一、细胞凋亡与心肌缺血/再灌注损伤的关系（论文文献综述）
宋欣丽[1]（2021）在《龙牙楤木总皂苷抗MIRI机制研究及中成药防治MIRI的系统评价》文中研究指明研究目的1.通过建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,观察龙牙楤木总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用;并且探讨其保护作用是否与线粒体功能障碍以及内质网应激有关。2.通过Meta分析方法对中成药治疗心肌缺血再灌注损伤疗效进行系统评价,为临床使用中成药治疗心肌缺血再灌注损伤治疗提供循证医学依据。研究方法1.实验研究:采用随机数字表法将Wistar大鼠随机分为5组,分别为假手术组、模型组、龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组,通过结扎左前降支30min后复灌,构建大鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型,假手术组、模型组予生理盐水灌胃,龙牙楤木总皂苷剂量组分别按50、100、200mg/（kg·d）灌胃处理。2,3,5—氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色法测定大鼠心肌梗死面积,酶联免疫法检测各组大鼠肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌钙蛋白T（cTnT）的含量,TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）染色法观察心肌组织细胞凋亡指数;使用透射电镜观察心肌组织中线粒体结构和形态变化,提取各组大鼠心肌组织线粒体,活性氧荧光（DCFH-DA）探针法观察线粒体活性氧簇（Reactive Oxygen Species,ROS）的生成变化、JC-1荧光探针法观察线粒体膜电位变化、比色法观察腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate,ATP）的形成及琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase,SDH）活性变化情况。免疫组织化学检测法、蛋白质印迹法（Western blot）法检测内质网经典信号通路PERK-eIF2α通路中蛋白激酶R样内质网激酶（proteinkinase R-like ER kinase,PERK）、p-蛋白激酶R 样内质网激酶（p-protein kinase R-like ER kinase,p-PERK）、真核起始因子 2（eukaryotic initiation factor 2,eIF2α）、p-真核起始因子 2（p-eukaryotic initiation factor 2,p-eIF2α）相关蛋白的表达,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测PERK、eIF2α中mRNA的含量。2.临床研究:通过全面搜索并筛选数据库中自建库到2021年1月1日以来发表的关于中成药治疗心肌缺血再灌注损伤患者的随机临床对照试验,对相关结局指标利用RevMan5.3软件进行系统评价。评价指标包括心肌损伤标志物:肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌钙蛋白I（cTNI）、肌钙蛋白T（cTNT）、再灌注心律失常发生率、不良事件发生率、左室射血分数（LVEF）、高敏C-反应蛋白（hs-CRP）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、乳酸脱氢酶（LDH）等。研究结果实验研究:实验一:TTC染色结果显示,sham组、I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组心肌梗死面积占总心肌面积百分比分别为:0%、72%、56%、52%、31%。其中,与sham组相比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高组心肌梗死面积所占比例明显增加,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组提示差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;龙牙楤木总皂苷各剂量组和I/R组相比较,从各组心肌梗死面积所占百分比可见,龙牙楤木总皂苷各组梗死面积比值均低于I/R组,并且随着龙牙楤木总皂苷剂量的增加,心肌梗死面积所占比值逐渐降低,统计学分析显示,龙牙楤木总皂苷低剂量组统计结果显示无统计学差异（P>0.05）;龙牙楤木总皂苷中剂量组结果显示具有统计学意义（P<0.05）,而龙牙楤木总皂苷高剂量组结果提示具有显着统计学意义（P<0.01）。TUNEL染色结果显示,从颜色上看,sham组:大部分心肌细胞的细胞核呈现为蓝色;I/R组:大部分心肌细胞的细胞核呈现为黄褐色;龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量黄褐色细胞核所占比例介于sham组和I/R组之间,但呈逐渐减少的趋势。sham组细胞凋亡很不明显,可见存在少量散在凋亡细胞;具体的凋亡细胞百分比见下表。与sham组比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组大鼠心肌细胞凋亡百分比则明显增加,阳性凋亡细胞数明显升高,统计学分析结果显示,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组提示差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,龙牙楤木总皂苷低剂量组差异具有统计学意义（P<0.05）,中、高剂量组差异具有显着统计学意义（P<0.01,P<0.01）。酶联免疫法结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高CK-MB、cTnT含量,均有所显着升高,统计分析结果显示,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01、P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05;P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,龙牙楤木总皂苷低剂量组差异无明显统计学意义（P>0.05;P>0.05）,龙牙楤木总皂苷中剂量组差异具有统计学意义（P<0.05;P<0.05）,龙牙楤木总皂苷高剂量组差异具有显着统计学意义（P<0.01;P<0.01）。实验二:透射电镜结果显示:sham组心肌细胞大小及形态基本规则,肌原纤维排列规则;肌细胞内线粒体丰富,线粒体结构完整、形态规则,线粒体内脊排列密集、结构清晰。I/R组心肌细胞大小及形态有较大差异,可见萎缩及坏死肌细胞,肌原纤维排列紊乱;肌细胞内线粒体分布不均,部分聚集,线粒体大小及形态有较大差异,内脊大多模糊。龙牙楤木总皂苷低剂量组心肌细胞形态有一定差异,肌原纤维排列不规则;肌细胞内线粒体丰富,线粒体肿胀,内脊扩张、大多结构模糊;中剂量组心肌细胞大小及形态稍不规则,细胞核呈长梭形,肌原纤维排列稍不规则;肌细胞内线粒体丰富,线粒体结构完整、形态规则,线粒体内脊部分结构清晰、部分模糊;高剂量组心肌细胞大小及形态基本规则,肌原纤维排列规则;肌细胞内线粒体丰富,线粒体结构完整、形态规则,线粒体内脊排列密集、结构清晰。DCFH-DA探针法检测ROS水平结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高ROS水平均显着升高,统计分析结果显示,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,随着龙牙楤木总皂苷剂量的增高,ROS水平呈现出逐步走低的趋势;统计分析结果显示,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异均具有显着统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.01）。比色法观察ATP水平结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高ATP水平均有所降低,统计分析结果显示,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,随着龙牙楤木总皂苷剂量的增高,ATP水平呈现出逐步增高的趋势;统计分析结果显示,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异均具有显着统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.01）;JC-1荧光探针法观察线粒体膜电位水平结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高线粒体膜电位水平水平均有所降低,统计分析结果显示,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,随着龙牙楤木总皂苷剂量的增高,线粒体膜电位水平水平呈现出逐步增高的趋势;统计分析结果显示,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异均具有显着统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.01）;比色法观察SDH活性水平结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高SDH活性水平均有所升高,统计分析结果显示,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,随着龙牙楤木总皂苷剂量的增高,SDH活性水平呈现出逐步走低的趋势;统计分析结果显示,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异均具有显着统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.01）。实验三:Western blot方法检测心肌组织中PERK、eIF2α的表达。结果显示:与sham组相比,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组PERK、eIF2α的表达没有明显变化,统计学分析结果显示,差异均不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05;P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05）。而与I/R组相比较,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组PERK的表达也没有明显改变,统计学分析显示,差异也不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05;P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05）。Western blot方法检测心肌组织中p-PERK、p-eIF2α的表达结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高p-PERK、p-eIF2α表达水平均显着升高,统计分析结果显示,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01、P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,随着龙牙楤木总皂苷剂量的增高,p-PERK、p-eIF2α表达水平呈现出逐步走低的趋势;统计分析结果显示,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异均具有显着统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.01;P<0.01,P<0.01,P<0.01）。qRT-PCR 方法检测心肌组织中PERK、eIF2αmRNA的表达,结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高PERK、eIF2α表达水平均显着升高,统计分析结果显示,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01;P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05;P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,随着龙牙楤木总皂苷剂量的增高,PERK、eIF2α表达水平呈现出逐步走低的趋势;统计分析结果显示,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异均具有显着统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.01;P<0.01,P<0.01,P<0.01）。免疫组化结果显示:与 sham组相比,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组PERK、eIF2α的表达没有明显改变,统计学分析结果显示,差异均不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05;P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05）。而与I/R组相比较,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组PERK、eIF2α的表达也没有太大差异,统计学分析显示,差异也不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05;P>0.05,P>0.05,P>0.05）。免疫组化方法检测心肌组织中p-PERK的表达。结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高p-PERK表达水平均显着升高,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,随着龙牙楤木总皂苷剂量的增高,p-PERK表达水平呈现出逐步走低的趋势;统计分析结果显示,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异均具有显着统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.01）。免疫组化方法检测心肌组织中p-eIF2α的表达。结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高p-eIF2α表达水平均显着升高,统计分析结果显示,I/R组差异具有统计学意义（P<0.05）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,随着龙牙楤木总皂苷剂量的增高,p-eIF2α表达水平呈现出逐步走低的趋势;统计分析结果显示,龙牙楤木总皂苷中、高剂量组差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）,龙牙楤木总皂苷低剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05）。临床研究:最终纳入研究96项,中文文献92篇,英文文献4篇。Meta分析结果显示:CK-MB（SMD:-1.86,95%CI:[-2.33,-1.38],I2=95%,P<0.00001）;CK（SMD:-102.21,95%CI:[-129.34,-75.09],I2=100%,P<0.00001）;cTnI（SMD:-0.80,95%CI:[-0.97,-0.62],I2=99%,P<0.00001）,cTnT（SMD:-1.55,95%CI:[-1.8,-1.3],I2=100%,P<0.00001）;再灌注心律失常发生率（MD:-0.42,95%CI:[-0.34,-0.51],I2=45%,P<0.00001）;不良事件发生率（MD:-0.28,95%CI:[-0.22,-0.36],I2=12%,P<0.00001）;LVEF（SMD:-4.89,95%CI:[-3.9,-5.87],I2=86%,P<0.00001）;HsCRP（SMD:-5.04,95%CI:[-6.92,-3.16],I2=99%,P<0.00001）;MDA（SMD:-4.25,95%CI:[-5.22,-3.28],I2=99%,P<0.00001）;SOD（SMD:-15.26,95%CI:[-10.74,-19.78],I2=99%,P<0.00001）;NO（SMD:-15.26,95%CI:[-5.29,-7.51],I2=97%,P<0.00001）;LDH（MD:-13.83,95%CI:[-20.31,-7.35],I2=0%,P<0.00001）。研究结论1.龙牙楤木总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有一定的保护作用,可减少心肌酶漏出,抑制心肌细胞凋亡,改善损伤心肌组织和线粒体结构,抑制SDH活性,同时降低ROS生成,减缓蛋白磷酸化,其机制可能与降低线粒体功能障碍、抑制内质网应激的过度激活有关。龙牙楤木总皂苷的保护作用与剂量呈正相关,发挥大鼠抗心肌缺血再灌注损伤作用的最适有效剂量在200mg/（kg·d）左右。2.中成药联合西医常规治疗心肌缺血再灌注损伤疗效肯定,尤其在降低再灌注性心律失常和不良事件发生率方面效果显着,但鉴于纳入研究数量偏少、样本量较小、方法学质量偏低,未来需要更多高质量的随机对照试验来证实。
