一、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白在成年大鼠不同视神经再生模型中的表达（论文文献综述）
陈亭[1]（2021）在《大鼠RGCs发育过程中Jarid1b表达变化及视神经损伤后Jarid1b和H3K4me3的表达变化》文中指出目的:建立纯度良好的视网膜神经节细胞（RGCs）培养模型检测大鼠出生后RGCs发育过程中的Jarid1b的表达变化;建立大鼠动物模型来观察视神经损伤后H3K4me3、Jarid1b的表达趋势,推测Jarid1b可能在视神经损伤后再生修复过程中发挥一定功能,为视神经损伤后的临床诊疗提供一定的基础依据。方法:首先选取出生6天（P6）的乳鼠,麻醉后取其眼球,解剖获得乳鼠视网膜组织,经消化、筛选及纯化制得RGCs,将其悬浮后于24孔板中铺板,并通过免疫细胞化学方法鉴定其纯度。1.提取P6（出生6天）和成年大鼠的RGCs,并采用荧光定量PCR法检测Jarid1b的核酸表达水平的变化。2.选取清洁成年SD大鼠（n=45）损伤其左眼视神经以构建视神经损伤模型,右眼暴露视神经15秒以构建对照组模型。3.视神经损伤的第3天、第7天、第14天提取RGCs细胞、收集损伤组和对照组视神经组织制备组织切片;应用荧光定量PCR法检测损伤组和对照组中Jarid1b的核酸表达水平变化,应用免疫组化检测两组视神经中Jarid1b和H3K4me3的表达,并进行统计学分析。结果:1.光学显微镜下观察提取出的p6乳鼠RGCs,体外存活时间为7天左右,为后续细胞研究提供了基础。通过使用该培养方法筛选得出的RGCs阳性收益好,纯度较高,为进行RGCs相关的实验研究提供基础。2.通过qRT-PCR观察到Jarid1b的mRNA表达量在大鼠初生时随发育逐渐降低。3.视神经急性损伤后各时间点Jarid1b的表达均低于正常对照组,对照组Jarid1b表达无明显变化。4.视神经急性损伤后各时间点H3K4me3的表达均高于正常对照组。对照组H3K4me3的表达无明显变化。结论:1.该原代培养方法获得的大鼠RGCs阳性筛选效益较好。培养出的RGCs生长良好,纯度较高,初生6天乳鼠的RGCs体外存活时间可达7d,可以用于进一步的基础研究。2.Jarid1b在调控RGCs的发育、分化及凋亡等方面可能发挥着不同作用。3.视神经损伤后,H3K4me3及Jarid1b表达趋势提示:（1）Jarid1b与H3K4me3的表达变化在视神经损伤过程中关系密切;（2）推测Jarid1b表达变化是视神经损伤后抑制RGCs轴突再生的机制之一。
鄢敏[2]（2021）在《凝集蛋白agrin抗体致重症肌无力及agrin在肌肉再生中的作用研究》文中进行了进一步梳理神经肌肉接头（NMJ）是运动神经元轴突末端与肌纤维之间的突触连接,负责将神经系统的信号传递给与肌纤维。它的一个重要特征是各种突触蛋白在突触区域高度聚集,尤其是作为神经递质受体的烟碱型乙酰胆碱受体（ACh R）,这样的结构保证了神经信号在运动神经元和肌肉之间快速而可靠的传递。Agrin-LRP4-Mu SK信号通路对NMJ的形成及维持起关键性的作用,其中的凝集蛋白（agrin）、低密度脂蛋白受体相关蛋白4（LRP4）、肌肉特异性酪氨酸激酶（Mu SK）是NMJ形成过程中的关键分子。Agrin通过与LRP4结合并激活受体Mu SK,磷酸化DOK7促使肌纤维膜中ACh R的聚集而发挥作用。已有研究证实,缺乏该信号通路中任何一种分子的突变小鼠均不能形成NMJs而无法存活。在NMJ处ACh R聚集受损将扰乱神经肌肉之间的信息传递,导致重症肌无力（MG）和先天性肌无力综合症等病症的发生。MG是一种累及NMJ的自身免疫性疾病。MG患者表现出典型的自发性眼、四肢肌肉疲劳无力、吞咽困难,严重者可死于呼吸困难。MG主要是由于机体自身产生抗NMJ结构相关蛋白的抗体而引起,虽然ACh R抗体是导致MG的主要病因,但仍有部分患者为ACh R抗体阴性。研究者在抗ACh R抗体阴性的不同患者血清中检测到抗Mu SK抗体,抗LRP4抗体以及抗agrin抗体。然而抗agrin抗体是否直接导致MG尚不清楚。Agrin蛋白是agrin-LRP4-Mu SK信号通路中最早被发现的NMJ形成关键分子。按照其来源不同,可分为两种类型:神经型agrin（N-agrin）和肌肉型agrin（M-agrin）。N-agrin主要由运动神经元合成,经轴索转运后被释放至突触基底层。N-agrin内部其C端的第三个层粘连蛋白样结构域（LG3）中含有8个氨基酸残基（Z8）的剪接插入物,与LRP4胞外的β1结构域特异性结合形成四聚体,激活Mu SK,Mu SK再通过磷酸化DOK7高效介导ACh R聚集及突触后膜分化,促进NMJ的形成。M-agrin由肌肉细胞和其他非神经性细胞分泌,因其LG3结构域上缺乏Z8序列,丧失了激活Mu SK的能力,所以不具备诱导ACh R高效聚集这一功能。在抗ACh R抗体阴性的MG患者体内检测到抗agrin抗体,但究竟是N-agrin抗体还是M-agrin抗体能够促进MG的发生,目前并不清楚。为此,本文第一部分构建了N-agrin和M-agrin原核表达载体,进而表达和纯化了两种agrin蛋白。接下来利用N-agrin和M-agrin分别主动免疫A/J小鼠,并通过检测肌力、NMJ形态和电生理,重复性电刺激等实验,发现主动免疫M-agrin的小鼠没有呈现MG样症状,但免疫N-agrin的小鼠表现出明显的MG样症状。N-agrin主动免疫A/J小鼠的体重和肌肉收缩力下降,m EPP幅度、频率和EPP振幅降低,同时观察到NMJ处ACh R簇碎片化,抗N-agrin抗体处理的C2C12肌肉细胞ACh R簇减少。结果表明抗N-agrin抗体作用于神经肌肉接头,阻碍了agrin-LRP4-Mu SK信号通路的传递,使得神经肌肉接头处的ACh R聚集碎片化,大小、面积以及密度减少,神经肌肉突触传导受损,从而在机制上阐明了抗N-agrin抗体导致MG发病的分子机制。杜氏肌萎缩（DMD）一种X连锁隐性遗传致死性肌病,由肌纤维膜抗肌萎缩蛋白（dystrophin）完全缺失所导致,是进行性肌萎缩中发病率最高的类型之一。DMD病主要表现为对称性的肌无力和萎缩,腓肠肌假性肥大和盆带肌无力为首发症状。肌肉再生能力低是该病的一个重要特征,我们发现杜氏肌萎缩模型mdx小鼠肌肉中agrin表达降低,同时agrin在肌卫星细胞中表达,而肌卫星细胞是肌肉再生的重要来源,为了进一步探索M-agrin在肌肉再生中的作用,因此本文第二部分实验构建了肌肉条件性敲除agrin突变小鼠(HSA-agrinf/f),并利用心脏毒素（CTX）构建肌肉损伤再生模型,发现HSA-agrinf/f小鼠肌肉损伤后新生成肌管显着减少,再生能力降低,肌肉再生过程中肌卫星细胞增殖受到抑制,表明M-agrin在肌肉再生过程中对肌卫星细胞增殖有重要的作用,研究结果为肌萎缩疾病中肌肉再生能力弱的分子机制提供理论依据,也为进一步探索肌萎缩相关疾病的治疗提供新的靶点。
刘振辉[3]（2021）在《仿生导电人工神经支架的研究》文中认为目的:（1）制备具有导电功能的多微通道多壁碳纳米管琼脂糖导电支架,并对其进行表征,验证其生物相容性,利用支架进行细胞三维立体培养,研究电刺激对RSC96细胞生长的影响。（2）制备具有取向性纳米纤维的PLLA纤维膜,并对其进行表征,验证其生物相容性,研究纤维取向性对RSC96细胞信号蛋白的影响。（3）制备仿生导电人工神经支架,将支架植入大鼠坐骨神经缺损,探讨仿生导电人工神经支架对大鼠坐骨神经修复效果和机制。方法:（1）利用梯度冷冻和冷冻干燥技术制备出具有多微通道多壁碳纳米管琼脂糖导电支架。通过微结构、溶胀和脱溶涨、导电率、形状记忆功能、载药及药物释放性能、力学性能和生物相容性对制备的多微通道多壁碳纳米管琼脂糖导电支架进行表征,对三维立体培养的RSC96细胞进行组织学评价,观察不同培养条件下细胞生长行为。（2）利用静电纺丝技术制备出具有取向纳米纤维的PLLA纤维膜。通过扫描电镜、力学性能、降解性和生物相容性对制备的PLLA纤维膜进行表征。利用免疫荧光技术研究纤维取向性对RSC96细胞ERK、P38MAPK、MEK和LRP4蛋白的影响。（3）利用定制的模具制备多微通道导电支架,将第二部分制备的高取向PLLA纤维膜和定制的多微通道导电支架组合成仿生导电人工神经支架,并将神经支架植入到大鼠坐骨神经缺损处。将实验动物分为支架组（S）、支架联合电刺激组（S&E）和自体神经移植组（AT）,通过坐骨神经功能指数、神经电生理检测、肌肉组织学检测、再生神经的组织学检测来分析仿生导电神经支架对周围神经再生的影响。结果:（1）加入的多壁碳纳米管没有影响琼脂糖支架的孔隙组成比和形状记忆功能,但0.025%wt多壁碳纳米管提高了支架在溶胀平衡状态下的溶胀率和保水能力。多壁碳纳米管改变了琼脂糖支架的电导率、载药及药物释放能力和力学性能。高浓度多壁碳纳米管对RSC96细胞和PC12细胞的增殖有一定影响。电镜下PC12细胞在多壁碳纳米管琼脂糖支架上生长状态良好。多壁碳纳米管的加入未改变RSCs细胞的S100β表达量。当电刺激存在时,RSC96细胞层沿支架纵轴排列较好,0.025%MWCNT-琼脂糖支架和0.05%MWCNT-琼脂糖支架表现出更好的细胞黏附性。（2）制备的PLLA纤维膜为多孔结构,纤维大部分为取向排列,高取向纤维膜的纤维取向性更高,其表面光滑,粗细均匀,纤维间形成立体的三维孔隙并分布于整个纤维膜。取向PLLA纤维膜的拉伸强度为（59.06±2.49）MPa,取向PLLA纤维膜的拉伸强度为（56.82±2.80）MPa,两种纤维膜拉伸强度没有统计学差异;取向PLLA纤维膜的杨氏模量为（1037.07±133.30）MPa,高取向PLLA纤维膜的杨氏模量为（971.45±112.39）MPa,两种纤维膜杨氏模量没有统计学差异;取向PLLA纤维膜的断裂伸长率为364.48±53.79,高取向PLLA纤维膜的断裂伸长率为356.89±40.21,两种纤维膜断裂伸长率没有统计学差异。