一、TBhsp70融合蛋白的一个独立的功能区不依赖于CD4~+T细胞在体内诱导CTL（论文文献综述）
朱佳琳[1]（2019）在《白介素-35在前列腺癌发生发展中的作用及相关机制研究》文中研究指明研究背景及目的:前列腺癌（Prostate cancer,PCa）是仅次于肺癌的第二常见恶性肿瘤,也是全世界男性肿瘤相关死亡的第五大原因。前列腺特异性抗原（Prostate specific antigen,PSA）已成为最广泛使用的诊断前列腺癌的生物标志物。然而,PSA并非肿瘤特异性,PSA水平与PCa进展的相关性欠佳,这限制了PSA在PCa分期及预后中的应用。前列腺穿刺活检是一种在临床实践中能够明确诊断PCa的检查方法,但是因其有创性,部分患者难以接受。因此,迫切需要特异性较强的生物标志物用于检测、诊断PCa和判断PCa的预后。目前,局限性前列腺癌患者通常采用手术治疗或放射治疗。然而,20%-40%的接受根治性前列腺癌切除术的患者和30-50%的接受放疗的患者将会出现复发并发展为转移性疾病。转移性去势抵抗型前列腺癌目前没有最为理想的治疗方法,患者大都预后不良,因此需要开发更为有效的治疗方法。近年来,生物免疫治疗已成为备受关注的疗法。研究表明,部分肿瘤细胞通过激活负向刺激信号,调控抑制性免疫应答反应,来逃避免疫系统的识别和杀伤。此外,肿瘤细胞也可以招募某些免疫抑制细胞,直接或间接的介导免疫抑制因子的释放,共同促进免疫抑制肿瘤微环境的发生、发展,从而明显促进肿瘤进展。因此,一些具有免疫抑制功能的细胞因子受到了极大的关注,如转化生长因子（TGF）-β、白介素（IL）-6和IL-35等。IL-35是最新发现的免疫抑制性细胞因子,目前已成为肿瘤生物免疫相关领域研究的热点。研究结果表明,IL-35在多种肿瘤组织中都有高表达,具有促进肿瘤血管生成和抑制抗肿瘤细胞毒性淋巴细胞反应的作用;在多种不同类型恶性肿瘤中,血浆IL-35水平与肿瘤分期、肿瘤大小和癌旁淋巴结转移密切相关;IL-35在肿瘤组织中的高表达及其在血浆中的升高提示肿瘤预后不良。目前关于PCa的临床研究结果表明,PCa患者血清IL-35的平均浓度明显高于健康对照组,说明IL-35可能参与肿瘤的发生。关于IL-35在PCa肿瘤组织中的表达情况以及IL-35对于PCa进展及转移的影响及作用机制的研究尚无有关报道。因此,本研究旨在检测免疫抑制细胞因子IL-35在PCa患者血浆和肿瘤组织中的表达水平;检测IL-35在不同前列腺癌细胞系的表达情况,并探索IL-35对前列腺癌细胞的侵袭、迁移和增殖的影响;分析IL-35对皮下PCa荷瘤小鼠的肿瘤增殖、血管生成、转移及免疫微环境的影响。从临床、体外细胞及动物体内实验三个水平探索IL-35对前列腺癌发生和发展中的作用,并探讨相关的调控机制。方法:1.采用ELISA检测PCa患者血浆中IL-35的水平,分析患者血浆IL-35水平与各项临床指标和病理特征的相关性。并建立受试者操作特征曲线（ROC）,分析IL-35在PCa诊断中的临床应用价值。采用生存曲线比较不同IL-35水平的PCa患者总生存率的差异。使用人PCa组织芯片进行免疫组化染色,检测人PCa组织中IL-35的表达,并分析IL-35两个亚基的表达与临床病理指标之间的关系。2.采用Western blot和RT-PCR的方法检测IL-35的两个亚基在三种人PCa细胞系（LNCaP、DU145、PC-3）和小鼠PCa细胞系RM-1中的蛋白和mRNA的表达。对体外培养的PCa细胞分组进行不同处理,使用Transwell小室、划痕实验CCK-8试验检测各组细胞的侵袭、迁移和增殖能力。3.构建RM-1荷瘤小鼠PCa模型,分为四组进行不同处理:Control、IL-35组、Scramble组和IL-35中和抗体组。每组分别绘制肿瘤生长曲线、小鼠生存曲线。ELISA检测各组小鼠血浆IL-35水平;肿瘤组织分别进行免疫组化及Western blot,检测各组IL-35的两个亚基EBI3和p35、血管生成指标CD31和细胞增殖指标Ki67的蛋白表达;肺组织进行HE染色,计算各组小鼠肺转移率;流式细胞计数检测各组小鼠脾脏及血液中的MDSCs、Treg、CD4+T、CD8+T细胞的比例差异。结果:1.PCa患者血浆IL-35浓度明显高于前列腺增生组和健康对照组。PCa患者血浆IL-35浓度随肿瘤分期的进展而升高,并与Gleason评分呈正相关。有局域淋巴结转移及远处转移的患者血浆IL-35浓度分别高于无局域淋巴结转移和无远处转移者。血浆IL-35浓度高者总生存率明显低于低浓度者。IL-35对PCa患者有无淋巴结转移和有无远处转移的ROC曲线下面积高于PSA。2.IL-35的两个亚基EBI3和p35在PCa组织中的表达均明显高于癌旁组织。随着Gleason评分的增加,EBI3和p35的表达也明显增加。3.EBI3和p35蛋白在人高转移PCa细胞系PC-3和小鼠RM-1细胞系中均高表达,而中度转移潜能的DU145细胞系和激素敏感性细胞LNCap细胞系中主要表现为EBI3水平表达较高,而p35相对较低。与此对应,EBI3和p35的mRNA在PC-3和小鼠RM-1细胞系中均高表达,而DU145和LNCap细胞系中主要表现为EBI3水平表达较高,而p35相对较低。4.与对照组比较,加入IL-35可明显增加transwell下室细胞的数量PCa细胞的覆盖面积以及CCK-8实验中的光密度值;而IL-35中和抗体组transwell下室细胞的数量、PCa细胞愈合比例和OD值则较Scramble组明显减少。5.IL-35促进小鼠PCa肿瘤体积的增长,增加了肺转移的比例,降低了小鼠的整体生存率。小鼠PCa组织中,IL-35组CD31和Ki67表达升高,IL-35中和抗体组CD31和Ki67表达下降。6.IL-35增加肿瘤微环境中调节性T细胞（Treg）和骨髓源性抑制性细胞（MDSCs）的比例,降低CD4+和CD8+T细胞的比例。IL-35中和抗体组Treg、MDSCs的比例下降,CD4+和CD8+T细胞的比例升高。结论:1.IL-35在PCa患者的血浆和组织中高表达,其与PCa的发生、进展、转移和不良预后呈正相关,可能成为PCa进展过程中重要的生物标志物。2.IL-35对于PCa细胞的侵袭能力、迁移能力和细胞增殖能力有促进作用;中和IL-35后可明显抑制PCa细胞侵袭能力、迁移能力和细胞增殖能力。3.IL-35与小鼠PCa的进展、转移和不良预后相关,IL-35可作为治疗PCa的新靶点。4.IL-35通过上调CD31和Ki67促进小鼠PCa的血管生成和细胞增殖,从而促进肿瘤生长;中和IL-35治疗可以抑制小鼠PCa的血管生成和细胞增殖,从而抑制PCa进展。5.IL-35通过上调Treg细胞和MDSCs,抑制CD4+、CD8+T细胞,从而促进免疫抑制,促进PCa的恶性进展;中和IL-35治疗可能抑制PCa进展。
李莉娟[2]（2017）在《CCT3基因调控胃癌细胞增殖及机制研究》文中研究指明背景胃癌是全球癌症死亡的第二大原因,且发病率逐年升高。2016年全球每年新发胃癌病例近100万,41%发生在中国。国内大部分患者首次诊断时已为进展期,然而目前可能的干预手段如手术、化疗、放疗及其他辅助治疗效果欠佳。因此,临床亟需新型干预治疗方法,靶向治疗晚期胃癌有很大的前景。CCT（Chaperonin Containing TCP1）家族的CCT3有报道在肝癌、胆管癌等消化系统的恶性肿瘤中有着重要的作用,然而它在胃癌中的作用尚未报道。本研究的目的是探讨CCT3在人胃癌组织及癌旁组织中表达量,并揭示CCT3在胃癌发生发展中的重要生物学功能,以及该基因对胃癌发生发展影响的机制探索,为新的个体化治疗策略提供实验理论依据。方法首先分析在线TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中RNA测序（RNA-seq）数据并筛选出一个CCT3的基因,同正常样本相比其在胃癌组织显着高表达。通过免疫组织化学染色检测CCT3在癌组织及癌旁组织的表达情况,通过实时定量PCR反应（qRT-PCR）检测CCT3的表达情况。应用RNA干扰技术（RNAi）靶向沉默胃癌细胞株CCT3基因的表达,通过Cellomic细胞计数、MTT实验、克隆形成及凋亡检测对CCT3在胃癌细胞株（AGS、MGC-803、BGC-823）的生物学功能进行分析。在胃癌细胞株BGC-823中沉默CCT3基因的表达,检测裸鼠体内成瘤能力。应用Affymetrix人类全基因表达谱芯片检测CCT3基因沉默前后胃癌细胞株BGC-823中全基因组mRNA表达丰度。用Ingenuity通路分析（Ingenuity?pathway analysis,IPA）差异表达基因,利用差异基因寻找下游潜在的候选基因。应用qRT-PCR和Western blot检测CCT3基因沉默后,部分候选下游通路基因mRNA和蛋白表达量。应用抗体芯片技术检测比较实验组和对照组两组样本中关键信号通路分子的变化,从分子水平揭示CCT3基因影响胃癌发生发展的作用机制。结果CCT3基因在胃癌组织和细胞株中高表达并且其主要定位于细胞核中。应用CCT3-shRNA靶向沉默胃癌AGS、BGC-823和MGC-803细胞中CCT3基因显着抑制胃癌细胞系的增殖能力。同样,抑制CCT3导致细胞凋亡明显增加。为了探讨CCT3在胃癌中可能的功能,本实验使用体外及体内肿瘤模型。体外实验,观察到在CCT3沉默的情况下胃癌细胞的克隆形成能力显着受到抑制;体内模型中,沉默CCT3的BGC-823细胞在裸鼠成瘤体积显着小于对照组。通过CCT3-shRNA沉默CCT3后,859个基因表达量上调,887个基因表达量下调。CCT3的沉默导致蛋白激酶A（PKA）、Wnt/β-catenin、PPAR及cAMP介导的信号通路发生改变。使用qRT-PCR及蛋白印迹实验验证沉默BGC-823细胞中的CCT3,导致细胞应激及凋亡相关的基因发生改变,其中MAP3K7、CDC42、CCND3的表达水平显着下调,CDK2、CDK6表达水平显着上调。结论综上所述,CCT3基因很可能是一个重要的分子,其过表达与胃癌的发生有关系。因此CCT3基因可能是新的胃癌相关的原癌基因,并在之后胃癌靶向治疗中有潜在的价值。进一步的研究（如过表达CCT3的胃癌稳定株及相关的动物模型）能够帮助我们探究及确定CCT3基因的致癌能力。
