一、工程菌固定化细胞生产L-蛋氨酸完成中试（论文文献综述）
李益民[1]（2020）在《重组微生物全细胞催化高效合成丙谷二肽》文中指出丙谷二肽（L-Alanyl-L-glutamine,Ala-Gln）具有溶解度高、热稳定性好及分解速率快等优势,已经成为一种替代谷氨酰胺（L-Glutamine,Gln）的新型营养补充剂,被广泛应用于食品、保健品和医药等领域。α-氨基酸酯酰基转移酶（α-amino acid ester acyl transferase,Aet）能以丙氨酸甲酯盐酸盐（L-alanine methyl ester hydrochloride,AlaOMe）和Gln为底物直接合成Ala-Gln,基于表达Aet的微生物合成法因其原料廉价易得、反应步骤少、反应条件温和、环境污染小且副产物少,可以作为工业化生产Ala-Gln的新方法。然而,Aet催化合成Ala-Gln过程存在反应时间长和底物转化率低等问题,限制了其在Ala-Gln工业化生产中的应用。本论文的研究工作构建了异源表达Sphingobacterium siyangensis来源Aet（SsAet）的重组大肠杆菌和重组酿酒酵母,通过菌体的重复利用及絮凝自固定化技术,解决了上述问题,为实现Ala-Gln安全、绿色且高效生产奠定了基础。取得的主要研究结果如下:首先,构建异源表达SsAet的重组大肠杆菌高效合成Ala-Gln。以最常用的表达型宿主 BL21（DE3）,构建了重组大肠杆菌 BL21（DE3）-pET29a-SsAET（BPA）,发现 BPA表达了大量的包涵体,影响了其催化活性。通过更换有助于蛋白二硫键形成的宿主,提高蛋白的溶解性,其中Origami 2（DE3）-pET29a-SsAET（OPA）的SsAet可溶表达量最高,且催化活性是BPA的1.4倍。进一步优化了 OPA的诱导条件和全细胞催化合成Ala-Gln的反应条件,确定了最佳的诱导条件:温度16℃、诱导OD620=0.25、诱导时间12h及IPTG浓度0.6 mmol/L;最佳的反应条件:温度25℃、pH值8.5、反应溶液硼酸盐缓冲液及底物摩尔配比AlaOMe/Gln=1/2。在最优条件下,以OPA作为合成Ala-Gln的全细胞催化剂,反应过程最短可在5 min内完成,获得最高的底物转化率为94%,而比生产强度可高达1.78 g/L·min-1·OD620-1,是目前国内外文献中报道的最高水平。除此之外,OPA具有良好的重复利用性,经五个循环批次反应仍能维持80%以上的催化活性,实现了循环高效合成Ala-Gln。但是,在相同的细胞浓度和反应时间内,OPA全细胞的催化效率比裂解液降低了 21%,发现了物质扩散阻力的存在。其次,构建表面展示SsAet的重组酿酒酵母。为了克服物质扩散阻力和大肠杆菌表达系统潜在的生物安全问题,以生物安全性的酿酒酵母作为表达宿主,将SsAet以N端和C端锚定两种方式展示在酵母细胞表面,通过免疫荧光实验,证明了 SsAet已成功固定在酵母细胞壁上;综合比较菌株生长情况和催化活性,选择N端锚定作为SsAet在酵母表面展示的方法。在此基础上,通过密码子优化提高了 SsAet表达量,发现经密码子优化的EBY100-pYD1-SsAETs（EPagaAs）在20 min时Ala-Gln合成量是未经密码子优化菌株的1.7倍;反应终点从40 min缩短至30 min,生产效率提高了 33%。但是,EPagaAs合成Ala-Gln的反应时间长,且底物转化率仅为OPA的58%,推测酵母表达系统中蛋白翻译后修饰可能影响了 SsAet的催化活性。然后,针对上述问题,研究了蛋白翻译后修饰对SsAet的影响。以糖基化程度低的毕赤酵母为表达宿主,通过密码子优化,提高蛋白表达量和催化效率,构建了分泌表达SsAet的重组毕赤酵母GS115-pPIC9-SsAETP（GPAP）。以GPAP为研究对象,对重组毕赤酵母的诱导条件和合成Ala-Gln的反应条件进行了优化,确定了最佳的诱导温度为26℃、诱导时间为3d及甲醇补加量（v/v）为1.5%;最佳的反应温度为28℃、反应pH值为8.5、反应底物为AlaOMe及底物摩尔配比AlaOMe/Gln为2/1。在最优条件下,GPAP的底物转化率仅为OPA的71%左右,再次验证了蛋白后修饰作用对SsAet催化活性的影响。在此基础上,构建了胞内和分泌表达SsAet的重组毕赤酵母,发现胞内表达SsAet重组菌株的催化活性明显高于分泌表达的,其中胞内表达且去掉内源信号肽的菌株KM71-pPIC3.5K-SAETP1800（KP3.5KAP1800）合成Ala-Gln的底物转化率最高为80%,能达到OPA的90%左右,比分泌表达的对比菌株提高了 41%,阐述了胞内表达SsAet和去掉内源信号肽是提高酵母表达系统中SsAet催化活性的有效方法。通过SDS-PAGE和Western blotting发现了分泌型SsAet分子量的增加;通过去糖基化酶的切除,证明了分泌型SsAet中糖基化修饰的存在;通过LC-MS证明了糖基化修饰发生在第442位Asn残基上;通过圆二色光谱仪鉴定了胞内和分泌型SsAet的二级结构,发现了两者的显着性差异,证明了糖基化修饰是影响SsAet结构和催化活性的重要因素。最后,基于上述研究结果,构建了自固定化重组酿酒酵母高效合成Ala-Gln。使用高拷贝数质粒构建了胞内表达SsAet且去掉内源信号肽的EBY100-pRS424-SsAETs1800（EP424AS1800）。通过培养和反应条件的优化,EP424AS1800能在5 min内获得高达74%的底物转化率,是表面展示重组菌EPagaAs的1.44倍,能达到OPA的83%以上;反应时间比EPagaAs缩短了 80%以上,生产效率提高了 5倍;比生产强度高达1.28 g/L·min·1·OD600-1。通过导入絮凝基因FLOI,得到了毫米级絮凝颗粒且催化活性不受影响的EP424As1800-FLOI,实现了其在反应器内的自固定化。EP424AS1800-FLO1经过十次循环催化反应后仍能保持稳定的催化活性,实现了连续高效合成Ala-Gln。本论文的研究为Ala-Gln安全、绿色且高效的工业化生产奠定了基础。
李华[2]（2017）在《系统代谢工程改造大肠杆菌生产L-蛋氨酸》文中研究说明蛋氨酸是人和动物必需氨基酸中唯一含硫的氨基酸,被广泛用于制药行业、食品工业和饲料行业,2013年全球需求量约为80万吨（超过60万吨被用作饲料添加剂）。目前市售的蛋氨酸主要是丙烯醛化学方法合成,以石化原料甲硫醇、丙烯醛和氰化氢合成的蛋氨酸为DL消旋体混合物,需要酶法催化才能得到应用在医药行业的L-蛋氨酸。虽然动物能够吸收DL-消旋体混合物,但是最新的研究表明,L型比D型蛋氨酸更容易被消化吸收。相较于化工合成蛋氨酸高能耗、高生产安全要求（如剧毒的氰化物原料、中间体和废物）,微生物能够利用可再生廉价原料,在常温下生产L-蛋氨酸,属于环境友好型模式。在过去的几十年里,虽然各国学者们在产L-蛋氨酸菌株选育和育种方面做了大量的工作,但是筛选到的野生型和人工诱变的微生物生产能力比较低,不能满足工业生产的需要。随着对大肠杆菌（Escherichia coli）L-蛋氨酸合成机制的深入了解,用理性设计的策略,通过代谢工程的手段去改造微生物生产L-蛋氨酸受到各国学者的青睐。本论文中,分析了L-蛋氨酸合成途径的反馈抑制、合成瓶颈和生长抑制,通过挖掘基因功能、优化合成途径、修饰运输途径等策略针对E.coli W3110进行系统代谢改造,逐步提高L-蛋氨酸的产量,并探索L-蛋氨酸合成途径的一些新的调控机制,为后期研究提供理论依据。L-高丝氨酸是L-蛋氨酸的前体和碳骨架,以E.coli W3110为出发菌株,通过代谢工程策略构建了一个高产L-高丝氨酸的菌株。