增加PLLA纤维膜的取向,并未明显改变纤维膜的拉伸强度、杨氏模量和断裂延伸率。改变纤维膜的纤维取向程度,对PLLA纤维膜的降解速率没有影响。取向PLLA纤维膜和高取向PLLA纤维膜对RSC96细胞的增殖均没有影响。和取向性纤维膜相比,高取向的PLLA纤维膜上的RSC96细胞呈现出现明显的丝状伪足,沿着排列整齐的纳米纤维延伸。和取向性PLLA纤维膜相比,高取向PLLA纤维增加了RSC96细胞ERK、P38 MAPK、MEK和LRP4蛋白表达量（P<0.01）。（3）制备的仿生导电人工神经支架跟大鼠坐骨神经匹配良好,植入神经缺损出未见异物反应。S&E组坐骨神经功能指数、神经电生理结果、肌肉组织学结果、轴突和髓鞘再生效果接近AT组,好于S组。术后12周时免疫组化结果显示,NF-H蛋白和S00-β蛋白表达,S&E组和AT组的高于S组（P<0.01）,而S&E组接近AT组。LRP4蛋白和P38MAPK蛋白表达,AT组高于S组（P<0.01）,但AT和S&E组,S&E组和S组相比均无差异无统计学意义。ERK蛋白和MEK蛋白表达情况,AT组高于S组和S&E组（P<0.01）,S&E组和S组两者相比差异无统计学意义。结论:（1）多壁碳纳米管琼脂糖支架具有高的孔隙率、一定的形状记忆功能、载药及药物释放能力、导电能力,良好的生物相容性。在电刺激存在时,具有导电性能的多壁碳纳米管琼脂糖支架对RSC96细胞生长具有引导作用。（2）和取向性的PLLA纤维膜相比,高取向性的PLLA纤维膜未改变其力学性能、降解性和生物相容性,但增加了ERK、P38 MAPK、MEK和LRP4蛋白的表达量,能引导RSC96细胞生长和迁移,这有利于其在周围神经再生中的应用。（3）仿生导电人工神经支架联合电刺激能够增强周围神经再生。电刺激可能通过ES通过与MAPK信号通路的激活促进周围神经再生,ERK、P38MAPK、MEK和LRP4可能参与周围神经再生。
陶美含[4]（2021）在《脱细胞肌腱来源的防粘连膜的研制和性能评价》文中研究表明目的:肌腱是连接骨骼肌和骨骼的致密结缔组织。肌腱损伤是一种常见的骨科疾病,由创伤、年龄相关性退行性变或过度使用等原因引起。虽然随着手术技术和术后活动的增加,肌腱粘连的发生减少,但它仍是肌腱损伤修复术后的主要并发症,常常导致疼痛、关节活动受限、甚至需要再次手术。肌腱来源的脱细胞基质具有天然肌腱的成分、良好的生物相容性和低免疫原性。因此本研究试图利用肌腱脱细胞基质材料制备防粘连膜解决肌键损伤后粘连的问题。1.评估优化的肌腱脱细胞方法的脱细胞效果,以及新鲜肌腱、脱细胞肌腱和肌腱防粘连膜的理化性质。2.通过细胞毒试验、溶血试验和细胞亲和性试验检测防粘连膜在体外的生物相容性。3.通过将防粘连膜植入大鼠背部皮下,检测防粘连膜的体内降解性与免疫反应。4.通过将防粘连膜作用于肌腱来源细胞,检测细胞水平上防粘连膜对肌腱的影响。5.动物实验分析肌腱防粘连膜在防止粘连方面的效果。方法:优化肌腱的脱细胞方法并通过对新鲜组肌腱和脱细胞肌腱进行HE染色、DNA定量和琼脂糖电泳,从而对肌腱脱细胞的效果进行验证。通过对新鲜组肌腱和脱细胞肌腱进行横切片的Masson染色对肌腱切片中的组织成分进行定性分析,对干重情况下的新鲜组肌腱和脱细胞肌腱组织的胶原蛋白含量和糖胺聚糖含量进行检测,以此检测脱细胞方法对于肌腱组织的影响。用肌腱的脱细胞基质材料制备肌腱防粘连膜,并通过扫描电镜对防粘连膜的孔隙进行检测。通过蛋白质组学对新鲜肌腱、脱细胞肌腱和防粘连膜中的蛋白成分进行提取和分析。通过细胞毒试验、溶血试验和细胞亲和性试验检测防粘连膜在体外的生物相容性。通过将防粘连膜植入大鼠背部皮下囊中,然后进行HE染色和免疫荧光,从而检测膜的体内降解性与免疫反应。通过PCR检测膜对肌腱来源细胞的影响。膜被用于兔子跟腱损伤修复实验,横切片,然后进行HE染色、Masson染色、粘连评分和踝关节屈曲度,从而评价肌腱防粘连膜在防止粘连方面的效果。结果:HE染色、DNA定量和琼脂糖电泳显示,利用微切片技术优化的脱细胞方法能有效脱细胞。具体的就是,经过HE染色的脱细胞基质组织切片中未见到细胞核;在琼脂糖凝胶电泳的DNA定性实验中,脱细胞基质中没有残留明显的DNA片段;在双链DNA（dsDNA）定量实验中,干的脱细胞基质中双链DNA的含量为40.46±4.58 ng/mg,小于50 ng/mg。脱细胞后,脱细胞基质的整体结构与自然组织相似,但脱细胞基质结构更疏松,有许多孔洞。Masson染色显示脱细胞基质和自然组织均由胶原纤维组成。干态的脱细胞基质和自然组织中胶原含量分别为915.26±42.75 μg/mg 和 926.91±19.28 μg/mg,两组间无显着性差异（P>0.05）,说明脱细胞过程中胶原蛋白没有明显损伤。脱细胞基质与正常组织糖胺聚糖含量分别是0.96±0.04 μg/mg和0.97±0.03 μg/mg,无显着性差异（p>0.05）。肌腱防粘连膜在湿态为白色、不透明,在干燥状态下为无色和透明。扫描电镜结果显示,肌腱防粘连膜的结构均匀致密,无可见的孔隙。蛋白组学的结果表明,脱细胞前后的肌腱组织和肌腱防粘连膜中,均存在COL1A1、COL2A1等多种胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白等众多的结构蛋白,而且新鲜肌腱组织经过脱细胞处理,这些结构蛋白在总蛋白中的相对含量升高,这种现象可以被认为是由于脱细胞去除了组织中的细胞相关蛋白质,致使细胞外基质中的结构蛋白质被进一步提纯;而新鲜肌腱组织经过脱细胞处理,组织中的色素上皮衍生因子（PEDF）、血管性血友病因子、血管生成素样等生长因子,在总蛋白中的相对含量降低,这说明生长因子在脱细胞过程中有损失。脱细胞基质制备成膜的过程中,有41种蛋白质的相对含量增高,40种蛋白质的相对含量降低,相对于1381种被检测到的蛋白质总数,它们所占比例较小,这表明肌腱防粘连膜的制备条件相对温和。体外生物相容性试验包括细胞毒性试验、溶血试验和细胞亲和性试验。细胞毒性试验表明,肌腱防粘连膜作用于L929细胞,在1天内的相对增殖率高于100%,从第1天到第3天,细胞的相对增殖率逐渐降低,接近100%,这说明肌腱防粘连膜不仅对L929细胞无毒,而且能促进细胞增殖。溶血试验以生理盐水为阴性对照,蒸馏水为阳性对照,肌腱防粘连膜的浸提液组的上层液体透明,与生理盐水组相似,说明肌腱防粘连膜不会引起溶血反应。肌腱来源细胞在肌腱防粘连膜上能充分伸展,细胞形态良好,说明肌腱防粘连膜具有良好的细胞相容性。大鼠皮下植入后,用HE染色法研究肌腱防粘连膜在体内的降解情况,用HE染色法和免疫荧光法研究膜埋植后组织发生的免疫反应。试验中所有大鼠均存活至预定时间点,无并发症。HE染色显示肌腱防粘连膜的形态变化和体内降解性。HE染色后肌腱防粘连膜呈红色条带。大体上,前3周膜的结构无明显变化,第6周开始膜内可见大量细胞,第12周膜己经完全消失。HE染色和免疫荧光法直观地显示膜植入体内后炎症细胞的类型、数量和分布的变化,结果显示,植入后第1周至第12周均未发现巨噬细胞。植入后第1周,细胞膜周围有少量淋巴细胞。在第2周,一些淋巴细胞和大量浆细胞出现在细胞膜周围。在第3周,除了一些浆细胞和淋巴细胞外,在细胞膜周围还发现一些嗜酸性粒细胞。第4周,细胞膜周围可见部分中性粒细胞,浆细胞和淋巴细胞数量明显减少;细胞膜外层有大量浆细胞和淋巴细胞,但细胞膜中层未见细胞。第6周,浆细胞和淋巴细胞逐渐向膜内扩散,膜的周围仍可见嗜酸性粒细胞,但嗜酸性粒细胞数量远少于第3周。第12周未发现肌腱防粘连膜残留,所有炎症细胞消失,肌腱防粘连膜组与对照组无显着性差异,说明肌腱防粘连膜是一种较安全的生物材料,不会引起严重的炎症反应和免疫排斥反应。兔子跟腱修复实验结果显示,踝关节屈曲度、粘连评分、机械强度和组织学结果均优于对照组,说明防粘连膜能有效防止肌腱修复术后粘连的发生。结论:以异种细胞外基质为原料,采用优化的肌腱脱细胞方法,获得肌腱脱细胞基质,并成功地用肌腱脱细胞基质制备了肌腱防粘连膜（Decellularized Tendon Membrane,DTM）。理化性质、生物学评价、以及兔子跟腱修复实验结果表明,肌腱防粘连膜能有效防止肌腱粘连,展现出巨大的应用潜力。