甘莉莉[3]（2014）在《治疗性HPV疫苗的研制与动物实验研究》文中研究说明人类乳头瘤状病毒（Human papillomavirus, HPV）感染是宫颈癌的主要危险因子,近年来分子流行病学发现,HPV感染与口腔鳞癌的发生也有着密切的关系,HPV作为一个独立的危险因子,与口咽癌和口腔癌密切相关。25%的HNSCC可检测到HPV的DNA,尤其是HPV16,90%的HPV相关头颈部肿瘤由HPV16引起。但是HPV在不同地区的检出率及检出型别报道不一,本课题首先对HPV在武汉地区的OSCC患者中的发生率进行了流行病学的调查。另外,尽管目前有预防性疫苗和各种筛查措施来预防HPV的感染,但HPV引起的疾病在全球依然很普遍,全球有三分之一的感染性肿瘤是由HPV引起。很多研究都证明业已存在的HPV预防性疫苗对尚未感染过该病毒的人群有很好的预防作用,但是不能清除已经存在的病毒感染,因此,HPV治疗性疫苗的发展对治疗HPV相关肿瘤有着重大意义。本研究包含三个部分：第一部分：HPV在武汉地区的口腔癌患者中的流行病学调查收集从2009到2013年间诊断为OSCC的病例标本以及健康人群的第三磨牙拔除术中的牙龈组织,样本收集后立即储存于-80℃冰箱备用。用Qiagen试剂盒提取新鲜／冰冻组织中的总DNA,选取HPV通用引物GP5+/GP6+（5’-TTTGTTACTGTG GTAGATACYAC-3’/5’-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3’）,进行PCR分析,阳性结果送往生工测序鉴定HPV型别。SPSS20.0软件分析统计结果。结果显示OSCC组的HPV感染率达到27.5%,而对照组的HPV感染率是2.9%。第二部分：HPV治疗性疫苗的构建与检测1、HPV疫苗的构建为了降低HPV的转化活性,HPV16E7的第24位、26位和91位氨基酸C24E26和C91修改为了甘氨酸,HPV16E6的第63位和106为氨基酸C63和C106也修改为甘氨酸以破坏原有的锌指结构。把E7E6的基因序列直接连接,然后用人缘化密码子优化,得到的融合蛋白的基因序列在Invitrogen公司合成,并克隆大pVAX1载体上,命名为pE7E6。然后E7E6基因片段通过两端的KpnI和NotI酶切位点克隆到防龋疫苗pGJAP/VAX1上,得到带有靶向序列CTLA-4的疫苗pCTLA4-E7E6。同样,未经过修改的对照质粒疫苗命名为pwCTLA4-E7E6和pwE7E6,为了增强对照,未经修改过氨基酸序列的野生型E7和野生型E6也分别克隆到载体pVAX1上得到pwE7和pwE6。所有质粒都经DNA测序鉴定其正确性。结论：靶向HPV疫苗pCTLA4-E7E6及非靶向对照疫苗pE7E6、野生型对照疫苗pwCTLA4-E7E6、 pwE7E6、pE7、pE6成功构建。2、HPV疫苗的性能及机制检测构建好的疫苗以对照疫苗分别用Lipofectamine转染试剂转染293细胞,48h后提取表达的蛋白,分别检测E7、E6、p53、Rb等蛋白的表达。同时,用ELISA试验检测转染上清中的蛋白浓度,然后用流式细胞术检测融合蛋白结合DC2.4细胞系的能力。结论：新构建的融合CTLA-4及E7E6优化序列的质粒DNA,在体外细胞内能够正确表达相关蛋白,并且与p53、Rb等抑癌因子的结合力下降,无致癌危险。体外培养细胞上清中分泌的融合蛋白能够结合到DC2.4细胞系,证实其靶向性作用机制。第三部分：HPV治疗性疫苗在小鼠体内外的实验研究质粒pCTLA4-E7E6、pE7E6、pVAX1经真空干燥后重新溶解到生理盐水中以得到DNA的终浓度为1μg/μl.1、治疗性免疫选用6-8周龄的C57BL/6小鼠30只,随机分成4组：pCTLA4-E7E6、pE7E6、 pVAX1和PBS组。每只小鼠皮下注射2×105个TC-1细胞,在第10天的时候给予第一次免疫,免疫组小鼠在左后腿肌肉内注射100μL质粒,对照组注射100μLpVAX1或PBS。所有小鼠在第17天接受第二次免疫。每周记录肿瘤大小2-3次。第0、24、38天的时候收集小鼠上清做ELISA实验,分析小鼠体内抗体水平。在第38天,取脾细胞做CTL分析。结论：pCTLA4-E7E6诱导了比pE7E6更强的治疗性免疫效果。2、预防性免疫6-8周龄的C57BL/6小鼠32只随机分成4组：pCTLA4-E7E6、pE7E6、pVAX1和PBS组。在第0、14天进行免疫,第28天,每只小鼠注射6×104个TC-1细胞,第0、14、28、60天的时候收集小鼠上清做ELISA实验,分析小鼠体内抗体水平。在第80天,取脾细胞做CTL分析。结论：pCTLA4-E7E6诱导了比pE7E6更强的预防性免疫效果。
孙明伟[4]（2014）在《MHC I类分子递呈修饰后抗原的结构与免疫学研究》文中研究表明主要组织相容性抗原复合体（MHC）是一种存在于脊椎动物中的由一个庞大的基因家族编码的细胞表面分子,介导白细胞,也就是常说的免疫细胞与其它白细胞或体细胞间的相互作用,在机体细胞间识别和区分自已与异己中扮演重要角色。MHC分子作为表达于个体细胞表面的抗原递呈结构,影响着不同来源抗原的T细胞反应。因而,MHC在一定程度上决定了个体对于感染物抗原的免疫应答,这其中也涉及到对疾病的易感性和自身免疫反应的发生。在人类中,MHC又叫做人类白细胞抗原（HLA）。在细胞内,经过抗原加工和蛋白酶体降解途径产生的多肽作为T细胞表位,由MHCI类分子递呈给细胞毒性T细胞（CTLs）。该过程在效应细胞免疫中发挥着重要的作用。另一方面发生了各种翻译后修饰（PTMs）的真核蛋白能够产生一系列修饰的抗原,丰富了MHC相关多肽的类型,递呈于细胞表面成为T细胞受体（TCR）识别的潜在目标。已有研究表明,一些包含翻译后修饰（如甲酰化、脱酰胺化、糖基化、乙酰化、磷酸化和半胱氨酸化）的多肽可以与各自的非修饰类似物被T细胞特异性地区分开。在某种情况下,发生于感染、炎症、细胞转化、凋亡和衰老中的翻译后修饰往往带来新的MHC相关新抗原的产生。因此,表位中的翻译后修饰以及它们在作为肿瘤和自身免疫疾病的免疫治疗疫苗候选中的应用价值受到越来越多的关注。N端乙酰化作为真核蛋白最普遍的翻译后修饰之一,能够产生一系列N端乙酰肽,并由MHC I类分子递呈于细胞表面。虽然这一修饰类型在调节蛋白质降解中扮演重要角色,然而N端乙酰肽的递呈及T细胞识别的分子基础仍然很不清楚。因此,我们解析了HLA-B39与一段天然N端乙酰化多肽的复合物高分辨率晶体结构,以及B39与非修饰多肽的复合物结构。区别于传统非修饰多肽中暴露于A口袋外部的P1残基侧链,乙酰化P1-Ser的羟基侧链则是插入抗原结合槽的A口袋中,而NH2端乙酰基团突出结合槽外参与T细胞识别。此外,N端乙酰化不仅改变了多肽的构象,还显着地造成了B39的α1-螺旋残基的构象摆动,而这可能将影响到TCR结合与免疫识别。N端乙酰肽和一系列人源和鼠源的MHC I类分子的热稳定性检测显示了其普遍降低的稳定性。以人工合成的N端乙酰化HLA-A2限制性表位免疫HLA-A2.1/Kb转基因小鼠激发的CTL应答也表明表位在N端乙酰化以后免疫原性会显着提高。这些发现首次洞察了经典的MHC I类分子对N端乙酰肽的特异性递呈模式,为基于乙酰化表位的免疫治疗和疫苗研发奠定了基础。在以上工作基础上,我们又以A型流感病毒表位为研究对象,从预测和鉴定N端乙酰化的流感病毒CTL表位出发,调查了流感病毒N端乙酰化抗原在健康人群中的T细胞免疫反应水平,进而评价流感病毒潜在N端乙酰化抗原的细胞免疫原性。研究中首次鉴定了病毒来源的N端乙酰化T细胞表位及其在健康个体中激发的特异性T细胞响应,为研究N端乙酰化表位特异性CTL免疫反应提供了试验依据,丰富了翻译后修饰的T细胞免疫表位的范畴,为理解翻译后修饰依赖性的T细胞免疫反应提供了帮助。除了N端乙酰化修饰外,磷酸化作为癌变、恶性转化和凋亡等生理活动的重要标识在肿瘤免疫治疗策略中的应用也越来越引人关注。在邻近两个位点的协同磷酸化又是磷酸化修饰组中最为常见的形式。因此,我们通过X-射线晶体学方法分别解析了一对（10肽和9肽）双磷酸化多肽与HLA-B27的pMHC复合物结构。其结果不但展示出双磷酸多肽不同于单个位点磷酸化多肽的独特递呈特征,而且在将双磷酸化多肽结构与单磷酸化多肽及未修饰多肽结构的比较中,还进一步阐明了自身抗原在经过修饰或蛋白质剪切等多重改变后作为新表位被递呈的分子基础。另外,通过圆二色谱检测,我们揭示了磷酸基团对于多肽结合力和pMHC稳定性具有磷酸化位点依赖性的影响。这些结果也为双磷酸肽这种新型翻译后修饰下的抗原加工递呈研究提供了首次结构学及热动力学依据,进一步预示了多位点磷酸化对于多肽免疫原性和T细胞识别中的潜在影响,揭示了多位点磷酸化形式的潜在T细胞表位亟待作为抗原鉴定中首要考虑和挖掘的目标。多位点磷酸肽有望成为治疗自身免疫病和癌症等的疫苗或药剂成分。除此之外,基于前人的研究结果,我们通过多肽免疫转基因小鼠的方法分别评价了7条A2限制性磷酸化表位的细胞免疫原性,客观评估了磷酸化多肽作为肿瘤疫苗的潜在应用价值。此外,研究还采用5’-RACE技术为免疫优势磷酸化特异性T细胞受体序列的获得提供了方法学依据。总之,通过免疫信息学、小鼠模型、细胞生物学和结构晶体学等方法,我们分别对MHCⅠ类分子递呈N端乙酰化和磷酸化多肽提供了免疫学及结构学调查和评价,展示了同一来源的抗原经添加基团及蛋白质剪切等修饰成为多重改变的自身抗原的面貌和机制,揭示了这些翻译后修饰多肽作为MHCⅠ类抗原的递呈机制及其在T细胞识别中的潜在影响,进而探讨了其在免疫治疗和疫苗设计中的应用价值。
吴超[5]（2013）在《动物MHC分子抗新城疫病毒作用的研究》文中指出主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）由一组紧密连锁的、高度多态的基因座组成。它在脊椎动物的移植排斥反应、免疫应答以及免疫调控等方面起重要的作用，是当今免疫学研究的热点内容。多态性是MHC基因最显着的特性，与疾病的易感性密切相关。MHC I类分子主要负责呈递内源性抗原肽，最近研究发现它还可以交叉呈递外源性抗原。现在已清楚交叉呈递是机体免疫系统检测组织及吞噬细胞中的异源蛋白的主要机制。所以，研究MHC多态性特性和抗原交叉呈递机制是疾病评估与防治、分子育种以及新型抗病毒疫苗研发的基础。本文主要研究了鸡MHC I类分子结构与抗新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）之间的关系以及恒定链（Invariant chain，Ii）作为免疫载体增强抗原肽交叉呈递效率的作用。首先，我们通过血凝抑制试验（hemagglutination inhibition assay，HI）测定鸡血清中特异性抗NDV抗体的水平，筛选得到高抗体组（G组）20个个体，低抗体组（D组）10个个体。然后采用RT-PCR（Reverse transcription-PCR）方法从两组中获得191条鸡MHC Iα基因，它又称为鸡BF基因。其中，155条是BF2，占81.2%，36条是BF1，占18.8%。BF2是鸡主要表达的MHC I α基因，负责识别和呈递病毒抗原。BF1是次要表达的基因，有的个体甚至检测不到BF1基因的表达产物。序列比对显示BF2基因的多态性要高于BF1基因，而且，BF2分子含有不同于BF1的保守基序。BF2基因的多态性主要体现在α1/α2区域，它对应于I类分子抗原结合槽部位。系统进化树分析表明BF2和BF1基因明显属于两大分支，说明二者具有不同的进化历史。与预测的人和小鼠的3-D结构显示，鸡BF2分子与哺乳动物的MHC I类α分子的肽结合区结构相似。通过克隆、分析高度多态区域（sp/α1/α2， sp指信号肽），我们发现一个个体最多可表达6-8种不同的MHC I类α分子，其中有1种数量很多，是主要的I类分子亚型。因此，我们选择这一类序列作BF2分子。我们从G、D组中共筛选出30个BF2分子，然后进行序列比对和结构分析，筛选可能与识别病毒抗原肽相关的I类分子基序。G组和D组之间存在差异显着的两段区域，分别位于第123-128位氨基酸和第147-153位氨基酸。G组第1个区域序列的7氨基酸基序（FDKGTMT）完全保守，构成β转角且位于肽结合沟槽（peptide-binding groove，PBG）的外围，它可能不参与抗原肽的结合。