）对两个半卵胞质体与供体细胞进行融合，50％的PEG的融合率与45％、55％和60％PEG的融合率差异显着（39.3％vs 0％，39.3％vs 16.7％，39.3％vs 5.3％，P＜0.01）。对半卵胞质体-半卵胞质体-供体细胞进行一次性电融合时，参数二（AC 3.0V，12μs；DC 100V，30μs×1）与参数一（AC 3.0V，12μs；DC 90V，30μs×1）的融合率差异不显着（63.4％vs 55.2％，P＞0.05）。对半卵胞质体-供体细胞，半卵胞质体（融有供体细胞）-半卵胞质体进行融合时，在交流电压的功率和施用时间（AC 3.0V，12μs）相同的情况下，适当提高直流电压（分别将2次融合的DC电压由60V和40V相应升高到70V和50V）可极显着地提高克隆胚胎的总融合效率（55.6％vs 73.2％，P＜0.01）。采用参数二电融合胚胎的囊胚率与采用50％的PEG融合胚胎的囊胚率差异显着（11.2％vs 0％，P＜0.01），而与两次融合法参数四的重构胚的囊胚率差异不显着（11.2％vs 4.9％，P＞0.05）。采用2μmol／L的离子霉素对去透明带的卵母细胞进行孤雌激活时，其囊胚率显着高于5.0μmol／L和0.5μmol／L的组（29.4％vs 8.3％，29.4％vs 9.4％，P＜0.01），与3.5μmol／L的组差异不显着（29.4％vs 19.1％，P＞0.05）。对于去透明带胚胎的培养体系，微穴法与微滴法的分裂率差异不显着（61.3％vs 71.7％，P＞0.05），而囊胚率差异极显着（44.0％vs 8.3％，P＜0.01）。试验结果表明，应用HMC法体细胞克隆牛，可采用徒手切割去核以降低成本；采用一次性或分步电融合法均适用于半卵受体与供体细胞的融合；用离子霉素激活去透明带卵应采用较低浓度（2μmol／L）；常规的微滴培养法不适用于无透明带的牛胚胎体外培养，而应采用微穴法培养。
张林[7]（2007）在《牛同种及山羊—牛异种克隆胚胎体外培养的研究》文中认为本实验旨在对牛克隆胚胎以及山羊-牛核移植胚胎的体外培养基进行优化,并且研究了在培养过程中不同时间添加不同大分子物质对于胚胎发育的影响。从而建立一套较为系统、稳定、高效的胚胎培养体系,提高胚胎体外囊胚发育率,为提高制作转基因动物、克隆动物、试管动物等的效率提供技术平台,为该技术走出实验室,在实践中得以应用提供理论依据。试验设计结果为:1.以DMEM为基础培养液,对供体牛以及山羊胎儿耳朵组织块进行组织块法培养,又以0.2%胶原酶II和0.25%胰蛋白酶（Trypsin）按2:3的比例配成混合消化液消化山羊胎儿供体组织,以2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA（Gibco BRL）消化液消化牛胎儿供体组织,结果两种方法都获得了体外培养的胎儿耳朵成纤维细胞。可在含10%DMSO（二甲亚讽）的冷冻液中于-70℃条件下短期冻存,也可在-196℃条件下长期保存。2.通过细胞质内注射法将牛和山羊胎儿耳朵成纤维细胞移入去核的牛卵母细胞中构建重组胚胎以及山羊-牛异种胚胎,分别采用mCR2aa以及mSOF进行培养,结果表明:mSOF液中培养同种胚胎和异种胚胎的卵裂率、8/16-cell发育率,囊胚发育率以及囊胚细胞数均明显高于mCR2aa中的培养结果。（同种依次为74.4±6.5 % Vs54.2±4.3%、45.1±6.2% Vs31.5±2.9 %、18.5±2. 3% Vs9.3±1.8%以及98.2±4.3 Vs78.4±4.1,异种依次为46.6±3.7% Vs36.4±5.1%、30.4±3.8% Vs 20.3±3.2%、8.8±2.1% Vs 3.7±1.5%以及81.1±3.2 Vs68.0±2.5）（P<0.05）。3.在mSOF中按不同培养时间添加8mg/mlBSA或者10%FBS,培养前三天和培养三天后添加的补充物质及次序为:⑴B SA+ FBS;⑵BSA+BSA;⑶F BS+BSA;⑷FBS+FBS。结果表明:添加BSA+FBS和BSA+BSA的培养体系培养的同种胚胎和异种胚胎卵裂率（同种为79.8±7.1%及74.0±3.6%,异种为40.1±6.3%及36.2±2.7%）均比添加FBS+BSA,FBS+FBS的培养体系结果明显高（同种为49.8±5.1%及49.5±2.4%,异种为26.1±3.2%及23.4±2.8%）（P<0.05）。添加BSA+FBS培养的同种胚胎及异种胚胎的8/16-cell发育率,囊胚发育率和囊胚细胞数均比其他组高（同种8/16-cell发育率为49.7±3.5% Vs37.5±2.6% Vs20.4±2.4% Vs19.0±2.1%;同种囊胚发育率为:21.5±1.8% Vs10.9±2.0% Vs5.0±2.3% Vs4.3±2.0%;同种囊胚细胞数依次为115.2±4.3 Vs 103.4±4.4 Vs 101.1±5.2 Vs 102.9±7.7,异种8/16-cell发育率为29.2±2.0% Vs18.1±2.2% Vs19.9±2.8% Vs18.2±2.6%;异种囊胚发育率为13.4±2.1% Vs6.9±2.1% Vs3.3±1.6% Vs3.1±1.7%;异种囊胚细胞数为100.1±3.0 Vs 99.0±2.2 Vs 79.7±5.3 Vs 77.7±4.6）（P<0.05）。