具体策略如下:敲除大肠杆菌基因组lysC、thrBC和metA基因,阻断赖氨酸碳代谢流竞争途径,以及苏氨酸和蛋氨酸分解途径;为了增强L-高丝氨酸合成途径的碳代谢流,研究了过量表达lysC、thrA和metL对L-高丝氨酸产量的影响,并表征了L-高丝氨酸对天冬氨酸激酶（AK）AKI、AKII和AKIII的影响,结果表明过量表达metL基因,能够克服L-高丝氨酸合成途径的限速步骤;过量表达rhtA基因,增强向重组菌胞外分泌L-高丝氨酸速度,解除对菌体生长抑制作用和进一步提高L-高丝氨酸的生产能力;鉴定出TdcC是负责向胞内运输L-高丝氨酸转运蛋白之一,敲除大肠杆菌基因组tdcC基因,弱化重组菌胞外L-高丝氨酸被吸收到胞内的效率;得到重组菌HM5（pBRmetL–pNrhtA）,15-L发酵罐补料-分批发酵44 h L-高丝氨酸产量达到39.54 g·L-1。为了增强L-蛋氨酸合成途径的碳代谢流和解除met调节子的负调控,依次敲除了thrBC、lysA和metJ基因。通过pN25控制过量表达metAFbr（Fbr,抗反馈抑制）、malY克服了E.coli L-蛋氨酸生物合成途径的障碍。另外,通过弱启动子metK84p替换metKp弱化E.coli Me03 SAM合成酶的表达,过量表达解除反馈抑制的HTS,也能够解除γ-胱硫醚生成高半胱氨酸的合成障碍,并且能够显着增加L-蛋氨酸的产量。比较了不同方式阻断苏氨酸合成途径,发现只敲除thrC基因比同时敲除thrBC基因的重组菌具有更好的生长性能和生产L-蛋氨酸能力。通过上述的代谢工程策略,以E.coli W3110为出发菌株,构建的E.coli Me06（pETMAFbr-B-Y）重组菌500 mL摇瓶和15-L发酵罐L-蛋氨酸产量分别从0 g·L-1提高到0.4和3.5 g·L-1。过量表达了metE、metF和metH,以增加高半胱氨酸的甲基化效率。解除metE和metH的转录调控,过量表达MetE或MetH能够显着提高L-蛋氨酸的产量。与MetE相比,MetH具有更高的甲基化效率。研究了metH不同表达水平对L-蛋氨酸的影响,发现metH的表达量过高或过低都会造成L-蛋氨酸产量的下降。通过替换E.coli Me06基因组上metH自身启动子为组成型启动子pN25,可以解除其转录调控,经15-L罐发酵,Me08（pETMAFbr-B-Y）L-蛋氨酸产量能够达到5.43 g·L-1。构建MetD运输系统缺失突变株,研究该运输系统功能缺失对E.coli W3110 L-蛋氨酸吸收和积累的影响。MetJ阻遏调控解除后,metNIQ的表达量和L-蛋氨酸吸收速度显着增加。通过敲除E.coli W3110和Me05的metNIQ,MetD运输系统缺失导致L-蛋氨酸吸收速度下降。另外,分别敲除用于产L-蛋氨酸基座菌株Me06的metNIQ基因簇、metN、metI和metQ。生长曲线和摇瓶发酵结果表明,metI的敲除促进菌体的生长和L-蛋氨酸的合成,L-蛋氨酸的产量从0.39 g·L-1提高到0.45 g·L-1,提高了15.4%,L-蛋氨酸产率从0.14 g·g-1 DCW提高到0.15 g·g-1 DCW。通过tac启动子本底表达解除yjeH的调控,低水平表达YjeH能够降低胞内的L-蛋氨酸的浓度,L-蛋氨酸产量从0.45提高到0.58g·L-1。结合修饰L-蛋氨酸向胞内吸收速度、增强向胞外L-蛋氨酸的运输速度和甲基化效率,Me15（pETMAFbr-B-Y/pKK-tacyjeH）补料-分批发酵L-蛋氨酸产量提高到7.19 g·L-1比Me08（pETMAFbr-B-Y）提高了32.4%。为了增加半胱氨酸的供应,通过逐个解除E.coli半胱氨酸合成途径基因的调控,发现增强cysC、cysE、cysH和cysK基因表达量,能够提高L-蛋氨酸的合成效率。同时解除cysE和cysC的调控,增强半胱氨酸的硫还原和碳代谢流能够进一步提高E.coli L-蛋氨酸产量和产率。结合增强L-蛋氨酸向胞外运输,重组菌Me15（pETMAFbr-B-Y/pKK tacyjeH-cysE-C）摇瓶和发酵罐补料-分批发酵L-蛋氨酸产量分别增加到1.16和10.10g·L-1。
王治元[3]（2013）在《生物酶法制备手性氨基酸及其衍生物研究》文中指出手性是自然界的基本属性之一,构成生命有机体的分子绝大多数都是不对称的手性分子,这些大分子在生命体内具有重要的生理功能。氨基酸作为一种常见的手性化合物,广泛应用于医疗、食品、保健品及饲料等与人类生活和健康密切相关的几大行业。其中,D-氨基酸作为医药及食品领域的重要原料,被广泛应用于半合成抗生素、多肽激素、杀虫剂和甜味剂等生产。一般而言,氨基酸的生产方法有发酵法、化学合成法和生物酶法合成。酶法合成与普通化学合成相比,具有高效、环保、安全和适合大规模生产等优点。随着人们环境意识的增强,资源综合利用,清洁生产和低碳节能已成为全球发展的大趋势。以最小的环境影响,最少的资源消耗,最优的管理模式实现最合理的经济增长,走可持续发展之路已成为各国经济社会发展的共识。本文构建了大肠杆菌工程菌,进行了一系列天然及非天然的氨基酸的酶法合成研究;利用高活性、高选择性和耐盐性的基因工程菌,以氨基酰胺为原料,分别采用单酶法和双酶法合成了手性氨基酸,同时对酶法制备手性氨基酸的转化条件进行了优化。具体工作如下:1.重组表达了氨肽酶B（Peptidase B,PepB）,该酶具有广泛的底物特异性,可以DL-氨基酰胺为底物光学拆分获得L-氨基酸。在论文第二章中作者以丙烯酰胺为原料化学合成了 DL-3-甲氧基丙酰胺,并以该酶对其拆分,优化了酶促反应条件,最适条件为:pH9.0,反应温度40℃,底物浓度400 mmol/L,低浓度Co2+,Ca2+,Mn2+和Mg2+对酶有激活作用,在最佳条件下,反应14h后L-3-甲氧基丙酰胺的转化率可达96%。拆分后得到的L-3-甲氧基丙氨酸和D-3-甲氧基丙氨酰胺分别经氢溴酸水解即可得D-丝氨酸和L-丝氨酸。同时作者还以2-溴脂肪酸酰胺为原料化学生物法制备了 L-2-氨基脂肪酸,拆分得到的L-2-氨基丁酸、L-正缬氨酸和L-正亮氨酸比旋光均符合国际标准。2.重组表达了 D型酰胺水解酶（D-stereospecific amino-acid amidase,DaaA）,该酶具有广泛的底物特异性,可以DL-氨基酰胺为底物光学拆分获得D-氨基酸。以此酶对DL-苯丙酰胺进行拆分,优化了酶促反应条件,最适条件为:pH 9.0,反应温度45℃,底物浓度500 mmol/L,在最佳条件下,反应8h后D-苯丙酰胺的摩尔转化率可达98%。同时作者还以2-溴脂肪酸酰胺为原料化学生物法制备了 D-2-氨基脂肪酸,拆分得到的D-2-氨基丁酸、D-正缬氨酸和D-正亮氨酸比旋光均符合国际标准。3.重组表达了酰胺消旋酶（α-amino-ε-caprolactam racemase,ACLR）,该酶具有广泛的底物特异性,可以D型或L型氨基酰胺为底物消旋得到消旋的DL-氨基酰胺。以此酶对L-丙酰胺进行消旋,优化了酶促反应条件,最适条件为:pH7.5,反应温度45℃,底物浓度800 mmol/L,在最佳条件下,反应4h后L-丙氨酰胺的消旋率可达98%。将此酶与PepB、DaaA分别组合使用对DL-氨基酰胺类化合物进行手性拆分,取得了良好的拆分效果,一方面获得了纯的L和D型氨基酸,另一方面避免了原材料的浪费,对氨基酸工业化生产有着积极意义。以此两种双酶系统对DL-蛋氨酰胺进行拆分,优化了酶促反应条件,PepB-ACLR双酶体系的最佳工艺条件:pH 8.5,反应温度40℃,底物浓度300mmol/L,ACLR:PepB为1:3,反应10h;DaaA-ACLR双酶体系的最佳工艺条件:pH8.0,反应温度45℃,底物浓度 500mmol/L,ACLR:DaaA 为 1:1.5,反应 18h。4.研究了一种高效的化学酶法合成手性药物拉科酰胺的方法,该合成方法中重要的一步手性合成采用固定化乙酰化酶（EC3.5.1.14）对中间产业进行拆分。在文献合成方法的基础上,我们以低成本的丙烯酸甲酯为原料合成D,L-3-甲氧基-丙氨酸,D,L-3-甲氧基-丙氨酸通过乙酰化反应生成N-acetyl-D,L-3-甲氧基-丙氨酸,采用固定化乙酰化酶将消旋乙酰化原料拆分成N-acetyl-D-3-甲氧基丙氨酸和L-3-甲氧基丙氨酸,最后将N-acetyl-D-3-甲氧基-丙氨酸与苄胺在缩合剂存在下缩合成目标产物拉科酰胺。本论文立足于化学生物法合成手性氨基酸及其衍生物,结合基因工程手段重组表达生物酶,提高了酶法转化效率,制备了多种手性氨基酸化合物,具有重要的理论意义和应用潜力。