第2个区域也属于7氨基酸基序，它们分成两类：GDYAEGL和ESEPERW，它们参与α2结构域中α螺旋的形成。这个部位的几个氨基酸侧链深入PBG，参与对抗原肽的识别与结合。因此，我们推测，G组和D组BF2分子PBG中第2个7氨基酸基序的差异造成了其识别NDV抗原肽能力的不同。其次，我们研究Ii免疫载体的免疫增强效应。I类分子交叉呈递的发生在某种程度上是Ii依赖性的，而且，Ii和I类分子存在重要的功能相关性。Ii是MHC II类分子的分子伴侣，它作为免疫载体在增强II类分子表位的呈递效率中得到广泛应用。基于Ii通过CLIP占据I类分子PBG而与之结合，我们设计了两种Ii突变体：Ii-O257和Ii-CT257。Ii-O257是Ii的CLIP被OVA的CTL表位（OVA257-264）替换形成的Ii-OVA嵌合体，Ii-CT257是C端截断的Ii-O257，只包含它的第1-89位氨基酸。我们用这两个嵌合体蛋白免疫小鼠，并以OVA257-264肽和OVA蛋白为对照，然后用荧光定量PCR检测不同组细胞因子的分泌水平。结果表明，免疫Ii-O257或Ii-CT257蛋白的小鼠比单独的OVA257-264肽产生更高水平的细胞因子：IFN-γ分别增强11和13倍，IL-2分别增强9和11倍。共聚焦显微镜观察和免疫共沉淀实验显示这两个Ii-OVA突变体能在体内和鼠MHC I类分子结合。截断的Ii嵌合体Ii-CT257能与I类分子结合表明Ii作为免疫载体可应用于交叉呈递，而且，其N端功能片段可能是其发挥作用的最小功能片段。核酸疫苗和肽疫苗正是通过I类分子的交叉呈递途径发挥作用，因此，携带病毒表位的Ii嵌合体对于研发新型的抗新城疫病毒疫苗可能带来新的启示。
胡志东[6]（2013）在《DNA初免-痘病毒加强方案诱导高功能亲和力CD8+T细胞的特征和机制研究》文中提出CD8+T细胞是机体清除病毒感染和肿瘤的主要效应细胞,其杀伤能力与多种指标密切相关。其中,功能亲和力,也称抗原敏感度,综合反映了T细胞从抗原识别到执行效应功能的能力,是评价细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte, CTL）效应的重要指标之一。顾名思义,高功能亲和力的T细胞对抗原刺激比较敏感,可以在抗原浓度较低的情况对其进行识别,并启动免疫应答以杀伤靶细胞。这种具有快速杀伤活性的细胞对病原体感染的早期清除至关重要。因此,近年来,功能亲和力往往作为评价疫苗效果的免疫指标被广泛认知。其评价方法为,用梯度稀释的多肽体外刺激疫苗诱导的免疫细胞,量化不同浓度多肽刺激所诱导T细胞的效应功能,如分泌细胞因子的能力、裂解靶细胞的能力等,以达到最大效应功能50%所需要的肽浓度作为衡量标准。值得注意的是,尽管有报道证明单个T细胞可以经过不同方式的体外刺激诱导分化为功能亲和力高低不同的细胞,其机制也已经被阐明。但是,如何通过疫苗在体内诱导高功能亲和力的T细胞以及其中相关的调控机制,还不清楚。本课题以此为切入点,对痘病毒疫苗诱导功能亲和力成熟的调节通路进行了相关的描述性研究和机制探索。我们的前期研究发现,与DNA疫苗单独重复免疫相比,DNA疫苗初免-痘病毒加强的免疫方案可以诱导功能亲和力较强的抗原特异性CD8+T细胞。本课题对此现象进行了重复验证,并利用不同肽段刺激（优势单肽、亚优势单肽以及全肽库）、不同免疫原以及不同基因背景的小鼠模型确证了该现象。然后,我们对相关调控机制进行了探索性研究。首先,我们评价了相关文献提示的可能与功能亲和力相关的一些经典T细胞检测指标,如辅助性T细胞分泌细胞因子的情况、抗原特异性CD8+T细胞的多功能性以及记忆分群情况等。数据显示,在我们的体系中,痘苗诱导的高功能亲和力与这些指标无明显相关性,提示功能亲和力的体内调节不受这些已知的信号通路调控。然后,因为功能亲和力的检测体系往往是通过体外刺激脾细胞进行的,并没有区分T细胞和抗原提呈细胞（Antigen Presenting Cells, APC）等,而本文所用的痘病毒载体可于免疫后在体内存活一段时间,所以,T细胞功能亲和力的升高可能是痘病毒诱导的APC抗原提呈效率升高的结果,也可能是T细胞激活能力增强的原因。为了验证这一点,我们将DNA免疫组和痘病毒免疫组的CD8+T细胞分别分选出来,与相同来源的APC （Naive小鼠或痘病毒载体免疫过的小鼠）共孵育,或者将各组的CD8+细胞和CD8-细胞分别纯化后进行组间混合,然后进行功能亲和力的检测。结果发现,这样处理后,两个免疫组的功能亲和力无明显变化,且顺序保持一致,从而排除了自体APC抗原提呈能力的影响,并证明了痘病毒疫苗加强所诱导功能亲和力的提高主要在CD8+T细胞亚群上。另外,提示功能亲和力的调节机制与T细胞激活能力有关。随后,我们从T细胞激活信号通路的角度对痘苗免疫调控功能亲和力的机制进行了探索性研究。作为T细胞激活的第一步,肽-主要组织相容性复合物（peptide-Major Histocompatibility Complex, pMHC）和T细胞受体（T Cell Receptor, TCR）的相互作用是功能亲和力的决定因素之一。pMHC复合物形成后,可以通过优先选择与之结合力较强的TCR,从而更好的诱导T细胞应答以提高功能亲和力。为了在疫苗体系中验证TCR选择与功能亲和力的的关系,我们使用了TCR转基因OT-Ⅰ小鼠,该小鼠仅存在一种T细胞受体且只能识别模式抗原卵清蛋白（Ovalbumin, OVA）的一部分肽段。具体的,我们分选出OT-Ⅰ的CD8+T细胞并将其过继至C57BL/6小鼠中,以OVA作为免疫原对其进行不同方案的免疫,观察仅存在单一TCR的情况下,痘病毒是否依然具有提高抗原特异性CTL功能亲和力的能力。实验结果发现,在此小鼠过继模型中,痘病毒免疫组诱导的功能亲和力仍然高于DNA单独免疫组,从而排除了TCR选择对痘苗诱导功能亲和力调控的影响,并且提示,痘苗对功能亲和力的调控发生在pMHC和TCR结合以后的阶段。继而,作为TCR信号通路上游的接头分子,ZAP-70和Lck的激活是下游信号通路的必经过程,而且已有体外刺激实验和痘病毒感染实验证明了这两个分子在功能亲和力成熟中具有重要作用。因此,我们检测了这两个分子的磷酸化程度,以评估它们在疫苗体内调控功能亲和力中的作用。我们观察到,痘病毒免疫后,抗原特异性CD8+T细胞的ZAP-70本底激活水平显着高于DNA单独免疫组,而在抗原肽刺激后,痘病毒免疫组激活Lck的能力明显更强。因此提示,痘病毒免疫后,抗原特异性CD8+T细胞处在一个更容易被激活的状态,随后的抗原特异性细胞全基因组表达谱芯片分析支持这个推论。因此,这部分的数据提示,痘病毒疫苗加强免疫提高抗原特异性CD8+T功能亲和力的能力与TCR近端分子的激活程度升高引起的T细胞激活阂值降低相关。最后,炎症因子是T细胞激活的第三信号,在我们的免疫体系中,痘病毒可以引发一定水平的炎症因子的分泌。因此,为了验证痘病毒诱导的炎症微环境与功能亲和力调控的关系,我们进行了以下实验。第一步,我们将痘病毒载体和DNA疫苗混合后免疫小鼠,观察痘病毒载体诱导的炎症微环境是否可以提高DNA疫苗的免疫原性,数据显示,DNA疫苗所诱导的抗原特异性T细胞免疫应答并没有因为炎症微环境的加入而升高,提示功能亲和力的调控不受炎症因子分泌的影响；为了验证这一点,我们进行了第二步的实验：由于机体对痘苗的固有免疫应答由树突状细胞（Dendritic Cells, DC）上的髓样分化因子88 （Myeloid Differentiation Primary Response Gene 88, MyD88）介导,因此,我们引入了MyD88转基因缺陷小鼠作为免疫受体鼠,以排除痘病毒载体诱导的固有免疫对重组痘苗免疫原性的影响。有意思的是,数据显示,在该缺陷小鼠免疫模型中,重组痘苗所诱导的抗原特异性免疫应答显着降低,而功能亲和力也不再显着高于DNA单独免疫组,证明MyD88分子的表达在机体对痘苗的免疫应答,特别是功能亲和力的调控中占有至关重要的地位。考虑到CD8细胞上MyD88分子介导的信号通路在痘病毒感染中同样发挥了重要作用,这部分数据提示,重组痘苗提升抗原特异性CTL功能亲和力的能力,可能跟DC上MyD88介导的对痘病毒的固有免疫相关,也可能与CD8细胞上痘病毒激活的MyD88信号通路相关。因此,我们进行了第三步的实验进行验证,即,将OT-Ⅰ的CD8+T细胞过继至MyD88-/-小鼠中并对其进行不同免疫方案的免疫,在此免疫模型中,CD8+为MyD88阳性,功能正常,而DC为MyD88阴性,固有免疫缺陷。数据显示,此模型中,重组痘苗重新恢复了提高功能亲和力的能力,从而确证了,重组痘苗对功能亲和力的调控与痘病毒载体所诱导的炎症微环境无关,并且提示,该过程是由CD8细胞上MyD88分子介导的信号通路所调控的。综上所述,我们的研究结果证明,重组痘苗的加强免疫可以将DNA疫苗初免所诱导的低功能亲和力抗原特异性CD8+T细胞转变为高功能亲和力细胞,该过程的调控与TCR近端分子的激活程度和痘病毒载体感染诱导的CD8细胞上MyD88信号通路相关,与T细胞受体选择和痘病毒诱导的固有免疫无关。本实验为新型疫苗的设计、疫苗免疫方案的优化和T细胞免疫调节剂的寻找提供了科学依据。
李海波[7]（2013）在《基于多亚单位Th表位的幽门螺杆菌疫苗的研究》文中提出幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）在全球人口中的感染率超过50%，已被确定为慢性胃炎、消化性溃疡的重要致病菌，并被世界卫生组织列为胃癌的Ⅰ类致癌因子。表位是抗原分子中决定抗原特异性的关键部分，合理组合优势表位，可诱导出比原始抗原更为高效和特异的免疫应答。H. pylori感染导致机体对H. pylori自身天然抗原产生免疫耐受，选择H. pylori保护性抗原的优势表位来构建表位疫苗，有可能打破免疫耐受，从而达到免疫预防和清除H. pylori感染的目的。前期研究证实，特异性CD4+T细胞应答在抗H. pylori感染的保护性免疫应答中至关重要。本研究通过构建H. pylori Th表位疫苗，采用先免疫后攻毒以及先感染后治疗两种方式，在动物模型上对疫苗的预防和清除的保护效果进行评价，并探讨相应的免疫应答机制。主要研究方法、结果和结论如下：1.幽门螺杆菌Th表位的筛选和疫苗的设计通过生物信息学的方法预测并筛选H. pylori保护性抗原HpaA、CagA和UreB的优势Th表位，共筛选到17个表位肽。动力学模拟考察不同表位连接顺序所构成蛋白的动力学和热力学稳定型，确定以HpaA表位-CagA表位-UreB表位的连接顺序来构建Th表位疫苗Epivac。2.幽门螺杆菌Th表位疫苗的构建、表达和纯化构建疫苗蛋白的原核表达质粒pET30a-epivac，转化至BL21（DE3），经诱导表达和纯化，获得目的蛋白Epivac，HPLC分析蛋白纯度在90%以上。相同的技术方法制备含分子内佐剂的疫苗蛋白LTB-epivac。3.幽门螺杆菌Th表位疫苗的免疫保护效果评价及应答分析1)幽门螺杆菌Th表位疫苗免疫预防效果的评价及应答分析采用鼻腔滴注和皮下注射两种免疫途径，Epivac联用不同佐剂对BALB/c小鼠进行免疫，评价疫苗的免疫预防效果。结果显示，单用疫苗以及联用佐剂都可以有效预防H. pylori感染，且联用佐剂效果更优。此外，鼻腔滴注发挥保护作用的时间点要早于皮下注射。ELISA检测特异性抗体IgG、IgA的产生；Real-time RT PCR和ELISA检测脾淋巴细胞和胃组织细胞因子的表达变化；流式细胞术定量检测抗原特异性CD4+T细胞的水平及其应答特征。结果提示疫苗的保护作用与抗体应答无关，而主要依赖于疫苗诱导的系统性和局部的Th1型CD4+T细胞应答。2)幽门螺杆菌Th表位疫苗免疫清除效果的评价及应答分析：利用BALB/c小鼠模型对表位疫苗的免疫清除效果进行评价。相对于未免疫组，疫苗免疫可以显着降低小鼠胃内H. pylori的定植量，具有一定的治疗效果。通过分析小鼠抗体应答的特征，推测疫苗的免疫清除作用可能与特异性Th1型细胞应答密切相关。4.幽门螺杆菌Th表位疫苗的初步安全性评价通过内毒素检测、急性毒性试验和豚鼠最大化试验对疫苗的安全性进行初步评价，结果显示疫苗内毒素低于限量，且鼻腔滴注和皮下注射两种给药方式不会引起机体损伤和过敏反应，初步说明疫苗是安全无毒的。