刘燕锋[2]（2021）在《LncRNA SNHG8对缺氧-复氧H9C2细胞损伤的保护作用》文中研究指明目的:大量的研究表明长非编码RNA（lncRNA）在多种疾病（包括癌症和急性心肌梗塞（AMI））中的作用已进行了广泛的研究。我们这项研究主要旨在调查lncRNA SNHG8对缺氧/再复氧（HI/R）H9C2细胞损伤的保护作用及其潜在的作用机制,以探讨心肌缺氧-缺血-再灌注损伤的可能制。方法:CCK-8试剂盒分析不同处理组中的大鼠心肌细胞H9C2细胞活性的变化;Ed U分析检测细胞增殖;乳酸脱氢酶释放（LDH）分析LDH的释放;流式细胞术检测不同处理组的大鼠心肌细胞H9C2细胞凋亡情况;以及免疫印迹检测凋亡相关蛋白Bax,Bcl-2和Cleaved Caspase3蛋白的表达。结果:基因芯片筛选一系列lncRNA的HI/R诱导的H9C2心肌细胞中的表达,结果显示,TUG1,SNHG8和FOXO3-AS1这三个lncRNA在HI/R诱导的H9C2细胞中高表达,而且SNHG8上调的最明显。然后,我们通过CCK-8细胞活性实验,Ed U增殖实验,PCR凋亡实验进一步确定SNHG8在HI/R诱导的H9C2细胞中的保护作用。结果显示,SNHG8 si RNA干扰后,可以显着的增加HI/R诱导的H9C2的细胞活性和增殖,以及显着下调HI/R诱导导致的H9C2细胞凋亡。接下来我们又筛选了一些miRNA在HI/R诱导的H9C2心肌细胞中的表达,再结合Star Base分析,我们发现SNHG8和miR-335之间的关系,而且已通过双重萤光素酶报告基因测定法得以证实。进一步实验证实,转染SNHG8 si RNA可以逆转miR-335抑制剂在增加细胞凋亡和降低细胞生存力方面的作用。此外,我们联合使用Targetscan（http://www.targetscan.org/）和miRTar Base筛选m RNA探索miR-335的结合位点,韦恩图结果显示Targetscan预测的196个差异表达m RNA和miRTar Base预测的1个m RNA进行重叠分析,显示只有RASA1与miR-335相互作用,而且miR-335可以调节RASA1的表达,SNHG8 si RNA作用可以下调RASA1的表达。RASA1沉默可以抑制HI/R诱导的H9C2细胞损伤。然而,SNHG8并没有进一步减少细胞凋亡,这就表明SNHG8可与通过调控RASA1起保护作用,进一步研究发现RASA1可以介导SNHG8对HI/R心肌损伤的保护作用。结论:LncRNA SNHG8可以通过调节miR-335和RASA1减轻HI/R诱导的H9C2心肌细胞的损伤。
潘明月[3]（2021）在《金归配伍对MIRI模型大鼠心肌细胞的保护作用及自噬水平的研究》文中指出目的:研究金归配伍（JG,由乌腺金丝桃与当归2:1比例配伍而成）对心肌缺血再灌注损伤（Myocardial Ischemia/Repe-rfusion Injury,MIRI）模型大鼠心肌细胞的保护作用及自噬水平的影响,旨在为MIRI的防治提供新思路。方法:取50只健康的SD大鼠,雌雄各半,体重为280±20g。将大鼠随机分为5组,每组10只。分组情况为:（1）假手术组（Sham组）;（2）模型组（I/R组）;（3）金归配伍预处理组（JG组）;（4）金归配伍预处理+自噬激活剂组（JGR组）;（5）自噬激活剂组（R组）。各组大鼠于给药前适应性饲养一周。JG组和JGR组连续预防性灌胃给药21天,其余三组大鼠给予灌胃等量生理盐水。各组实验大鼠除Sham组外均通过结扎冠状动脉左前降支法建立MIRI模型。Sham组只穿线、不结扎。其它组处理方式皆与模型组相同。造模过程中对大鼠心电图进行实时监测。造模结束后取血清及心脏组织,检测相关指标。观察不同时段各组大鼠心电图的变化,检测各组大鼠的心肌梗死面积,检测各组大鼠血清中CK-MB、T-AOC的水平,观察心肌细胞超微结构,观察自噬小体的产生情况;检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的水平及自噬调控因子mTOR的磷酸化水平。结果:1.金归配伍能改善MIRI模型大鼠心电图异常,有效抑制MIRI模型大鼠心电图ST段抬高。缺血时,与Sham组比较,JG组ST段显着抬高（P<0.05）,I/R组、JGR组、R组ST段抬高,差异极显着（P<0.01）;与I/R组比较,JG组、JGR组ST段降低,差异极显着（P<0.01）,R组ST段显着抬高（P<0.05）;与JG组比较,JGR组、R组ST段抬高,差异极显着（P<0.01）。缺血30min时,与Sham组比较,I/R组、JG组、JGR组、R组ST段均抬高,差异极显着（P<0.01）;与I/R组比较,JG组ST段降低,差异极显着（P<0.01）,JGR组ST段显着降低（P<0.05）,R组ST段显着抬高（P<0.05）;与JG组比较,JGR组ST段显着抬高（P<0.05）,R组ST段抬高,差异极显着（P<0.01）。再灌注时,与Sham组比较,JG组ST段显着抬高（P<0.05）,I/R组、JGR组、R组ST段抬高,差异极显着（P<0.01）;与I/R组比较,JG组ST段降低,差异极显着（P<0.01）,JGR组ST段显着降低（P<0.05）,R组ST段显着抬高（P<0.05）;与JG组相比,JGR组ST段显着抬高（P<0.05）,R组ST段显着抬高（P<0.01）。再灌注120min时,与Sham组比较,JG组ST段显着抬高（P<0.05）,I/R组、JGR组、R组ST段抬高,差异极显着（P<0.01）;与I/R组比较,JG组ST段降低,差异极显着（P<0.01）,JGR组ST段显着降低（P<0.05）,R组ST段显着抬高（P<0.05）;与JG组相比,JGR组ST段显着抬高（P<0.05）,R组ST段抬高,差异极显着（P<0.01）。2.金归配伍能降低MIRI模型大鼠心肌梗死面积。与Sham组相比,I/R组、JG组、JGR组和R组梗死面积均增加,差异极显着（P<0.01）;与I/R组相比,JG组梗死面积减少,差异极显着（P<0.01）,JGR组梗死面积显着减少（P<0.05）,R组梗死面积显着增加（P<0.05）;与JG组相比,JGR组梗死面积显着增加（P<0.05）,R组梗死面积增加,差异极显着（P<0.01）;与JGR组相比,R组梗死面积增加,差异极显着（P<0.01）。3.金归配伍能显着降低MIRI模型大鼠血清CK-MB水平,减轻心肌细胞损伤程度,提高总抗氧化能力。与Sham组相比,I/R组、R组、JG组和JGR组血清中CK-MB含量均升高,差异极显着（P<0.01）;与I/R组相比,JG组CK-MB水平降低,差异极显着（P<0.01）;JGR组CK-MB水平显着降低（P<0.05）,R组CK-MB水平显着升高（P<0.05）;与JG组相比,JGR组CK-MB水平显着升高（P<0.05）,R组CK-MB水平升高,差异极显着（P<0.01）;与JGR组相比,R组CK-MB水平升高,差异极显着（P<0.01）。与Sham组相比,I/R组、JGR组和R组血清中T-AOC水平均降低,差异极显着（P<0.01）,JG组T-AOC水平显着降低（P<0.05）;与I/R组相比,JG组、JGR组T-AOC水平均升高,差异极显着（P<0.01）,R组T-AOC水平显着降低（P<0.05）;与JG组相比,JGR组T-AOC水平显着降低（P<0.05）,R组T-AOC水平降低,差异极显着（P<0.01）;与JGR组相比,R组T-AOC水平降低,差异极显着（P<0.01）。应用Rapa后,JG作用被抑制。4.金归配伍可降低自噬水平,维持正常心肌细胞形态和线粒体结构。Sham组核膜完整,线粒体结构完整,肌丝排列整齐;I/R组心肌细胞损伤,线粒体肿胀严重,肌丝断裂明显,可见自噬体出现;JG组细胞膜完整,线粒体结构相对完整,肌丝断裂明显改善,未见明显自噬体的出现;JGR组心肌细胞损伤明显改善,核膜相对完整,线粒体肿胀改善,肌丝断裂明显改善,未见明显自噬体形成;R组线粒体肿胀,肌丝断裂,可见较多自噬体出现。应用Rapa后,JG作用被抑制。5.金归配伍能降低自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表达水平,并提高pmTOR蛋白表达水平。与Sham组相比,JG组LC3-Ⅱ含量显着升高（P<0.05）,I/R组、JGR组和R组LC3-Ⅱ含量均升高,差异极显着（P<0.01）;与I/R组相比,JG组、JGR组LC3-Ⅱ水平均降低,差异极显着（P<0.01）,R组LC3-Ⅱ水平显着升高（P<0.05）;与JG组相比,JGR组LC3-Ⅱ水平显着升高（P<0.05）,R组LC3-Ⅱ水平升高,差异极显着（P<0.01）;与JGR组相比,R组LC3-Ⅱ水平升高,差异极显着（P<0.01）。与Sham组相比,JG组Beclin-1含量显着升高（P<0.05）,I/R组、JGR组、R组Beclin-1含量均升高,差异极显着（P<0.01）;与I/R组相比,JG组Beclin-1水平降低,差异极显着（P<0.01）,JGR组Beclin-1水平显着降低（P<0.05）,R组Beclin-1水平显着升高（P<0.05）;与JG组相比,JGR组Beclin-1水平显着升高（P<0.05）,R组Beclin-1水平升高,差异极显着（P<0.01）;与JGR组相比,R组Beclin-1水平升高,差异极显着（P<0.01）。与Sham组相比,JG组pmTOR表达显着降低（P<0.05）,I/R组、JGR组和R组pmTOR表达均降低,差异极显着（P<0.01）;与I/R组相比,JG组pmTOR表达升高,差异极显着（P<0.01）,JGR组pmTOR表达显着升高（P<0.05）,R组pmTOR表达显着降低（P<0.05）;与JG组相比,JGR组、R组pmTOR表达均降低,差异极显着（P<0.01）;与JGR组相比,R组pmTOR表达降低,差异极显着（P<0.01）。应用Rapa后,JG作用被抑制。结论:1.金归配伍对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠具有保护作用,能够改善MIRI模型大鼠心电图异常,降低MIRI模型大鼠心肌梗死面积。2.金归配伍通过降低MIRI大鼠血清中CK-MB水平,提MIRI模型大鼠的血清总抗氧化能力,减轻心肌细胞损伤。3.金归配伍能降低MIRI模型大鼠心肌细胞自噬水平,维持心肌细胞形态和线粒体结构。4.金归配伍能够显着降低MIRI模型大鼠自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表达水平,其发挥抑制MIRI和保护心肌的作用机制可能与上调pmTOR,抑制自噬过度表达有关。
李晨[4]（2021）在《电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用》文中研究说明目的 基于“中医治未病”思想及“心胸内关谋”经典理论,在前期研究基础上,以心肌缺血再灌注损伤模型大鼠为研究对象,从细胞凋亡、细胞焦亡以及细胞自噬的角度出发,观察电针“内关”“足三里”“关元”穴预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及其作用机制。并借用FXR/SHP凋亡信号通路激动剂GW4064及抑制剂Z-guggulsterone从FXR/SHP信号转导通路的角度探讨其作用机制,以及细胞凋亡、焦亡和自噬的联系,为电针预处理防治MIRI提供新的理论依据和治疗靶点。方法 一理论探讨:以中医学和现代医学理论为基础,从心肌细胞焦亡、自噬及凋亡角度出发,探讨电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及其机制;从FXR/SHP凋亡信号通路的角度出发,探讨FXR/SHP通路对心肌细胞凋亡、焦亡以及自噬的影响及其作用机制,以及三者间的联系。二动物实验:将Wistar大鼠80只（雄性,SPF级）按照“随机数字表法”进行随机分组,平均分为4组,分别是:正常组（N组）、假手术组（S组）、模型组（M组）和电针预处理组（EA组）,20只为一组。所有实验动物适应性喂养1周后,开始正式实验。通过左侧冠状动脉结扎法制备MIRI大鼠模型,每组大鼠给予相应的干预措施。再增加40只Wistar大鼠（雄性,SPF级）,随机分为2组,每组20只,分别为电针+GW4064激动剂组（EA+GW组）和电针+z-Guggulsterone抑制剂组（EA+Z组）,每组大鼠给予相应的干预措施。实验1:采用HE染色观察各组心肌组织的形态结构;采用TTC染色测量各组心肌梗死面积和心肌梗死质量;采用TUNEL染色计算各组心肌细胞凋亡指数,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法（ELISA法）进行各组心肌损伤标志物（LDH、CK和c Tn I）的测定;从而探讨电针预处理对MIRI大鼠的保护作用。实验2:采用Western-blot法检测各组NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D蛋白等焦亡相关指标的表达,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞焦亡通路的调节作用实验3:采用Western-blot法检测各组Beclin1、LC3I、LC3Ⅱ蛋白表达以及LC3Ⅱ/LC3I比值,研究电针预处理对心肌细胞的保护作用,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞自噬通路的调节作用。实验4:采用Western-blot法检测各组Bcl-2、Bax蛋白表达,同时用荧光定量PCR法检测各组Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA表达,研究电针预处理对MIRI大鼠模型的保护作用,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞凋亡通路的调节作用。实验5:采用TUNEL染色法计算各组心肌细胞凋亡指数,采用荧光定量PCR法检测凋亡相关指标FXRm RNA、SHPm RNA表达,采用Western-blot法检测各组凋亡相关指标Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表达,焦亡相关指标Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达以及自噬相关指标Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,探讨电针预处理对MIRI模型大鼠FXR/SHP信号通路的影响,以及FXR/SHP信号通路对细胞凋亡、焦亡、自噬的影响及三者间的联系。结果 实验1电针预处理对MIRI大鼠心肌损伤标志物、心肌细胞凋亡指数及形态学影响（1）HE染色:光镜下观察与比较各组大鼠心肌细胞形态学结果如下:N组和S组大鼠心肌纤维走向整齐,横纹清晰可见,细胞结构完整,形态正常,无炎性浸润,细胞核位置正常,无空泡样变性;M组心肌纤维走形紊乱、可见心肌纤维断裂现象,心肌细胞结构不完整,炎性细胞浸润明显,可见空泡样变性;EA组大鼠心肌组织大体形态正常,破坏减轻,心肌纤维排列稍显杂乱,少许纤维断裂,少量炎性细胞浸润,少量细胞水肿坏死。表明电针预处理能有效缓解心肌缺血再灌注模型大鼠心肌组织损伤。