米晓云[8]（2007）在《猪囊尾蚴组织细胞的培养及其杂交瘤细胞株的初步建立与鉴定》文中研究指明猪囊虫病（Cysticercosis cellulosae ）是由猪带绦虫（Taenia solium）的幼虫猪囊尾蚴寄生于人或猪而引起的人畜共患寄生虫病。囊虫病和绦虫病在中国大部分地区尤其在少数民族地区是一个重要的公共卫生问题,对人的健康危害很大。不仅如此囊虫病的广泛存在还造成畜牧业的重大经济损失,极大影响了我国畜产品在国际市场上的竞争力,因而是公认的世界经济病之一。猪囊尾蚴病的免疫预防之所以一直困扰着兽医工作者,主要原因是抗原来源问题。猪囊尾蚴原代组织细胞体外培养的成功,为猪囊尾蚴细胞疫苗的研制提供了条件。但是,由于猪囊尾蚴原代细胞生长缓慢,满足不了利益要求。为了实现通过体外培养的途径快速生产猪囊尾蚴组织细胞抗原我们进行了本项探索。试验猪人工感染猪带绦虫虫卵三个月经ELISA检测血清为阳性者宰杀,收集新鲜的猪囊尾蚴,经处理获得猪囊尾蚴组织细胞,对猪囊尾蚴组织细胞进行体外培养,测定生化指标,观察显微结构。猪囊尾蚴原代细胞在体外成功传代20代以上,测得其染色体为28条14对,细胞生长周期14到21天,细胞系含皮层细胞、实质细胞、成石灰小体细胞、焰细胞和成肌细胞五种细胞,细胞形状多为椭圆形、圆盘形,部分为圆形、梨形、圆盘形带有肩胛。选择状态良好的猪囊尾蚴原代组织细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞融合,经筛选克隆后用ELISA法和基因检测法确认所得细胞系为杂交瘤细胞。测定杂交瘤细胞的生长曲线并与猪囊尾蚴组织细胞做对比,结果证明杂交瘤细胞生长速度大于猪囊尾蚴组织细胞。杂交瘤细胞抗原作为检测抗原,ELISA法检测猪囊虫病猪阴阳性血清,其阳性血清的检测OD值大于阴性血清的2倍以上,证明杂交瘤细胞抗原中包含有猪囊尾蚴组织细胞抗原;用杂交瘤细胞抗原免疫小鼠,用猪囊尾蚴纯化全虫抗原检测免疫小鼠血清抗体,结果为阳性,进一步证实杂交瘤细胞中含有猪囊尾蚴组织细胞抗原。实验初步证明,我们所获得的杂交瘤细胞是猪囊尾蚴原代组织细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的杂合体。
周竹娟[9]（2007）在《转核技术建立可增殖神经细胞系的实验研究》文中指出目的:将胎鼠皮质神经元细胞核转入到骨髓间充质干细胞胞质体中构建转核细胞,以期望建立一种可增殖的神经细胞系,为脑移植的供体细胞来源探索一条新的途径。方法:（1）骨髓间充质干细胞的培养,用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志物CD44、CD90、CD71、CD11b进行鉴定,用免疫细胞化学染色法检测CD133的表达情况;（2）用梯度离心法制备骨髓间充质干细胞胞质体,并用HE染色、Giemsa染色、免疫荧光双标法、透射电镜检查等方法进行鉴定,用台盼蓝染色检测其活性;（3）采用胎龄17d的胎鼠进行皮质神经元的分离培养,用免疫组化法检测神经元MAP2和NeuN的表达情况;（4）用梯度离心法制备神经元细胞核,并用HE染色、免疫荧光染色、透射电镜检查等方法进行鉴定,用台盼蓝染色检测其活性;（5）用PEG介导神经元细胞核与骨髓间充质干细胞胞质体发生融合构建转核细胞;（6）用Hoechst33342和CD71免疫荧光双标法对转核细胞进行鉴定;（7）用抗BrdU和Hoechst33342免疫荧光双标法检测转核细胞是否具有增殖能力,用MTT比色法绘制生长曲线;（8）用扫描电镜和透射电镜对转核细胞进行检测;（9）用流式细胞仪检测转核细胞CD44、CD90、CD71、CD11b等抗原的表达变化;（10）用免疫荧光双标法和免疫细胞化学染色法检测转核细胞NeuN的表达情况;（11）用免疫细胞化学染色法检测转核细胞CD133、MAP2、Nestin等抗原的表达情况;结果:（1）骨髓间充质干细胞呈长梭形、漩涡状生长,用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志物CD44、CD90、CD71阳性,CD11b阴性,免疫细胞化学染色显示CD133阴性。（2）HE染色和Giemsa染色显示骨髓间充质干细胞经梯度离心后在1518%Ficoll400梯度层可见到大量胞质体,贴壁生长的胞质体呈多边形或类圆形,体积与完整细胞相比差别不大。Hoechst33342和CD71免疫荧光双标染色显示骨髓间充质干细胞经梯度离心后在1518% Ficoll400梯度层可见到胞浆呈绿色荧光的胞质体,胞核所在部位无蓝色荧光显示。台盼蓝染色示活胞质体比例为99.5%。12.518% Ficoll400梯度层细胞透射电镜标本可观察到只有胞浆成分的圆形胞质体,胞浆中有内质网、线粒体等超微结构。（3）胎鼠皮质神经元呈多角形,伸出多个突起,MAP2染色显示神经元细胞浆和突起呈免疫反应阳性,NeuN染色显示神经元细胞核呈免疫反应阳性,部分核周胞质和部分近端突起也呈免疫反应阳性。在培养6h、3d、6d时MAP2和NeuN阳性细胞比例均在90%左右,培养不同时间免疫阳性细胞比例无显着性差异。（4）HE染色和Hoechst免疫荧光染色显示神经元梯度离心后在2230% Ficoll400梯度层可见到大量圆点状细胞核,台盼蓝染色显示活细胞核比例为99.6%。在2230% Ficoll400梯度层细胞透射电镜标本中可观察到圆形的细胞核,在细胞核的周围仅见到一层薄薄的胞浆成分。（5）用PEG可介导神经元细胞核与骨髓间充质干细胞胞质体融合构建转核细胞,转核细胞呈梭形或多边形,少数细胞长出两个或数个突起,部分转核细胞呈球状聚集生长。（6）转核细胞Hoechst33342和CD71免疫荧光双标阳性,提示细胞核来自神经元,细胞浆来自骨髓间充质干细胞。转核效率为64.8%。