刘燕瑜[8]（2012）在《Quil A、PICKCa对FMDV、PCV2-PRRSV DNA疫苗免疫增强作用的效果观察》文中研究表明Quil A是从南美Quillaja皂莫利纳的树皮中提取的三萜皂苷，通过高效液相色谱分析包含至少5种不同的皂苷，是一种表面活性剂，易溶于水、稳定、表面活性较好，是具有辅助属性的皂苷。1936年，第一次作为佐剂由Thibaulu和Richou部署在兽用疫苗，随之被发展起来。PICKCa是一种改进的佐剂，是复杂的基于聚肌胞核苷酸制定的，聚肌胞本身对人体有毒性作用，但同时也具有强烈的佐剂作用，卡那霉素和氯化钙能迅速水解于其中。作为一个带正电的分子，卡那霉素能够中和聚肌胞的负电荷，使聚肌胞更稳定，抗水解。添加氯化钙则有利于聚肌胞进入细胞。总之，PICKCa是一种稳定安全的佐剂。探讨QuilA、PICKCa及二者联合使用对实验动物免疫应答的调节作用，分别给小鼠、猪注射QuilA、PICKCa及二者混合物，于注射后不同时间采血，检测细胞因子水平；注射后第7d检测猪T淋巴细胞的体外增殖反应。实验结果表明小鼠和猪在注射药物之后均未出现任何不良反应；实验组动物的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平均显着高于对照组；猪T淋巴细胞体外增殖能力也显着高于对照组。说明QuilA、PICKCa对小鼠和猪具有良好的免疫调节作用，是具有良好应用前景的免疫佐剂。为研究Quil A对O型口蹄疫DNA疫苗的免疫增强作用，在FMD核酸疫苗pVIRIL18P1中加入Quil A，经肌肉注射免疫猪，检测猪VP1结构蛋白抗体及细胞因子水平，观察T淋巴细胞增殖情况，并与无佐剂组进行比较。结果表明，首免用猪口蹄疫核酸疫苗pVIRIL18P1及二免用重组鸡痘疫苗vUTAL3CP1中加入Quil A，两次免疫后抗体水平、细胞因子水平及T淋巴细胞增殖率都显着升高，与空白对照组比较差异显着（P<0.05）甚至极显着（P<0.01），与未加佐剂组及商品化疫苗比较有显着差异。表明Quil A对O型口蹄疫DNA疫苗具有较好的免疫增强作用。为研究PICKCa对猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病二联核酸疫苗的免疫增强效果，在二联核酸疫苗pIRES-ORF2-ORF5m-ORF6a中加入PICKCa，经肌肉注射免疫猪，检测猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病病毒抗体及细胞因子水平，观察T淋巴细胞增殖情况，并与无佐剂组进行比较。猪体免疫试验结果证明，构建的重组核酸疫苗加以PICKCa均能刺激实验猪产生PRRSV、PCV2抗体。细胞免疫检测结果表明PRRSV、PCV2特异性T淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-2分泌水平显着提高、CTL杀伤活性增强，表明其能够介导较好的Th1类免疫反应。重组核酸疫苗免疫猪的组织器官无病理损伤，可以防止猪体病毒血症的出现。攻毒保护实验证明，添加PICKCa佐剂的重组核酸疫苗对实验猪起到明显的免疫保护提升作用。
张德庆[9]（2011）在《C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究》文中研究表明近年来,随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展,运用基因重组表达技术研制预防、治疗用生物制品己经成为免疫学领域研究的热点,其中核酸（DNA）疫苗倍受青睐。该疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗及基因工程疫苗后的新一代疫苗。核酸疫苗具有同时激发机体体液和细胞免疫应答、使用安全、易于生产等优点,并可将多种基因联合在一起制成基因联合疫苗。然而由于DNA疫苗蛋白表达量低,激发的免疫应答较弱,从而限制了其开发应用速度。因此,提高DNA疫苗的免疫效果已成为基因免疫研究中急需解决的问题;目前常采用新型分子佐剂,如白细胞介素、干扰素、胸腺肽和补体分子佐剂等是提高DNA疫苗免疫效果的重要措施,其中补体C3d分子佐剂倍受人们的关注。补体C3d分子是补体C3被抗原激活以后的最终裂解片段,能够促进抗原提呈细胞对抗原的摄取、提呈作用,增强机体的免疫应答能力。因此,C3d已经成为核酸疫苗有效的新型分子佐剂。但是C3d作为分子佐剂具有种属差异性,不同种动物间C3d免疫增强作用的差异性需要作进一步的研究。PRRSV GP5基因编码的GP5蛋白为糖基化囊膜蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,能诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫。invH基因是沙门氏菌A-E群的高度保守基因,编码吸附和侵袭上皮细胞表面的蛋白,该蛋白决定沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力。本研究首先对哺乳动物猪、鼠的C3d基因进行克隆及序列测定分析,并探讨了不同种动物（猪、鼠、鸡、鸭）间补体C3d在基因水平上的相关性和差异性,然后以PRRSV GP5为模型基因,利用鼠、猪（哺乳动物）C3d的受体结合功能区p28和鸡、鸭（禽类动物）C3d的受体结合功能区p29作为分子佐剂,构建了C3d-p28（29）.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗和沙门氏菌pcDNA3.1-invH-mC3d -p28.6核酸疫苗;用构建的核酸疫苗免疫小鼠并对其免疫效果进行了体液和细胞免疫主要指标的检测,探讨不同动物C3d-p28（29）对核酸疫苗的免疫增强作用。本研究主要包括四部分内容:1、哺乳动物猪、鼠补体C3d基因的克隆及序列分析:为了获得哺乳动物（猪、鼠）的补体C3d基因克隆并比较同禽类动物（鸡、鸭）C3d基因序列的差异性,首先从哺乳动物鼠、猪的肝组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定并进行序列测定,然后进行C3d序列和CR2结合区同源性比较分析。电泳结果显示,分别在936bp和888bp处呈现明亮的条带,成功获得了鼠和猪的C3d基因克隆。序列分析结果表明,哺乳动物（猪、鼠）和禽类（鸡、鸭）的补体C3d基因同源性仅为64%;进化树显示,哺乳动物与禽类的亲缘关系越近,C3d基因进化关系也越近。哺乳动物（猪、鼠）与禽类（鸡、鸭）C3d基因的CR2结合区比较分析发现,禽类为29个氨基酸,而哺乳动物为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为62%,而鼠、猪两种哺乳动物之间、鸡、鸭两种禽类动物之间的同源性分别达82.8%和84%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的差异性。2、不同动物C3d分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗的构建:为探明不同动物C3d分子佐剂在核酸疫苗中的免疫增强作用,在上述试验克隆了动物C3d cDNA的基础上,设计引物克隆C3d-p28（29）至pUC19载体,利用同裂酶BamHⅠ和BglⅡ构建多聚体C3d-p28（29）.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）上;然后以RT-PCR扩增的PRRSV GP5基因作为模式基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1-C3d-p28（29）.n中p28（29）.n上游,构建pcDNA3.1-GP5-C3d-p28 （29）.n重组质粒。酶切结果显示,电泳后在807、987、1167bp处分别出现了明亮的条带,表明成功构建了含有补体C3d-p28（29）多聚体分子佐剂的PRRSV GP5核酸疫苗（pcDNA3.1-GP5-C3d-p28（29）.n）。3、不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗免疫增强效果研究:为了探索不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗的免疫增强作用及差异性,在构建了鼠、猪、鸡、鸭四种动物补体C3d-p28（29）.n PRRSV GP5核酸疫苗（pcDNA3.1-GP5-C3d-p28（29）.2.4.6）及pcDNA3.1-GP5核酸疫苗的基础上,分别提取质粒,通过脂质体转染至Marc145细胞进行瞬时表达,并免疫BALB/c小鼠,然后利用不同ELISA试剂盒分别检测各免疫组小鼠的GP5抗体水平和IL-4、IFN-γ含量。结果表明,以补体C3d-p28（29）.n为分子佐剂的PRRSV GP5基因重组疫苗均可在Marc145细胞内进行表达;连接不同动物C3d-p28（29）2,4,6聚体的核酸疫苗免疫鼠血清中GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量均比空载体（pcDNA3.1）和pcDNA3.1-GP5对照组的升高,差异均显着（P<0.05）,其中以pcDNA3.1-GP5-p28（29）.6组的效果最佳,但均不如PRRSV油乳剂灭活苗组的效果好。另外,含有C3d-p28（29）.n（n=2,4,6）相同聚体的疫苗免疫组小鼠血清中的GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量两两比较无差异性。4、鼠C3d分子佐剂沙门氏菌invH基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究:为了进一步探讨分子佐剂C3d在细菌核酸疫苗中的免疫增强作用,以沙门氏菌invH为核酸疫苗的模式基因,构建了pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6重组质粒,免疫BALB/c小鼠并检测了小鼠血清中invH抗体和IL-4、IFN-γ的含量,然后进行小鼠攻毒保护试验。结果表明,小鼠血清中invH抗体水平、IL-4和IFN-γ的含量与pcDNA3.1、pcDNA3.1-invH对照组比较,差异均显着（P<0.05）。通过攻毒试验结果表明,pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6核酸疫苗对小鼠的免疫保护率高于pcDNA3.1-invH组,差异显着（P<0.05）,与空白组和pcDNA3.1组比较,差异均极显着（P<0.01）,但核酸疫苗的保护效果不及灭活疫苗。本研究结果探明了动物C3d分子佐剂对病毒及细菌核酸疫苗的免疫增强作用,为开发利用不同动物C3d分子佐剂研制其他病原的核酸疫苗提供了理论依据和技术支持。