N组和S组大鼠心肌纤维走向整齐,横纹清晰可见,细胞结构完整,形态正常,无炎性浸润,细胞核位置正常,无空泡样变性;M组心肌纤维走形紊乱、可见心肌纤维断裂现象,心肌细胞结构不完整,炎性细胞浸润明显,可见空泡样变性;EA组大鼠心肌组织大体形态正常,破坏减轻,心肌纤维排列稍显杂乱,少许纤维断裂,少量炎性细胞浸润,少量细胞水肿坏死。表明电针预处理能有效缓解心肌缺血再灌注模型大鼠心肌组织损伤。（2）心肌梗死面积:与N组相比较,S组梗死面积变化不大,差异无统计学意义（P>0.05）;与N组相比较,M组的梗死面积显着增加（P<0.01）;与M组相比较,EA组的梗死面积显着减小（P<0.01）。（3）心肌梗死质量;与N组相比较,S组梗死质量变化不大,差异无统计学意义（P>0.05）;与N组相比较,M组的梗死质量显着增加（P<0.01）;与M组相比较,EA组的梗死质量显着减小（P<0.01）。（4）心肌细胞凋亡指数:N组和S组心肌组织中,可见极少量凋亡细胞核,M组中存在大量凋亡细胞,细胞核形态不规则,成碎片状,EA组可见少量凋亡细胞核。与N组和S组比较,M组心肌细胞凋亡指数明显上升（P<0.01）,与M组比较,EA组心肌细胞凋亡指数明显下降（P<0.01）。（5）血清LDH、CK、c Tn I含量:与N组相比较,S组血清LDH、CK、c Tn I含量变化不大,差异均无统计学意义（均P>0.05）;与N组比较,M组、EA组血清LDH、CK、c Tn I含量均上调（均P<0.01）,EA组血清LDH、CK、c Tn I含量均低于M组（均P<0.01）。实验2电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠焦亡通路的调控作用（1）心肌组织NLRP3、ASC蛋白表达情况:与N组、S组相比较,M组、EA组的NLRP3、ASC蛋白表达均升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组NLRP3、ASC蛋白表达均显着下降（均P<0.05）。（2）心肌组织Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达情况:与N组、S组相比较,M组、EA组的Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达均升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达均显着下降（均P<0.05）。实验3电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠自噬通路的调控作用（1）心肌组织Beclin-1蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组Beclin-1蛋白表达明显升高（P<0.05）,与M组相比,EA组Beclin-1蛋白表达明显降低（P<0.05）。（2）心肌组织LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值情况:与N组、S组比较,M组、EA组LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显升高（均P<0.05）,与M组相比,EA组LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显降低（P<0.05）。实验4电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠细胞凋亡的影响（1）心肌组织Bcl-2蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组Bcl-2蛋白表达水平均下降（均P<0.05）。与M组比较,EA组Bcl-2蛋白表达水平显着升高（P<0.05）。（2）心肌组织Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组和EA组Caspase-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达显着升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组的Caspase-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）。实验5电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠FXR/SHP信号通路的影响（1）心肌细胞凋亡指数:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组、EA+Z组心肌细胞凋亡指数明显升高（P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组、EA+Z组心肌细胞凋亡指数均明显降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组心肌细胞凋亡指数明显下降（P<0.05）,EA+GW组心肌细胞凋亡指数明显升高（P<0.05）。（2）心肌组织FXRm RNA、SHPm RNA表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组及EA+GW组大鼠心肌细胞FXRm RNA、SHPm RNA表达水平均明显升高（均P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组、EA+Z组的FXRm RNA、SHPm RNA表达均有显着性降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组FXR、SHPm RNA表达水平显着降低（P<0.05）,EA+GW组FXR、SHPm RNA表达水平明显升高（P<0.05）。（3）心肌组织Bcl-2、Bax、Caspases-3蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GM组及EA+Z组大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白表达水平均下降（均P<0.05）,Bax、Caspase-3蛋白表达水平均显着升高（均P<0.05）。与M组比较,EA组、EA+GW组及EA+Z组的Bcl-2蛋白表达水平均明显升高（均P<0.05）,Bax、Caspase-3蛋白表达水平均明显降低（均P<0.05）,与EA组比较,EA+Z组Bcl-2蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,EA+GW组Bax、Caspases-3蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）。（4）心肌组织Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组及EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显升高（均P<0.05）,与M组相比,EA组、EA+GW组及EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显降低（均P<0.05）,与EA组比较,EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显着降低（均P<0.05）,EA+GW组均显着升高（均P<0.05）。（5）心肌组织Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组及EA+Z组大鼠心肌细胞Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均明显升高（均P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组及EA+Z组的Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达均有显着性降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）,EA+GW组均显着升高（均P<0.05）。结论 1.电针预处理能使MIRI模型大鼠心肌梗死面积及梗死程度明显下降,降低凋亡指数,病理形态学检测提示电针可显着改善受损心肌组织的病理损害程度。2.电针预处理能下调MIRI模型大鼠血清中LDH、CK及c Tn I的含量,保护大鼠心肌组织。3.电针预处理能抑制MIRI模型大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达,通过抑制细胞焦亡,保护心肌组织。4.电针预处理能抑制MIRI模型大鼠Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值过度升高,通过抑制细胞过度自噬,保护心肌组织。5.电针预处理能下调MIRI模型大鼠Bax蛋白表达、Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA表达,上调Bcl-2蛋白表达,通过抑制细胞凋亡,保护心肌组织。6.电针预处理能通过抑制FXR/SHP凋亡信号通路从而抑制心肌细胞凋亡,抑制凋亡,能起到抑制细胞焦亡和抑制细胞过度自噬的作用,从该角度探讨三者间的联系,进一步说明电针预处理对MIRI的保护机制可能是多层次、多途径的综合效应。
叶景学[5]（2021）在《羟基红花黄色素A调控AMPK/NLRP3通路抗心肌缺血再灌注损伤分子机制研究》文中进行了进一步梳理急性心肌梗死严重威胁着人类的健康,早期血流恢复对维持心脏功能、减轻心肌细胞损伤具有重要作用。然而,随着血流恢复,心肌组织结构和心功能产生进一步损伤称为心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI）。炎症反应是MIRI的重要病理机制之一,缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）诱导NLRP3炎症小体活化,由此产生的IL-1 β、IL-18和caspase-1参与MIRI过程。自噬可抑制炎症小体活化,并抑制IL-1 β和IL-18的分泌。自噬在MIRI过程中发挥重要作用,适度的自噬抑制了心肌梗死后的损伤。因此,通过调节自噬抑制NLRP3炎症小体活化是减轻MIRI有效途径。AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）可通过自噬等多条途径负调控NLRP3炎症小体活化所介导的炎症反应。羟基红花黄色素A（Hydroxysafflor yellow A,HSYA）是红花及注射用红花黄色素的主要黄酮类活性成分,红花及注射用红花黄色素的多种药理活性与HSYA有关。红花是传统的活血化瘀类代表药物,被广泛地应用于心脑血管疾病的治疗,其中红花黄酮是红花的主要效应物质,对心血管系统具有显着的保护作用。红花黄酮对缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）诱导的心肌细胞损伤具有保护作用,其机制与抑制NLRP3炎症小体激活有关。然而,红花黄酮对MIRI保护作用的物质基础尚不明确,HSYA能否通过抑制NLRP3炎症小体对MIRI发挥保护作用及其作用机制尚待确定。在本研究中,首先利用H9c2心肌细胞H/R模型研究五种红花黄酮对MIRI保护作用,然后利用细胞和动物模型探讨了 HSYA对MIRI的保护作用及其激活自噬抑制NLRP3炎症小体活化的分子机制。主要研究结果如下:1.羟基红花黄色素A、脱水红花黄色素B、山奈酚、圣草酚和芹菜素五种红花黄酮分别预给药6 h,利用MTT法检测不同红花黄酮对正常H9c2心肌细胞的影响,确定了五种红花黄酮的安全剂量范围。然后将五种红花黄酮分别预给药4 h、12 h和24 h,然后进行缺氧6 h,复氧12 h处理,利用MTT法分别检测五种红花黄酮对H/R诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用。结果表明,在本实验设定的剂量范围内,羟基红花黄色素A和脱水红花黄色素B对正常H9c2心肌细胞没有显着影响,芹菜素和山奈酚给药剂量达到25 μM后降低H9c2心肌细胞的存活率,而圣草酚给药剂量大于50 μ M时降低H9c2心肌细胞存活率。五种红花黄酮均对H/R诱导H9c2心肌细胞损伤具有保护作用,其中,羟基红花黄色素A、脱水红花黄色素B、山奈酚三种黄酮对H/R诱导的H9c2心肌细胞损伤表现出较强的保护作用。2.成年SD大鼠结扎左前降支30 min,再灌注24 h制作MIRI模型,研究HSYA对大鼠MIRI的保护作用及其机制。利用TTC染色测量并计算不同组别大鼠心肌梗死面积;利用TUNEL试剂盒检测心肌组织的凋亡情况;利用HE染色检测心肌组织形态改变;利用生化试剂盒检测大鼠血清中心肌酶CK-MB、LDH、AST水平;通过ELISA试剂盒检测不同组别大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-18等炎症因子水平,通过Western blot和免疫组化检测不同组别大鼠心肌组织中NLRP3炎症小体等相关蛋白表达,以评价HSYA对炎症损伤的保护作用;采用Western blot检测自噬相关蛋白Atg5、BECN1、P62、LC3B等的表达,以评价HSYA对自噬的影响;采用Westernblot检测HSYA对AMPK/mTOR信号通路的影响。结果表明,HSYA对大鼠MIRI发挥保护作用,能够降低心肌梗死面积,减轻心肌功能紊乱,与缺血再灌注损伤组比较,HSYA能抑制mTOR表达,提高AMPK磷酸化水平,抑制心肌细胞凋亡,降低大鼠血清炎性细胞因子水平,诱导自噬,从而抑制NLRP3炎症小体活化。3.研究HSYA对H/R诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用及其机制。采用JC-1染色观察细胞线粒体膜电位变化,流式细胞术检测细胞早期凋亡（AnnexinV/PI双染）,生化试剂盒检测caspase-3活性,研究HSYA对H/R诱导心肌细胞凋亡的保护作用;通过ELISA试剂盒检测细胞上清中IL-1 β的分泌,生化试剂盒检测Caspase-1活性,Western blot检测NLRP3炎症小体相关蛋白的表达,以评价HSYA对炎症损伤的保护作用;构建自噬双标慢病毒（RFP-GFP-LC3）H9c2细胞稳定细胞系,实时监测自噬流,采用Western blot检测LC3等自噬相关蛋白的表达,以评价HSYA对自噬的影响;采用Western blot检测HSYA对AMPK信号通路蛋白磷酸化的影响。结果表明,HSYA对H/R诱导H9c2心肌细胞损伤具有保护作用,提高心肌细胞活力,维持线粒体膜电位,减少心肌细胞凋亡,降低caspase-3活性,抑制H/R诱导NLRP3炎症小体的激活。HSYA对H/R诱导心肌细胞损伤的保护作用可以被AMPK抑制剂Compound C所抑制,表明HSYA可通过提高AMPK磷酸化水平,改善自噬,负调控NLRP3炎症小体活化对H/R诱导心肌细胞损伤发挥保护作用。本论文首次证明了 HSYA可通过提高AMPK磷酸化水平,改善自噬,负调控NLRP3炎症小体活化,从而发挥抗MIRI作用,为红花更精准的临床应用提供科学依据。并明确了促进自噬、抑制NLRP3炎症小体活化可作为药物对MIRI发挥保护作用的新途径,为抗MIRI新药发现提供了新思路。