（7）转核细胞抗BrdU与Hoechst33342免疫荧光双标染色阳性。细胞传代次数和细胞培养天数对转核细胞MTT值变化具有显着性影响（p<0.01）。二代和三代转核细胞MTT值与一代转核细胞相比明显增高（p<0.05）。转核细胞培养第4天的MTT值较培养第1天的MTT值明显增高,具有显着性差异（p<0.05）。（8）扫描电镜可观察到神经元细胞核与骨髓间充质干细胞胞质体发生融合的过程。透射电镜可观察转核细胞核浆比偏大,核膜有较多皱褶,内质网数量多,体积比较宽大。（9）一至四代转核细胞CD71、CD90呈阳性,CD11b呈阴性,一代转核细胞CD44为阴性,随着传代次数的增加CD44阳性细胞率逐渐增加,至第四代时CD44阳性细胞率达98.5%。（10）大多数转核细胞的胞浆NeuN均呈免疫阳性反应,部分转核细胞胞浆NeuN呈免疫阳性反应,胞核呈强阳性反应,另有少数转核细胞仅胞核部位NeuN呈强阳性。第二代转核细胞NeuN表达较第一代转核细胞明显增加（p<0.05）,继续传代NeuN表达逐渐下降,第四代转核细胞NeuN表达与第二代转核细胞相比明显下降（p<0.05）。（11）部分转核细胞的细胞膜上出现Nestin阳性表达。一至四代转核细胞Nestin表达强弱比较无明显差异（p>0.05）,但阳性细胞比例逐渐增加。转核细胞胞浆中CD133表达阳性,一至四代转核细胞CD133表达水平无显着性差异（p>0.05）。第一代转核细胞胞浆中MAP2呈免疫阳性反应,随传代次数增加表达水平逐渐减弱,第四代转核细胞MAP2表达呈阴性反应。结论:（1）用梯度离心法可制备骨髓间充质干细胞胞质体;（2）用梯度离心法可制备胎鼠皮质神经元细胞核;（3）采用PEG介导法可将胎鼠皮质神经元细胞核转入到骨髓间充质干细胞胞质体中,构建转核细胞;（4）本研究方法制备的转核细胞具有增殖能力,可表达NeuN和MAP2等神经元标志物,是具有增殖能力的神经元细胞;（5）转核细胞表达CD133、Nestin、CD44、CD90等神经干细胞标志物,随传代次数增加NeuN、MAP2等神经元标志物表达有所下调,CD44、Nestin阳性细胞比例增加,提示转核细胞向神经干细胞方向出现去分化。
李宝山[10]（2007）在《马体细胞与牛卵母细胞和绵羊卵母细胞异质克隆胚的构建及其发育能力的比较》文中研究说明本试验用不同的方法体外培养马皮肤成纤维细胞,以其作为核供体构建了马体细胞-绵羊卵母细胞和马体细胞-牛卵母细胞两种重组胚,并对其早期发育进行了研究。马皮肤成纤维细胞的分离培养:在37℃、5%CO2、饱和湿度下,10%FBS的DMEM/F12培养液适宜于马皮肤成纤维细胞体外培养,小组织块直接培养法比酶消化法更易获得马皮肤成纤维细胞,经4次消化传代培养后,分离纯化了马皮肤成纤维细胞,并发现至少传至第10代时有76.3%的染色体还保持正常的二倍体倍性（2n=64）。绵羊卵母细胞孤雌激活:绵羊卵母细胞在用离子霉素联合6-DMAP的化学激活时,其卵裂率为81.68%,囊胚发育率为34.43%,优于在激活电压1300v/cm,脉冲时间为10μsec,脉冲次数为2次,间隔0.5s的条件下,卵裂率为74.22%,囊胚率为29.69%的电激活效果。经盲吸去核,带下注射结合电融合构建重组胚。两种重组胚在1580v/cm融合电压下,融合率和卵裂率最高:马-牛重组胚融合率为49.01%,卵裂率为55.65%;马-绵羊重组胚融合率为55.36%,卵裂率为58.06%。马-牛重组胚发育到早期桑椹胚,而马-绵羊重组胚发育到囊胚期,经胚胎染色体检查重组胚染色体数目和形态同马成纤维细胞染色体相同,说明马体细胞可以与绵羊的卵母细胞构建重组胚。
二、哺乳动物细胞去核过程及分离的胞质体和核体的电镜观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、哺乳动物细胞去核过程及分离的胞质体和核体的电镜观察（论文提纲范文）
（1）自噬对猪克隆早期胚胎中供体线粒体清除及重编程的影响初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照表 |
| 绪论 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 克隆胚中供体细胞源线粒体命运的研究进展 |
| 1 克隆胚中供体线粒体的命运 |
| 1.1 克隆后代中的供体线粒体可能被完全清除 |
| 1.2 供体线粒体能以极低含量与母源线粒体共存 |
| 1.3 供体线粒体可能主导重构胚及其后代的发育 |
| 2 供体线粒体可能的清除机制 |
| 2.1 胞吐 |
| 2.2 泛素蛋白酶体系统 |
| 2.3 自噬 |
| 第二章 克隆胚中重编程的研究进展 |
| 1 克隆胚中的重编程 |
| 2 自噬与重编程 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第三章 猪克隆胚中供体线粒体清除机制初探 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 主要耗材 |
| 1.3 细胞、卵母细胞及胚胎培养相关试剂 |
| 1.4 染色相关试剂 |
| 1.5 Western blot相关试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 核移植体细胞的准备 |
| 2.2 猪卵母细胞的采集与体外成熟 |
| 2.3 孤雌激活胚以及手工克隆胚的构建 |
| 2.4 3-MA以及CB处理 |
| 2.5 免疫荧光染色 |
| 2.6 透射电镜观察 |
| 2.7 Western blot分析 |