徐礼生[4]（2013）在《酶法合成色氨酸和非天然氨基酸及其催化机理研究》文中研究说明氨基酸是一类具有生物活性手性分子,氨基酸及其衍生物在医药、食品领域有非常广泛应用,具有很大市场需求,由于氨基酸及其衍生物具有重要应用价值成为氨基酸领域研究热点。氨基酸及其衍生物制备方法有生物法、化学法和物理法等,生物法是利用微生物或酶直接转化,生物法合成与化学法合成相比,具有高效、环保、安全和适合大规模生产等优点。本论文正是基于以上背景开展了系列相关工作,构建基因工程菌生物合成了一系列手性氨基酸中间体,丰富了生物法制备手性药物中间体的研究。具体工作如下:1.trpBA和trpA是L-色氨酸合成途径两个关键酶基因,采用PCR方法从大肠杆菌K-12菌株基因组DNA中扩增到trpBA和trpA基因,将trpBA和trpA基因串联在质粒pETDuet-1上导入大肠杆菌中表达。结果表明,酶法最佳转化条件为:反应温度为35 ℃,pH值为8,底物L-丝氨酸浓度为100 mmol/L,在此条件下酶促反应6 h,L-丝氨酸转化率可达81%,trpBA和trpA基因串联表达宿主细胞酶活高于trpBA单独表达宿主细胞酶活。2.在水/有机溶剂双相体系中,利用重组大肠杆菌色氨酸合成酶催化L-丝氨酸和吲哚合成L-色氨酸。考察了不同有机溶剂、有机相乙酸乙酯体积分数、反应温度、水相pH、底物L-丝氨酸与吲哚摩尔比、底物L-丝氨酸浓度、表面活性剂和酶添加量对色氨酸合成酶酶活的影响。结果表明,酶法最佳转化条件为:有机相溶剂为乙酸乙酯,乙酸乙酯体积分数为2.5%,反应温度为35℃,水相pH为8,底物L-丝氨酸与吲噪摩尔比为1:1.2,底物L-丝氨酸浓度为100 mmol/L,吐温80质量分数为0.4%,单位体积反应介质中酶的添加量为20 g/L。在此条件下酶促反应2.5 h,L-丝氨酸摩尔转化率达95%。色氨酸合成酶空间构象研究表明,吲哚与色氨酸合成酶活性位点Asp138形成了稳定的氢键。利用色氨酸合成酶催化L-丝氨酸和2-甲基吲哚合成2-甲基-L-色氨酸,结果表明,酶法最佳转化条件为:有机相溶剂为甲苯,甲苯体积分数为2%,反应温度为40 ℃,水相pH为8,底物L-丝氨酸与吲哚摩尔比为1:1.2,底物L-丝氨酸浓度为150 mmol/L,表面活性剂Trion X-100质量分数为2%,金属离子Ca2+浓度为0.1 mmol/L,酶促反应5 h,L-丝氨酸摩尔转化率达97.5%。色氨酸合成酶空间构象研究表明,2-甲基吲哚与色氨酸合成酶活性位点Gly189形成了稳定的氢键。3.研究了多羟基化合物聚乙二醇PEG1000、聚乙二醇PEG2000、丙三醇、乙二醇对色氨酸合成酶催化活性影响及其动力学,研究结果表明PEG2000对色氨酸合成酶催化活性具有促进作用,在添加10 g L-1 PEG 2000、pH 9和40 ℃反应条件下,底物L-丝氨酸浓度为100mmol L-1反应2h后转化达到平衡,色氨酸合成酶酶促反应动力学常数分别为Vmax 0.314 mmol min-1 per-1 g-1、Km 1.386 mM、Kcat 23.6 s-1 和KcatKm 17.OmM-1 s-1。4.利用重组色氨酸合成酶催化合成L-半胱氨酸、S-甲基-L-半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸和S-苯基-L-半胱氨酸。考察了底物特异性、反应温度、pH、底物浓度、底物摩尔比和反应时间对色氨酸合成酶酶活影响。结果表明,色氨酸合成酶以硫氢化钠和甲硫醇为底物时活性显着高于苯硫酚和巯基乙酸为底物时活性,四种底物酶法最佳转化条件为:反应温度为37 ℃,pH为8,L-丝氨酸与硫氢化钠、甲硫醇、苯硫酚或巯基乙酸的适宜底物摩尔比为1:1.2,底物最适合浓度为400mmol/L,硫氢化钠、甲硫醇、苯硫酚和巯基乙酸反应达到平衡时间分别为8 h、12 h、16 h和18 h,底物L-丝氨酸摩尔转化率均达到90%以上,硫氢化钠与色氨酸合成酶活性位点Ser235形成稳定的氢键,甲硫醇与色氨酸合成酶活性位点Gly234形成稳定的氢键,苯硫醇与色氨酸合成酶活性位点Ser235和Gly233形成稳定的氢键,疏基乙酸与色氨酸合成酶活性位点Gly232、Gly233、Gly234、Ser235和Asn236形成稳定的氢键。5.利用N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶拆分N-乙酰-D,L-色氨酸、N-乙酰-D,L-苯丙氨酸和N-乙酰-D,L-蛋氨酸,该酶促反应最适条件:pH7.0,反应温度为45℃时,表面活性剂吐温-800.4%,Co2+浓度为10-4mol/L,反应时间为5h,N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶拆分300mmol/L N-乙酰-DL-氨基酸能力依次为N-乙酰-DL-蛋氨酸、N-乙酰-D,L-苯丙氨酸和N-乙酰-D,L-色氨酸,N-乙酰-DL-蛋氨酸、N-乙酰-D,L-苯丙氨酸和N-乙酰-D,L-色氨酸摩尔转化率分别为96%、83%和65%。
吴丛伟[5]（2013）在《腈水解酶催化生产蛋氨酸的研究》文中研究说明蛋氨酸是一种重要的氨基酸,主要用于饲料行业,目前国内的蛋氨酸生产能力远远不能满足需求,大部分需要依赖进口,因此开发蛋氨酸的生产工艺具有很大的发展潜力。与传统的化学合成法相比,腈转化酶法催化4-甲硫基丁腈生产蛋氨酸具有反应条件温和,产物易分离等特点,越来越受到人们的广泛关注。本文利用实验室构建的产腈水解酶重组大肠杆菌E.coli BL21（DE3）/pET28b-NIT催化2-氨基-4-甲硫基丁腈制备蛋氨酸。首先对重组大肠杆菌静息细胞催化2-氨基-4-甲硫基丁腈的反应条件进行了研究:最适缓冲体系为Tris-HCl（pH7.5）,最适温度为40 ℃,底物浓度在150～250 mM时水解酶活性达到最大,最大比酶活2800 U/gDCW;随着底物浓度的增大,腈水解酶活力受到了一定程度的抑制。同时,静息细胞的重复使用性较差,第二次使用时酶活就已经降到了 50%以下。论文比较了不同固定化方法对静息细胞催化的影响,选择海藻酸钠（SA）-聚乙二醇（PEG）复合包埋法固定该重组大肠杆菌。通过单因素和正交法优化后,获得最适的固定化条件为:SA浓度为2.5%,CaCl2浓度为2%,固定化时间6h,菌体包埋量为60mg/ml,PEG6000添加量为100 mg/ml。同时研究了固定化细胞的转化条件,并与游离细胞做了比较,发现固定化细胞的最适pH和最适转化温度与游离细胞相同,说明该固定化细胞有较好的通透性。固定化细胞的温度稳定性和重复使用性都有了显着提高,40 ℃和50 ℃下的半衰期分别比游离细胞提高了1.29倍和1.45倍,固定化细胞在使用到第九次的时候,还能保留75%的酶活,而游离细胞已经几乎检测不到活力。最后研究了填充床反应器中固定化细胞连续生产蛋氨酸的过程,确定了Φ35×400 mm的填充床反应器的最佳操作条件:浓度为40 mM底物以0.4 ml/min的速度从反应器的上方流入,转化5 h后转化液从反应器的下方流出,连续反应100 h后,底物的转化率仍维持在85%以上,此时蛋氨酸的生产速度为每克干菌体每小时生产1.29 g,是文献中报道的蛋氨酸生产速度的14.3倍,生产速度有了很大的提高。同时构建了填充床反应器中的代数经验动力学方程L=-0.18/η[32lncs/cs0+（cs-cs0）,该方程与反应器中的动力学参数Km、rmax,底物转化率、颗粒孔隙率和内扩散有效因子相关。通过计算,得到了底物浓度40mM下的代数经验方程:L =-0.58×[32lncs/cs0+（cs-cs0）]。最后,利用乙醇萃取法对转化液中蛋氨酸进行分离提取,并对分离提取到的样品进行了液相、核磁等检测手段表征,结果表明提取到的样品是蛋氨酸,且纯度达到了 99%以上。