张婵媛[5]（2020）在《JARID1B在大鼠RGCs发育过程中的表达及对体外RGCs存活影响的研究》文中研究说明目的:通过提取初生SD大鼠视网膜建立视网膜神经节细胞（RGCs）的原代培养模型并对其纯度进行鉴定,检测组蛋白去甲基化酶JARID1B在大鼠出生后RGCs发育过程中的表达,研究JARID1B在其发育过程中的变化;建立过表达JARID1B的RGCs细胞模型,初步探索其对体外培养RGCs存活的影响。为视功能恢复及视神经相关疾病的基础研究提供一种体外实验体系,并为JARID1B在RGCS发育及再生中起重要作用提供依据。方法:1.首先通过培育OX-7杂交瘤细胞提取含Thy1.1抗体上清液用于阳性筛选RGCs;然后选取成年SD大鼠雌性12只,雄性6只,2:1交配,选取出生7d（P7）以内的乳鼠,选用木瓜蛋白酶对其视网膜组织进行消化,制备RGCs细胞悬液,以巨噬细胞多克隆抗体对所得细胞进行初步筛选,再以山羊抗兔IgG（H+L）、山羊抗鼠IgG（H+L）+含Thy-1.1抗体上清液依次进行阴性、阳性选择,将所得RGCs悬浮后铺板于24孔细胞培养板（提前用鼠层粘连蛋白和多聚-D-赖氨酸预处理）中进行培养,培养72h后采用抗鼠Thy-1.1抗体通过免疫细胞化学方法鉴定其纯度。2.用Western Blots检测P6（出生6d）、P14（出生14d）、成鼠视网膜组织中H3K4me3蛋白的表达;分别提取P3、P6、P14、10W（出生10W）、20W（出生20W）大鼠的RGCs,利用qRT-PCR及免疫荧光方法检测JARID1B及其相关分子的mRNA及蛋白表达变化水平及趋势。3.利用Cumate-pLenti-JARID1B-SV40-GFP慢病毒质粒转染培育3天的P6 RGCS使其过表达JARID1B,空病毒载体组作为对照,观察其对体外培养条件下自然凋亡（或坏死）的RGCs存活的影响。4.本文采用SPSS软件进行统计学分析,均通过方差齐性检验,配对资料采用配对t检验,不同组间比较采用独立样本t检验,检验水准为0.05,P<0.05说明差异有统计学意义。结果:1.OX-7杂交瘤细胞培育结果良好,所提取出的上清液含Thy-1.1抗体浓度高,用于阳性筛选大鼠RGCs效益好,收益率达1.5万个细胞/视网膜,连续观察培养RGCs无污染等现象,且可长期贮存,易于推广。2.此抗体筛选方法培养出的RGCs生长良好,纯度较高,体外可存活9天;P3RGCs存活时间相对更长,高密度接种的RGCs形成的细胞间突起连接更多,死亡速度更慢。3.WB检测H3K4me3蛋白在大鼠视网膜发育的不同阶段（P6、P14、成鼠）表达无显着差异;qRT-PCR检测JARID1B的mRNA表达量在大鼠初生时随发育逐渐增高,在P14后的某一时间点到达高峰,至20W（老年期）下降;细胞免疫荧光检测其蛋白表达证实了转录水平与翻译水平的统一。4.以慢病毒作为载体使体外培养的RGCs过表达JARID1B,观察到体外培养条件下会自然凋亡（或坏死）的RGCs存活时间延长,同一时间点镜下存活细胞较对照组多,且形态更稳定。结论:1.通过培育OX-7杂交瘤细胞提取的含Thy-1.1抗体上清液用于大鼠RGCs阳性筛选效益好,易于推广。培养出的RGCs生长良好,纯度较高,P6 RGCs体外存活时间可达9d,可以用于进一步的基础研究。2.JARID1B很有可能参与了RGCs的分化、成熟、凋亡过程,在RGCs发育过程的不同阶段发挥着不同的作用;H3K4me3与JARID1B在RGCs发育中的相互作用需要进一步研究。3.JARID1B过表达可使体外培养的RGCs存活时间延长,并维持RGCs形态及轴突连接,显示了JARID1B在维持RGCs活性、抑制RGCs凋亡乃至促进RGCs再生方面的可能潜力。
徐金辉[6]（2020）在《敲除KLF4基因促进哺乳动物轴突再生》文中研究说明目的:神经轴突再生是神经损伤后功能恢复的基础,然而在临床上神经轴突再生特别是中枢神经系统（Central nervous system,CNS）轴突的再生依然是一个难以解决的问题。神经元轴突的完整性在神经元之间物质运输及信号传递起着非常重要的作用。轴突再生能力的强弱取决于神经元所处的环境以及自身的再生能力。Kruppel样因子4（Kruppel-like factor4,KLF4）是锌指蛋白转录因子家族的成员。研究发现敲除Klf4基因可以促进视网膜神经节细胞（Retinal ganlion cells,RGCs）的轴突再生,但是敲除Klf4基因对皮质脊髓束（Corticospinal tract,CST）和坐骨神经再生的影响未知。因此,本课题拟通过脊髓夹伤模型、坐骨神经夹伤模型及体外神经元培养等方法研究敲除Klf4对哺乳动物轴突再生的影响。方法:1.为了构建背根神经节（Dorsal root ganglion,DRG）感觉神经元内Klf4特异性敲除小鼠,我们用Klf4 floxed（Klf4f/f）小鼠分别与Advillin-Cre（Avil-Cre）小鼠和Pirt-Cre小鼠交配,所生子代再与Klf4f/f小鼠交配,最终获得Klf4f/f/Avil-Cre小鼠和Klf4f/f/Pirt-Cre小鼠,分别使用染色和蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）检测Klf4敲除后蛋白表达变化情况。2.成年ICR（Institute of Cancer Research）小鼠接受了坐骨神经切断术（axotomy）,WB用于检测axotomy后1、3、7、21天KLF4蛋白表达的变化,然后对axotomy后7天的DRG组织切片进行免疫荧光染色检测KLF4蛋白的变化。3.体外取Klf4f/f/Avil-Cre、Klf4f/f/Pirt-Cre及Klf4f/f小鼠的DRG感觉神经元培养3天。用神经元特异性抗体免疫荧光染色测定并统计轴突长度。4.对Klf4f/f/Avil-Cre、Klf4f/f/Pirt-Cre及Klf4f/f小鼠的DRG进行体内电穿孔转染EGFP（Enhanced green fluorescent protein）质粒以标记感觉神经元轴突,2天后夹伤坐骨神经,再3天取坐骨神经压片,测量再生轴突长度。5.对Klf4f/f小鼠大脑皮层注射AAV-Cre病毒以敲除皮层Klf4基因,对照组注射AAV-GFP病毒。2周后进行T8脊髓夹伤,再过6周在大脑皮层注射生物素葡聚糖胺（Biotin dextran amine,BDA）以标记CST,再2周处死小鼠取脊髓进行冰冻切片。对切片进行CyTM3染色以标记CST,统计再生轴突情况。结果:1.与Klf4f/f小鼠相比,Klf4f/f/Avil-Cre小鼠和Klf4f/f/Pirt-Cre小鼠DRG切片的免疫荧光染色显示DRG感觉神经元核内KLF4表达减少。WB显示Klf4f/f/Avil-Cre小鼠和Klf4f/f/Pirt-Cre小鼠DRG中的KLF4蛋白表达量明显降低（P<0.01）。上述结果表明KLF4在DRG感觉神经元中被特异性敲除,我们成功构建出所需实验小鼠。2.对ICR小鼠行axotomy后,WB显示KLF4的表达量降低,其中第7天降到最低（P<0.01）,第21天较第7天略有增加。axotomy后第7天的DRG组织冰冻切片免疫荧光染色显示,核内KLF4蛋白表达降低,提示KLF4可能和感觉神经元轴突再生有关。3.DRG感觉神经元的体外培养实验显示Klf4f/f/Avil-Cre小鼠（P<0.01）和Klf4f/f/Pirt-Cre小鼠（P<0.001）再生的轴突长度比Klf4f/f小鼠长。4.敲除Klf4能促进坐骨神经损伤后的再生（P<0.001）。5.在大脑皮层敲除Klf4基因,能促进脊髓损伤后CST的再生（P<0.05）。结论:敲除Klf4基因能促进哺乳动物轴突的再生。
王磅博[7]（2020）在《搭载神经营养因子的聚己内酯纳米纺丝共聚物对脊髓损伤的修复作用》文中研究说明研究背景脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）是一种严重的公共健康问题,全世界每年大约有25万-50万例新发病例[1,2]。高处坠落、车祸、运动性伤害以及暴力等外界物理因素突然作用于脊髓,一系列复杂的病理生理变化随之发生,从急性期和亚急性期的出血、胶质细胞和神经元的坏死、自由基的释放、炎症细胞的浸润,到慢性期胶质瘢痕以及囊性空洞的形成、神经细胞生长因子以及轴突生长底物的缺乏,等严重阻碍了脊髓的结构和功能恢复。这不仅给患者带来灾难性的身心创伤,而且由于他们长期住院,康复效果欠佳以及对护理的过度依赖,给社会及其家庭带来了沉重的经济负担。在过去的一个世纪以来,在SCI机制方面研究的进步促进了临床干预的发展。大剂量激素使用、外科手术减压和康复训练降低了SCI患者的致残率,并改善了其功能结局[2,3]。然而,临床疗效与理想相距甚远。在全球越来越重视科研的前提下,过去的几十年见证了一系列SCI基础研究的发展,比如神经保护性药物、细胞移植、生物组织工程、深部电刺激以及脑机接口等。这些研究为SCI患者带来了希望[4]。用于桥接局部缺损组织、为组织生长提供支架的组织工程技术也成为研究的焦点。迄今为止,胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、聚乳酸-乙醇酸等各种生物相容性材料已被用于脊髓损伤的修复研究中。然而,单一的材料移植对于复杂的脊髓损伤效果有限。此外,在干细胞移植中,如何解决干细胞在损伤局部恶劣微环境中存活的问题,以及如何进行定向分化,这一系列的问题仍然有待解决。目的近年来,关于脊髓损伤修复的研究越来越达到共识,研究表明脊髓损伤的修复若想取得较好的结果,单一的干预方式效果有限。针对脊髓损伤的病理生理学基础,在不同的阶段进行对应的干预,可取得较好的效果[5]。这些必要条件包括:（1）激发神经元内在的再生能力[6];（2）神经元轴突再生延伸所需要的支撑性底物[7,8];（3）进一步生长所需要的化学诱导因子[9];（4）术后康复训练[10,11]。针对这一观点,我们试图利用聚己内酯（Poly-ε-caprolacton,PCL）作为轴突定向生长所需要的引物,并且体外验证PCL对PC12细胞生长的影响。利用成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2,FGF2）和表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）诱导周围细胞分泌层粘连蛋白等支撑轴突生长所需要的底物。利用胶质细胞源性神经营养因子（glial-derived neurotrophic factor,GDNF）作为进一步化学诱导轴突生长所需要的化学诱导因子。水凝胶作为这些生长因子的载体,将富含这三类细胞因子的水凝胶均匀填充到聚己内酯（PCL）纳米纺丝周围,体外证实支架复合物的理化性质,而后将合成的支架复合物移植到横断性脊髓损伤大鼠的缺损部位,企图用于脊髓损伤的修复。