张雯雯[6]（2021）在《益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮功能影响与机制的研究》文中研究说明目的:缺血再灌注损伤可见于心、脑、肺、肾等人体多个重要器官,探究其病理机制,最大程度降低损伤,提高临床疗效越来越成为医学界的研究热点。缺血心肌再灌注（MIRI）后无复流、慢复流致使心律失常甚至再梗死等并发症严重影响血运重建治疗的临床预后,其机制涉及冠脉微循环病变。西医治疗方案尚缺乏安全有效防治冠脉微循环障碍的药物,特别是血运重建后期治疗方面,中医药能够发挥未病先防、既病防变的特色优势,临床疗效明显,较西药治疗费用更低。目前国内关于中药单体及复方防治MIRI的研究虽有一定进展,但缺乏对多靶点作用机制的深入探究。宫丽鸿教授以“风扰心络为病”理论为基础,提出益气搜风、养血解痉、通络止痛之治法,总结自身多年临床经验结合前人古方,形成益气搜风中药组方黄芪复方,寓意补养心络亏虚之气血、搜剔内扰之毒风,以助心脉气血调和、脉道息风通络,改善心肌细胞因缺血缺氧形成的组织结构与功能损伤。此法以补为通,寓通于补,通补兼施,相辅相成,补气而不留邪,剔邪而不伤正,针对本虚标实的病理特点,可谓标本兼治。本研究通过冠脉结扎法复制建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型,以模型大鼠为研究对象,观察益气搜风中药黄芪复方对实验大鼠内皮功能影响与炎症反应、细胞凋亡相关因子蛋白与基因的表达,从对血管内皮功能的保护作用角度,探讨益气搜风中药对缺血再灌注损伤中微循环障碍的影响,并进一步揭示其产生作用可能相关的机制途径,丰富风扰心络为病之理论内涵,并为临床推广应用提供实验依据。材料与方法:1.心肌缺血再灌注损伤模型建立与益气搜风中药对模型大鼠内皮功能影响:将120只（240±20）g SD大鼠随机分为假手术组、模型组、培哚普利组、益气搜风中药黄芪复方低中高剂量组,共6组,每组20只。根据成人（按体重60kg计算）常用剂量与实验动物用药剂量换算公式,折算出大鼠剂量,每组给予不同预处理。假手术组、模型组大鼠均予生理盐水10 mL·kg-1灌胃;益气搜风中药低、中、高剂量组分别予含黄芪复方1.8g·kg-1、3.6 g·kg-1、7.2 g·kg-1药液灌胃;培哚普利组予以含有培哚普利浓度为0.4mg·kg-1溶液灌胃。上述操作各组日1次,持续7d。第7d灌胃完毕1h采用冠脉结扎法建立心肌缺血再灌注模型;其中假手术组术中不结扎冠脉,余操作同其它各组;分别记录结扎30 min时与再灌注120 min时大鼠ECG情况;选取Ⅱ导联为实验中主要观察目标,以ST段变化作为心肌缺血标志;以ST段显着抬高判定结扎成功,以抬高的ST段回落幅度达1/2判定再灌注造模成功。造模成功后进行取材,取材前夜（即第6d）大鼠禁食不禁水。取腹主动脉取血,静置后离心,上清液-20℃保存,用于后续实验;采血后即刻处死大鼠,无菌条件下取出心脏,经灭菌生理盐水清洗以10%甲醛固定,-20℃冻存用于后续实验。采用ELISA法检测各组血清中TXA2、PGI2、s TM、s EPCR的含量,比较各组TXA2/PGI2比值。2.益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮炎症因子的影响:取已采集的各组大鼠血清,采用ELISA法检测各组血清中IL-8、IL-6、TNF-α含量。3.益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮细胞凋亡的影响:取已采集的各组大鼠心脏组织,电子天平称取左心室心尖部位100mg,高通量组织研磨仪研磨组织,研磨好的心肌组织置于预先配制好的500ul裂解液,以12000 rpm速度离心10 min后取上清液,经处理后采用Western Blot法测定各组Akt、P-Akt、Bax、Bcl-2蛋白表达水平,采用蛋白质定量（BCA）法测定蛋白浓度,采用ECL化学发光检测法检测,实验结果通过成像系统显示;采用RT-PCR法测定Aktm RNA、eNOS m RNA、Baxm RNA、Bcl-2 m RNA表达水平,采用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物,采用2-ΔΔct法对各样品中基因的表达差异进行相对定量分析。统计学处理均采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析,Graphpad Prism 9.0.0版统计软件绘制数据分析图,计量资料以（?）表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较方差齐采用LSD检验。P<0.05表示存在统计学差异,P<0.01表示差异显着,P>0.05为差异不具有统计学意义。结果:1.心肌缺血再灌注损伤模型建立与益气搜风中药对模型大鼠内皮功能影响:1.1复制大鼠心肌缺血再灌注损伤模型:模型建立过程中各组大鼠存活情况:麻醉操作后,死亡1只大鼠;气管插管与术中行结扎、再灌注等操作时,因呼吸停止、大出血和室颤共造成37只大鼠死亡,其中假手术组5只、其他造模组32只。各组存活大鼠数量满足后续实验需求。造模情况:经心电图监测观察结扎时与再灌注后大鼠Ⅱ导联心电变化,筛除未符合ST段改变标准大鼠8只,成功造模总数59只,各组造模成功大鼠数量满足指标检测需求。1.2各组大鼠血清TXA2、PGI2水平及TXA2/PGI2比值:相较假手术组,模型组TXA2水平显着升高,PGI2水平显着降低,TXA2/PGI2明显升高（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组和益气搜风中药黄芪复方各剂量组TXA2含量均显着降低,PGI2含量显着升高,TXA2/PGI2显着下降（P<0.01）;相较于培哚普利组,益气搜风中药中剂量组TXA2、PGI2含量与TXA2/PGI2均无明显差异（P>0.05）。1.3各组大鼠血清s TM、s EPCR水平:相较于假手术组,模型组s TM、s EPCR含量显着升高（P<0.01）;相较于模型组,培哚普利组和益气搜风中药各剂量组s TM、s EPCR含量均显着降低（P<0.01）;相较于培哚普利组,中药各剂量组s TM、s EPCR含量升高（P<0.05）。2.益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮炎症因子的影响:2.1各组大鼠血清IL-6、IL-8水平:相较假手术组,模型组IL-6、IL-8含量显着升高（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组和中药各剂量组IL-6、IL-8含量均显着降低（P<0.01）;相较于培哚普利组,中药中剂量组IL-6、IL-8含量无明显差异（P>0.05）。2.2各组大鼠血清TNF-a水平:相较假手术组,模型组TNF-a含量显着升高（P<0.01）;相较于模型组,培哚普利组和中药各剂量组TNF-a含量均显着降低（P<0.01）;相较于培哚普利组,中剂量组TNF-a含量无明显差异（P>0.05）。3.益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮细胞凋亡的影响:3.1各组大鼠Akt、eNOS m RNA的表达:相较假手术组,模型组Akt m RNA、eNOS m RNA表达显着降低（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组与益气搜风中药各剂量组Akt mRNA、eNOS m RNA表达均增加（P<0.05）;相较于培哚普利组,益气搜风中药中剂量组Akt mRNA、eNOS mRNA表达无明显差异（P>0.05）。3.2各组大鼠Akt、P-Akt蛋白表达与P-Akt/Akt 比值:相较假手术组,模型组Akt、P-Akt蛋白表达显着降低（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组、益气搜风中药各剂量组Akt、P-Akt蛋白表达显着增加（P<0.01）;相较于培哚普利组,益气搜风中药中剂量组Akt蛋白表达、P-Akt/Akt 比值无明显差异（P>0.05）,高剂量组P-Akt蛋白表达无明显差异（P>0.05）。3.3各组大鼠Bcl-2、Bax mRNA的表达:相较假手术组,模型组Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达均升高（P<0.05）;相较模型组,培哚普利组与益气搜风中药各组Bcl-2mRNA表达均升高,Bax mRNA表达降低（P<0.05）;与培哚普利组相比,益气搜风中药中剂量组Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达无明显差异（P>0.05）。3.4各组大鼠Bcl-2、Bax蛋白表达与Bcl-2/Bax比值:相较假手术组,模型组Bcl-2、Bax蛋白表达均显着升高,Bcl-2/Bax比值显着降低（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组、益气搜风中药中剂量组Bcl-2蛋白表达与Bcl-2/Bax比值均显着升高,Bax蛋白表达显着降低（P<0.01）;相较于培哚普利组,益气搜风中药中剂量组Bcl-2蛋白表达无明显差异（P>0.05）。结论:1.益气搜风中药黄芪复方能够调控血管内皮功能损伤因子的表达,提示益气搜风中药复方对MIRI大鼠血管内皮功能可能具有保护作用。2.益气搜风中药复方能够下调大鼠IL-8、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达,提示益气搜风中药复方对MIRI大鼠心肌的保护作用可能与抑制炎性反应有关。3.益气搜风中药复方能够上调PI3K/Akt信号通路中关键靶蛋白Akt及其下游eNOS mRNA表达水平;干预Akt及P-Akt蛋白表达水平,调控P-Akt/Akt平衡;同时调控凋亡因子Bcl-2、Bax基因与蛋白的表达。提示益气搜风中药复方改善MIRI血管内皮功能的机制可能与激活PI3K/Akt信号通路活性从而调控细胞凋亡有关。
苏亚乐[7]（2021）在《环状RNA Foxo3在心脏移植心肌缺血再灌注损伤中的作用机制研究》文中研究说明背景:心脏移植是治疗终末期心力衰竭或严重冠心病的最终有效手段。然而供体心脏在移植过程中不可避免地会发生缺血再灌注损伤,严重影响了心脏移植的临床结局。供心低温保存于器官保存液中时,心脏活力会得以保存,但移植心脏仍然会经历热缺血、冷缺血和再灌注损伤,而缺血再灌注损伤是心脏移植早期移植物功能障碍和移植物功能衰竭的主要原因,冷缺血时间超过6小时会导致移植心脏早期功能障碍,降低5年生存率,严重降低供心利用率。因此,迫切需要新的机制和治疗靶点来有效的预防和治疗心脏移植术后缺血再灌注损伤。Circ RNA是一种新型的具有共价闭环结构的RNA,其属于非编码基因的一个种类,因其能够参与到很多疾病的发生和发展的过程而成为近年来表观遗传学领域的一个新的研究热点。在心血管循环系统疾病中,circ RNA被报道和血管内皮细胞增殖、凋亡,血管平滑肌细胞表型转换以及心肌细胞坏死/凋亡相关,其中也有报道circ RNA参与到缺血再灌注损伤的疾病过程,但是circ RNA在缺血再灌注损伤的中的研究尚处于起步阶段,许多circ RNA在疾病中具体的作用机制尚不清楚。目的:因此,为了阐明circ Foxo3在心肌缺血再灌注损伤中的作用及相关机制,本研究通过体外细胞分子实验验证circ Foxo3在缺氧/复氧损伤过程中差异性表达,对circ Foxo3进行干扰下调后是否可以起到减轻缺氧/复氧过程中心肌细胞损伤程度,从而证明circ Foxo3参与到缺血再灌注心肌损伤的过程中。然后应用免疫共沉淀技术找到与circ Foxo3相结合的基因,进一步分析circ Foxo3调节缺血再灌注心肌损伤的具体靶点。最后构建缺血再灌注动物模型,再次通过体内实验证实circ Foxo3参与到缺血再灌注心肌损伤过程。最终锁定心脏移植过程中心肌缺血再灌注的关键发病机制,为后续心肌缺血再灌注预防、诊断和治疗提供血清学标志物和潜在药物治疗靶点。方法:1.缺氧/复氧损伤细胞模型诱导。实验前预先将HL-1细胞铺板于6孔板中,移除培养基后更换2 ml UW溶液,然后将细胞放入hypoxia workstation（0.5%O2,5%CO2,94.5%N2,10℃）进行培养24小时,更换正常培养基并在正常培养条件下培养12小时。原代心肌细胞损伤模型诱导为加入0.5 ml UW溶液然后于上述低氧条件培养16小时,随后更换正常培养并在正常培养条件下培养6小时。2.circ Foxo3在缺氧/复氧损伤过程对心肌细胞损伤作用机制研究。qRT-PCR确认circ Foxo3在缺氧/复氧损伤细胞模型与正常细胞之间呈现差异性表达。RNA干扰技术对HL-1细胞进行circ Foxo3 siRNA转染,Annexin V检测细胞凋亡,线粒体膜电位实验检测线粒体损伤,Incu Cyte系统评价细胞死亡,q RT-PCR和蛋白电泳检测细胞凋亡以及炎症损伤标志物。3.circ Foxo3下游结合基因检测。q RT-PCR确认与circ Foxo3相结合的mi RNA在缺氧/复氧损伤细胞模型中的表达量。构建circ Foxo3生物素化探针,对差异表达的mi RNA应用RNA免疫共沉淀实验再次确认是否具有结合性,检测与circ Foxo3相结合的mi RNA。qRT-PCR确认Foxo3基因在缺氧/复氧损伤细胞模型表达量,免疫共沉淀再次验证circ Foxo3和Foxo3蛋白的可结合性,蛋白电泳检测低表达circ Foxo3的细胞中p-Foxo3蛋白的表达量。4.缺血再灌注损伤动物模型诱导。8周大的C57BL/6NCrl小鼠被用来进行心脏移植的供体以及受体。首先用1毫升含有50 ug circ Foxo3干扰物或circ Foxo3对照物的UW保存液进行心脏灌注,然后不同的供体心脏在4摄氏度下保存24小时,随后进行同种异体心脏移植。5.circ Foxo3对心脏移植小鼠缺血再灌注过程的影响。通过超声心动检查评价2组心脏移植后小鼠的心脏射血分数及。将2组小鼠处死后进行HE染色评价小鼠心脏组织大体变化,马松染色评价心肌纤维化改变情况,TUNEL染色检测小鼠心肌凋亡情况,同时检测心脏组织中Caspase-3的活性及蛋白表达。结果:1.成功构建HL-1细胞及原代心肌细胞缺氧/复氧损伤模型。2.circ Foxo3在HL-1细胞以及原代培养的心肌细胞缺氧/复氧损伤模型中较正常培养的心肌细胞表达显着性升高。Annexin V检测结果显示缺氧/复氧处理后HL-1细胞中显着增加Annexin-V+凋亡细胞。在HL-1细胞低表达circ Foxo3后显着降低缺氧气再灌注对细胞造成的损伤,Annexin-V+凋亡细胞明显减少。Incu Cyte系统动态显示低表达circ Foxo3后显着降低缺血再灌注细胞的死亡数量。q RT-PCR检测显示低表达circ Foxo3后Bax、caspase 8、caspase 9和caspase 3表达水平显着降低。蛋白电泳显示低表达circ Foxo3后caspase 3表达水平显着降低。3.circ Foxo3结合Foxo3蛋白并能抑制Foxo3蛋白磷酸化。q RT-PCR检测显示低表达circ Foxo3后,mi R-433和mi R-136表达量降低而mi R-22、mi R-138和mi R-149表达无明显变化。RNA免疫共沉淀实验显示circ Foxo3探针下拉复合物中并未检测到mi R-433和mi R-136表达。低表达circ Foxo3的HL-1心肌细胞中p-Foxo3蛋白表达增高,而高表达circ Foxo3的HL-1心肌细胞中p-Foxo3蛋白表达降低。免疫共沉淀实验显示circ Foxo3探针下拉复合物中检测到Foxo3蛋白表达。4.通过外科手术方法成功制造心脏移植小鼠动物模型（动物外科手术,均在加拿大西安大略大学Matthew Mailing中心完成）。5.circ Foxo3参与心脏移植小鼠心肌缺血再灌注损伤。qRT-PCR检测显示保存24小时的心脏供体再进行心脏移植较直接心脏移植的供体中circ Foxo3表达量增高。相对于加入circ Foxo3干扰物对照物的移植供体,加入circ Foxo3干扰物的心脏供体移植后心脏射血分数增加,左室功能增加。HE染色显示心肌细胞排列整齐,心肌损伤程度较低,仅有水样变性。而对照组心肌排列紊乱,有大量坏死和梗死物质。马松染色显示加入circ Foxo3干扰物UW液灌注的心脏供体移植后心脏纤维化程度降低,同时心脏组织中Caspase-3的活性及蛋白表达降低。结论:1.心肌缺血再灌注损伤过程伴随着circ Foxo3表达量差异性升高,其中经缺氧/复氧损伤诱导的HL-1细胞及新生小鼠原代心肌细胞中circ Foxo3表达增高,经心脏移植缺血再灌注损伤诱导的小鼠心肌组织中circ Foxo3表达增高。2.在HL-1细胞中低表达circ Foxo3后可以显着降低缺氧/复氧对细胞造成的损伤,减少细胞凋亡水平和线粒体损伤程度。3.低表达circ Foxo3的UW液体保存的供体心脏可以显着提高心脏功能,减少心肌缺血再灌注后所受到的损伤,降低心肌损伤后纤维化程度。4.circ Foxo3能通过结合Foxo3蛋白并能抑制Foxo3蛋白磷酸化,进而诱导心肌缺血再灌注损伤。综上,心肌缺血再灌注损伤过程心肌组织中高表达circ Foxo3能够促进对Foxo3蛋白的吸附并能抑制Foxo3蛋白磷酸化水平增加,从而导致心肌细胞凋亡、坏死增加以及线粒体损伤。上述研究结果为环状RNA在心脏移植心肌缺血再灌注损伤过程中的发病机制提供全新的理论基础。并且为心脏移植过程中心肌缺血再灌注损伤的诊断、预防以及治疗提供早期诊断血清学标志物以及潜在药物治疗靶点。