党万利[6]（2012）在《生物法生产蛋氨酸的研究》文中进行了进一步梳理腈水解酶在有机合成中有重要的应用价值,被广泛应用转化各种腈或酰胺合成精细化工产品和医药中间体,生物降解有毒腈治理环境污染等方面。蛋氨酸被广泛用于医药、食品、饲料和化妆品等领域,全球市场需求量以4～5%的幅度增长,2011年产量约为100万吨。蛋氨酸的生产方法分为化学法和生物法两大类,本文利用腈水解酶催化2-氨基-4-甲硫基丁腈制备蛋氨酸,围绕基因工程菌的构建、培养条件的优化、转化过程研究等方面展开研究和讨论。首先,通过基因工程技术构建了一株具有腈水解酶活性的基因工程菌J10-4。重组菌经诱导表达,Ni-NAT柱分离纯化,SDS-PAGE分析结果显示,重组蛋白约为43KDa,酶活为960U/mg。对腈水解酶的酶学性质研究发现:酶促反应最适pH=7.5,最适温度为40℃,在40℃时半衰期为5.52h;对该酶的酶促反应动力学研究得出其Vmax=0.0197mol/（L·min）,Km=0.096mol/L。底物特异性研究表明此腈水解酶对脂肪族的腈都表现出活力,但是对于芳香和杂环族的腈基本没有活力。其次,利用单因素实验对重组大肠杆菌J10-4摇瓶培养的培养基和培养条件进行了优化。优化培养基和培养条件为:蛋白胨12g/L、酵母粉8g/L、NaCl8g/L;选择IPTG作为诱导剂,终浓度0.2mM,培养基初始pH7.0,摇瓶装液量为20%（V/V）,接种量为3%,在诱导温度28℃下诱导培养12h。重组大肠杆菌J10-4静息细胞转化2-氨基-4-甲硫基丁腈的反应条件:其最适缓冲体系为Tris-HCl（pH=8.0）,最适温度为40℃,测得表观活化能Ea=44.56kJ/mol;在30℃和40℃下的半衰期分别为18.23h和7.8h;底物浓度在150mM～250mM时水解酶活性达到最大,最大酶活2800DCWU/g,总酶活为7100U/L;随着底物浓度的增大,腈水解酶活力受到了一定程度的抑制。在5L发酵罐里对重组大肠杆菌J10-4进行了分批补料发酵的研究,最终确定的5L发酵罐发酵工艺为:初始培养基葡萄糖5.0g/L、蛋白胨8g/L、酵母粉5.4g/L、NaCl8g/L;初始pH=7.0,控制发酵液pH恒定在7.0左右;在发酵6h时添加诱导剂IPTG,其终浓度为0.4mM,诱导温度为28℃;当葡萄糖浓度下降为2g/L时开始补加碳源补料培养基,发酵过程中维持葡萄糖浓度在2～3g/L之间;从发酵6h开始每隔2h补加50ml氮源补料培养基,共补加4次;整个发酵过程持续18～20h,补料分批发酵的菌体量为11.5g/L,总酶活为31000U/L。
吴瑶瑶[7]（2012）在《低排放循环工艺生物转化法生产β-丙氨酸的研究》文中研究指明本文研究了生产L-天冬氨酸α-脱羧酶（简称PanD）的重组大肠杆菌发酵工艺,YCY发酵培养基较适初始pH值为7.5;选择补料配方及添加浓度为麦芽糖9.52 g/L、玉米浆15.6 g/L,分批次补料优于一次性补料结果,确定分批次补料时间点为3 h、6 h、9 h,71.4 g/L的麦芽汁可替代原YCY培养基中的麦芽糖用于制备发酵培养基,利用发酵罐对不同发酵条件下菌种的发酵性能进行综合考察,结果表明优化补料发酵培养基培养菌株效能优于原优化发酵培养基,酶活提高达2倍。对转化体系条件进行优化,选择添加初始底物浓度2 g/L,底物初始pH值7.0,转化温度为35℃。研究发现增加溶氧可提高PanD菌株酶活及其底物转化率,阳离子表面活性剂对PanD酶活及底物转化有较好促进作用,其中1%浓度的表面活性剂X可促进底物转化率达87%,不同无机离子对转化反应影响不同,Fe3+可提高底物转化率1.3 倍。利用732阳离子交换树脂分离转化混合液,选择树脂处理类型为H+型,当树脂吸附时间达15 min及以上时,两种氨基酸的吸附即达动态平衡,较适吸附液的初始浓度为15 g/L,料液最佳pH为5,料液最佳吸附温度为30℃,洗脱剂氨水体积为5%,综合考虑两种树脂吸附方法的效果,在后续实验中选择动态吸附法。设计生物法产β-Ala的低排放循环转化反应装置,并对循环转化体系进行研究,确定底物补加方法为在转化前48 h中每8 h补加底物浓度2 g/L,之后每8 h添加底物浓度为1 g/L;表面活性剂X对酶活具有较大促进作用,但在循环转化体系中其对酶活稳定性未有显着影响;PanD酶活的半衰期为28.9 h,循环转化反应至第24 h时酶活达到峰值,反应进行到第48 h时酶活降至初始酶活力的50%以下,为最大限度利用酶活并避免底物资源的浪费,选择循环转化反应持续时长为72 h,732阳离子交换树脂重复利用5次后对L-Asp和β-Ala的吸附量比初始吸附量分别降低70%和25%,选择每150 mL循环转化液中添加10 g树脂参与完成一次循环转化反应周期,循环反应转化体系生产β-Ala获得的产量比分批次转化所得产量提高1.55倍,同比降低了生产成本并解决了后续产物分离操作问题。
黄丽霖[8]（2011）在《高密度限氧酵母发酵木糖生产乙醇及其细胞应激乙醇耐受机理的研究》文中研究指明木糖是木质纤维原料中半纤维素水解的主要成分,充分利用木糖发酵生产乙醇对纤维乙醇的发展有重要的意义。目前,发酵木糖的自然菌对木糖的利用率低、发酵周期长,且产乙醇量低,从而限制自然发酵菌的大规模应用。通过选用自然发酵菌树干毕赤酵母进行高密度培养,并优化培养条件,实现发酵液中高细胞浓度,并对高密度限氧酵母的循环利用性、发酵性能和应激乙醇的耐受性进行研究。稀酸预处理秸秆中,酸水解的H+作用秸秆表面显露的官能团,使木糖从木聚糖结构链上释放出来。处理后的秸秆表面结构松散,内孔隙度增大,比表面积增大,有利于酶与秸秆接触,加快酶解糖化速率。通过二次回归正交设计对酸处理中时间、浓度和固液比进行优化,确定适宜的工艺条件：反应时间2h,稀酸浓度4.1%、液固比22：1。在研究发酵过程的影响因素中发现,通过不同纱布层来限制发酵中氧的传递,保证发酵液中微量氧满足细胞代谢中的氧化还原平衡和细胞的生长。同时在发酵过程中适宜的转速有利于保证酵母的摄糖和摄氧能力,加强发酵液的流动性,保持细胞活力,并降低发酵产物对细胞生长和代谢的抑制作用。实验表明,当木糖浓度为60 g/L,转速为140 r/min下发酵48 h,糖的利用率达到99.57%。对比游离细胞发酵结果表明,高密度限氧酵母对糖的利用和产乙醇量高于游离细胞。在发酵半纤维素水解液得到的结果比不上纯糖发酵,但其效率要高于游离细胞。因此,利用高密度限氧酵母发酵可提高细胞浓度,缩短发酵周期,最终提高对木糖的利用率和发酵效率。最后,考察高密度酵母应激乙醇耐受性能的结果表明,外加高乙醇浓度的木糖发酵中,高密度限氧酵母细胞浓度和酒精度减少,对木糖的利用减慢。但相比于游离细胞而言,外加高浓度乙醇时,高密度细胞的木糖利用率要高于游离细胞,其受高浓度乙醇的影响小于游离细胞。说明高密度细胞在应激高浓度乙醇时,细胞内和细胞间相互起到保护和抵抗作用。