方法1搭载神经营养因子的聚己内酯水凝胶纳米纺丝共聚物的制备及其理化性质研究1.1 PCL纳米纺丝的鉴定和PCL水凝胶理化特性研究:通过红外光谱和核磁光谱分析对PCL进行鉴定,通过扫描电镜对PCL水凝胶微观结构进行观察,采用全自动比表面及孔隙度分析仪BET对水凝胶比表面积、孔径大小进行检测,使用通用拉伸机对PCL水凝胶的压缩模量进行测定。1.2搭载神经营养因子聚己内酯水凝胶纳米纺丝共聚物的缓释特性研究:采用ELISA对支架复合物释放缓慢释放细胞因子的特性进行研究。2 PC12细胞和原代神经元分别与PCL纳米纺丝共培养:对PCL消毒灭菌处理后,将PCL固定细胞培养皿中,接种PC12细胞或者原代神经元,共培养后使用CCK-8法检测PCL对PC12细胞和原代神经元细胞的相容性。使用免疫荧光观察微管蛋白MAP2的表达情况,观察PCL对PC12细胞生长的影响,并对黏附定向生长的细胞进行计数。通过体外实验观察PCL纳米纺丝对神经细胞生长的影响,为体内的实验奠定基础。3支架复合物移植用于大鼠横断性脊髓损伤的修复研究:将30只220g左右的雌性SD大鼠随机分为脊髓损伤对照组（10只）、水凝胶/细胞因子组（10只）和PCL/水凝胶/细胞因子组（10只）,采用显微手术技术完全横断大鼠T9脊髓组织,成功建立横断性脊髓损伤大鼠模型,分别将水凝胶/细胞因子和PCL/水凝胶/细胞因子移植到脊髓缺损部位。在术后1天,7天而后每周一次,持续8周使用BBB评分对各组大鼠后肢运动功能进行评估。在植入后2月,对大鼠进行灌注、取材和脊髓组织切片。对脊髓损伤部位的大体形态进行观察,使用HE染色观察损伤部位组织生长情况,采用免疫荧光染色观察损伤部位神经元（MAP2阳性细胞）轴突的再生情况,同时观察损伤部位层粘连蛋白底物的生长情况,进而探讨支架复合物对脊髓损伤的修复作用。结果1搭载神经营养因子聚己内酯水凝胶纳米纺丝共聚物的制备及其理化性质研究1.1通过红外光谱和核磁光谱分析对PCL进行鉴定时,发现其特征峰符合PCL特征峰的要求,扫描电镜观察PCL水凝胶具有良好的的三维立体结构,水凝胶表面布满微孔,PCL纳米纺丝为表面粗糙的纤维样结构,纤维直径约200 um±5 um。全自动比表面及孔隙度分析仪BET对水凝胶孔径大小测定结果发现:水凝胶的BET比表面积和孔径分别为7.7254 m2g-1、16.66?。既往研究表明[12],具有相似BET比表面积物理性质的水凝胶具有良好的吸附能力。对PCL水凝胶的压缩模量进行测定后,发现:单纯的水凝胶压缩形变在20%-30%时,压力变化区间在0.83-2.40Kpa,PCL水凝胶复合物压力变化区间在2.75-5.07 Kpa,虽然两者有较大差异,但是都依然接近于正常脊髓组织的形变模量[13,14]。1.2搭载神经营养因子聚己内酯水凝胶纳米纺丝共聚物的缓释特性研究:使用ELISA对支架复合物释放缓慢释放细胞因子特性的研究表明:支架复合物对FGF 2,EGF和GDNF具有良好的缓释作用。当缓释实验进行到21天时,累积释放量接近25%。这些细胞因子的持续缓慢释放有利于刺激周围细胞分泌支持神经元轴突生长的底物,以及进一步化学诱导轴突的生长。2 PC12细胞和原代神经元分别与PCL纳米纺丝共培养:PC12细胞和原代神经元分别与PCL纳米纺丝共培养,CCK-8分析表明:PCL组和对照组之间在450nm处的吸光度没有显着差异。共培养免疫荧光图像表明:与对照组相比,单纯PCL可以促进神经突粘附和定向生长。此外,我们量化了不同组中的定向生长细胞。我们发现,PCL组中定向生长细胞的数量显着高于对照组。3支架复合物移植用于大鼠横断性脊髓损伤的修复研究:体内实验表明,从支架复合物干预后第7周开始,PCL/水凝胶/细胞因子组的行为学评分（BBB评分）结果显着高于对照组和水凝胶/细胞因子组（P?0.05）。体内组织学HE染色表明,在损伤部位,对照组和水凝胶/细胞因子组出现明显的组织空洞、结构杂乱,PCL/水凝胶/细胞因子组损伤部位组织相对有序,沿着PCL方向有序排列。体内组织免疫荧光结果显示,在损伤部位,PCL/水凝胶/细胞因子组神经元（MAP2阳性细胞）的轴突沿着PCL纤维束方向生长,在损伤部位轴突的量进行定量后发现其显着多于损伤对照组和水凝胶/细胞因子组（P?0.05）。对损伤部位层粘连蛋白的免疫荧光染色以及定量表明,层粘连蛋白再生的量PCL/水凝胶/细胞因子组也显着多于对照组损伤对照组和水凝胶/细胞因子组（P?0.05）。结论通过体外对PCL制备以及鉴定,使用扫描电镜对PCL以及水凝胶微观结构进行观察,使用通用拉伸机对其机械形变性质进行测量,采用ELISA对其细胞因子缓释特性进行分析,发现其具有良好的比表面积、缓释特性以及和正常脊髓组织类似的机械硬度。随后在体外,使用单纯的PCL分别与PC12细胞和原代神经元进行共培养,CCK-8结果表明PCL没有对细胞产生毒性,免疫荧光结果提示PCL能够促进细的黏附和定向生长。体内实验表明:PCL/水凝胶/细胞因子支架复合物,通过PCL为神经元的生长提供方向性指引和结构支撑,通过搭载有细胞因子的水凝胶为神经元轴突的生长、延伸以及底物的产生提供良好的微环境,促进了脊髓损伤的修复,为进一步的研究奠定了基础。
齐士斌[8]（2020）在《NF-κB/STAT3信号通路调控成年神经元的轴突再生及相互关系》文中研究表明目的临床上,周围神经损伤后的轴突生长不仅扮演着重要的角色,也是目前面临的难题。周围神经损伤后,主要表现为轴突连续性的中断,导致了神经炎症反应和神经轴突信号传递的缺失,最终致使患者感觉和运动功能的丧失。众所周知,炎症反应是调控神经轴突再生的重要因素之一。核因子κB（nuclearfactorkappa-B,NF-κB）作为经典的炎症因子参与到许多的炎症反应,并在其中起着重要的调控作用。然而,NF-κB在成年哺乳动物的感觉神经元轴突再生作用却是未知的。信号转导转录因子3（signal transductionoftranscriptionfactor,STAT3）同样具有调控炎症因子的合成及释放,在神经轴突再生具有一定的作用。在此,我们发现周围神经损伤后,NF-κB和STAT3均在成年感觉神经元中激活。此外,药物抑制NF-κB和STAT3的表达均可阻碍周围感觉神经元在体外及体内的轴突生长;相反,激活NF-κB后,体外轴突再生未表现出明显促进作用,而激活STAT3则可促进神经轴突的再生。此外我们还发现STAT3的激活显着促进视神经的体内再生,并在一定程度上提高了视网膜神经节细胞的存活率。更重要的是,激活STAT3可以逆转由于NF-κB受抑所引起的轴突生长受阻。综上所述,本研究表明NF-κB通过STAT3调节成年感觉神经元轴突生长。方法1.本课题研究采用外周神经损伤模型,于损伤1、3、7天后取背根神经节（dorsal rootganglion,DRG）,对感觉神经元中NF-κB及STAT3的蛋白表达进行蛋白质免疫印迹（Western Blot）定量检测。2.体外应用DRG感觉神经元培养模型,通过特异性的化学药物及小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）抑制NF-κB及STAT3的蛋白表达,体外培养3天后,经特异性神经元标记抗体进行免疫荧光染色,标记神经元再生轴突并统计测量其长度,以此检测NF-κB及STAT3对轴突再生的功能作用。3.体外DRG感觉神经元培养,通过特异性化学激活剂激活NF-κB及STAT3的活性表达,体外培养2天后,使用特异性神经元标记抗体通过免疫荧光染色标记再生轴突并统计测量其长度,以此检测NF-κB及STAT3对轴突再生的功能作用。4.体内DRG电穿孔转染特异性siRNA与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）混合溶液至腰椎4、5（Lumbar4～5,L4～5）抑制NF-κB及STAT3的活性,2天后行坐骨神经夹伤,5天后取出夹伤侧坐骨神经进行压片,统计测量被GFP转染标记的神经元再生轴突,以此检测两者在体内对轴突再生的功能作用。5.利用玻璃体注射及视神经损伤模型,将20%乙醇或STAT3特异性激活剂注射进入玻璃体并同时进行视神经损伤。术后12天再次注射Alexa-488标记的霍乱毒素B（Alexa-488-CTB）进入眼球玻璃体内顺行标记再生轴突。术后14天使用4%多聚甲醛固定视神经并通过10%、20%、30%蔗糖梯度脱水处理。冰冻切片后,测量统计视网膜神经节细胞的存活率及视神经轴突再生情况。6.利用视神经损伤模型,于损伤后14天,取出视网膜,冰冻切片后,通过特异性神经元免疫荧光染色统计视网膜神经节细胞的存活率,以此确定激活STAT3在一定程度上促进节神经元的存活。结果1.NF-κB调控感觉神经元轴突再生。1)外周神经损伤后,DRG神经元内p-p65蛋白表达逐渐升高,且在第3、7天最为明显。2)药物PDTC抑制NF-κB活性,或转染p65小干扰RNA敲减其蛋白,阻碍了体外培养的DRG感觉神经元轴突的生长。3)p65小干扰RNA体内电转染至L4/L5 DRG内,敲减NF-κB蛋白后,坐骨神经轴突再生受到抑制。4)相反,药物VP16虽促进了磷酸化p65表达升高,但体外感觉神经轴突的生长未表现出明显的增长。2.STAT3调控感觉神经元轴突再生。1)外周神经损伤后,DRG神经元内磷酸化STAT3表达在第一天达到高峰,此后呈现逐渐降低趋势。2)药物S3I-201抑制STAT3活性,或转染siRNA敲减其蛋白,体外培养的DRG感觉神经元轴突再生受到阻碍。3)特异性STAT3小干扰RNA电转染至L4/L5 DRG感觉神经元中,坐骨神经轴突的生长受抑。4)药物CLN不仅促进了磷酸化STAT3表达明显升高,还可显着促进成年感觉神经元的轴突再生。5)玻璃体内注射CLN激活STAT3活性,既促进视神经轴突的生长,也提高了视网膜神经节细胞的存活率。3.NF-κB通过STAT3调控感觉神经元轴突再生。1)通过PDTC抑制NF-κB活性后,不仅能降低p-p65,还能致使p-STAT3表达降低。2)使用CLN激活STAT3活性,可在一定程度上逆转NF-κB抑制剂所带来的阻碍感觉神经元轴突再生的作用。结论外周神经损伤后轴突再生的过程比较复杂,它受体内多种基因严格的联合调控。一般情况下,神经损伤后常伴随炎症反应及相关转录因子的激活,以此来调控损伤后轴突再生所需的必要物质。本研究结果表明,NF-κB及STAT3均具有调控感觉神经轴突再生的功能,且揭示了 NF-κB能通过调节STAT3进一步调控轴突再生。更为重要的是,激活STAT3不仅能促进视神经受损后的轴突再生,还可在一定程度上提高视网膜神经节细胞的存活率。