郭昊[10]（2011）在《白介素35基因治疗协同地西他滨抑制小鼠心脏移植排斥反应的研究》文中指出本实验研究白介素35（interleukin 35, IL-35）基因表达质粒载体联合甲基转移酶抑制剂地西他滨（decitabine）对小鼠免疫功能尤其是CD4+CD25+调节性T细胞表达水平和功能的影响；采用小鼠尾静脉快速注射质粒载体的方法研究体内基因转染效果,筛选相对高效IL-35质粒剂量组；建立稳定的小鼠腹腔异位心脏移植模型,经尾静脉注射IL-35质粒载体协同地西他滨联合干预受体,观察其对受体调节性T细胞表达水平和同种异系小鼠心脏移植排斥反应的影响,探索出诱导移植免疫耐受的新途径。第一部分：IL-35及地西他滨对体外培养的小鼠T淋巴细胞的作用研究目的：酶切鉴定小鼠IL-35质粒载体,探讨体外IL-35和地西他滨对小鼠T淋巴细胞的作用,研究其负向免疫调节作用及机制。方法：酶切鉴定英国格拉斯哥大学惠赠IL-35质粒,设计目的基因IL-35的上下游引物,通过聚合酶链式反应（PCR）,合成目的基因IL-35；通过阳离子脂质体转染法,体外转染人肾上皮细胞系293细胞,流式细胞术（FCM）分析细胞转染效率以及酶联免疫吸附法（ELISA）检测转染后细胞上清液中IL-35的浓度,分析IL-35基因表达情况；进行单向混合淋巴细胞培养,观察IL-35及地西他滨处理后对培养体系的影响,以流式细胞技术检测培养体系T细胞亚群和CD4+CD25+Treg比例。结果：IL-35质粒载体鉴定成功；质粒载体转染的细胞上清液中有IL-35表达；IL-35及地西他滨上调体外同种异体混合淋巴细胞反应体系中的CD4+CD25+Treg比例,下调CD4+CD8-T细胞比例。第二部分：IL-35体内基因转染对小鼠免疫功能的影响目的：评价经小鼠尾静脉注射质粒载体方法进行体内转染的效果,探讨IL-35基因转染对小鼠免疫功能的影响,并筛选相对高效IL-35质粒剂量组。方法：设置空质粒对照组和目的基因质粒载体组,经鼠尾静脉流体力学转染质粒载体,体内干预小鼠,流式细胞技术检测转染第3、5、7天后外周血和脾脏组织中T细胞亚群、调节性T细胞、NK细胞比例。结果：经鼠尾静脉注射质粒载体方法可使IL-35目的基因在体内表达；IL-35引起小鼠体内外周血及脾脏CD4+CD25+Treg比例上调,外周血CD4+CD8-T细胞、CD3-CD16+NK细胞比例下调；筛选出IL-35相对高效转染质粒剂量为50ug。第三部分：IL-35基因转染协同地西他滨在同种异系小鼠心脏移植中的抗排斥反应作用研究目的：观察受体小鼠尾静脉注射IL-35质粒载体及地西他滨对同种异系小鼠心脏移植排斥反应的作用,探讨其抗排斥机制。方法：建立小鼠异位腹腔心脏移植模型；设置异系对照组、空质粒对照组、IL-35质粒载体处理组、地西他滨处理组、IL-35质粒协同地西他滨处理组。观察各组移植心脏存活时间,评定术后7天移植物排斥反应病理分级；流式细胞术检测术后7天外周血及脾脏组织T细胞亚群及CD4+CD25+Treg的变化水平。结果：成功构建同种异系小鼠腹腔异位心脏移植模型。与异系对照组（中位生存期8天）和空质粒Fc组（中位生存期7天）相比,IL-35质粒载体处理组（中位生存期10天）、地西他滨处理组（中位生存期11天）和IL-35质粒协同地西他滨处理组（中位生存期12天）移植心脏存活时间明显延长（P<0.01）；IL-35质粒载体处理组、地西他滨处理组和IL-35质粒协同地西他滨处理组术后7天移植心的急性排斥反应病理分级较异系对照组明显降低（P<0.01）；与异系对照组和空质粒Fc组相比,IL-35质粒载体处理组、地西他滨处理组和IL-35质粒协同地西他滨处理组术后7天外周血和脾脏CD4+CD25+Treg比例均明显升高（P<0.01）,外周血CD4-CD8+T细胞水平均明显降低（P<0.01）。结论：小鼠异位腹腔心脏移植模型是研究移植排斥反应的理想动物模型。IL-35及地西他滨对同种异系小鼠心脏移植有抗排斥作用,其机制可能为IL-35及地西他滨刺激CD4+CD25+Treg的生成,抑制效应性T细胞增殖和应答,延长存活时间。IL-35质粒协同地西他滨的基因免疫治疗可能成为新的有效的诱导移植免疫耐受的途径。
二、TBhsp70融合蛋白的一个独立的功能区不依赖于CD4~+T细胞在体内诱导CTL（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、TBhsp70融合蛋白的一个独立的功能区不依赖于CD4~+T细胞在体内诱导CTL（论文提纲范文）
（1）白介素-35在前列腺癌发生发展中的作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、白介素-35在前列腺癌发生和发展中作用的临床病例研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 资料收集 |
| 1.1.3 标本采集 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 主要溶液配比 |
| 1.1.6 主要仪器及设备 |
| 1.1.7 酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) |
| 1.1.8 免疫组化 |
| 1.1.9 统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 纳入患者基本资料 |
| 1.2.2 PCa组、BPH组及组之间血浆IL-35和PSA浓度的比较 |
| 1.2.3 PCa患者血浆IL-35水平和临床和病理参数的关系 |
| 1.2.4 IL-35与PSA的ROC曲线的比较 |
| 1.2.5 不同血浆IL-35浓度患者的生存曲线比较 |
| 1.2.6 前列腺癌患者肿瘤组织中IL-35的表达水平 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 细胞因子IL-35 |
| 1.3.2 IL-35与前列腺癌的发生、发展的相关性 |
| 1.3.3 IL-35与前列腺癌的局部和远处转移的相关性 |
| 1.3.4 IL-35促进肿瘤发展的可能分子机制 |
| 1.4 小结 |
| 二、白介素-35在前列腺癌细胞中的表达及作用的体外实验研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 前列腺癌细胞系 |
| 2.1.2 实验分组 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.1.5 主要实验器材 |
| 2.1.6 主要实验方法 |
| 2.1.7 统计方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 IL-35在4种前列腺癌细胞系中的蛋白表达水平 |
| 2.2.2 IL-35在4种前列腺癌细胞系中的mRNA水平 |
| 2.2.3 IL-35对前列腺癌细胞侵袭能力的影响 |
| 2.2.4 IL-35对前列腺癌细胞迁移能力的影响 |
| 2.2.5 IL-35对前列腺癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 IL-35与PCa恶性程度相关性 |
| 2.3.2 IL-35促进体外肿瘤细胞的迁移、侵袭和细胞生长 |
| 2.3.3 IL-35促进肿瘤细胞迁移、侵袭和增殖 |
| 2.4 小结 |
| 三、白介素-35在前列腺癌发生和发展中作用及相关机制的体内实验研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验分组 |
| 3.1.3 主要实验试剂 |
| 3.1.4 主要实验溶液配制 |
| 3.1.5 主要实验设备 |
| 3.1.6 主要实验方法 |
| 3.1.7 统计方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 肿瘤体积变化比较 |
| 3.2.2 小鼠生存率(OS)比较 |
| 3.2.3 ELISA检测血浆IL-35浓度的比较 |
| 3.2.4 免疫组化结果 |
| 3.2.5 肿瘤组织中相关蛋白的表达情况 |
| 3.2.6 小鼠肺转移率的比较 |
| 3.2.7 IL-35对前列腺癌小鼠免疫细胞的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 IL-35促进肿瘤增长 |
| 3.3.2 IL-35过表达提示预后不良 |
| 3.3.3 IL-35促进肿瘤转移 |
| 3.3.4 IL-35促进血管生成及肿瘤细胞增殖 |
| 3.3.5 IL-35与Treg细胞 |
| 3.3.6 IL-35与MDSCs |
| 3.3.7 IL-35与CD4~+T细胞 |
| 3.3.8 IL-35与CD8~+T细胞 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 白介素35在恶性肿瘤、慢性感染和炎症疾病中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）CCT3基因调控胃癌细胞增殖及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 CCT3在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验器材 |
| 2.1.3 组织标本 |
| 2.1.4 细胞株 |
| 2.1.5 主要工作液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 临床组织病理切片的制备 |
| 2.2.2 组织标本免疫组化染色 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 胃癌细胞株及人胃粘膜上皮细胞株中CCT3基因qRT-PCR检测 |
| 2.2.5 统计学方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 CCT3基因在TCGA数据库表达分析 |