王霞[9]（2010）在《氨基酰化酶产生菌米曲霉发酵条件的优化》文中指出氨基酰化酶具有光学异构专一性,能够选择性地水解N-酰基-DL-氨基酸,通过分离即可得到光学纯L-或D-氨基酸。工业上利用这一特点可以大规模生产氨基酸。因此,高活力和高立体选择性的氨基酰化酶的生产菌株的选育和产酶条件的优化,是高效、低成本制备氨基酸的基础。现在用于氨基酸拆分的氨基酰化酶大多来自米曲霉发酵,但是其产量和质量远不能满足工业生产的需求。为解决这一矛盾,本论文以经过离子诱变的米曲霉为实验对象,通过改变它的碳源、氮源、磷酸盐、以及它们的浓度、装液量、温度、转速等各种因素来寻求它的最优发酵条件,以达到发酵条件的最优化。探求从外界环境进一步提高米曲霉产氨基酰化酶的酶活,为工业化,规模化生产奠定基础。实验通过单因素试验研究了碳源及浓度,氮源及浓度,磷酸盐及浓度、镁离子浓度,底物及表面活性剂等培养基添加物对氨基酰化酶生产的影响,以及温度、接种量、装液量和转速等发酵条件对产酶的影响。结果表明发酵最适碳源为麸皮,最适氮源为有机复合氮源（蛋白胨和尿素）,最适磷酸盐为磷酸二氢钠。实验结果表明,液态发酵的氨基酰化酶不是诱导酶,添加底物对酶活没有影响。而添加表面活性剂,对氨基酰化酶的活力有抑制作用。在单因素试验的基础上,利用正交设计法对主要因素进行9因素3水平试验,通过试验结果和方差分析确定优化培养基为:麸皮1%,蛋白胨1.25%,尿素0.75%,硫酸镁0.15%,磷酸二氢钠0.2%,不添加底物和表面活性剂。优化培养条件为:250 ml三角瓶中装入20 ml培养基,转速为150 r/min,接种量为8%,pH为6.5,不添加玻璃珠,40℃下,培养50h。以此培养基发酵3批样品,米曲霉产氨基酰化酶的平均酶活可高达850μmol/g·h。与优化前75μmol/g·h相比,酶活提高11倍多。另外,对诱变前后米曲氨基酰化酶蛋白的提取及结构进行了初步的探索。由于实验时间比较短,实验条件有限,蛋白酶提取效果并不好,需要今后继续努力研究,以便能得到较纯的氨基酰化酶。
苏志鹏[10]（2009）在《嗜热脂肪芽孢杆菌氨基酰化酶基因在大肠杆菌中的克隆，表达及细胞固定化研究》文中提出甲硫氨酸是一个含硫的必需氨基酸,在饲料、医药、保健和食品工业领域都有着广泛的用途。甲硫氨酸是一个高附加值产品,也是我国为数不多需从国外大量进口的氨基酸之一。寻找成本低,产量高的甲硫氨酸生产工艺和方法成了近年来国内氨基酸生产领域的一个研究热点。本研究以嗜热脂肪芽孢杆菌为原始菌,从中克隆出氨基酰化酶基因,并转化到大肠杆菌中进行诱导表达,同时对菌体细胞进行了直接固定化研究,以N-乙酰-DL-甲硫氨酸为底物,探讨适合工业化拆分DL-甲硫氨酸的应用可能性。方法是以嗜热脂肪芽孢杆菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增出编码氨基酰化酶amaA基因,与pMD-18T vector重组,对阳性克隆菌的序列分析显示,与Genebank中amaA（Y08753）序列完全一致。用NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切pET-28a（+）和pMD-18T vector阳性克隆,T4 DNA连接酶连接,构建了amaA-pET28a（+）的重组表达载体,转化到E.coli BL21中进行诱导表达。SDS-PAGE分析和氨基酰化酶活性测定都表明,amaA基因在大肠杆菌中获得了高效表达。研究了IPTG的浓度,IPTG加入的时间和诱导表达的时间等。结果显示的最佳条件为:37℃,200rpm培养,菌浓度OD600在0.8～1.0之间时加入IPTG诱导,IPTG终浓度0.4mmol/L,诱导表达6h后,获得了氨基酰化酶活性为1,043U/g湿菌体。以N-乙酰-DL-甲硫氨酸为底物的拆分研究显示:底物浓度＜0.08mol/L时,反应速度随底物浓度增加呈线性关系;55℃酶反应,游离菌的Km为4.5mmol/L,固定化后的Km为14.7mmol/L。酶学性质研究同时表明,65℃酶的催化效率最高,最适pH为7.0;固定化后酶pH稳定范围更广,热稳定性也更高;连续10批次拆分N-乙酰-DL-甲硫氨酸,活性仅损失20%左右;4℃条件下保存23天仍保留有固定化时73.6%的酶活性。菌体直接固定化研究显示,最佳条件为:3%卡拉胶包埋30%菌体细胞,以1.25%多乙烯多胺渗透交联固定化菌体细胞10min和0.1%戊二醛硬化处理20min,与未固定菌体比较,菌体固定化后仍保留有83%的酶活性。本研究显示,重组大肠杆菌表达的氨基酰化酶有着很好的应用前景。
二、工程菌固定化细胞生产L-蛋氨酸完成中试（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、工程菌固定化细胞生产L-蛋氨酸完成中试（论文提纲范文）
（1）重组微生物全细胞催化高效合成丙谷二肽（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号表 |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 L-谷氨酰胺 |
| 1.1.1 理化性质 |
| 1.1.2 代谢及生理功能 |
| 1.1.3 局限性及替代物 |
| 1.2 丙谷二肽 |
| 1.2.1 理化性质及应用优势 |
| 1.2.2 合成方法及研究进展 |
| 1.2.3 检测方法 |
| 1.3 异源表达系统介绍 |
| 1.3.1 大肠杆菌原核表达系统 |
| 1.3.2 酿酒酵母真核表达系统 |
| 1.3.3 毕赤酵母真核表达系统 |
| 1.4 糖基化修饰 |
| 1.4.1 N-糖基化修饰 |
| 1.4.2 O-糖基化修饰 |
| 1.5 本文主要研究思路 |
| 1.5.1 选题背景及存在问题 |
| 1.5.2 研究内容及技术路线 |
| 2 异源表达SsAet重组大肠杆菌高效合成Ala-Gln |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 培养基和溶液 |
| 2.2.4 引物 |
| 2.2.5 分子操作技术 |
| 2.2.6 分析验证方法 |
| 2.2.7 异源表达SsAet重组大肠杆菌的构建 |
| 2.2.8 异源表达SsAet重组大肠杆菌诱导条件的优化 |
| 2.2.9 全细胞催化合成Ala-Gln反应条件的优化 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Ala-Gln定性定量方法的确立 |
| 2.3.2 异源表达SsAet重组大肠杆菌的表征 |
| 2.3.3 可溶性表达SsAet重组大肠杆菌的构建及筛选 |
| 2.3.4 OPA催化方式及催化活性差异性的分析 |
| 2.3.5 OPA诱导条件和全细胞催化反应条件的优化 |
| 2.3.6 循环利用OPA全细胞合成Ala-Gln |
| 2.4 本章小结 |
| 3 表面展示SsAet重组酿酒酵母合成Ala-Gln |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 试剂和仪器 |
| 3.2.3 培养基和溶液 |
| 3.2.4 引物 |
| 3.2.5 分子操作技术 |
| 3.2.6 分析验证方法 |
| 3.2.7 表面展示SsAet重组酿酒酵母的构建 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 表面展示方式对SsAet催化活性的影响 |