吴蕾[9]（2020）在《MMP9在氯胺酮所致发育早期神经元凋亡中的作用》文中提出长时间或反复接受全身麻醉可引起幼年动物中枢神经系统神经元细胞的广泛凋亡。全麻药引起的凋亡主要发生在突触形成高峰期,也被定义为易感窗口期,但全麻药引起窗口期神经元凋亡的机制尚不明确。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMP）是锌离子依赖的内肽酶,可以通过降解或修饰细胞外基质（extracellular matrix,ECM）在早期神经元发育过程中发挥重要的调节作用。既往研究发现,ECM中层粘连蛋白的降解导致新生神经元的凋亡。全麻药是否通过MMP影响层粘连蛋白的降解引起发育早期神经元的凋亡尚不清楚。本研究应用新生乳鼠离体全层视网膜模型,结合免疫组织化学,Western blot,TUNEL等技术探讨MMP9在氯胺酮引起发育窗口期视网膜神经元凋亡中的作用及可能的机制。结果发现,150μM氯胺酮孵育5h能够诱导发育窗口期大鼠视网膜节细胞层神经元凋亡且高峰期在P7天。发育易感窗口期MMP9在节细胞层的表达及活性在P7天一过性增高,与节细胞层神经元凋亡高峰期及趋势相吻合,而层粘连蛋白表达趋势与神经元的凋亡趋势相反。150μM氯胺酮能够明显增加发育窗口期MMP9的表达及活性,降低层粘连蛋白的表达。进一步研究发现,阻断非整合素层粘连蛋白受体（lamnin receptor,LR）明显促进氯胺酮诱导的神经元凋亡,而非整合素LR的激活明显减弱氯胺酮诱导的凋亡。抑制MMP9的活性可通过减少层粘连蛋白的降解,明显降低氯胺酮诱导的神经元凋亡。此外,外源性锌离子明显增加了氯胺酮引起的神经元凋亡,而锌离子螯合剂减弱了氯胺酮引起的神经元凋亡,其机制可能与下调Zn2+降低MMP9的活性、减少层粘连蛋白的降解有关。另外,抑制MMP9的活性、激动非整合素LR明显减轻150μM氯胺酮引起的小胶质细胞的激活,以及TNF-α、IL-1β、CXCL10、CCL2的释放。因此,MMP9通过降解层粘连蛋白参与氯胺酮所致视网膜神经元的凋亡。MMP9参与了氯胺酮引起的小胶质细胞的激活、炎症介质的释放,可能加剧神经元的凋亡。下调Zn2+、抑制MMP9活性或增加层粘连蛋白的表达可以对氯胺酮诱导的神经元凋亡起保护作用。另外,在临床研究中,为了有效评估患儿的麻醉状态,减少麻醉药的用量,以避免在深度麻醉下引起对发育期大脑的影响,我们探讨了基于脑电图的镇痛指数（pain threshold index,PTI）和镇静指数在小儿全麻中的作用,并发现PTI可以用于预测气管插管和切皮引起的血流动力学反应,ROC曲线下面积分别为0.81和0.82,而镇静指数不能预测伤害性刺激引起的血流动力学反应。因此,PTI可为小儿手术期间麻醉药物的使用提供指导。
李越[10]（2019）在《新型组织工程神经调节的炎性微环境对大鼠SN长段缺损的修复作用》文中提出现代战争中各种火器的强大动能极易导致周围神经缺损,平时周围神经损伤则常见于交通事故、肿瘤切除、炎性疾病、先天性畸形等因素。缺损性周围神经损伤不仅难以修复,也给病人及社会带来沉重负担。与再生能力低下的中枢神经系统损伤相比,长度小于0.5cm的周围神经缺损可采用神经吻合术进行处理,预后往往较好。当神经缺损大于4cm时则首先采用自体神经移植进行修复,但以自体神经为供体不仅来源受限、匹配困难,也存在很多后遗症,且修复效果也并非尽如人意。同种异体神经虽已开展临床应用研究,但修复效果远不如自体神经,亦存在免疫排斥问题。近年来快速发展的组织工程神经技术为神经缺损修复带来了新希望,其优点在于:一是可以作为自体神经和同种异体神经的替代物,二是可以修复更长的神经缺损,三是可以根据神经缺损长度和直径“量身定做”。虽已有少量组织工程神经用于临床,但存在神经再生缓慢、神经结构和功能恢复欠佳等问题。从以往组织工程神经及其修复周围神经缺损的研究来看,目前学者正从以下几个方面对组织工程神经技术进行改进:一是支架材料的合成、筛选与神经导管制作,目前认为PLGA是较为理想的支架材料;二是选择更适宜的种子细胞,以往曾用种子细胞有ESCs、NSCs、BMSCs、ADSCs、DPSCs、SCs、OECs等多种,表皮神经嵴干细胞（Epidermal neural crest stem cells,EPI-NCSCs）易于获取、自我更新能力强、且具有多向分化、分泌神经营养因子、致瘤风险低等优点,显示了较好的应用前景;三是选择更优秀的细胞外基质,以强化移植修复过程中对神经再生的诱导和促进作用。同时,人们还发现,炎性免疫反应对于神经缺损的修复有十分重要的影响,这也成为近年研究的一个热点,对其进行探讨将有助于从机制上突破现有神经缺损修复的困境。炎性免疫反应在组织创伤修复过程中具有重要作用,深刻影响着神经再生的病理生理过程。炎性免疫反应是由免疫活性细胞和炎性细胞因子构成的复杂网络,近年来人们逐渐认识到巨噬细胞是这一网络中关键的免疫活性细胞,它在神经缺损修复过程中既能向M1型极化从而产生神经毒性,也能向M2型极化而利于神经损伤修复。目前认识到炎性细胞因子主要有两类,一类是促炎因子,如IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等,可加剧炎性反应;另一类是抗炎因子,如IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β1等,则可以抑制炎性反应。本研究在课题组既往建立的人工神经制备方法基础上,提出以EPI-NCSCs这样一种从自体毛囊获得的神经干细胞,结合PLGA支架及ECM细胞基质构建出新型组织工程神经,观察其桥接移植的修复效果,并着重从其对炎症反应调控的角度,研究其作用机制。首先将新型组织工程神经桥接于大鼠坐骨神经（Sciatic nerve,SN）缺损处（缺损总长度为15mm,该长度相当于人体神经缺损12.8-14.2cm）。再于桥接后9周内分别采用不同指标,观察新型组织工程神经在移植修复过程中对巨噬细胞的极化状态、炎性因子表达变化的调控及其对于缺损坐骨神经结构和功能的修复作用。拟解决的关键科学问题是:新型组织工程神经对局部神经组织内的巨噬细胞极化是否具有调节作用?新型组织工程神经能否调控局部炎性细胞因子的表达?调控后的炎性免疫微环境是否更有利于周围神经缺损的移植修复?材料与方法1.EPI-NCSCs培养与组织工程神经制作及坐骨神经桥接（1）细胞培养:EPI-NCSCs取自GFP转基因大鼠毛囊中,用DMEM/F12/FBS/bFGF培养液原代培养,PBS液洗涤覆有细胞的载玻片后,用Nestin/SOX10一抗工作液4℃孵育过夜,PBS漂洗后用Cy5-IgG/Alexa-Flour-594-IgG二抗工作液37℃避光孵育,然后计算SOX10+/Nestin+细胞数量。（2）PLGA支架:将PLA/PGA按85/15的比例混匀后溶于三氯甲烷制备5%溶液,玻璃培养皿中蒸发形成厚约25um的PLGA膜,然后卷膜制成PLGA导管,γ射线照射灭菌,用前以DMEM/F12浸润。（3）常规麻醉SD大鼠,暴露右侧坐骨神经,切除10mm坐骨神经,残端回缩形成长约15mm缺损。然后用PLGA导管套接于神经断端,注入25μL EPI-NCSCs/ECM,8-0缝线缝合断端,逐层缝合肌肉皮肤。2.调控巨噬细胞极化（1）免疫荧光鉴定:同上麻醉SD大鼠,暴露并取出长约20 mm坐骨神经,切为20μm冰冻切片,入TritonX-100 15分钟,山羊血清封闭1小时,用CD68/iNOS一抗（M1型巨噬细胞）和CD206/Arginase-1一抗（M2巨噬细胞）4℃孵育过夜,TRITC-IgG/FITC-IgG二抗避光孵育2小时,Hoechst33342细胞核染色,避光孵育30分钟。（2）成纤维细胞和SCs免疫荧光鉴定:SD大鼠麻醉后取出坐骨神经,制成20μm冰冻切片,用Vimentin一抗（成纤维细胞）和S-100一抗（SCs）孵育,二抗工作液为TRITC-IgG/FITC-IgG（1:200）,细胞核用Hoechst33342染色。3.炎性细胞因子调节（1）Western-blot测定:将所取坐骨神经匀浆后提取总蛋白,然后定量蛋白浓度,再进行SDS-PAGE电泳、转膜,用IL-4/IL-6/IL-13/TNF-α/actin一抗孵育,再用辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗孵育,PVDF膜曝光后用Image J图像分析软件测算条带灰度值,actin内参作对照。（2）免疫组化染色:SD大鼠麻醉、取出坐骨神经后制作4μm石蜡切片,脱蜡水化后经3%过氧化氢室温10分钟,山羊血清封闭1小时,用IL-4/IL-6/IL-13/TNF-α一抗过夜孵育,再用山羊抗兔/鼠IgG二抗孵育,链霉亲和素-过氧化物酶30分钟,DAB显色,光镜观察分析。（3）免疫荧光染色:SD大鼠麻醉、灌注固定、取出坐骨神经后后制作20μm冰冻切片,入0.3%TritonX-100室温15分钟,山羊血清室温封闭1小时,用IL-4/IL-6/IL-13/TNF-α一抗过夜孵育,二抗TRITC-IgG/FITC-IgG避光孵育2小时,Hoechst33342细胞核染色,荧光显微镜下拍照与分析。