肖燕[8]（2020）在《基于mTORC1-ULK1-FUNDC1通路的电针预处理减轻MIRI的线粒体自噬机制研究》文中研究说明目的:1、比较不同电流强度电针预处理（EAP）对心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的影响,并明确其效应差异,探索EAP抗MIRI的相对适宜电流强度。2、探索mTORC1在EAP抗MIRI保护效应中与线粒体自噬的相关性。3、探索EAP调控MIRI大鼠线粒体自噬的mTORC1-ULK1-FUNDC1信号机制。方法:1、将120只SPF级成年雄性SD大鼠随机分为8组:模型组（I/R组）、模型+非电针对照组（I/R+SEA组）、模型+0.2mA电流强度电针预处理4d组（I/R+0.2mA组）、模型+1mA电流强度电针预处理4d组（I/R+1mA组）、模型+2mA电流强度电针预处理4d组（I/R+2mA组）、模型+4mA电流强度电针预处理4d组（I/R+4mA组）、模型+6mA电流强度电针预处理4d组（I/R+6mA组）、模型+8mA电流强度电针预处理4d组（I/R+8mA组）,每组各15只。各电针预处理组分别于MIRI手术前4天（d）干预,选择大鼠双侧“内关”穴（PC6）进行电针（2/100Hz）,20min/次,1次/d。I/R+SEA组每天进行与其他组相同方式、时间的异氟烷吸入麻醉但不电针。各组均于第5d结扎心脏冠状动脉左前降支（LAD）30min,再灌注4h,建立心肌缺血再灌注损伤模型,期间进行心电图（ECG）监测。每天监测大鼠体重变化,再灌注4h后,统计室性心律失常评分（VAS）情况,并对各组大鼠生存情况进行生存曲线分析;采用Evans blue-TTC双染法染色切片,计算心肌梗死面积比（Infarct size,IS%）、风险面积比（Risk size）;利用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌钙蛋白T（cTnT）的浓度。2、在探索了电针预处理抗MIRI的相对适宜电流强度基础上,进行实验二和实验三。实验二将140只SPF级成年雄性SD大鼠,随机分为5组,分别为:假手术组（S组）,除不结扎LAD,余与模型组操作相同;假手术+电针预处理组（S+EA组）,除不结扎LAD,余与模型+电针预处理组操作相同;模型组（I/R组）,同“方法1”中的造模方法;模型+非电针预处理组（I/R+SEA组）,在大鼠两侧PC6皮肤表面贴上与电针同样大小的自制的竹制签子20min/次/d,连续4d,第5天造模;模型+电针预处理组（I/R+EA组）,每天电针1次（2mA,2/100Hz,20min）,连续4d,第5天造模。每组各28只。实验三将196只SPF级成年雄性SD大鼠,随机分为7组,分别为:I/R组,同上;I/R+EA组,同上;空白对照组（B组）,未做干预处理;模型+阴性对照预处理组（I/R+C组）,腹腔注射与抑制剂组等量的助溶剂,1次/d,连续4d,并于第5天造模;模型+阴性对照+电针预处理组（I/R+C+EA组）,每天电针1次、腹腔注射与抑制剂组等量的助溶剂1次,连续4d,第5天造模;模型+mTORC1抑制剂（雷帕霉素,Rapamycin）预处理组（I/R+R组）,腹腔注射雷帕霉素,每天1次,3.0mg/kg,连续3d,并于最后1次注射24h后造模;模型+mTORC1抑制剂+电针预处理组（I/R+R+EA组）,每天电针1次,连续4d;电针第2天,同时开始给予腹腔注射雷帕霉素,每天1次,连续3d,于最后1次注射24h后造模。每组各28只。每天监测大鼠体重变化,并在实验结束后对各组大鼠生存情况进行生存曲线分析;采用ECG检测心脏ST段变化,并对缺血期的前20min和再灌注期的前20min及220-240min进行VAS统计;Evans blue-TTC双染色法观察心肌梗塞面积情况,计算IS%与Risk size;ELISA法测定血清心肌酶谱CK-MB、LDH、cTnT的水平;采用末端脱氧核苷酰转移酶介导的DUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡,评价心肌细胞存活情况,全面充分评价心脏功能情况。在充分明确EAP对MIRI保护效应的基础上,采用透射电镜观察自噬囊泡（即自噬小体）水平;免疫荧光染色法检测线粒体、溶酶体及两者结合情况,评价EAP抗MIRI效应与线粒体自噬的相关性。采用蛋白免疫印迹（WB）、免疫组化法（IHC）分别检测心肌组织线粒体中LC3-I（mito-LC3-I）与LC3-Ⅱ（mito-LC3-Ⅱ）、心肌中mTORC1、ATG13、ULK1、p-ULK1、FUNDC1、p-FUNDC1等物质的分布和表达水平;采用大鼠能量（ATP）ELISA试剂盒检测左心室心肌组织中线粒体的ATP产生情况,整体分析EAP通过mTORC1-ULK1-FUNDC1信号通路调控线粒体自噬从而减轻MIRI的可能潜在机制。结果一:不同电流强度EAP对MIRI的效应差异1、不同电流强度EAP对各组大鼠体重及MIRI术后生存曲线的影响各组大鼠体重变化表明,EAP电流强度为0.2mA、1mA与2mA时,EAP的大鼠体重呈正常增长趋势,而电流强度为4mA、6mA、8mA时大鼠体重随着EAP电流强度的增大,体重出现不增反减的趋势;对生存曲线的分析结果显示,与I/R组比,EAP各组的存活率均升高,但0.2mA、1mA与2mA时的大鼠术后存活率高于4mA、6mA与8mA组。2、不同电流强度EAP抗MIRI的效应研究大鼠VAS、心脏Evans blue-TTC双染色及血清心肌酶谱结果表明,与I/R组比,不同电流强度EAP均可有效降低MIRI。VAS结果显示,EAP（仅I/R+2mA组）可有效降低室性心律失常评分VAS（P<0.05）。Evans blue-TTC染色结果显示,与I/R组比,EAP（I/R+0.2mA 组、I/R+1mA 组、I/R+2mA 组、I/R+4mA 组、I/R+6mA 组、I/R+8mA 组）可明显降低 IS%、Risk size（P<0.05）,其中 I/R+2mA 组的 IS%、Risk size 值最小（P<0.05）;而与 I/R+2mA 组相比,I/R+4mA 组、I/R+6mA 组、I/R+8mA 组的 IS%增加（P<0.05）,其中 I/R+6mA 组、I/R+8mA 组 IS%显着增加（P<0.01）。与 I/R+2mA 组相比,I/R+SEA 组、I/R+0.2mA 组、I/R+1mA 组、I/R+6mA 组、I/R+8mA 组心肌 Risk size 均增加（P<0.05）。血清心肌酶谱结果表明,与I/R组比,不同电流强度EAP均可有效降低血清CK（P<0.05）、CK-MB（P<0.05）、LDH（P<0.05）、cTnT（P<0.05）的水平。其中 I/R+2mA 组的心肌酶谱水平均最低,效应最佳。结果二:EAP调控MIRI大鼠线粒体自噬的效应研究1、EAP对各组大鼠体重及MIRI术后生存曲线的影响各组大鼠体重及术后生存曲线的结果表明,与I/R组比,EAP可促进大鼠体重稳步增长,并有效提高大鼠MIRI术后存活率。2、对 VAS、IS%及 Risk size 的影响结果显示,与I/R组比,EAP可有效降低VAS（P<0.05）、降低IS%（P<0.05）及Risk size（P<0.05）。3、EAP减少MIRI诱导的心肌损伤标志物和细胞凋亡结果显示,与I/R组比,I/R+EA组可降低血清CK-MB（P<0.05）、LDH（P<0.05）、cTnT（P<0.05）的水平,减少心肌细胞凋亡（P<0.05）,从而减轻MIRI,对心脏起到保护作用。4、EAP减弱MIRI诱导的线粒体自噬与S组相比,I/R和I/R+SEA组的自噬囊泡明显增加（P<0.01）。与I/R组相比,EAP（I/R+EA组）显着减少了再灌注240min后心肌组织自噬囊泡的数量（P<0.05）,即EAP可抑制线粒体与溶酶体的结合。5、EAP 调节 mTORC1、ULK1 和 FUNDC1 的表达采用WB、IHC检测心肌组织中的mTORC1、ULK1、FUNDC1蛋白表达,结果初步显示,EAP可促进mTORC1蛋白的表达,抑制线粒体自噬相关蛋白ULK1、FUNDC1的表达水平。结果三:EAP调控MIRI大鼠线粒体自噬的mTORC1-ULK1-FUNDC1信号机制研究1、雷帕霉素阻断了 EAP的心脏保护作用各组大鼠体重及术后生存曲线的结果表明,在应用雷帕霉素抑制mTORC1蛋白后,消除了 EAP促进MIRI大鼠体重稳步增长,并有效提高大鼠MIRI术后存活率这一保护作用。在应用雷帕霉素抑制mTORC1蛋白后,消除了 EAP对MIRI的保护效应:与I/R组比,I/R+R+EA组的VAS升高（P<0.05）、IS%（P<0.05）及Risk size（P<0.05）也升高、血清CK-MB（P<0.05）、LDH（P<0.05）、cTnT（P<0.05）的水平均升高,心肌细胞凋亡率也增加（P<0.05）。2、雷帕霉素减弱EAP抑制的线粒体自噬结果显示,在应用雷帕霉素抑制mTORC1蛋白后,消除了 EAP对MIRI线粒体自噬的抑制效应:I/R+R+EA组的自噬囊泡水平（P<0.05）升高,线粒体与溶酶体的结合（P<0.05）增加,表明线粒体自噬的水平增加,从而使MIRI加重。3、EAP通过mTORC1-ULK1-FUNDC1途径抑制线粒体自噬WB、IHC检测mTORC1-ULK1-FUNDC1信号通路中的相关蛋白:心肌组织mTORC1、ATG13、p-ULK1、ULK1、p-FUNDC1、FUNDC1 及心肌线粒体中 mito-LC3Ⅰ、mito-LC3Ⅱ,结果显示,EAP可促进mTORC1蛋白的表达,抑制线粒体自噬相关蛋白ATG13、p-ULK1、ULK1、p-FUNDC1、FUNDC1、mito-LC3Ⅱ/Ⅰ 的表达水平（全部,P<0.05）,但在应用雷帕霉素抑制mTORC1蛋白后,EAP的这些调节作用则受到抑制（P<0.05）。对ATP（三磷酸腺苷）检测水平的结果显示,心肌缺血再灌注损伤后FUNDC1蛋白诱导的线粒体自噬会通过过度消除线粒体而增加心肌细胞凋亡（P<0.05）,线粒体数量的绝对不足而导致ATP产生障碍。但在PC6上进行EAP可逆转这种情况:EAP可促进线粒体内ATP的产生（P<0.05）,防治MIRI。而应用雷帕霉素后,EAP的这一促进作用则受到抑制。结论:1、不同电流强度EAP“内关”穴4天均可有效抗MIRI,其中2mA电流强度的EAP保护效应最好。2、EAP“内关”穴减轻MIRI大鼠的心肌保护效应可能与其促进心肌组织mTORC1蛋白的表达,同时下调ULK1、FUNDC1蛋白的表达,从而抑制线粒体自噬的发生有关。说明mTORC1在EAP抗MIRI中可能起关键性的作用。3、雷帕霉素抑制mTORC1后消除了 EAP“内关”穴对MIRI大鼠的心肌保护效应,说明EAP对MIRI的心肌保护效应可能是通过mTORC1-ULK1-FUNDC1这一信号通路调控线粒体自噬,进而增加线粒体来源的ATP,改善MIRI后的能量供应来实现的。
邢小卫[9]（2020）在《miR-26a-5p通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路对心肌缺血再灌注损伤的作用研究》文中指出研究背景心血管疾病是世界上无论是发展中国家还是发达国家中最常见的死亡原因之一,而这其中急性ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI）首当其冲成为最为凶险、致死致残率最高的一类。虽然我国心血管疾病的预防和救治工作有了很大的改善,但急性心肌梗死的发病率及死亡率仍然在不断上升。再灌注治疗是STEMI患者最有效的治疗措施,可以向缺血区域提供及时有效的能量,从而减少梗死范围、维持心脏收缩功能。但是越来越多的基础和临床研究表明,缺血心肌在恢复血液再次灌注后会导致额外的心肌损伤,如心肌顿抑、心律失常、无复流、心肌坏死等的发生,这种现象称之为心肌缺血/再灌注损伤（myocardialischemia/reperfusion injury,MIRI）,MIRI 已成为影响再灌注治疗效果和STEMI患者预后的主要因素。既往研究MIRI的机制包括氧自由基学说、钙超载学说、心肌能量代谢障碍学说、细胞凋亡学说等;治疗策略包括非药物干预的方法如缺血预适应、缺血后适应和远程缺血预适应,药物干预方法包括腺苷、心房钠肽、环孢素A、极化液、胰高血糖素样肽-1等。虽然许多细胞实验、动物实验证实上述治疗措施有效,但转化成临床试验的结局确是令人失望的。单一的心脏保护策略对改善缺血再灌注损伤效果不佳,联合多种保护策略或者协同多靶点治疗却很有希望治疗缺血再灌注损伤,因此我们非常有必要进一步深入研究MIRI的分子机制,为我们探索新的诊断、治疗靶点提供依据。越来越多的证据表明缺血再灌注损伤的一种重要病理生理机制是细胞凋亡,细胞调亡是一个需要能量的过程,虽然冉灌注过程给缺血心肌提供赖以生存的氧气和能量,但同时也为细胞凋亡提供了能量。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase家族）在凋亡的执行阶段起主要作用,凋亡是多种Caspase共同完成的,Caspase-3被认为是各种凋亡刺激因子促进凋亡过程中的终末剪切酶,有研究表明Caspsase-3在缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡过程中发挥重要作用。微小RNA（miRNA）是近年来发现的内源性非编码单链小分子RNA,通过结合靶mRNA的3’ UTR区从而降解靶mRNA或抑制其翻译,达到调控基因表达的目的。miRNA在各种细胞功能调控中具有重要作用,例如胚胎发育、细胞凋亡、细胞生长和分化以及肿瘤发生等。研究表明在心血管系统方面,miRNA与心肌梗死、心脏肥大、心肌重塑、心力衰竭和心律不齐等各种心脏病的发病机制有密切关系。miRNA具有细胞和组织特异性,有快速释放的动力学特点,在血清当中相对稳定存在,因此循环miRNA有望用于心血管疾病的早期诊断、危险分层、判断预后甚至治疗。目前miRNA研究颇多,一些研究表明miRNA在心肌细胞凋亡中发挥着重要的调控作用,但在心肌缺血再灌注损伤中的研究仍不成熟。miR-26a-5p作为新近发现的一种miRNA,在多种心血管疾病中存在差异表达。如有研究显示经过miR-26a-5p抑制剂转染的冠心病小鼠模型,分离出的内皮细胞生存力明显下降而凋亡率明显升高。另一项研究表明miR-26a-5p的过表达可以减轻冠状动脉微循环栓塞引起的无复流和心肌坏死。鉴于心肌缺血再灌注损伤与心肌细胞凋亡、冠脉微循环栓塞有着密切的关系,我们推测miR-26a-5p可能通过调节细胞凋亡参与心肌缺血再灌注损伤。目前,miR-26a-5p在心肌缺血再灌注损伤中的作用尚未见报道。我们通过心肌细胞缺氧/复氧模型、小鼠缺血再灌注模型分别在体外、体内模拟了心肌缺血再灌注损伤模型。然后,利用生物实验结合生物信息学方法来探索miR-26a-5p在心肌缺血再灌注损伤中的表达和调控作用,并进一步探讨miR-26a-5p影响缺血再灌注损伤可能的通路和机制,从而为更好的解释心肌缺血再灌注损伤的机制和提供可能的治疗策略奠定实验基础。第一章miR-26a-5p在缺氧/复氧心肌细胞中的表达及其调控作用目的关于心肌缺血再灌注损伤的分子机制仍未明确阐明,而关于miR-26a-5p在心肌缺血再灌注损伤当中的作用尚不清楚。第一章研究的目的是明确miR-26a-5p在细胞缺氧/复氧损伤中的表达水平,分析miR-26a-5p的过表达或抑制对缺血再灌注损伤程度的影响。方法1.生物信息学分析:从GEO数据库中搜索与心肌缺血再灌注相关的miRNAs的大数据,比较分析差异表达的miRNA。2.原代心肌细胞的分离和培养:取2日龄的C57BL/6乳鼠,消毒后开胸取心脏,分离出左心室后剪碎并胰酶消化,应用差速贴壁离心方法纯化心肌细胞,加入DMEM培养基,在37℃培养箱中培养。3.细胞转染:miR-26a-5p模拟物、miR-26a-5p抑制剂及相应对照物利用Lipofectamine█ RNAiMAX Reagent转染至原代心肌细胞中。4.建立心肌细胞缺氧/复氧模型:心肌细胞培养液置换为不含血清、不含糖的DMEM培养基,放置在37℃含5%C02、95%N2的低氧培养箱中缺氧培养4小时,之后置换上含糖、FBS的DMEM培养基并放置在37℃含95%空气和5%C02的培养箱中继续培养心肌细胞2小时,自此,缺氧/复氧（H/R）模型成功建立。5.细胞实验分组5.1实验一分组:1.对照组（Control group）;2.缺氧/复氧组（H/R group）。5.2 实验二分组:1.miRNA control+H/R 组;2.miR-26a-5p mimic+H/R组;3.inhibitor control+H/R 组;4.miR-26a-5p inhibitor+H/R 组。6.MTT法检测心肌细胞活力:各组心肌细胞培养孔中加入MTT、二甲基亚砜后测定心肌细胞存活率。7.流式细胞学技术测定细胞实验中心肌细胞凋亡率。8.实时萤光定量PCR检测各组心肌细胞中miR-26a-5p含量。9.Western Blot实验检测促凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达。结果1.GEO网站为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/,识别出心肌缺血再灌注相关的miRNAs生物芯片数据,与正常组织对比,做差异分析。发现miR-26a-5p在心肌缺血再灌注组织中表达下调,差异明显（P=0.0004）。2.流式细胞学技术来检测H/R心肌细胞的凋亡率是12.65%,对照组心肌细胞凋亡率为0.71%,差异明显。Western Blot技术检测结果显示H/R心肌细胞中凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达量明显高于对照组（P=0.0003）。