| 3.3.2 密码子优化对SsAet催化活性的影响 |
| 3.3.3 表面展示SsAet重组酿酒酵母的絮凝化 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 糖基化修饰对SsAet结构和催化活性的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 试剂和仪器 |
| 4.2.3 培养基和溶液 |
| 4.2.4 引物 |
| 4.2.5 分子操作技术 |
| 4.2.6 分析验证方法 |
| 4.2.7 异源表达SsAet重组毕赤酵母的构建 |
| 4.2.8 产酶条件和催化反应条件的优化 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 异源表达SsAet重组毕赤酵母的表征 |
| 4.3.2 糖基化修饰对SsAet催化活性的影响 |
| 4.3.3 糖基化修饰的鉴定及对SsAet结构的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 胞内表达SsAet重组酿酒酵母的自固定化及高效合成Ala-Gln |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 试剂和仪器 |
| 5.2.3 培养基和溶液 |
| 5.2.4 引物 |
| 5.2.5 分子操作技术 |
| 5.2.6 分析验证方法 |
| 5.2.7 胞内表达SsAet重组酵母的构建 |
| 5.2.8 胞内表达SsAet重组酵母培养条件的优化 |
| 5.2.9 胞内表达SsAet重组酵母全细胞催化反应条件的优化 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 胞内表达SsAet重组酵母的催化活性 |
| 5.3.2 胞内表达SsAet重组酵母的条件优化 |
| 5.3.3 胞内表达SsAet重组酵母的自固定化及重复利用 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（2）系统代谢工程改造大肠杆菌生产L-蛋氨酸（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋氨酸概述 |
| 1.2 蛋氨酸生产方法简述 |
| 1.2.1 化学合成法 |
| 1.2.2 酶催化DL-蛋氨酸转化为L-蛋氨酸 |
| 1.2.3 前体物质发酵 |
| 1.2.4 微生物法合成L-蛋氨酸 |
| 1.3 微生物合成L-蛋氨酸菌种选育进展 |
| 1.4 代谢工程改造微生物生产L-蛋氨酸研究进展 |
| 1.5 E. coli L-蛋氨酸代谢途径 |
| 1.5.1 高丝氨酸生物合成途径 |
| 1.5.2 高丝氨酸的激活 |
| 1.5.3 硫的整合 |
| 1.5.4 甲基化修饰高半胱氨酸生成L-蛋氨酸 |
| 1.5.5 一碳化合物代谢 |
| 1.5.6 硫酸盐的吸收与还原 |
| 1.5.7 L-蛋氨酸的转化与降解 |
| 1.5.8 E. coli中蛋氨酸运输途径 |
| 1.6 L-蛋氨酸生物合成调控 |
| 1.6.1 转录水平调节 |
| 1.6.2 代谢产物反馈抑制 |
| 1.7 代谢工程改造氨基酸生产菌株的方法和策略 |
| 1.7.1 代谢工程改造氨基酸生产菌株的通用策略 |
| 1.7.2 系统代谢工程 |
| 1.7.3 理性设计改造关键酶 |
| 1.7.4 启动子工程 |
| 1.7.5 改造基因组优化代谢途径 |
| 1.8 立题依据和主要研究内容 |
| 第二章 代谢工程改造E. coli高产L-蛋氨酸前体 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2.2 分子生物学实验操作方法 |
| 2.2.3 本章菌株和质粒 |
| 2.2.4 本章引物 |
| 2.2.5 培养基和培养条件 |
| 2.2.6 基因敲除方法 |
| 2.2.7 质粒构建 |
| 2.2.8 产物分析方法 |
| 2.2.9 天冬氨酸氨酸激酶的纯化和酶活检测方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 高丝氨酸竞争碳代谢流途径和分解途径的阻断 |
| 2.3.2 解除L-高丝氨酸碳代谢流瓶颈 |
| 2.3.3 表征L-高丝氨酸对AK的抑制作用 |
| 2.3.4 重组菌 15-L发酵罐的L-高丝氨酸生产能力和生长特性 |
| 2.3.5 解除L-高丝氨酸的生长抑制和反馈抑制 |
| 2.3.6 鉴定及修饰L-高丝氨酸向胞内运输途径 |
| 2.3.7 乙酸副产物的生成 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 E. coli产L-蛋氨酸基础菌株的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 主要试剂和仪器 |
| 3.2.2 分子生物学实验操作方法 |
| 3.2.3 本章菌株和质粒 |
| 3.2.4 本章引物 |
| 3.2.5 培养基和培养条件 |
| 3.2.6 基因敲除方法 |
| 3.2.7 荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 3.2.8 质粒的构建 |
| 3.2.9 定点突变metK基因组启动子的突变 |
| 3.2.10 分析方法 |
| 3.3 结果和讨论 |
| 3.3.1 竞争L-蛋氨酸碳代谢流途径的阻断 |
| 3.3.2 MetJ阻遏调控的解除 |
| 3.3.3 L-蛋氨酸过量合成途径的构建 |
| 3.3.4 弱化SAM合成途径对L-蛋氨酸生物合成途径调控的影响 |
| 3.3.5 thrC和thrBC基因敲除对L-蛋氨酸合成影响的比较 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 高半胱氨酸甲基化效率对E. coli合成L-蛋氨酸的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 主要试剂和仪器 |
| 4.2.2 分子生物学实验操作方法 |
| 4.2.3 本章菌株和质粒 |
| 4.2.4 本章引物 |
| 4.2.5 培养基和培养条件 |
| 4.2.6 荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 4.2.7 质粒的构建 |
| 4.2.8 pN25和tac启动子替换metH基因组启动子 |
| 4.2.9 分析方法 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.3.1 增强高半胱氨酸甲基化对L-蛋氨酸产量的影响 |
| 4.3.2 metH基因表达量对L-蛋氨酸的影响 |
| 4.3.3 改造metH基因组启动子对L-蛋氨酸产量的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 E. coli L-蛋氨酸运输系统的改造 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 主要试剂和仪器 |
| 5.2.2 分子生物学实验操作方法 |
| 5.2.3 本章菌株和质粒 |
| 5.2.4 本章引物 |
| 5.2.5 培养基和培养条件 |
| 5.2.6 荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 5.2.7 基因敲除 |