4.缺损坐骨神经修复（1）组织学观察:术后9周时麻醉、固定大鼠、取出坐骨神经行石蜡包埋,切4μm切片,HE染色,光学显微镜观察分析。（2）运动终板检测:术后9周取腓肠肌制作30μm冰冻切片,AChE染色,光学显微镜观察,Image ProPlus图像软件分析。（3）感觉功能评估:术后9周时将大鼠两侧后足浸入50℃热水中,记录两侧后足的回缩反射时间,痛温觉用LFRT表示。（4）运动功能评估:术后9周时记录大鼠后足足印迹,分别测量TS、ITS、PL,然后根据公式计算SFI。（5）神经电生理检测:术后9周时麻醉大鼠,暴露实验侧和正常侧坐骨神经,双钩状电极（极间距2 mm）刺激,双极针形电极记录,刺激间期0.25 ms,刺激强度10mA,刺激频率1Hz,每只大鼠重复记录5次,结果用PowerLab软件分析。（6）腓肠肌湿重恢复检测:术后9周时,麻醉大鼠后切取实验侧和正常侧腓肠肌,吸去血迹后立即用电子天平称重,结果以实验侧腓肠肌重量/正常侧腓肠肌重量×100%表示。5.统计学分析以SPSS（版本22.0）数据统计软件进行统计分析,以均数±标准差表示,以独立样本t检验进行组间比较,P<0.05表示存在显着性差异,P<0.01表示存在极显着性差异。结果1.从GFP大鼠毛囊中获得EPI-NCSCs,经SOX10和Nestin双标鉴定,其纯度高达99.23±2.1%,移植到缺损10mm坐骨神经后,至少在宿主组织内存活9周。所制作的PLGA导管管壁表面为网状结构,间有很多直径约6μm左右的微孔,从而为EPI-NCSCs粘附生长提供了结构基础,也为种子细胞获得环境营养提供了结构保障。2.组织工程神经桥接坐骨神经缺损后1周,可明显提高M2巨噬细胞的比例,降低M1巨噬细胞的数量。桥接后3周时,有利于神经再生的SCs数量和活性被显着提高,而阻碍神经再生的成纤维细胞数量和活性则被明显降低。在所用组织工程神经各成分中,种子细胞EPI-NCSCs在这些有益效应中发挥了关键作用。3.组织工程神经桥接坐骨神经缺损后1、3、7、14、21天,Western-blot、免疫荧光和免疫组化实验证实,宿主组织抗炎因子IL-4和IL-13的表达呈逐渐增强的趋势,而促炎因子IL-6和TNF-α则呈逐渐下降的趋势。抗炎因子水平的提高和促炎因子水平的下降,为坐骨神经损伤后的神经纤维再生提供了更适宜的炎性免疫微环境。4.术后9周时,形态组织学观察证实组织工程神经桥接恢复了缺损坐骨神经的连续性,且神经直径更粗,组织结构更致密,神经纤维成分更多,运动终板数量更多体积也更大。LFRT测定表明感觉功恢复更好。SFI评估显示明显提高了运动功能的恢复水平。与此同时,肌肉湿重恢复率明显优于对照组动物。神经电生理检查证实电位的潜伏期缩短,电位幅度提高,说明神经传导速度更快,对刺激反应更强。结论本研究制备的组织工程神经中的种子细胞EPI-NCSCs至少可在宿主组织内存活9周。组织工程神经在移植过程中一方面促使宿主组织内巨噬细胞向M2型极化,促进抗炎因子（IL-4,IL-13）表达,增加有利于神经纤维再生的SCs数量;另一方面降低M1巨噬细胞的数量,抑制促炎因子（IL-6,TNF-α）的表达,降低抑制神经纤维再生的成纤维细胞数量。组织工程神经调控的局部炎性免疫微环境提高了长节段缺损坐骨神经结构与功能的恢复水平。
二、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白在成年大鼠不同视神经再生模型中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白在成年大鼠不同视神经再生模型中的表达（论文提纲范文）
（1）大鼠RGCs发育过程中Jarid1b表达变化及视神经损伤后Jarid1b和H3K4me3的表达变化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 大鼠RGCs的原代培养和鉴定 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料及准备 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要设备、仪器 |
| 1.4 其余试剂、仪器 |
| 1.5 试剂准备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验准备 |
| 2.2 解剖视网膜组织及消化 |
| 2.3 组织研碎 |
| 2.4 细胞接种 |
| 2.5 细胞消化 |
| 2.6 铺板 |
| 2.7 纯度鉴定 |
| 结果 |
| 1 RGCs的形态学观察情况 |
| 2 鉴定结果 |
| 讨论 |
| 1 RGCs培养方法总结与改进 |
| 2 RGCs培养基、培养板处理及纯度鉴定 |
| 3 存在问题及解决方案 |
| 第二部分 Jarid1b在大鼠RGCs发育过程中的表达变化 |
| 材料与方法 |
| 1 标本采集与保存 |
| 2 主要试剂及耗材 |
| 3 主要设备及仪器 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 qRT-PCR检测大鼠发育过程中RGCs中的Jarid1b的表达变化 |
| 5 统计分析 |
| 结果 |
| 1 qRT-PCR检测大鼠RGCs发育中Jarid1b的mRNA表达情况 |
| 讨论 |
| 第三部分 视神经损伤后Jarid1b和H3K4me3的表达变化 |
| 材料与方法 |
| 1 实验动物和饲养环境 |
| 2 实验试剂及药品 |
| 3 使用实验设备及仪器 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 qRT-PCR检测视神经损伤后大鼠RGCs中的Jarid1b的表达变化 |
| 4.2 免疫组化分析视神经损伤后Jarid1b和H3K4me3的表达变化 |
| 5 统计分析 |
| 结果 |
| 1 RT-qPCR检测视神经损伤后RGCs中Jarid1b的表达变化 |
| 2 大鼠视神经轴突中Jarid1b的表达变化 |
| 3 大鼠视神经轴突中H3K4me3表达变化 |
| 讨论 |
| 1 视神经损伤动物模型方法总结 |
| 2 损伤后Jarid1b和H3K4me3的表达变化 |
| 3 问题与总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 视神经再生机制研究进展 |
| 引言 |
| 1 炎症刺激促进视神经再生 |
| 2 提供外源神经营养因子 |
| 3 抑制视神经再生的内在抑制因子 |
| 4 激活细胞内信号通路 |
| 5 改善视神经抑制性细胞外环境 |
| 6 视神经损伤后靶神经的再支配 |
| 结论 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（2）凝集蛋白agrin抗体致重症肌无力及agrin在肌肉再生中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 NMJ的形成与功能维持 |
| 1.2 Agrin-LRP4-MuSK信号通路 |
| 1.2.1 Agrin蛋白对NMJ的形成起重要作用 |
| 1.2.2 LRP4是agrin-LRP4-MuSK信号通路的关键分子 |
| 1.2.3 MuSK蛋白保证了NMJs的形成及功能的发挥 |
| 1.3 重症肌无力与自身免疫 |
| 1.3.1 抗ACh Rs抗体 |
| 1.3.2 抗MuSK抗体 |
| 1.3.3 抗LRP4抗体 |
| 1.3.4 抗agrin抗体 |
| 1.3.5 其他类型的抗体 |
| 1.4 杜氏肌萎缩与肌肉卫星细胞及肌肉再生 |
| 1.5 Agrin与肌肉再生 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验药品及溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物设计及目的基因的扩增 |
| 2.2.2 原核表达载体的构建 |
| 2.2.3 目的蛋白的诱导表达 |
| 2.2.4 SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定表达蛋白 |
| 2.2.5 重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.2.6 EAMG小鼠模型的建立 |
| 2.2.7 免疫后小鼠抗体检测 |
| 2.2.8 肌力测定 |
| 2.2.9 倒挂悬网实验测定 |
| 2.2.10 肌肉收缩力测定 |
| 2.2.11 肌肉电生理 |
| 2.2.12 神经肌肉接头染色 |
| 2.2.13 真核表达载体pFLAG-CMV1-N-agrin的构建 |
| 2.2.14 HEK293T细胞系培养及目的蛋白的表达 |
| 2.2.15 C_2C_(12)细胞系培养 |
| 2.2.16 小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.17 荧光定量PCR |
| 2.2.18 CTX肌肉损伤再生模型建立 |
| 2.2.19 肌肉单纤维分离与培养方法(参照 Shan et al,Stem cells.2014) |
| 2.2.20 肌卫星细胞分离培养与诱导分化 |
| 2.2.21 HE染色 |
| 2.2.22 统计方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 第一部分:抗N-agrin抗体致重症肌无力 |