3.qRT-PCR检测结果显示H/R心肌细胞中miR-26a-5p的含量明显低于对照组（P=0.0003）。4.转染miR-26a-5pmimic后心肌细胞中miR-26a-5p的水平明显升高;而转染 miR-26a-5pinhibitor 后心肌细胞中 miR-26a-5p 含量明显降低（P<0.0001）。MTT检测结果显示与对照组相比,过表达miR-26a-5p显着增加了心肌细胞在缺氧/复氧后的细胞活力;miR-26a-5p表达受抑制后显着降低心肌细胞在缺氧/复氧后的细胞活力（P<0.01）。5.流式细胞学技术检测结果显示:过表达miR-26a-5p组H/R心肌细胞凋亡率显着低于对照组,miR-26a-5p mimic组的细胞凋亡率为7.54%,mimic control组的细胞凋亡率为20.86%,差异明显;受抑制miR-26a-5p组H/R心肌细胞凋亡率显着高于对照组,miR-26a-5p inhibitor组的细胞凋亡率为35.89%,inhibitor control组的细胞凋亡率为23.25%,差异明显。Western Blot结果显示:过表达miR-26a-5p组H/R心肌细胞中cleaved caspase-3的含量显着低于对照组;受抑制miR-26a-5p组H/R心肌细胞中cleaved caspase-3的含量显着高于对照组（P<0.001）。结论及意义1.与正常对照组相比,miR-26a-5p在缺氧/复氧细胞中的表达明显下降;心肌细胞凋亡率明显升高。2.在缺氧/复氧心肌细胞模型中,miR-26a-5p的过表达可以通过降低心肌细胞凋亡率来减轻心肌缺血再灌注损伤;而miR-26a-5p低表达可以通过增加心肌细胞凋亡来加重心肌缺血再灌注损伤。3.我们的研究结果可能有助于发现心肌缺血再灌注损伤中发生、进展的新机制,有助于开发心肌缺血再灌注损伤新的早期诊断生物标志物或新的治疗手段。第二章miR-26a-5p调控PTEN/PI3K/AKT通路改善心肌缺血再灌注损伤目的miRNA是一类内源性非编码的单链小分子RNA,它通过结合靶基因mRNA的3’非翻译区,降解靶基因或抑制其翻译。miRNA具有功能多样性的特点,研究miRNA的靶基因功能较为复杂,近些年随着TargetScan、miRBase等大型miRNA分析数据库的发展,方便了科学家进行miRNA靶基因预测。我们在第一章的研究结果表明,miR-26a-5p在心肌缺血再灌注细胞中表达下调,且过表达miR-26a-5p可以减轻心肌缺血再灌注损伤,但具体机制尚不明确。本章目的是对miR-26a-5p的靶基因进行预测,研究miR-26a-5p调控心肌缺血再灌注损伤可能的通路机制并进一步验证。方法1.生物信息学分析:利用Targetscan数据库对miR-26a-5p的靶基因进行预测（http://www.targetscan.org/vert72）。2.利用双萤光素酶报告基因检测验证miR-26a-5p与PTEN的3’UTR是否存在互补结合关系。我们构建PTEN野生型和突变型的双萤光报告载体pMIR-REPORTTM-PTEN-WT和pMIR-REPORTTM-PTEN-Mut,分别与 miR-26a-5p 模拟物（miR-26a-5pmimcs）以及阴性对照共同转染心肌细胞,观察各组萤光素酶活性的变化,从而验证PTEN是否是miR-26a-5p的靶基因。3.细胞培养、转染miRNA以及模拟缺氧/复氧模型（H/R）:同第一章。4.细胞实验分组:4.1实验一分组:萤光素酶报告基因检测1.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-WT+miR-26a-5p mimics 组。2.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-WT+miRNA control 组。3.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-Mut+miR-26a-5p mimics 组。4.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-Mut+miRNA control 组4.2实验二分组:1.对照组（Control group）;2.缺氧/复氧组（H/R group）。4.3 实验三分组:1.miRNA control+H/R 组;2.miR-26a-5p mimic+H/R组;3.inhibitor control+H/R 组;4.miR-26a-5p inhibitor+H/R 组。5.qRT-PCR技术检测PTEN基因含量;Western Blot技术检测PTEN/PI3K/AKT蛋白表达量,方法类同第一章。结果1.Targetscan 预测 PTEN 是 miR-26a-5p 的靶基因。2.双萤光素酶报告实验显示与对照组相比,转染了野生型PTEN-3’UTR和miR-26a-5pmimics的萤光素酶活性显着降低（P=0.0003）;而共转染突变型PTEN-3’ UTR和miR-26a-5p mimics组与对照组相比萤光素酶活性无显着性差异（P>0.9999）。结果表明miR-26a-5p可直接与PTEN的3’ UTR作用。3.qRT-PCR检测H/R心肌细胞中PTEN基因含量,结果显示H/R组PTEN基因含量明显高于正常对照组（P=0.0038）。Western Blot检测H/R心肌细胞中PTEN蛋白表达含量,结果显示H/R组PTEN蛋白表达含量明显高于对照组（P=0.0001）。4.通过心肌细胞转染,分别构建过表达miR-26a-5p组、敲低miR-26a-5p组以及相应对照组,Western Blot检测显示过表达miR-26a-5p显着下调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显着提高了 PI3K和AKT的表达水平;相反的,敲低miR-26a-5p显着上调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显着降低了 PI3K和AKT的表达水平（P<0.001）。结论及意义1.在心肌缺血再灌注过程中,PTEN是miR-26a-5p的靶基因。2.过表达miR-26a-5p可以通过与PTEN的3’UTR结合而负性调控PTEN蛋白表达,PTEN受抑制后反向激活PI3K/AKT通路,达到抗心肌细胞凋亡目的,从而改善心肌缺血再灌注损伤。3.通过研究miR-26a-5p具体调控机制有助于我们更深入的理解缺血再灌注损伤的机制,有助于开发心肌缺血再灌注损伤新的药物或非药物治疗手段。第三章miR-26a-5p在缺血再灌注小鼠心肌组织中的表达及其调控机制目的在之前的研究中,我们通过体外实验建立心肌细胞缺氧/复氧（H/R）模型,发现H/R组心肌细胞凋亡率增高,miR-26a-5p在H/R组心肌细胞中表达下降,过表达miR-26a-5p减轻了心肌细胞缺血再灌注损伤。同时发现PTEN是miR-26a-5p的靶基因,miR-26a-5p通过PTEN/PI3K/AKT通路改善心肌缺血再灌注损伤。在这一章中,在小鼠体内心脏实验中,我们进一步验证miR-26a-5p对心肌缺血再灌注损伤是否会有相同的影响。方法1.缺血再灌注损伤小鼠模型的建立:C57BL/6小鼠麻醉后取仰卧位,气管插管后连接动物呼吸机,小鼠四肢通过电极连接到心电图仪。碘伏消毒胸前区后,第三和第四肋间行开胸手术。在左冠状动脉前降支距离左心耳下缘1-2mm处对冠状动脉左前降支进行结扎,发现明显的ST段抬高时表示结扎成功,阻断血流后30分钟,缝合线被释放,冠状动脉重新恢复血流,小鼠心肌缺血再灌注模型建立成功。在假手术组中,缝线只穿过小鼠的心脏,不进行结扎。2.小鼠心肌转染:构建腺相关病毒AAV9-miRNA载体,8周龄C57BL/6小鼠随机分组后,通过尾静脉注射AAV9-miRNA-26a-5p或AAV9-control构建转染模型。3.动物实验分组3.1实验一分组:1.假手术组（Shamgroup）;2.缺血再灌注损伤组（I/R group）。3.2 实验二分组:1.miRNA control+I/R 组;2.miR-26a-5pmimic+I/R组;3.inhibitor control+I/R 组;4.miR-26a-5p inhibitor+I/R 组。4.TTC-Evans blue双染法检测各组小鼠心肌梗死面积。5.流式细胞学技术测定动物实验中各组小鼠心肌细胞凋亡率。6.实时萤光定量PCR检测各组小鼠心肌组织中miR-26a-5p、PTEN含量。7.Western Blot 实验检测 cleaved caspase-3、PTEN、PI3K、AKT 的表达。结果1.Evans blue/TTC染色观察I/R组小鼠的心肌梗死面积大于对照组（P=0.0058）。流式细胞学技术显示I/R组小鼠心肌组织中心肌细胞凋亡率明显高于对照组,I/R组小鼠心肌细胞的凋亡率是40.24%,对照组心肌细胞凋亡率为8.83%,差异明显。Wesetern Blot检测显示I/R组小鼠心肌cleaved caspase-3蛋白含量明显高于对照组（P=0.0015）。2.qRT-PCR方法检测结果显示I/R组小鼠心肌细胞中miR-26a-5p的表达量显着低于正常对照组（P<0.0001）。3.qRT-PCR的方法检测各组转染小鼠心肌中miR-26a-5p的表达,结果显示转染miR-26a-5p mimic小鼠心肌中miR-26a-5p的水平明显升高;而转染miR-26a-5p inhibitor 小鼠心肌中 miR-26a-5p 含量明显降低（P<0.01）。Evans blue/TTC染色观察发现过表达miR-26a-5p显着减少了小鼠心肌I/R后梗死面积,受抑制miR-26a-5p组小鼠心肌I/R后梗死面积显着大于对照组（P<0.05）。4.qRT-PCR检测发现I/R组小鼠心肌PTEN基因含量明显高于正常对照组（P=0.0080）。Western Blot检测结果显示I/R组心肌组织中PTEN蛋白表达含量明显高于对照组（P<0.0001）。5.Western Blot检测显示在小鼠I/R损伤模型中,与对照组相比,过表达miR-26a-5p显着下调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显着提高了 PI3K和AKT的蛋白表达水平;相反的,抑制miR-26a-5p组显着上调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显着降低了 PI3K和AKT的蛋白表达水平,组间差异具有统计学意义（P<0.001）。结论及意义1.与正常对照相比,缺血再灌注小鼠模型中,心肌细胞凋亡和cleaved caspase-3表达量升高,缺血再灌注组织中miR-26a-5p的表达明显下降;miR-26a-5p的过表达减轻了心肌缺血再灌注损伤;而miR-26a-5p低表达可以增加心肌凋亡来加重心肌缺血再灌注损伤。2.体内实验进一步验证了缺血再灌注组织中PTEN基因及蛋白表达量明显升高,PTEN 是 miR-26a-5p 的靶基因;miR-26a-5p 可以通过 PTEN/PI3K/AKT 通路调控心肌缺血再灌注损伤。3.我们体内实验的研究结果进一步验证miR-26a-5p对心肌缺血再灌注损伤的调控作用和机制,为开发心肌缺血再灌注损伤新的早期诊断生物标志物或新的治疗手段提供实验基础。
李莉[10]（2020）在《LncRNA FTX调控miR-410-3p/Fmrl分子轴减弱缺氧复氧诱导的H9c2细胞损伤》文中指出背景和目的:缺血性心脏病是临床常见的一种疾病,通过手术等方式促使缺血心肌组织恢复血流供应,但心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）的发生可降低治疗效果,因而探究心肌细胞再灌损伤的分子机制对预防心肌缺血再灌注损伤具有重要作用。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）可通过充当miRNA的海绵分子而调控靶基因表达从而参与心血管疾病发生及发展过程。长链非编码RNAFTX（Long non-coding RNAFTX,LncRNAFTX,FTX）在心肌细胞损伤中呈低表达并可能参与心肌缺血再灌注损伤过程,但关于其作用机制尚未完全阐明。通过生物信息学分析显示微小RNA-410-3p（microRNA-410-3p,miR-410-3p）可能是 FTX 的靶基因,miR-410-3p在心肌细胞损伤中呈高表达并可能发挥重要调控作用。通过生物信息学分析显示脆性X精神发育迟缓基因1（fragile X mental retardation 1 gene,Fmr1）可能是miR-410-3p的靶基因,Fmr1在脂多糖诱导的心肌细胞损伤中呈低表达,并可能对心肌细胞损伤具有保护作用。但FTX是否可通过调控miR-410-3p/Fmr1分子轴从而对心肌细胞损伤发挥作用尚未阐明。本研究包括以下三部分:第一部分:LncRNA FTX 对缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）诱导的 H9c2 细胞活力、凋亡、氧化应激及炎症的影响;第二部分:LncRNA FTX靶向调控miR-410-3p调控H/R诱导H9c2细胞损伤的机制;第三部分:miR-410-3p靶向调控Fmr1调控H/R诱导H9c2细胞损伤的研究。方法:选取20例心肌缺血再灌注损伤患者为I/R组,20例健康志愿者为Normal组。大鼠心肌细胞H9C2正常培养为Normoxia组,进行缺氧/复氧处理为H/R组。H9C2细胞培养转染pcDNA、pcDNA-FTX、si-NC、si-FTX后进行缺氧/复氧处理,分为 H/R+pcDNA 组、H/R+FTX 组、H/R+si-NC 组、H/R+si-FTX 组。H9C2细胞转染 pcDNA-FTX 与 miR-NC、pcDNA-FTX 与 miR-410-3p mimics 后,进行缺氧/复氧处理,分为 H/R+FTX+miR-NC 组、H/R+FTX+miR-410-3p 组。H9C2细胞转染 miR-NC、miR-410-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-410-3p 后,进行缺氧/复氧处理,分为 H/R+miR-NC 组、H/R+miR-410-3p 组、H/R+anti-miR-NC组、H/R+anti-miR-410-3p 组。H9C2 细胞培养转染 anti-miR-410-3p 与 si-NC、anti-miR-410-3p 与 si-Fmr1、si-FTX 与 anti-miR-NC、si-FTX 与 anti-miR-410-3p后进行缺氧/复氧处理,分为 H/R+anti-miR-410-3p+si-NC 组、H/R+anti-miR-410-3p+si-Fmr1 组、H/R+si-FTX+anti-miR-NC 组、H/R+si-FTX+anti-miR-410-3p组。双荧光素酶报告实验验证FTX与miR-410-3p的靶向结合关系,miR-410-3p与Fmr1的靶向结合关系。根据试剂盒说明书检测LDH、MDA、SOD、GSH-PX。CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率。Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭。qRT-PCR检测FTX、miR-410-3p、Fmr1 mRNA 的表达量。Western blot 检测 Bcl-2、Bax、cleaved-casp-3蛋白表达量。ELISA检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。结果:与Normal组比较,I/R组血清中FTX的表达量显着降低（P<0.05）;H/R处理后心肌细胞中FTX的表达量显着降低（P<0.05）,miR-410-3p的表达水平显着升高（P<0.05）,Fmr1 mRNA及蛋白表达量显着降低（P<0.05）。H/R处理后心肌细胞活力显着降低（P<0.05）,心肌细胞凋亡率显着升高（P<0.05）,迁移细胞数与侵袭细胞数显着减少（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达量显着降低（P<0.05）,Bax、cleaved-casp-3蛋白表达量显着升高（P<0.05）,LDH活性显着升高（P<0.05）,MDA含量显着升高（P<0.05）,SOD、GSH-PX活性显着降低（P<0.05）,IL-1β、IL-6、TNF-α的水平显着升高（P<0.05）;FTX过表达后心肌细胞活力显着升高（P<0.05）,心肌细胞凋亡率显着降低（P<0.05）,迁移细胞数与侵袭细胞数显着增多（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达量显着升高（P<0.05）,Bax、cleaved-casp-3蛋白表达量显着降低（P<0.05）,LDH活性显着降低（P<0.05）,MDA 含量显着降低（P<0.05）,SOD、GSH-PX 活性显着升高（P<0.05）,IL-1β、IL-6、TNF-α的水平降低（P<0.05）。