| 2.8 数据分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 克隆胚中供体线粒体的分布变化 |
| 3.2 克隆胚与孤雌胚中LC3荧光的分布变化 |
| 3.3 调节自噬对供体线粒体清除的影响 |
| 3.4 克隆胚与孤雌胚的电镜观察 |
| 3.5 胞质排出现象的观察及其对供体线粒体清除特异性的初探 |
| 4 讨论 |
| 第四章 自噬对猪克隆早期胚胎重编程的影响初探 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 耗材 |
| 1.3 试验试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 LC3 siRNA转染 |
| 2.3 雷帕霉素处理 |
| 2.4 基因表达水平评估 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 转染LC3 siRNA对猪克隆胚的影响 |
| 3.2 雷帕霉素对猪克隆胚的影响 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（2）猪体细胞核移植相关技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物核移植技术研究进展 |
| 1.核移植研究历史回顾 |
| 2.核移植技术程序 |
| 3.核移植胚胎的发育机理 |
| 4.影响核移植效果的因素 |
| 5.不同动物的核移植发展现状 |
| 6.核移植技术当前面临的问题 |
| 7.体细胞核移植的发展前景 |
| 8.核移植技术所生产的转基因食品安全性 |
| 9.体细胞核移植技术展望 |
| 10.结束语 |
| 第二部分 实验部分 |
| 第二章 猪卵母细胞体外成熟过程中减数分裂进程的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 猪卵母细胞体外成熟培养体系建立与优化 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第四章 激活方法对猪卵母细胞孤雌发育的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第五章 猪核移植供体细胞分离与传代培养 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第六章 猪体细胞核移植方法的摸索 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第七章 供体细胞种类及其培养处理方法对猪体细胞核移植效果的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写—中文对照表 |
| 图片与说明 |
| 个人简历 |
| 文献发表情况 |
| 致谢 |
（3）牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 哺乳动物卵母细胞体外成熟与体外受精的研究进展 |
| 1.1 卵泡卵母细胞体外成熟 |
| 1.1.1 卵母细胞成熟的机理 |
| 1.1.2 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.1.3 卵母细胞成熟的判断 |
| 1.1.4 卵母细胞的获取与分级 |
| 1.1.5 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 1.2 精子的体外获能与体外受精 |
| 1.2.1 受精作用机制 |
| 1.2.2 精子体外获能 |
| 1.2.3 体外受精 |
| 1.2.4 体外受精的影响因素 |
| 1.3 受精卵的体外培养 |
| 1.3.1 受精卵体外发育阻断 |
| 1.3.2 受精卵体外培养系统 |
| 1.3.3 影响体外受精卵体外发育的因素 |
| 1.4 小结与展望 |
| 第二章 哺乳动物细胞核移植的研究进展 |
| 2.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 2.2 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 2.3 哺乳动物异种细胞核移植研究进展 |
| 2.4 哺乳动物细胞核移植的方法和程序 |
| 2.4.1 受体细胞的选择与去核 |
| 2.4.2 供体细胞的选择 |
| 2.4.3 细胞核的移植 |
| 2.4.4 重组胚的激活 |
| 2.4.5 重构胚的培养 |
| 2.5 哺乳动物核移植相关机理的研究进展 |
| 2.5.1 MPF 与核移植的关系 |
| 2.5.2 体细胞供体核的表观遗传重编程 |
| 2.6 影响哺乳动物核移植成功率的因素 |
| 2.6.1 核受体胞质对核移植的影响 |
| 2.6.2 核供体对核移植的影响 |
| 2.6.3 融合-激活方案对核移植的影响 |
| 2.6.4 核移植胚胎的体外培养对发育的影响 |
| 2.7 细胞核移植技术存在的问题和应用前景 |
| 2.7.1 细胞核移植技术存在的问题 |
| 2.7.2 细胞核移植技术的应用前景 |
| 第三章 牛卵泡卵母细胞体外受精的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 成熟液中添加EGF、Insulin 对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响 |