| 3.1 N-agrin及M-agrin原核表达载体的构建及蛋白纯化 |
| 3.1.1 N-agrin及M-agrinDNA片段扩增及产物鉴定 |
| 3.1.2 N-agrin及M-agrin原核表达质粒的构建 |
| 3.1.3 N-agrin及M-agrin蛋白纯化及鉴定 |
| 3.2 重症肌无力小鼠疾病模型的建立 |
| 3.2.1 主动免疫后小鼠症状 |
| 3.2.2 免疫N-agrin蛋白小鼠体重下降 |
| 3.2.3 主动免疫小鼠肌力功能检测 |
| 3.3 N-Agrin免疫后小鼠神经肌肉接头传导受损 |
| 3.4 N-agrin免疫后小鼠的NMJ呈现片段化改变 |
| 3.5 N-agrin免疫小鼠的抗体处理肌肉细胞AChR簇减少 |
| 3.5.1 真核表达载体的构建 |
| 3.5.2 N-agrin和M-agrin蛋白表达及鉴定 |
| 3.5.3 抗N-agrin抗体处理的C_2C_(12)肌肉细胞AChR簇减少 |
| 第二部分:Agrin在肌肉再生过程中的作用 |
| 3.6 Agrin在肌卫星细胞中表达 |
| 3.7 肌肉特异性敲除agrin小鼠的构建及鉴定 |
| 3.8 HSA-agrin~(f/f)小鼠新肌管生成减少 |
| 3.9 Agrin敲除抑制肌卫星细胞激活和分化 |
| 3.9.1 HSA-agrin~(f/f)小鼠肌生成因子MyoD表达下降 |
| 3.9.2 HSA-agrin~(f/f)小鼠肌卫星细胞增殖受抑制 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 抗N-agrin抗体致重症肌无力 |
| 4.2 Agrin在肌肉再生中的作用 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 抗agrin抗体诱导小鼠重症肌无力表型 |
| 5.2 肌肉中agrin缺陷引起肌肉再生受损 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（3）仿生导电人工神经支架的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 多微通道导电神经支架的设计和制备及物理性能和生物相容性能检测评价 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验对象及主要试剂 |
| 1.3 实验分组及方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 聚左旋乳酸取向性纤维膜及其生物相容性的研究 |
| 1 研究方法与内容 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验对象及主要试剂 |
| 1.3 实验分组及方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 仿生导电人工神经支架修复大鼠坐骨神经缺损的研究 |
| 1 研究方法与内容 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验对象和主要试剂 |
| 1.3 实验分组和方法 |
| 2 结果 |
| 3.讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 周围神经损伤修复的细胞和分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（4）脱细胞肌腱来源的防粘连膜的研制和性能评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 应用脱细胞肌腱制备防粘连膜及其理化性质的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 新鲜肌腱的获得 |
| 2.2.2 脱细胞肌腱的制备 |
| 2.2.3 组织学检测 |
| 2.2.4 DNA定量分析 |
| 2.2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 胶原蛋白的定量分析 |
| 2.2.7 糖胺聚糖的定量分析 |
| 2.2.8 脱细胞肌腱来源的防粘连膜的制备 |
| 2.2.9 扫描电镜观察膜的表面结构 |
| 2.2.10 蛋白质组学 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 脱细胞有效性的评价 |
| 3.2 Masson染色结果 |
| 3.3 胶原蛋白和糖胺聚糖定量检测结果 |
| 3.4 DTM的干态和湿态 |
| 3.5 DTM的扫描电镜结果 |
| 3.6 蛋白质组学 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 脱细胞肌腱制备的防粘连膜的体外和体内生物相容性评价 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 小鼠L929 细胞的培养 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞毒性检测 |
| 2.2.2 溶血试验 |
| 2.2.3 皮下植入手术的实施 |
| 2.2.4 皮下植入实验的组织学检测 |
| 2.2.5 肌腱来源细胞的提取 |
| 2.2.6 细胞亲和性 |
| 2.2.7 实时定量PCR实验 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞毒性试验结果 |
| 3.2 溶血试验结果 |
| 3.3 细胞亲和性试验结果 |
| 3.4 大鼠皮下植入试验的HE染色结果 |
| 3.5 大鼠皮下植入试验的免疫荧光结果 |
| 3.6 DTM对肌腱来源细胞的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 脱细胞肌腱制备的防粘连膜预防肌腱术后粘连促进修复的体内研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 手术方案及实验分组 |
| 2.2.2 踝关节屈曲情况的评价 |
| 2.2.3 肌腱粘连情况的评估 |
| 2.2.4 组织学评价 |
| 2.2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 踝关节屈曲度 |
| 3.2 粘连评分 |
| 3.3 组织学评价 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 肌腱损伤修复材料的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）JARID1B在大鼠RGCs发育过程中的表达及对体外RGCs存活影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 大鼠视网膜神经节细胞的原代培养及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料与准备 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 1 OX-7杂交瘤细胞培育情况 |
| 2 RGCs形态及生长情况观察 |
| 3 免疫荧光鉴定结果 |
| 讨论 |
| 1 RGCs原代培养方法的选择与改进 |
| 2 原代培养鉴定方法及时机的选择 |
| 3 原代培养过程中经验与问题 |
| 第二部分 JARID1B在大鼠视网膜神经节细胞发育中的表达 |
| 材料与方法 |
| 1 标本采集与保存 |
| 2 主要试剂及耗材 |
| 3 主要设备及仪器 |
| 4 实验方法 |
| 结果 |
| 1 WB检测H3K4me3 蛋白在大鼠视网膜发育中的表达变化 |
| 2 q RT-PCR检测大鼠RGCs发育过程中JARID1B及相关分子的m RNA表达情况 |
| 3 免疫荧光染色检测大鼠RGCs发育过程中JARID1B蛋白表达结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 JARID1B对体外RGCs存活影响的研究 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（6）敲除KLF4基因促进哺乳动物轴突再生（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 常规溶液及配制 |
| 1.2 常规试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 病毒或抗体 |
| 1.5 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 基因鉴定 |
| 2.2 DRG感觉神经元的体外培养 |
| 2.3 体内电穿孔转染 |
| 2.4 坐骨神经夹伤 |
| 2.5 坐骨神经压片 |
| 2.6 坐骨神经损伤模型的建立 |
| 2.7 大脑皮层注射AAV及用BDA标记CST |
| 2.8 脊髓夹伤模型的建立 |
| 2.9 蛋白质免疫印迹 |
| 2.10 组织切片准备 |
| 2.11 免疫染色 |
| 2.12 体外再生轴突统计及体内坐骨神经和CST再生统计 |
| 2.13 统计学方法 |
| 实验结果 |
| 1 成功构建DRG感觉神经元Klf4基因特异性敲除小鼠 |