双荧光素酶报告实验证实FTX可靶向结合miR-410-3p,并可负向调控miR-410-3p的表达及活性。FTX与miR-410-3p 呈负相关（r=-0.638,p=0.0025）。miR-410-3pmimics 与 FTX 过表达共转染后,细胞活力显着降低（P<0.05）,细胞凋亡率显着升高（P<0.05）,迁移细胞数与侵袭细胞数显着减少（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达量显着降低（P<0.05）,Bax、cleaved-casp-3蛋白表达量显着升高（P<0.05）,LDH活性显着升高（P<0.05）,MDA含量显着升高（P<0.05）,SOD、GSH-PX活性显着降低（P<0.05）,IL-1β、IL-6、TNF-α的水平显着升高（P<0.05）。双荧光素酶报告实验证实miR-410-3p可靶向结合Fmr1,并可负向调控Fmr1的表达及活性。Fmr1与 miR-410-3p 呈负相关（r=-0.6753,p=0.0011）。抑制 miR-410-3p 表达后,细胞活力显着升高（P<0.05）,细胞凋亡率显着降低（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达量显着升高（P<0.05）,Bax、cleaved-casp-3蛋白表达量显着降低（P<0.05）,迁移细胞数与侵袭细胞数显着增多（P<0.05）,LDH活性显着降低（P<0.05）,MDA 含量显着降低（P<0.05）,SOD、GSH-PX 活性显着升高（P<0.05）,IL-1β、IL-6、TNF-α 水平显着降低（P<0.05）.anti-miR-410-3p 与 si-Fmr1 共转染后可明显减弱抑制miR-410-3p表达对心肌细胞活力、凋亡、迁移、氧化应激及炎症反应的作用（P<0.05）。结论:1.LncRNAFTX过表达可减轻缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤。2.LncRNA FTX可通过抑制miR-410-3p表达而减轻缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤。3.LncRNA FTX通过调控miR-410-3p/Fmr1分子轴而减弱缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤。
二、细胞凋亡与心肌缺血/再灌注损伤的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞凋亡与心肌缺血/再灌注损伤的关系（论文提纲范文）
（1）龙牙楤木总皂苷抗MIRI机制研究及中成药防治MIRI的系统评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 上篇 文献综述 |
| 综述一 心肌缺血再灌注损伤与内质网应激 |
| (一) 内质网应激的主要路径 |
| (二) 内质网应激在心肌缺血再灌注损伤中的作用机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 线粒体功能障碍与心肌缺血再灌注损伤的研究进展 |
| (一) 线粒体形态动力学异常 |
| (二) 线粒体能量代谢障碍 |
| (三) 活性氧产生过量 |
| (四) 钙稳态异常 |
| (五) 线粒体膜通透性改变 |
| 参考文献 |
| 综述三 心肌缺血再灌注损伤的中西医结合研究进展 |
| 1.中药复方汤剂 |
| 2.中成药 |
| 3.中药单体及有效成分 |
| 4.结语与展望 |
| 参考文献 |
| 下篇 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 龙牙楤木总皂苷对心肌缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 1 实验器材和材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 实验二 基于线粒体功能障碍探讨龙牙楤木总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 1 主要仪器和材料 |
| 2 实验方法 |
| 3.结果 |
| 4 小结 |
| 实验三 基于内质网应激探讨龙牙楤木总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 1 主要实验材料和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 1 研究的临床意义 |
| 2 龙牙楤木总皂苷抗MIRI的研究基础 |
| 3 大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的选择 |
| 4 研究结果分析 |
| 参考文献 |
| 临床研究 中成药治疗心肌缺血再灌注损伤的系统评价 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）LncRNA SNHG8对缺氧-复氧H9C2细胞损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第1章 LncRNA SNHG8 调控缺氧-复氧心肌损伤的保护作用 |
| 1.研究背景 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和设备材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 低氧-缺血-再复氧条件的建立 |
| 2.2.3 细胞转染 |
| 2.2.4 细胞活性检测 |
| 2.2.5 Ed U试剂盒检测心肌细胞增殖情况 |
| 2.2.6 细胞蛋白的提取 |
| 2.2.7 细胞蛋白浓度的检测以及定量 |
| 2.2.8 Western Blot免疫印迹法检测相关蛋白的表达 |
| 2.2.9 细胞RNA的提取 |
| 2.2.10 RT-PCR检测 |
| 2.2.11 Real-time quantitative PCR反应检测m RNA的表达 |
| 2.2.12 双荧光报告基因检测 |
| 2.2.13 乳酸脱氢酶释放(LDH)分析 |
| 2.2.14 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.2.15 生物信息学分析 |
| 2.2.16 统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 LncRNA的筛选 |
| 3.2 Lnc SNHG8 siRNA作用可以增强缺氧-缺血-复氧诱导的心肌细胞活性 |
| 3.3 LncSNHG8si RNA作用可以减少缺氧-缺血-复氧诱导的心肌细胞损伤和凋亡 |
| 3.4 SNHG8 可以调控miR-335 的表达 |
| 3.5 下调miR-335 的表达可以抑制缺氧-缺血-复氧诱导的细胞活力的变化 |
| 3.6 Lnc SNHG8SNHG8 通过调节miR-335 在缺氧-缺血-复氧诱导心肌损伤中发挥作用 |
| 3.7 Mi R-335 可以负调控心肌细胞RASA1 的表达 |
| 3.8 LncSNHG8 可通过调控miR-335和RASA1 对缺氧-缺血-复氧心肌损伤产生保护作用 |
| 4.讨论 |
| 第2章 鉴定和验证AURKB通过WNT信号通路调控VSMC表型转变 |
| 1.研究背景 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和设备材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 数据来源 |
| 2.2.2 差异基因分析 |
| 2.2.3 GO功能富集分析 |
| 2.2.4 蛋白网络互作分析(protein–protein interaction (PPI) networks) |
| 2.2.5 Logistic回归模型构建 |
| 2.2.6 细胞培养 |
| 2.2.7 细胞转染 |
| 2.2.8 细胞蛋白的提取 |
| 2.2.9 Western Blot免疫印迹法检测相关蛋白的表达 |
| 2.2.10 细胞侵袭实验分析 |
| 2.2.11 细胞划痕实验分析 |
| 2.2.12 流式实验分析细胞凋亡和周期 |
| 2.2.13 统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 生物信息学分析算法和总结 |
| 3.2 差异基因分析结果 |
| 3.3 PPI网络构建结果分析和Logistic回归模型构建及预测分析 |
| 3.4 AURKB基因过表达后对VSMC细胞迁移、划痕自愈和细胞周期的影响 |
| 3.5 AURKB基因过表达后对VSMC细胞中Wnt/β-Catenin通路蛋白的影响 |
| 3.6 验证AURKB基因确实是通过Wnt/β-Catenin通路对细胞功能的影响. |
| 4.讨论 |
| 结论与展望 |
| 1.结论 |
| 2.进一步工作的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 论文综述 非编码 RNA-miRNA-mRNA 在心肌缺血再灌注损伤长轴上的深入研究:机理和治疗 |
| References |
（3）金归配伍对MIRI模型大鼠心肌细胞的保护作用及自噬水平的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 一、祖国医学对于心肌缺血/再灌注损伤的认识与防治 |
| (一)学术源流 |
| (二)病因病机 |
| (三)辨证论治 |
| 二、现代医学对于心肌缺血/再灌注损伤的研究进展 |
| (一)心肌缺血再灌注损伤的现代认识 |
| (二)心肌缺血再灌注损伤的发病机制 |
| (三)心肌缺血再灌注损伤的治疗现状 |
| 三、自噬与心肌缺血再灌注损伤的关系 |
| (一)自噬的研究进展 |
| (二)自噬在心肌缺血再灌注损伤中发挥的作用 |
| (三)中医药通过调控自噬干预心肌缺血再灌注损伤的研究进展 |
| 实验研究 |
| 一、实验材料 |
| (一)实验动物 |
| (二)实验药品 |
| (三)实验试剂 |
| (四)实验仪器 |
| (五)药物制备 |
| 二、实验方法 |
| (一)分组及给药 |
| (二)造模方法 |
| (三)造模成功标准 |
| (四)模型排除标准 |
| 三、检测指标 |
| (一)金归配伍对MIRI大鼠心电图的影响 |
| (二)金归配伍对MIRI大鼠心肌梗死面积的影响 |
| (三)金归配伍对MIRI大鼠血清中CK-MB、T-AOC水平的影响 |
| (四)金归配伍对MIRI大鼠超微结构与自噬水平的影响 |
| (五)金归配伍对MIRI大鼠自噬相关蛋白及pmTOR的影响 |
| 四、统计学处理 |
| 五、技术路线 |
| 实验结果 |
| 一、各组大鼠心电图的变化 |
| 二、各组大鼠心肌梗死面积的变化 |
| 三、各组大鼠血清中CK-MB、T-AOC水平的变化 |
| 四、各组大鼠超微结构与自噬水平的变化 |
| 五、各组大鼠自噬相关蛋白及pmTOR的变化 |
| 讨论 |
| 一、本实验的研究意义 |
| 二、动物心肌缺血/再灌注损伤模型的建立 |
| 三、金归配伍的组方依据及研究进展 |
| (一)方药组成与方剂功效 |
| (二)现代药物研究进展 |
| 四、关于实验结果的探讨 |
| (一)金归配伍对MIRI大鼠心电图的影响 |
| (二)金归配伍对MIRI大鼠心肌梗死面积的影响 |
| (三)金归配伍对MIRI大鼠血清中CK-MB、T-AOC水平的影响 |
| (四)金归配伍对MIRI大鼠超微结构与自噬水平的影响 |
| (五)金归配伍对MIRI大鼠自噬相关蛋白及pmTOR的影响 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表论文 |
| 个人简介 |
（4）电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌损伤标志物、凋亡指数和形态学的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞焦亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞自噬的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验五 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠FXR/SHP通路的调控作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录一 文献综述 心肌缺血再灌注损伤相关信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 附图二 |
| 附录三 读博期间发表论文、科研情况 |
| 致谢 |
（5）羟基红花黄色素A调控AMPK/NLRP3通路抗心肌缺血再灌注损伤分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 实验流程图 |
| 第一章 五种红花黄酮对缺血/再灌注诱导心肌细胞损伤保护作用 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 H9c2心肌细胞的复苏及培养 |
| 2.2 H9c2心肌细胞缺氧/复氧处理 |
| 2.3 实验分组 |
| 2.3.1 五种红花黄酮对正常心肌细胞的影响 |
| 2.3.2 五种红花黄酮对H/R诱导H9c2心肌细胞损伤保护作用 |
| 2.4 MTT法检测心肌细胞存活率 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 五种红花黄酮对正常H9c2心肌细胞的影响 |
| 3.2 五种红花黄酮对H/R诱导H9c2心肌细胞损伤保护作用 |
| 3.2.1 HSYA对H/R诱导H9c2心肌细胞损伤保护作用 |
| 3.2.2 AHSYB对H/R诱导H9c2心肌细胞损伤保护作用 |
| 3.2.3 圣草酚对H/R诱导H9c2心肌细胞损伤保护作用 |
| 3.2.4 芹菜素对H/R诱导H9c2心肌细胞损伤保护作用 |
| 3.2.5 山奈酚对H/R诱导H9c2心肌细胞损伤保护作用 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 HSYA激活自噬抑制NLRP3炎症小体活化对大鼠MIRI的保护作用及分子机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 大鼠心肌缺血再灌注实验模型 |
| 2.2 药物配制与给药 |
| 2.3 心肌梗死面积检测 |
| 2.4 心肌酶检测 |
| 2.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子 |
| 2.6 组织病理学检测及免疫组化分析 |
| 2.7 心肌细胞凋亡测定 |
| 2.8 蛋白质印迹分析 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 HSYA对大鼠MIRI保护作用 |
| 3.1.1 HSYA对大鼠MIRI心肌梗死面积的影响 |
| 3.1.2 HSYA对MIRI大鼠心肌酶的影响 |
| 3.1.3 HSYA对MIRI大鼠心肌形态学影响 |
| 3.2 HSYA对I/R诱导大鼠心肌细胞凋亡保护作用 |
| 3.2.1 TUNEL法评价HSYA对I/R诱导大鼠心肌细胞凋亡保护作用 |
| 3.2.2 HSYA对I/R大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白的影响 |
| 3.3 HSYA对I/R大鼠心肌炎症因子表达的影响 |
| 3.4 HSYA对I/R大鼠心肌NLRP3炎症小体表达的影响 |
| 3.5 HSYA激活I/R大鼠心肌自噬作用 |
| 3.6 HSYA调控I/R大鼠心肌AMPK/mTOR信号通路作用 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 HSYA通过AMPK/ NLRP3信号通路对H/R诱导心肌细胞损伤保护作用及机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 H9c2心肌细胞的复苏及培养 |
| 2.2 H9c2心肌细胞H/R处理 |