| 3.2.2 不同精液处理方法对牛卵泡卵母细胞体外受精的影响 |
| 3.2.3 体细胞共培养对牛体外受精卵体外发育的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 EGF、Insulin 对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响 |
| 3.3.2 精液处理方法对牛卵泡卵母细胞体外受精的影响 |
| 3.3.3 体细胞共培养对牛体外受精卵体外发育的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 激活方法和共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同激活方法对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.2.2 不同共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 不同激活方法对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.3.2 不同共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 牛体细胞克隆胚胎DNA 甲基化和组蛋白乙酰化分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 抗5－甲基胞嘧啶抗体和抗组蛋白H3(acetyl K18)抗体特异性检测 |
| 5.2.2 牛体外受精胚胎和核移植胚胎各发育阶段单细胞核DNA 甲基化水平比较 |
| 5.2.3 牛体外受精胚胎和核移植胚胎各发育阶段单细胞核组蛋白乙酰化水平比较 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 DNA 甲基转移酶抑制剂对牛核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 5-aza-dC 处理供体细胞对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.2.2 5-aza-dC 处理重构胚对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.2.3 体细胞和重构胚均用5-aza-dC处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 组蛋白脱乙酰化酶抑制剂对牛核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 TSA 处理供体细胞对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.2.2 TSA 处理重构胚对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.2.3 体细胞和重构胚均用TSA 处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 5-aza-dC 联合 TSA 对牛核移植胚胎体外发育 及其表观遗传状态的影响 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 5-aza-dC＋TSA 处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 8.2.2 不同个体来源成纤维细胞作核供体，供体细胞和重构胚均用5-aza-dC＋TSA 处理后对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）手工核移植技术在牛体细胞克隆中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 哺乳核移植技术研究进展 |
| 1.1 哺乳动物核移植发展历程 |
| 1.2 动物核移植技术研究成果 |
| 1.3 我国动物核移植研究成果 |
| 1.3.1 转基因体细胞克隆山羊 |
| 1.3.2 体细胞克隆山羊 |
| 1.3.3 体细胞克隆牛 |
| 1.3.4 "胎儿皮肤上皮细胞"克隆牛 |
| 1.3.5 转基因克隆牛 |
| 1.3.6 体细胞克隆引进良种牛--荷斯坦奶牛和盖普威种公牛 |
| 1.3.7 体细胞克隆我国优质黄牛--红系冀南牛 |
| 1.4 目前体细胞核移植技术存在的问题 |
| 1.4.1 克隆效率及存活率低 |
| 1.4.2 部分个体表现出生理或免疫缺陷 |
| 1.4.3 基础理论研究有待加强 |
| 1.5 体细胞核移植术的应用前景 |
| 第二章 核移植相关技术及影响因素 |
| 2.1 影响核移植的相关因素 |
| 2.1.1 去核方法对核移植的影响 |
| 2.1.2 重构胚的影响因素 |
| 2.1.3 卵母细胞的激活 |
| 2.1.4 供体细胞与受体卵母细胞的细胞周期的同步化 |
| 2.1.5 卵母细胞的体外成熟 |
| 2.1.6 克隆胚胎的体外培养 |
| 2.1.7 卵母细胞与核移植胚胎的冻存 |
| 2.1.8 怀孕的维持与围产期护理 |
| 2.1.9 其他影响因素 |