| 5.2.8 质粒的构建 |
| 5.2.9 分析方法 |
| 5.3 结果和讨论 |
| 5.3.1 解除MetJ阻遏蛋白负调控对MetD运输系统的影响 |
| 5.3.2 MetD运输系统缺失菌株的构建 |
| 5.3.3 MetD运输系统缺失对L-蛋氨酸吸收效率的影响 |
| 5.3.4 MetD运输系统缺失对L-蛋氨酸产量的影响 |
| 5.3.5 增强YjeH运输系统表达对E. coli生长的影响 |
| 5.3.6 增强YjeH运输系统表达对E. coli L-蛋氨酸合成的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 E. coli半胱氨酸合成途径对L-蛋氨酸产量的影响 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 主要试剂和仪器 |
| 6.2.2 分子生物学实验操作方法 |
| 6.2.3 本章菌株和质粒 |
| 6.2.4 本章引物 |
| 6.2.5 培养基和培养条件 |
| 6.2.6 质粒的构建 |
| 6.2.7 分析方法 |
| 6.3 结果和讨论 |
| 6.3.1 半胱氨酸对E. coli L-蛋氨酸合成的影响 |
| 6.3.2 解除cys基因调控对E. coli L-蛋氨酸合成的影响 |
| 6.3.3 共表达cysE-cysK、cysE-cysH和cysE-cys C对E. coli L-蛋氨酸合成的影响 |
| 6.3.4 增强半胱氨酸合成和L-蛋氨酸分泌途径对产量的影响 |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（3）生物酶法制备手性氨基酸及其衍生物研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 手性药物拆分技术研究进展及应用 |
| 1.1 手性及手性技术研究概况 |
| 1.2 手性化合物拆分的方法 |
| 1.2.1 酶法拆分 |
| 1.2.2 化学拆分法 |
| 1.2.3 色谱拆分法 |
| 1.2.4 膜拆分法 |
| 1.2.5 萃取拆分 |
| 1.2.6 旋转带蒸馏技术 |
| 1.2.7 结晶拆分 |
| 第二节 酰胺酶研究进展及应用 |
| 2.1 酰胺酶概况 |
| 2.2 酰胺酶分类 |
| 2.3 酰胺酶进化 |
| 2.4 酰胺酶参与的生物催化反应 |
| 2.5 酰胺酶理化性质 |
| 2.7 酰胺酶底物特异性和酶的立体选择性 |
| 2.8 热稳定性 |
| 2.9 氨基酸序列同源性 |
| 2.10 酰胺酶反应机理 |
| 2.11 酰胺酶分子生物学 |
| 2.12 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 氨肽酶B对酰胺及酰胺衍生物拆分作用研究 |
| 第一节 氨肽酶B基因工程菌构建 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 主要实验试剂 |
| 1.1.2 主要实验仪器 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 氨肽酶B基因工程菌(pET-28a-pepB/BL21)构建 |
| 1.2.2 氨肽酶(Pep B)工程菌诱导表达 |
| 1.2.3 氨肽酶(Pep B)活性测定 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 重组质粒pET-28a-pepB构建 |
| 1.3.2 氨肽酶(PepB)基因工程菌诱导表达 |
| 1.3.3 氨肽酶(PepB)活性测定 |
| 1.4 结论 |
| 第二节 化学酶法合成D/L-丝氨酸 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 仪器与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验路线 |
| 2.2.2 甲醇钠制备 |
| 2.2.3 α-溴-β-甲氧基丙酰胺制备 |
| 2.2.4 α-氨基-β-甲氧基丙酰胺制备 |
| 2.2.5 L-3-甲氧基丙氨酸标准曲线的绘制 |
| 2.2.6 氨肽酶PepB拆分反应 |
| 2.2.7 酶活性定义 |
| 2.2.8 D/L丝氨酸制备 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 醇钠的影响 |
| 2.3.2 丙烯酰胺加成反应溶剂和滴加条件 |
| 2.3.3 氨解条件 |
| 2.3.4 L-3-甲氧基丙氨酸标准工作曲线 |
| 2.3.5 转化温度对细胞酶活影响 |
| 2.3.6 pH对酶促反应影响 |
| 2.3.7 底物浓度及反应时间对酶活影响 |
| 2.3.8 金属离子对酶活影响 |
| 2.3.9 D-和L-丝氨酸制备 |
| 2.4 结论 |
| 第三节 酶法合成L-2-氨基脂肪酸 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 实验仪器与试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验路线 |
| 3.2.2 2-氨基脂肪酰胺制备 |
| 3.2.3 酶转化反应 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 2-Br脂肪酸甲酯氨解过程监测 |
| 3.3.2 酶促拆分进程 |
| 3.3.3 产物纯度及产率 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 D型酰胺水解酶对酰胺类化合物拆分作用研究 |
| 第一节 D型酰胺水解酶基因工程菌构建 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 主要实验试剂 |
| 1.1.2 主要实验仪器 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 DaaA基因工程菌(pET-Duet-daaA/ BL21)构建 |
| 1.2.2 D型酰胺水解酶DaaA工程菌诱导表达 |
| 1.2.3 D型酰胺水解酶DaaA酶活性测定 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 重组质粒pET-Duet-daaA构建 |
| 1.3.2 D型酰胺水解酶DaaA工程菌诱导表达 |
| 1.3.3 D型酰胺水解酶DaaA酶活性测定 |
| 1.4 结论 |
| 第二节 D/L苯丙氨酸的酶法制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 仪器与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验路线 |
| 2.2.2 DL-苯丙酰胺化学合成 |
| 2.2.3 D型酰胺酶DaaA菌体培养及收集 |
| 2.2.4 D型苯丙氨酸标准曲线绘制 |
| 2.2.5 酶法转化及酶活测定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 D型苯丙氨酸标准工作曲线 |
| 2.3.2 反应温度对酶活影响 |
| 2.3.3 反应pH值对酶活影响 |
| 2.3.4 表面活性剂对酶活影响 |
| 2.3.5 底物浓度对酶活影响 |