| 2.3 自噬双标慢病毒(RFP-GFP-LC3) H9c2细胞稳定细胞系构建 |
| 2.4 实验分组 |
| 2.5 MTT法检测H9c2心肌细胞存活率 |
| 2.6 细胞上清液中LDH活性的测定 |
| 2.7 线粒体膜电位(ΔΨm)测定 |
| 2.8 流式细胞术检测细胞凋亡率 |
| 2.9 caspase-1活性分析 |
| 2.10 caspase-3活性分析 |
| 2.11 蛋白质印迹分析 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 HSYA对H/R损伤H9c2心肌细胞存活率的影响 |
| 3.2 HSYA对H/R诱导损伤H9c2心肌细胞LDH漏出的影响 |
| 3.3 HSYA抑制H/R诱导的H9c2细胞凋亡 |
| 3.4 HSYA抑制H/R诱导H9c2细胞NLRP3炎症小体激活 |
| 3.5 HSYA提高AMPK磷酸化水平抑制H/R诱导的NLRP3炎症小体激活 |
| 3.6 HSYA提高AMPK磷酸化水平诱导自噬作用 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 总结 |
| 第五章 创新点 |
| 文献综述：心肌缺血再灌注损伤发生机制及红花保护作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮功能影响与机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 心肌缺血再灌注损伤模型建立与益气搜风中药对模型大鼠内皮功能影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮炎症因子的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮细胞凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 现代医学对心肌缺血再灌注损伤认识与研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医学对心肌缺血再灌注损伤的认识与研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（7）环状RNA Foxo3在心脏移植心肌缺血再灌注损伤中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 综述 非编码RNA在心肌缺血再灌注中的研究进展 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 缺血再灌注损伤心房肌细胞模型诱导 |
| 概述 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 损伤及凋亡标志物检测 |
| 2.2.2 HL-1 细胞及原代心肌细胞培养 |
| 2.2.3 HL-1 细胞及原代心肌细胞缺氧/复氧模型诱导 |
| 2.2.4 细胞RNA提取 |
| 2.2.5 逆转录 |
| 2.2.6 实时定量PCR |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 HL-1 细胞缺氧/复氧损伤模型诱导 |
| 2.3.2 原代心肌细胞缺血再灌注损伤模型诱导 |
| 2.3.3 circFoxo3 在缺氧再灌注以及氧化应激损伤模型中表达量 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 circFoxo3 在心房肌细胞缺血再灌注损伤过程中的分子机制 |
| 概述 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞干扰 |
| 3.2.2 RNA提取,逆转录及实时定量PCR |
| 3.2.3 蛋白电泳 |
| 3.2.4 Annexin V/碘化丙啶(PI)染色 |
| 3.2.5 线粒体膜电位测定 |
| 3.2.6 用Incu Cyte系统实时定量分析细胞死亡 |
| 3.2.7 生物素化探针制备 |
| 3.2.8 RNA免疫共沉淀 |
| 3.2.9 免疫共沉淀 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 缺氧/复氧促进心肌细胞凋亡 |
| 3.3.2 敲低circFoxo3 可减少缺氧/复氧过程中circFoxo3 的表达 |
| 3.3.3 敲低circFoxo3 对靶基因Foxo3 的影响 |
| 3.3.4 敲低circFoxo3 可减少缺氧/复氧导致的细胞凋亡 |
| 3.3.5 敲低circFoxo3 可减少缺氧/复氧导致的细胞死亡 |
| 3.3.6 敲低circFoxo3 可减少缺氧/复氧导致的线粒体损伤 |
| 3.3.7 敲低circFoxo3 可减少细胞损伤标志物的表达 |
| 3.3.8 circFoxo3 影响miR-433和miR-136 表达 |
| 3.3.9 circFoxo3 不与miR-433和miR-136 直接作用 |
| 3.3.10 p-Foxo3 与缺氧/复氧诱导的关系 |
| 3.3.11 p-Foxo3与circFoxo3 的关系 |
| 3.3.12 circFoxo3 抑制Foxo3 蛋白的磷酸化 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 circFoxo3 在小鼠心脏移植缺血再灌注损伤过程中的作用机制 |
| 概述 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 动物资料 |
| 4.2.2 异体心脏获取 |
| 4.2.3 异体心脏保存 |
| 4.2.4 小鼠同种异体心脏移植 |
| 4.2.5 受体小鼠心脏功能评价 |
| 4.2.6 组织HE染色 |
| 4.2.7 纤维化染色 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 心脏移植术后心脏损伤情况 |
| 4.3.2 circFoxo3 在心脏移植术后缺血再灌注损伤的移植物中过度表达 |
| 4.3.3 circFoxo3 低表达改善心脏移植功能 |
| 4.3.4 circFoxo3 低表达减少心脏移植后心肌坏死 |
| 4.3.5 低表达circFoxo3 降低心脏移植后心肌纤维化 |
| 4.3.6 低表达circFoxo3 降低心脏移植后心肌凋亡 |
| 4.3.7 低表达 circFoxo3 降低心脏移植后Caspase-3 表达 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 结论 |
| 创新点与不足之处 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）基于mTORC1-ULK1-FUNDC1通路的电针预处理减轻MIRI的线粒体自噬机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1.中医学对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的认识 |
| 1.1 MIRI的中医学病名与病因病机 |
| 1.2 针灸“治未病”理论与“心痛” |
| 1.3 MIRI的中医证治概要 |
| 2.现代医学对MIRI的认识 |
| 2.1 流行病学 |
| 2.2 MIRI概述 |
| 2.3 MIRI的发病因素 |
| 2.4 MIRI的发生机制 |
| 3.MIRI的临床表现和治疗概况 |
| 3.1 MIRI的临床表现 |
| 3.2 西医治疗概况 |
| 3.3 中药治疗概况 |
| 4.针灸“治未病”与MIRI防治的研究现状 |
| 4.1 针灸预处理抗MIRI的用穴与电针刺激参数 |
| 4.2 针灸预处理调控MIRI自噬的研究现状 |
| 5.线粒体自噬在MIRI中的作用 |
| 5.1 线粒体自噬的概述 |
| 5.2 线粒体自噬在MIRI中的研究现状 |
| 5.3 mTORC1-ULK1-FUNDC1信号通路与线粒体自噬 |
| 6.EAP调控mTORC1、ULK1蛋白的研究现状 |
| 第二部分 实验研究 |
| 技术路线图 |
| 实验一 不同电流强度EAP对MIRI的效应差异研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器与耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验动物分组与干预 |
| 2.2 电针预处理操作方法 |
| 2.3 MIRI模型制作与评价 |
| 2.4 室性心律失常评分(VAS) |
| 2.5 心脏Evans blue-TTC染色及心肌IS%、Risk size的计算 |
| 2.6 血清心肌酶谱指标检测 |
| 2.7 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 不同电流强度EAP对各组大鼠体重及MIRI大鼠术后生存曲线的影响 |
| 3.2 不同电流强度EAP对各组大鼠心律失常、心梗面积比与风险面积比及血清酶谱的影响 |
| 实验二 EAP对MIRI大鼠线粒体自噬的调控效应研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器与耗材 |
| 2、实验方法 |
| 2.1 实验动物分组与干预 |
| 2.2 电针预处理方法 |
| 2.3 MIRI模型制作与评价 |
| 2.4 室性心律失常评分(VAS) |
| 2.5 心脏Evans blue-TTC染色及心肌IS%、Rize size的计算 |
| 2.6 血清心肌酶谱指标检测 |
| 2.7 TUNEL染色 |
| 2.8 自噬小体的检测 |
| 2.9 免疫荧光染色(IF) |
| 2.10 石蜡切片免疫组化染色(IHC) |
| 2.11 mTORC1、ULK1、FUNDC1蛋白检测 |
| 2.12 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 EAP对各组大鼠体重及MIRI术后生存曲线的影响 |
| 3.2 EAP对各组大鼠ECG、VAS、IS%及Risk size的影响 |
| 3.3 EAP可减少MIRI诱导的心肌损伤标志物和细胞凋亡 |
| 3.4 EAP减弱了MIRI诱导的线粒体自噬 |
| 3.5 EAP调节mTORC1,ULK1和FUNDC1的表达 |
| 实验三 EAP减轻MIRI大鼠线粒体自噬的mTORC1-ULK1-FUNDC1信号机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器与耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验动物分组与干预 |
| 2.2 电针预处理操作方法 |
| 2.3 MIRI模型制作与评价 |
| 2.4 雷帕霉素的配制 |
| 2.5 室性心律失常评分(VAS) |
| 2.6 心脏Evans blue-TTC染色及心肌IS%、Rize size的计算 |
| 2.7 血清心肌酶谱指标检测 |
| 2.8 TUNEL染色 |
| 2.9 自噬小体的检测 |
| 2.10 免疫荧光染色(IF) |
| 2.11 石蜡切片免疫组化染色(IHC) |
| 2.12 心肌组织线粒体的分离提取 |
| 2.13 mTORC1-ULK1-FUNDC1通路蛋白检测 |
| 2.14 ATP水平的检测 |
| 2.15 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 雷帕霉素阻断了EAP的心脏保护作用 |
| 3.2 雷帕霉素减弱EAP抑制的线粒体自噬 |
| 3.3 EAP通过mTORC1-ULK1-FUNDC1途径抑制线粒体自噬 |
| 第三部分 讨论 |
| 1.MIRI实验模型的制作与评价 |
| 2.电针预处理PC6的选择依据 |
| 2.1 PC6的现代研究 |
| 2.2 PC6穴名解析 |
| 2.3 PC6的特异性 |
| 2.4 心脏与心包经的联系 |
| 2.5 电针预处理的选择依据 |
| 3.电针预处理刺激强度的选择 |
| 4.MIRI防治与针灸预处理 |
| 5.mTORC1与MIRI线粒体自噬及电针预处理的干预作用 |
| 6.电针预处理减轻MIRI的mTORC1-ULK1-FUNDC1信号机制 |
| 第四部分 结论 |
| 论文创新点 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一: 英文缩略词一览表 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）miR-26a-5p通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路对心肌缺血再灌注损伤的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一章 miR-26a-5p在缺氧/复氧心肌细胞中的表达及其调控作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第二章 miR-26a-5p调控PTEN/PI3K/AKT通路改善心肌缺血再灌注损伤 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第三章 miR-26a-5p在缺血再灌注小鼠心肌组织中的表达及其调控机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 创新性与局限性 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 英文全文 |
（10）LncRNA FTX调控miR-410-3p/Fmrl分子轴减弱缺氧复氧诱导的H9c2细胞损伤（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 LNCRNA FTX对缺氧复氧诱导的H9C2细胞活力、凋亡、氧化应激及炎症的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 LNCRNA FTX靶向调控MIR-410-3P调控缺氧复氧诱导H9C2细胞损伤的机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 MIR-410-3P靶向调控FMR 1调控缺氧复氧诱导H9C2细胞损伤的研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 LNCRNA在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
四、细胞凋亡与心肌缺血/再灌注损伤的关系（论文参考文献）
- [1]龙牙楤木总皂苷抗MIRI机制研究及中成药防治MIRI的系统评价[D]. 宋欣丽. 北京中医药大学, 2021(02)
- [2]LncRNA SNHG8对缺氧-复氧H9C2细胞损伤的保护作用[D]. 刘燕锋. 南昌大学, 2021(01)
- [3]金归配伍对MIRI模型大鼠心肌细胞的保护作用及自噬水平的研究[D]. 潘明月. 黑龙江中医药大学, 2021(01)
- [4]电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用[D]. 李晨. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [5]羟基红花黄色素A调控AMPK/NLRP3通路抗心肌缺血再灌注损伤分子机制研究[D]. 叶景学. 北京协和医学院, 2021(02)
- [6]益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮功能影响与机制的研究[D]. 张雯雯. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [7]环状RNA Foxo3在心脏移植心肌缺血再灌注损伤中的作用机制研究[D]. 苏亚乐. 吉林大学, 2021
- [8]基于mTORC1-ULK1-FUNDC1通路的电针预处理减轻MIRI的线粒体自噬机制研究[D]. 肖燕. 南京中医药大学, 2020(01)
- [9]miR-26a-5p通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路对心肌缺血再灌注损伤的作用研究[D]. 邢小卫. 山东大学, 2020(08)
- [10]LncRNA FTX调控miR-410-3p/Fmrl分子轴减弱缺氧复氧诱导的H9c2细胞损伤[D]. 李莉. 郑州大学, 2020(02)