| 2.3.2 胃癌组织中CCT3蛋白的表达高于癌旁组织 |
| 2.3.3 胃癌细胞株及人胃粘膜上皮细胞株中CCT3基因的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 靶向沉默CCT3基因对胃癌细胞功能的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验质粒 |
| 3.1.2 实验菌株TOP10 |
| 3.1.3 细胞株 |
| 3.1.4 实验试剂 |
| 3.1.5 实验器材 |
| 3.1.6 主要工作液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 总体实验流程 |
| 3.2.2 细胞培养 |
| 3.2.3 CCT3基因RNAi慢病毒载体制备 |
| 3.2.4 CCT3基因RNAi慢病毒包装 |
| 3.2.5 CCT3基因RNAi慢病毒感染胃癌细胞株 |
| 3.2.6 qRT-PCR检测CCT3基因mRNA水平的沉默效率 |
| 3.2.7 Western blot检测CCT3基因蛋白水平的沉默效率 |
| 3.2.8 Cellomics细胞计数检测 |
| 3.2.9 MTT细胞活力检测 |
| 3.2.10 克隆形成检测 |
| 3.2.11 细胞凋亡检测 |
| 3.2.12 统计学方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 慢病毒感染效率 |
| 3.3.2 CCT3-shRNA-LV感染后沉默CCT3基因 |
| 3.3.3 RNAi沉默CCT3基因对胃癌细胞增殖的影响 |
| 3.3.4 RNAi沉默CCT3基因对胃癌细胞活性的影响 |
| 3.3.5 RNAi沉默CCT3基因对胃癌细胞克隆的影响 |
| 3.3.6 RNAi沉默CCT3基因对胃癌细胞凋亡的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 CCT3基因沉默后对胃癌细胞裸鼠成瘤的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 试剂 |
| 4.1.2 实验器材 |
| 4.1.3 细胞株 |
| 4.1.4 实验动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验流程 |
| 4.2.2 细胞培养 |
| 4.2.3 CCT3基因RNAi慢病毒感染胃癌BGC-823 细胞 |
| 4.2.4 皮下接种 |
| 4.2.5 检测成瘤情况 |
| 4.2.6 统计学方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 慢病毒感染BGC-823 细胞的效率 |
| 4.3.2 沉默CCT3后对裸鼠成瘤的影响 |
| 4.3.3 活体小动物成像 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 CCT3基因对胃癌发生发展影响的机制探索 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 芯片信息 |
| 5.1.2 实验器材 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 细胞株 |
| 5.1.5 实验主要工作液配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 实验流程 |
| 5.2.2 样品细胞总RNA抽提和质检 |
| 5.2.3 IVT反应获得片段化aRNA |
| 5.2.4 芯片杂交洗染、扫描 |
| 5.2.5 差异表达基因qRT-PCR和Western blot检测验证 |
| 5.2.6 PathScan? Antibody Array检测 |
| 5.2.7 统计学方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 RNA质检结果 |
| 5.3.2 芯片数据质控 |
| 5.3.3 Affymetrix芯片数据结果 |
| 5.3.4 生物信息分析 |
| 5.3.5 差异表达基因qRT-PCR和Western blot检测验证结果 |
| 5.3.6 PathScan? Antibody Array检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 CCT3与肿瘤的关系及研究现状 |
| 参考文献 |
| 综述二 肿瘤微环境与免疫 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 附件 |
| 致谢 |
（3）治疗性HPV疫苗的研制与动物实验研究（论文提纲范文）
| 本论文创新点 |
| 目录 |
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 综述一 HPV与OSCC相关性研究进展 |
| 摘要 |
| 一、HPV的生物学特性 |
| 二、HPV的致病机制 |
| 三、HPV与OSCC的相关证据 |
| 四、HPV在OSCC中的发病率 |
| 五、HPV的的多种检测手段的优缺点 |
| 六、HPV与OSCC预后的关系 |
| 七、小结 |
| 综述二 HPV疫苗的研究进展 |
| 摘要 |
| 一、预防性HPV疫苗 |
| 二、治疗性HPV疫苗 |
| 三、展望 |
| 第一部分 HPV在口腔癌中的流行病学调查 |
| 实验一 HPV在武汉地区OSCC患者中的流行病学调查 |
| 实验设计 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 治疗性HPV疫苗的构建与检测 |
| 实验设计 |
| 实验二 编码人CTLA-4胞外区基因的质粒PCTLA4-E7E6的构建 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验三 治疗性HPV疫苗在真核细胞中的表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 融合DNA疫苗免疫小鼠的研究 |
| 实验四 PCTLA4-E7E6免疫小鼠的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（4）MHC I类分子递呈修饰后抗原的结构与免疫学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论(文献综述) |
| 1.1 引言 |
| 1.2 MHC分子结构免疫学概述 |
| 1.2.1 MHC的概念 |
| 1.2.2 MHC Ⅰ类分子相关抗原肽的加工呈递 |
| 1.2.3 MHC及相关分子的结构特点 |
| 1.2.4 MHC分子结构在T细胞免疫研究中的应用 |
| 1.3 翻译后修饰抗原的MHC分子递呈 |
| 1.3.1 翻译后修饰概述 |
| 1.3.2 MHC相关抗原的翻译后修饰 |
| 1.3.3 翻译后修饰在抗原识别及自身免疫中的影响 |
| 第二章 MHC Ⅰ类分子递呈N端乙酰化抗原机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要商品试剂 |
| 2.2.3 常用溶液及配制方法 |
| 2.2.4 菌株和载体 |
| 2.2.5 多肽合成 |
| 2.2.6 引物设计与合成 |
| 2.2.7 HLA-B~*3901基因扩增及亚克隆构建 |
| 2.2.8 HLA-B~*3901和hβ_2m包涵体蛋白大量表达 |
| 2.2.9 多肽与MHC Ⅰ类分子包涵体蛋白体外复性 |
| 2.2.10 pMHC复合物的蛋白质纯化 |
| 2.2.11 BCA protein assay kit检测蛋白质浓度 |
| 2.2.12 pHLA-B~*3901复合物蛋白质结晶 |
| 2.2.13 pHLA-B~*3901复合物蛋白质晶体X-射线衍射和数据收集 |
| 2.2.14 pHLA-B~*3901复合物蛋白质结构解析、精修及分析 |
| 2.2.15 pMHC复合物蛋白质热稳定性试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 表达载体pET-28b-HLA-B~*3901的构建 |
| 2.3.2 HLA-B~*3901蛋白试表达及包涵体纯化 |
| 2.3.3 pHLA-B~*3901复合物体外复性及纯化 |
| 2.3.4 pHLA-B~*3901复合物蛋白质结晶及X-射线衍射数据收集 |
| 2.3.5 pHLA-B~*3901复合物蛋白质结构解析 |
| 2.3.6 N端乙酰化多肽与HLA-B~*3901复合物结构分析 |
| 2.3.7 N端乙酰化对多肽结合稳定性的影响 |
| 2.3.8 N端乙酰化对表位的T细胞免疫原性的影响 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 N端乙酰化流感病毒表位的T细胞免疫学研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 主要商品试剂 |
| 3.2.2 常用溶液及配制方法 |
| 3.2.3 血样的采集和处理 |
| 3.2.4 HLA分型检测 |
| 3.2.5 人外周血单个核细胞(PBMCs)分离 |
| 3.2.6 细胞的冻存及复苏 |
| 3.2.7 PBMCs体外刺激培养 |
| 3.2.8 MACS技术磁珠分选CD4~+/CD8~+细胞 |
| 3.2.9 ELISPOT操作过程(QuantoBio) |
| 3.2.10 pHLA复合物体外复性及纯化 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 N端乙酰化T细胞表位预测 |
| 3.3.2 N端乙酰化M1抗原表位T细胞免疫原性检测 |
| 3.3.3 N端乙酰化流感病毒表位T细胞免疫水平调查 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 MHC Ⅰ类分子递呈双磷酸化抗原机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 主要实验仪器、材料及试剂 |
| 4.2.2 多肽合成 |
| 4.2.3 主要实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 pHLA-B~*2705复合物体外复性及纯化 |
| 4.3.2 pHLA-B~*2705复合物蛋白质结晶及X-射线衍射数据收集 |
| 4.3.3 pHLA-B~*2705复合物蛋白质结构解析 |
| 4.3.4 HLA-B27限制性双磷酸化多肽递呈的结构基础 |
| 4.3.5 磷酸基团对HLA-B27结合和稳定性的位点特异性影响 |