| 2.2 卵母细胞的去核方法 |
| 2.2.1 盲吸法 |
| 2.2.2 半卵盲吸法 |
| 2.2.3 挤压去核法 |
| 2.2.4 点击去核法 |
| 2.2.5 荧光染色法 |
| 2.2.6 切割去核法 |
| 2.2.7 化学辅助的导向去核法 |
| 2.3 手工核移植技术 |
| 2.3.1 手工核移植的概念 |
| 2.3.2 手工核移植的相关研究 |
| 2.3.3 HMC 技术的应用前景 |
| 第三章 脱羰秋水仙碱诱导牛卵母细胞显核的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Deme 处理时间对显核的影响 |
| 3.3.2 Deme 浓度对显核率的影响 |
| 3.3.3 极体对显核率的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 牛手工核移植技术 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 结果和分析 |
| 4.3.1 不同方法实验步骤及所需时间 |
| 4.3.2 两种去核方法的去核率比较 |
| 4.3.3 胚胎发育情况的比较 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）不同成熟因素对延边黄牛卵母细胞体外成熟及核移植后胚胎早期发育的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 体细胞克隆 |
| 1.2 卵母细胞体外成熟 |
| 1.3 体细胞核移植 |
| 1.4 研究目的 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验设计 |
| 2.4 统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 不同季节对牛卵母细胞体外成熟和核移植后胚胎发育的影响 |
| 3.2 不同保存温度对牛卵母细胞体外成熟和核移植后胚胎发育的影响 |
| 3.3 不同操作时间对牛卵母细胞体外成熟和核移植后胚胎发育的影响 |
| 3.4 不同成熟时间对牛卵母细胞体外成熟和核移植后胚胎发育的影响 |
| 3.5 有无黄体对牛卵母细胞体外成熟和核移植后胚胎发育的影响 |
| 3.6 不同卵泡直径对牛卵母细胞体外成熟和核移植后胚胎发育的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 不同季节对牛卵母细胞体外成熟和核移植后胚胎发育的影响 |
| 4.2 不同温度对牛卵母细胞体外成熟和核移植后胚胎发育的影响 |
| 4.3 不同操作时间对牛卵母细胞体外成熟和核移植后胚胎发育的影响 |
| 4.4 不同成熟时间对牛卵母细胞体外成熟和核移植后胚胎发育的影响 |
| 4.5 有无黄体对牛卵母细胞体外成熟和核移植后胚胎发育的影响 |
| 4.6 不同卵泡直径对牛卵母细胞体外成熟和核移植后胚胎发育的 |
| 第五章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（6）牛HMC法体细胞克隆技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 HMC技术及其研究进展 |
| 1.1 细胞核移植的研究简史 |
| 1.2 卵母细胞去核的方法及其影响 |
| 1.3 HMC技术及其研究进展 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂的配制 |
| 2.2 卵母细胞的收集及体外成熟 |
| 2.3 颗粒细胞单层的制备 |
| 2.4 微穴培养盘(well of the well,WOW)的制备 |
| 2.5 供体细胞(体细胞)的准备 |
| 2.6 卵母细胞的孤雌激活 |
| 2.7 卵母细胞去核 |
| 2.8 供/受体细胞的融合 |
| 2.9 重构胚的激活及培养 |
| 2.10 试验设计 |
| 2.11 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 培养方式对有无透明带卵母细胞孤雌激活及发育的影响 |
| 3.2 不同离子霉素浓度对Z-PA的影响 |
| 3.3 徒手与机械手臂切割卵母细胞的效果比较 |
| 3.4 聚乙二醇法细胞融合效果 |
| 3.5 一次性电融合不同参数的比较 |
| 3.6 两步法融合不同参数的比较 |
| 3.7 不同融合方法效果的比较 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 去透明带卵母细胞孤雌激活发育的比较 |
| 4.2 徒手切割卵母细胞与机械手臂切割卵母细胞的比较 |
| 4.3 半卵胞质体与供体细胞进行融合研究的比较 |
| 4.4 不同融合方法得到重构胚的发育情况比较 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文目录 |
（7）牛同种及山羊—牛异种克隆胚胎体外培养的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.1 供核体细胞的类型、细胞周期以及与受体卵的来源，成熟 |
| 1.1.1 供体细胞的来源 |
| 1.1.2 供体所处细胞周期 |
| 1.1.3 血清饥饿的问题 |
| 1.1.4 对供体细胞的特殊处理 |
| 1.1.5 受体卵母细胞的来源 |