| 2 坐骨神经损伤后,DRG感觉神经元中KLF4的表达明显降低 |
| 3 敲除DRG感觉神经元的Klf4基因促进轴突再生 |
| 4 敲除DRG感觉神经元的Klf4基因,促进坐骨神经的轴突再生 |
| 5 敲除皮层神经元的Klf4基因,促进CST的再生 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 转录因子对神经轴突再生的影响 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间本人公开发表的论着、论文、专利 |
| 致谢 |
（7）搭载神经营养因子的聚己内酯纳米纺丝共聚物对脊髓损伤的修复作用（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 搭载神经营养因子聚己内酯水凝胶纳米纺丝共聚物的制备 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 PC12细胞和SD大鼠原代神经元与聚己内酯纳米纺丝共培养 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 支架复合物移植治疗SD大鼠横断性脊髓损伤 |
| 4.1 实验材料和方法 |
| 4.2 实验动物和方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 脊髓损伤的修复以及组织工程在其中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）NF-κB/STAT3信号通路调控成年神经元的轴突再生及相互关系（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 常规试剂 |
| 1.2 常规溶液 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DRG取材 |
| 2.2 DRG组织的消化与培养 |
| 2.3 细胞培养中抑制剂激活剂的加入 |
| 2.4 体外siRNA或DNA质粒电穿孔转染DRG神经元 |
| 2.5 细胞的免疫荧光染色 |
| 2.6 蛋白质免疫印迹 |
| 2.7 DRG组织的灌注取材 |
| 2.8 DRG冰冻切片的制备及免疫荧光染色 |
| 2.9 坐骨神经轴突损伤(Axotomy)模型的建立 |
| 2.10 DRG神经元体内电穿孔转染[52, 53] |
| 2.11 坐骨神经夹伤模型的建立、取材及压片 |
| 2.12 玻璃体内显微注射及视神经损伤模型建立 |
| 2.13 体外及体内实验神经轴突长度的测量 |
| 2.14 视网膜神经节细胞轴突的标记及再生数量统计 |
| 2.15 视网膜免疫荧光染色统计神经元存活率 |
| 2.16 统计学 |
| 实验结果 |
| 第一章 NF-κB对成年感觉神经元轴突再生的调控作用 |
| 1.1 坐骨神经损伤后,DRG神经元中p-p65表达量上调 |
| 1.2 抑制NF-κB活性阻碍成年感觉神经元的轴突再生 |
| 1.3 体内抑制NF-κB活性阻碍成年感觉神经轴突再生 |
| 1.4 激活NF-κB活性可影响感觉神经轴突再生 |
| 小结 |
| 第二章 STAT3对成年感觉神经元轴突再生的调控作用 |
| 2.1 坐骨神经损伤后,DRG神经元中p-STAT3表达量上调 |
| 2.2 抑制STAT3活性阻碍成年感觉神经元的轴突再生 |
| 2.3 体内抑制STAT3活性阻碍成年感觉神经元轴突的生长 |
| 2.4 激活STAT3活性可促进感觉神经轴突再生 |
| 2.5 激活STAT3活性可促进视神经轴突再生 |
| 2.6 激活STAT3活性能提高视神经元的存活率 |
| 小结 |
| 第三章 NF-κB通过STAT3调控感觉神经元轴突的生长 |
| 3.1 抑制N-κB活性,p-STAT3蛋白表达水平降低 |
| 3.2 NF-κB通过STAT3调控感觉神经元的轴突再生 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 周围神经损伤后神经轴突再生的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略表 |
| 攻读学位期间本人公开发表的论文、论着 |
| 致谢 |
（9）MMP9在氯胺酮所致发育早期神经元凋亡中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一部分 氯胺酮对发育窗口期大鼠视网膜MMP2及MMP9 表达的影响 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 仪器设备 |
| 2.3 试剂配制 |
| 2.4 实验动物及分组 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.6 统计分析 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第二部分 MMP9 在氯胺酮所致发育早期大鼠视网膜神经元凋亡中的作用 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 仪器设备 |
| 2.3 试剂配制 |
| 2.4 实验动物及分组 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.6 统计分析 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三部分 MMP9 在氯胺酮所致发育早期视网膜炎性介质释放中的作用 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 仪器设备 |
| 2.3 试剂配制 |
| 2.4 实验动物及分组 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.6 统计分析 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第四部分 PTI和 WLI在全麻儿童术中监测麻醉安全性的应用 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 入排标准 |
| 2.2 麻醉方法 |
| 2.3 研究方案 |
| 2.4 统计分析 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的论文 |
（10）新型组织工程神经调节的炎性微环境对大鼠SN长段缺损的修复作用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 新型组织工程神经制作与大鼠坐骨神经长段缺损损伤模型的建立 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 组织工程神经对坐骨神经缺损损伤后巨噬细胞极化及炎性细胞的影响 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 组织工程神经修复坐骨神经缺损过程中对炎性细胞因子的调节作用 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 组织工程神经对坐骨神经长段缺损的结构和功能修复作用 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 巨噬细胞极化在神经系统损伤修复中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的成果 |
| 致谢 |
四、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白在成年大鼠不同视神经再生模型中的表达（论文参考文献）
- [1]大鼠RGCs发育过程中Jarid1b表达变化及视神经损伤后Jarid1b和H3K4me3的表达变化[D]. 陈亭. 青岛大学, 2021(02)
- [2]凝集蛋白agrin抗体致重症肌无力及agrin在肌肉再生中的作用研究[D]. 鄢敏. 南昌大学, 2021(02)
- [3]仿生导电人工神经支架的研究[D]. 刘振辉. 新疆医科大学, 2021(08)
- [4]脱细胞肌腱来源的防粘连膜的研制和性能评价[D]. 陶美含. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]JARID1B在大鼠RGCs发育过程中的表达及对体外RGCs存活影响的研究[D]. 张婵媛. 青岛大学, 2020(01)
- [6]敲除KLF4基因促进哺乳动物轴突再生[D]. 徐金辉. 苏州大学, 2020(02)
- [7]搭载神经营养因子的聚己内酯纳米纺丝共聚物对脊髓损伤的修复作用[D]. 王磅博. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [8]NF-κB/STAT3信号通路调控成年神经元的轴突再生及相互关系[D]. 齐士斌. 苏州大学, 2020(02)
- [9]MMP9在氯胺酮所致发育早期神经元凋亡中的作用[D]. 吴蕾. 上海交通大学, 2020(01)
- [10]新型组织工程神经调节的炎性微环境对大鼠SN长段缺损的修复作用[D]. 李越. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019