| 4.3.6 磷酸基团修饰对抗原特性及TCR识别的影响 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 磷酸化表位T细胞免疫学及其T细胞受体研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 主要商品试剂 |
| 5.2.2 常用溶液及配制方法 |
| 5.2.3 多肽合成 |
| 5.2.4 引物设计与合成 |
| 5.2.5 免疫佐剂gp96 N333表达与纯化 |
| 5.2.6 小鼠多肽免疫 |
| 5.2.7 小鼠脾脏细胞分离 |
| 5.2.8 ELISPOT操作过程(BD) |
| 5.2.9 小鼠脾细胞体外培养 |
| 5.2.10 MHC Tetramer制备 |
| 5.2.11 MHC Tetramer染色 |
| 5.2.12 细胞总RNA提取(5～10×10~6细胞) |
| 5.2.13 5’RACE扩增TCR序列 |
| 5.2.14 5’RACE扩增TCR序列 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 gp96 N333蛋白免疫佐剂的表达纯化 |
| 5.3.2 磷酸化多肽对转基因鼠的T细胞免疫原性监测 |
| 5.3.3 MHC四聚体染色分选磷酸化表位特异性T细胞 |
| 5.3.4 HLA-A2.1/K~b转基因小鼠T细胞受体序列扩增 |
| 第六章 其它工作 |
| 6.1 猪源病毒CTL表位多肽与SLA-1结合研究 |
| 6.1.1 引言 |
| 6.1.2 结果与讨论 |
| 6.1.3 小结与展望 |
| 6.2 HLA-A3超类型交叉递呈多肽的结构学研究 |
| 6.2.1 引言 |
| 6.2.2 结果和讨论 |
| 6.2.3 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 缩略词表 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（5）动物MHC分子抗新城疫病毒作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 图表目录 |
| 缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 MHC研究概况 |
| 1.1 MHC的起源 |
| 1.2 MHC的结构比较 |
| 1.3 MHC的遗传学特性 |
| 1.4 MHC基因的表达产物——Ⅰ和Ⅱ类分子 |
| 1.5 MHC的分布 |
| 1.6 MHC的生物学功能 |
| 1.7 MHC分子与疾病的关系及机理 |
| 1.8 国内外关于家禽MHC的研究 |
| 2 恒定链依赖性交叉呈递的机制新进展及应用展望 |
| 2.1 经典的MHC I类分子途径 |
| 2.2 MHC I类分子交叉呈递现象的发现 |
| 2.3 叉呈递抗原的性质 |
| 2.4 交叉呈递的抗原摄取机制 |
| 2.5 恒定链（Ii）依赖性的交叉呈递途径 |
| 2.6 Ii免疫载体应用于交叉呈递的展望 |
| 3 新城疫病毒的研究进展 |
| 4 研究的目的与意义 |
| 引言 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 鸡MHC I类分子sp/α1/α2 和部分Cyt基因的克隆与分析及抗NDV相关氨基酸基序的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Total RNA抽提结果 |
| 2.2 鸡 MHC I α、sp/α1/α2 以及部分Cyt基因RT-PCR扩增 |
| 2.3 鸡 MHC I sp/α1/α2 序列和结构特性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 鸡的两个MHC I α基因位点（BF1 和BF2）拥有不同的进化历史 |
| 3.2 鸡MHC I类分子分子PBR与哺乳相似 |
| 3.3 鸡MHC I分子亚型与抗NDV病毒的关系 |
| 4 结论 |
| 第二章 Ii功能片段增强I类分子表位呈递的机理 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 H-2Kb的克隆和Ii-OVA嵌合体片段的构建及鉴定 |
| 2.2 Ii-OVA嵌合体融合蛋白的表达、纯化与鉴定 |
| 2.3 Ii-OVA嵌合体增强小鼠的细胞因子分泌水平 |
| 2.4 小鼠H-2Kb和Ii链共定位于细胞的胞吞小体中和膜表面 |
| 2.5 小鼠H-2Kb和Ii链共定位于胞吞小体和膜表面 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介及攻读期成果 |
（6）DNA初免-痘病毒加强方案诱导高功能亲和力CD8+T细胞的特征和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语与中英文对照 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 重组痘苗研究进展 |
| 1.2 T细胞功能亲和力研究进展 |
| 1.3 立题依据 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 痘病毒加强免疫提高了DNA疫苗初免所诱导T细胞的功能亲和力 |
| 3.2 CD8~+T细胞是痘苗诱导功能亲和力升高的主要细胞亚群 |
| 3.3 痘苗诱导功能亲和力的升高不受T细胞受体选择调控 |
| 3.4 痘苗诱导功能亲和力的升高与T细胞激活程度相关 |
| 3.5 痘苗诱导功能亲和力的升高与MyD88及其介导固有免疫的关系 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）基于多亚单位Th表位的幽门螺杆菌疫苗的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 幽门螺杆菌 Th 表位的筛选和疫苗设计 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 幽门螺杆菌 Th 表位疫苗的的构建、表达及纯化 |
| 3.1 幽门螺杆菌 Th 表位疫苗的构建和表达 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 实验结果 |
| 3.2 幽门螺杆菌 Th 表位疫苗的发酵、纯化和蛋白特性分析 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 幽门螺杆菌 Th 表位疫苗的免疫保护效果评价与应答分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 幽门螺杆菌 Th 表位疫苗初步安全性评价 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 T 细胞表位预测方法研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（8）Quil A、PICKCa对FMDV、PCV2-PRRSV DNA疫苗免疫增强作用的效果观察（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 佐剂的研究进展 |
| 1.1 佐剂的简介 |
| 1.2 最新进展和未来的科学挑战 |
| 1.3 展望 |
| 2 DNA 疫苗的研究进展 |
| 2.1 DNA 疫苗简介 |
| 2.2 DNA 疫苗佐剂 |
| 2.3 前景与展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 QuilA 与 PICKCa 对试验动物的免疫调节作用 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 Quil A 对 O 型口蹄疫 DNA 疫苗的免疫增强作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 PICKCa 对 PCV2-PRRSV DNA 疫苗免疫增强作用的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 核酸疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 核酸疫苗的构成 |
| 1.1.1.1 抗原编码基因 |
| 1.1.1.2 真核表达质粒载体 |
| 1.1.2 核酸疫苗的分类 |
| 1.1.3 核酸疫苗可能的作用机制 |
| 1.1.4 核酸疫苗的免疫 |
| 1.1.4.1 靶细胞的选择 |
| 1.1.4.2 接种前动物组织的预处理 |
| 1.1.4.3 核酸疫苗的接种方法和途径 |
| 1.1.4.4 核酸疫苗的接种剂量 |
| 1.1.4.5 核酸疫苗的免疫佐剂选择 |
| 1.1.4.5.1 细胞因子佐剂 |
| 1.1.4.5.2 协同刺激分子佐剂 |
| 1.1.4.5.3 补体佐剂 |
| 1.1.4.5.4 免疫刺激序列( |
| 1.1.4.5.5 霍乱毒素(choleratoxin,CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素( |
| 1.1.4.5.6 蛋白转换域( |
| 1.1.4.5.7 模拟或增强 MHC 作用 |
| 1.1.5 核酸疫苗的应用 |
| 1.1.5.1 寄生虫核酸疫苗 |
| 1.1.5.2 细菌核酸疫苗 |
| 1.1.5.3 病毒核酸疫苗 |
| 1.1.6 核酸疫苗研究的意义及展望 |
| 1.2 分子佐剂补体C3d 的研究进展 |
| 1.2.1 补体系统的组成 |
| 1.2.1.1 补体固有成分 |
| 1.2.1.2 补体调节蛋白 |
| 1.2.1.3 补体受体 |
| 1.2.2 补体的激活 |
| 1.2.2.1 经典激活途径 |
| 1.2.2.2 旁路途径 |
| 1.2.2.3 凝集素途径 |
| 1.2.3 C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1.2.3.1 C3d 的产生 |
| 1.2.3.2 C3d 的分子结构 |
| 1.2.3.3 C3d 的天然受体CR2 |
| 1.2.3.4 CR2 与C3d 的结合位点 |
| 1.2.4 C3d 佐剂作用的研究方法 |
| 1.2.4.1 C3d 分子间的直接串联 |
| 1.2.4.2 C3d 与CR2 结合功能区的串联 |
| 1.2.5 C3d 分子的佐剂作用 |
| 1.2.5.1 C3d 对体液免疫应答的影响 |
| 1.2.5.2 C3d 对细胞免疫应答的影响 |
| 1.2.5.3 C3d 对细胞因子表达类型的影响 |
| 1.2.5.4 对抗原特异性体液和细胞免疫的负向调节作用 |