| 1.1.6 卵母细胞的成熟 |
| 1.1.7 卵母细胞的激活 |
| 1.2 去核，移核，重组胚胎的激活 |
| 1.2.1 卵母细胞的去核 |
| 1.2.2 移核，重组胚的构建 |
| 1.2.3 重构胚的激活 |
| 1.3 异种核移植历程 |
| 1.3.1 胚胎细胞异种核移植 |
| 1.3.2 体细胞异种核移植 |
| 1.4 异种核移植机理以及影响因素 |
| 1.4.1 异种核移植机理 |
| 1.4.2 影响因素 |
| 1.5 重组胚胎的培养 |
| 1.6 胚胎的质量检测 |
| 1.7 现存问题 |
| 1.7.1 牛体细胞核移植现存问题 |
| 1.7.2 异种核移植现存问题以及解决办法 |
| 1.7.3 其他方面问题 |
| 1.8 应用前景以及研究方向 |
| 第二章 哺乳动物胚胎培养体系（IVC）的研究进展 |
| 2.1 早期胚胎发育阻滞的主要原因 |
| 2.2 胚胎的体外基础培养液 |
| 2.3 基础培养液中其它成分的添加及功用 |
| 2.3.1 能量物质对胚胎发育的影响 |
| 2.3.2 氨基酸及粘多糖对胚胎发育的影响 |
| 2.3.3 蛋白质对胚胎发育的影晌 |
| 2.3.4 生长因子对胚胎发育的影晌 |
| 2.3.5 无机盐离子 |
| 2.3.6 共培养体系 |
| 2.4 前景与展望 |
| 试验研究 |
| 第三章 牛及山羊胎儿耳朵成纤维细胞的分离培养 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 数据分析 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 胎儿耳朵成纤维细胞体外培养生长特点 |
| 3.2.2 组织块培养法培养牛及山羊胎儿耳朵成纤维细胞 |
| 3.2.3 消化法对牛及山羊胎儿耳朵组织的消化效果 |
| 3.2.4 胎儿成纤维细胞生长曲线的测定 |
| 3.2.5 胎儿耳朵成纤维细胞解冻后的贴壁结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 培养液对牛和山羊-牛核移植胚胎培养的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 卵母细胞的体外成熟 |
| 4.1.2 供体细胞的准备 |
| 4.1.3 卵母细胞的去核以及核移植 |
| 4.1.4 核移植胚胎的激活以及体外培养 |
| 4.1.5 囊胚细胞数计数 |
| 4.1.6 试验设计 |
| 4.1.7 数据统计 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 mSOF和mCR2aa对同种胚胎以及异种胚胎的影响 |
| 4.2.2 发育囊胚细胞数的比较 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 培养液对牛和山羊-牛异种核移植胚胎培养的影响 |
| 4.3.3 牛同种克隆胚胎和山羊-牛异种克隆胚胎的培养比较 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 FBS及BSA对牛和山羊-牛核移植胚胎培养的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 BSA以及FBS添加次序不同对胚胎发育胚胎发育率的影响 |
| 5.2.2 发育囊胚细胞数的比较 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 SOF培养液中FBS和BSA的添加次序对于胚胎发育率的影响 |
| 5.3.2 SOF培养液中FBS和BSA的添加次序对于胚胎品质的影响 |
| 5.3.3 牛克隆胚胎培养液对山羊-牛异种克隆胚胎发育的影响 |
| 5.4 小论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验图片 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）猪囊尾蚴组织细胞的培养及其杂交瘤细胞株的初步建立与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 文献综述 |
| 3 材料和方法 |
| 3.1 猪囊尾蚴和肿瘤细胞 |
| 3.2 酶和试剂 |
| 3.3 引物 |
| 3.4 溶液 |
| 3.5 仪器与设备 |
| 3.6 猪囊尾蚴组织细胞的获取 |
| 3.7 猪囊尾蚴组织细胞的体外培养 |
| 3.8 小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0 细胞)的培养 |
| 3.9 猪囊尾蚴组织细胞与小鼠骨髓瘤细胞的融合 |
| 3.10 融合细胞的鉴定 |
| 3.11 动物试验 |
| 4 结果 |
| 4.1 猪囊尾蚴组织细胞的体外培养 |
| 4.2 小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0 细胞)的培养 |
| 4.3 融合细胞的鉴定 |
| 4.4 动物实验结果 |
| 5 讨论 |
| 5.1 关于细胞培养 |
| 5.2 关于细胞超微结构 |
| 5.3 关于生长曲线 |
| 5.4 关于细胞融合 |
| 5.5 关于融合细胞的检验基因 |