| 1.2.5.5 小鼠品系对C3d 免疫作用的影响 |
| 1.2.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 1.2.6.1 C3d 偶联抗原可增强CR2细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 1.2.6.2 促进B 细胞活化，降低B 细胞的活化阈 |
| 1.2.6.3 促进抗体亲合力成熟 |
| 1.2.6.4 上调Raji 细胞协同刺激分子87-1 和87-2 的表达 |
| 1.2.6.5 依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| 1.2.7 不同动物C3d 的研究 |
| 1.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 蛋白研究进展 |
| 1.3.1 PRRSV 的结构及其生物学特性 |
| 1.3.1.1 PRRSV 的形态结构 |
| 1.3.1.2 PRRSV 的理化性质 |
| 1.3.1.3 PRRSV 的生物学结构 |
| 1.3.1.4 PRRSV GP5 蛋白 |
| 1.3.2 PRRSV 的免疫特性 |
| 1.3.3 PRRSV 的持续性感染与免疫抑制 |
| 1.3.4 PRRS 的诊断方法研究进展 |
| 1.3.4.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.3.4.2 抗原检测方法 |
| 1.3.4.3 PRRSV 的分子生物学诊断 |
| 1.3.4.4 血清学诊断 |
| 1.3.5 基于GP5 蛋白的疫苗研究进展 |
| 1.3.5.1 核酸疫苗 |
| 1.3.5.2 重组多肽疫苗 |
| 1.3.5.3 活载体疫苗 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株和菌株 |
| 2.1.2 载体 |
| 2.1.3 试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 溶液及配制 |
| 2.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 2.2.1.1 鼠、猪C3d 基因的克隆 |
| 2.2.1.2 C3d 和pMD18-T 载体的构建 |
| 2.2.1.3 鼠、猪C3d 基因的测序 |
| 2.2.1.4 哺乳动物与禽类补体C3d 基因序列的比较分析 |
| 2.2.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗的构建 |
| 2.2.2.1 鼠、猪C3d-p28 串联体的构建 |
| 2.2.2.2 pcDNA3.1-C3d-p28.n(n=2，4，6)的构建 |
| 2.2.2.3 PRRSV GP5 基因的扩增 |
| 2.2.2.4 pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).n 重组质粒的构建 |
| 2.2.3 不同动物C3d 分子佐剂对PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究 |
| 2.2.3.1 重组质粒在Marc145 细胞的表达 |
| 2.2.3.2 GP5 核酸疫苗免疫小鼠效果检测 |
| 2.2.3.3 数据处理和分析 |
| 2.2.4 鼠C3d 分子佐剂沙门氏菌invH 核酸疫苗的构建及免疫效果研究 |
| 2.2.4.1 重组质粒pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.2 4 6 的构建 |
| 2.2.4.2 重组质粒在Marc145 细胞的表达 |
| 2.2.4.3 invH 重组质粒免疫小鼠效果检测 |
| 2.2.4.4 数据处理和分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 3.1.1 鼠、猪C3d 基因克隆的电泳结果 |
| 3.1.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 3.1.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 3.1.3.1 鼠、猪的C3d 序列 |
| 3.1.3.2 C3d 基因序列比较分析 |
| 3.1.3.3 CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 3.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗的构建 |
| 3.2.1 C3d-p28 串联体的构建 |
| 3.2.1.1 单拷贝C3d-p28 基因克隆 |
| 3.2.1.2 C3d-p28 串联体的构建 |
| 3.2.2 RT-PCR 扩增PRRSV GP5 基因 |
| 3.2.3 pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).n 重组质粒的构建 |
| 3.3 不同动物C3d 分子佐剂对PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究 |
| 3.3.1 GP5 表达结果 |
| 3.3.2 安全性检验结果 |
| 3.3.3 GP5 核酸疫苗的免疫效果 |
| 3.3.3.1 抗体水平检测结果 |
| 3.3.3.2 中和抗体测定结果 |
| 3.3.3.3 IFN-γ含量的测定结果 |
| 3.3.3.4 IL-4 含量的测定 |
| 3.4 鼠C3d 分子佐剂沙门氏菌invH 核酸疫苗的构建及免疫效果研究 |
| 3.4.1 pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.n 重组质粒的构建 |
| 3.4.2 invH 表达结果 |
| 3.4.3 安全性检验结果 |
| 3.4.4 invH 核酸疫苗的免疫效果 |
| 3.4.4.1 invH 抗体水平结果 |
| 3.4.4.2 小鼠血清中IL-4 和IFN-γ的含量 |
| 3.4.4.3 小鼠攻毒保护试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆 |
| 4.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗构建 |
| 4.3 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究的意义 |
| 4.4 鼠C3d 沙门氏菌invH 核酸疫苗构建及免疫效果研究的意义 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 博士学位论文内容简介及自评 |
（10）白介素35基因治疗协同地西他滨抑制小鼠心脏移植排斥反应的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、IL-35质粒载体及地西他滨对小鼠T淋巴细胞的作用 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 质粒鉴定 |
| 1.2.2 质粒转染 |
| 1.2.3 单向混合淋巴细胞培养 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 调节性T细胞与免疫耐受 |
| 1.3.2 IL-35与调节性T细胞 |
| 1.3.3 甲基转移酶抑制剂地西他滨与免疫耐受 |
| 1.4 小结 |
| 二、IL-35基因转染对小鼠免疫功能的影响 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 流式细胞术检测IL-35基因转染小鼠CD4~+CD25~+Treg比例 |
| 2.2.2 流式细胞术检测IL-35基因转染小鼠T细胞亚群比例 |
| 2.2.3 流式细胞术检测IL-35基因转染小鼠NK细胞比例 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 转染性载体研究现状 |
| 2.3.2 IL-35质粒载体转染对小鼠免疫功能的影响 |
| 2.4 小结 |
| 三、IL-35基因转染协同地西他滨在同种异系小鼠心脏移植中的抗排斥反应作用研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 小鼠腹腔异位心脏移植模型建立 |
| 3.2.2 小鼠异位心脏移植术后调节性T细胞变化 |
| 3.2.3 小鼠异位心脏移植术后T细胞亚群变化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 小鼠心脏移植模型建立和制作体会 |
| 3.3.2 IL-35在小鼠动物模型中的研究 |
| 3.3.3 地西他滨在小鼠异位心脏移植模型中的研究 |
| 3.3.4 IL-35基因转染协同地西他滨在小鼠异位心脏移植模型中的研究 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 白介素12家族的研究新进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
四、TBhsp70融合蛋白的一个独立的功能区不依赖于CD4~+T细胞在体内诱导CTL（论文参考文献）
- [1]白介素-35在前列腺癌发生发展中的作用及相关机制研究[D]. 朱佳琳. 天津医科大学, 2019(02)
- [2]CCT3基因调控胃癌细胞增殖及机制研究[D]. 李莉娟. 兰州大学, 2017(03)
- [3]治疗性HPV疫苗的研制与动物实验研究[D]. 甘莉莉. 武汉大学, 2014(01)
- [4]MHC I类分子递呈修饰后抗原的结构与免疫学研究[D]. 孙明伟. 中国科学技术大学, 2014(10)
- [5]动物MHC分子抗新城疫病毒作用的研究[D]. 吴超. 安徽农业大学, 2013(05)
- [6]DNA初免-痘病毒加强方案诱导高功能亲和力CD8+T细胞的特征和机制研究[D]. 胡志东. 复旦大学, 2013(08)
- [7]基于多亚单位Th表位的幽门螺杆菌疫苗的研究[D]. 李海波. 第三军医大学, 2013(11)
- [8]Quil A、PICKCa对FMDV、PCV2-PRRSV DNA疫苗免疫增强作用的效果观察[D]. 刘燕瑜. 吉林大学, 2012(09)
- [9]C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究[D]. 张德庆. 山东农业大学, 2011(08)
- [10]白介素35基因治疗协同地西他滨抑制小鼠心脏移植排斥反应的研究[D]. 郭昊. 天津医科大学, 2011(12)