| 5.6 关于动物实试验的问题 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）转核技术建立可增殖神经细胞系的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文转核技术建立可增殖神经细胞系的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 骨髓间充质干细胞的培养鉴定和胞质体的制备 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 胎鼠皮质神经元的分离鉴定和细胞核的制备 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 转核技术建立可增殖神经细胞系 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 图片 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 体细胞核移植技术进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 胚胎干细胞向神经细胞分化的研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士期间撰写和发表的论文 |
（10）马体细胞与牛卵母细胞和绵羊卵母细胞异质克隆胚的构建及其发育能力的比较（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 综述 |
| 2.1 核移植和动物克隆的概念 |
| 2.2 动物体细胞克隆的有关机理 |
| 2.2.1 CA~(2+)对供体核的再程序化过程的启动作用 |
| 2.2.2 MPF 对供体核的再程序化的作用 |
| 2.2.3 DNA 的甲基化对于供体核的再程序化是必要的 |
| 2.2.4 核质互作 |
| 2.3 哺乳动物核移植研究进展 |
| 2.3.1 同种动物细胞核移植的研究进展 |
| 2.3.2 异种动物细胞核移植研究进展 |
| 2.4 体细胞克隆技术 |
| 2.4.1 去核方法 |
| 2.4.2 供核细胞的准备 |
| 2.4.3 核移植重组胚的激活 |
| 2.4.4 重构胚的体外培养 |
| 2.5 存在的问题 |
| 2.5.1 生产效率低 |
| 2.5.2 端粒与克隆动物年龄 |
| 2.5.3 体细胞突变和其他遗传问题 |
| 2.6 应用前景 |
| 2.6.1 扩大优良育种群和拯救濒危动物 |
| 2.6.2 加深核质互作关系的研究 |
| 2.6.3 生产转基因动物 |
| 2.6.4 为器官移植提供充足材料 |
| 2.6.5 肿瘤和癌细胞基因活动的研究 |
| 3 试验部分 |
| 3.1 马皮肤成纤维细胞的体外培养 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 试验仪器 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.2 异质克隆胚的构建 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 试验试剂 |
| 3.2.3 试验仪器 |
| 3.2.4 卵母细胞的准备 |
| 3.2.5 异质克隆胚的构建 |
| 3.2.6 重组胚染色体的制备 |
| 3.2.7 数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 组织块直接贴壁培养 |
| 3.3.2 酶对皮肤组织块消化的影响 |
| 3.3.3 传代培养、冻存和复苏 |
| 3.3.4 马皮肤成纤维细胞的生长 |
| 3.3.5 马皮肤成纤维细胞的染色体 |
| 3.3.6 绵羊卵母细胞孤雌激活 |
| 3.3.7 重组胚在不同电压下的融合 |
| 3.3.8 重组胚的发育能力比较结果 |
| 3.3.9 重组胚的染色体检查 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 作者简介 |
四、哺乳动物细胞去核过程及分离的胞质体和核体的电镜观察（论文参考文献）
- [1]自噬对猪克隆早期胚胎中供体线粒体清除及重编程的影响初探[D]. 迟大明. 南京农业大学, 2017(07)
- [2]猪体细胞核移植相关技术研究[D]. 黄雅琼. 广西大学, 2008(12)
- [3]牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究[D]. 丁向彬. 西北农林科技大学, 2008(12)
- [4]手工核移植技术在牛体细胞克隆中的应用研究[D]. 万敏. 西北农林科技大学, 2008(11)
- [5]不同成熟因素对延边黄牛卵母细胞体外成熟及核移植后胚胎早期发育的影响[D]. 苗婷婷. 延边大学, 2007(06)
- [6]牛HMC法体细胞克隆技术的研究[D]. 田国富. 广西大学, 2007(05)
- [7]牛同种及山羊—牛异种克隆胚胎体外培养的研究[D]. 张林. 西北农林科技大学, 2007(06)
- [8]猪囊尾蚴组织细胞的培养及其杂交瘤细胞株的初步建立与鉴定[D]. 米晓云. 新疆农业大学, 2007(02)
- [9]转核技术建立可增殖神经细胞系的实验研究[D]. 周竹娟. 第三军医大学, 2007(03)
- [10]马体细胞与牛卵母细胞和绵羊卵母细胞异质克隆胚的构建及其发育能力的比较[D]. 李宝山. 内蒙古农业大学, 2007(03)