| 2.3.6 金属离子对酶活影响 |
| 2.3.7 酶促反应进程 |
| 2.3.8 D-和L-苯丙氨酸制备 |
| 2.4 结论 |
| 第三节 D型酰胺酶法制备D-2-氨基脂肪酸 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 实验仪器与试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验路线 |
| 3.2.2 2-氨基脂肪酰胺制备 |
| 3.2.3 酶转化反应 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 酶促拆分进程 |
| 3.3.2 产物纯度及产率 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 双酶法制备D/L氨基酸 |
| 第一节 己内酰胺消旋酶(ACLR)基因工程菌构建 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 主要实验试剂 |
| 1.1.2 主要实验仪器 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 ACLR基因工程菌(pET-Duet-aclR/ BL21)构建 |
| 1.2.2 ACLR基因工程菌诱导表达 |
| 1.2.3 ACLR基因工程菌酶活性测定 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 重组质粒pET-Duet-aclR构建 |
| 1.3.2 己内酰胺酶ACLR工程菌诱导表达 |
| 1.3.3 己内酰胺消旋酶ACLR酶活性测定 |
| 1.3.4 酶反应条件的优化 |
| 1.4 结论 |
| 第二节 双酶法制备L/D-蛋氨酸 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 仪器与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验路线 |
| 2.2.2 DL-蛋氨酰胺制备 |
| 2.2.3 PepB、DaaA及ACLR菌体培养及收集 |
| 2.2.4 L/D型蛋氨酸标准曲线绘制 |
| 2.2.5 酶法转化及酶活测定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 L和D型蛋氨酸标准工作曲线 |
| 2.3.2 反应温度对酶活影响 |
| 2.3.3 反应pH值对酶活影响 |
| 2.3.4 底物浓度对酶活影响 |
| 2.3.5 双酶体系中不同种类酶比例对催化效率影响 |
| 2.3.6 酶促拆分进程 |
| 2.3.7 D/L-蛋氨酸制备 |
| 2.4 结论 |
| 第三节 双酶法制备D/L-2-氨基脂肪酸 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 实验仪器与试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验路线 |
| 3.2.2 2-氨基脂肪酰胺化学合成 |
| 3.2.3 酶转化反应 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 抗癫痫药物拉科酰胺化学酶法合成 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 仪器与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验路线 |
| 2.2.2 甲醇钠的制备 |
| 2.2.3 2-溴-3-甲氧基丙酸甲酯制备 |
| 2.2.4 2-溴-3-甲氧基丙酸制备 |
| 2.2.5 DL-3-甲氧基丙氨酸制备 |
| 2.2.6 DL-3-甲氧基丙氨酸分离 |
| 2.2.7 DL-N-乙酰-3-甲氧基丙氨酸制备 |
| 2.2.8 氨基酰化酶固定化细胞制备 |
| 2.2.9 L-3-甲氧基丙氨酸标准曲线绘制 |
| 2.2.10 固定化细胞酶活定义 |
| 2.2.11 L-3-甲氧基丙氨酸、D-N-乙酰-3-甲氧基丙氨酸分离纯化 |
| 2.2.12 拉科酰胺合成 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 氨解条件 |
| 2.3.2 L-3-甲氧基丙氨酸标准工作曲线 |
| 2.3.3 DL-N-乙酰-3-甲氧基丙氨酸结构表征 |
| 2.3.4 转化条件对酶活影响 |
| 2.3.5 L-3-甲氧基丙氨酸结构表征 |
| 2.3.6 D-N-乙酰-3-甲氧基丙氨酸结构表征 |
| 2.3.7 拉科酰胺结构表征 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 攻读博士学位期间发表论文与申请专利 |
| 致谢 |
（4）酶法合成色氨酸和非天然氨基酸及其催化机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 手性药物研究意义 |
| 1.2 手性药物制备方法 |
| 1.2.1 手性药物生物合成 |
| 1.2.2 手性药物化学合成 |
| 1.2.3 手性药物色谱拆分 |
| 1.2.4 手性药物膜拆分 |
| 1.3 生物技术在手性药物合成中应用 |
| 1.3.1 酶拆分外消旋体法合成手性药物 |
| 1.3.2 酶法不对称合成手性药物 |
| 1.3.3 微生物发酵法合成手性药物 |
| 1.3.4 手性药物生物合成方法改进 |
| 1.4 酶工程技术在氨基酸生产领域应用 |
| 1.4.1 酶法氨基酸生产概况 |
| 1.4.2 我国酶法制备氨基酸进展 |
| 1.5 氨基酸代谢酶研究 |
| 1.5.1 色氨酸合成酶性质 |
| 1.5.2 色氨酸合成酶应用 |
| 1.5.3 N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶性质 |
| 1.5.4 N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶应用 |
| 1.6 添加剂对酶促反应影响 |
| 1.6.1 有机溶剂影响 |
| 1.6.2 多醇类化合物影响 |
| 1.6.3 表面活性剂影响 |
| 1.7 选题目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 串联表达trpBA和trpA色氨酸合成酶基因工程菌构建及应用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 菌株和质粒 |
| 1.2.2 酶和试剂 |
| 1.2.3 主要实验仪器 |
| 1.2.4 培养基 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 引物设计 |
| 1.3.2 E. coli K-12基因组DNA提取 |
| 1.3.3 PCR扩增 |
| 1.3.4 PCR产物纯化 |
| 1.3.5 质粒pETDuet-1提取 |
| 1.3.6 目的基因和载体双酶切 |
| 1.3.7 酶切产物纯化 |
| 1.3.8 连接反应 |
| 1.3.9 连接产物转化 |
| 1.3.10 重组质粒双酶切验证 |
| 1.3.11 色氨酸合成酶工程菌诱导表达 |
| 1.3.12 质粒pETDuet-1提取 |
| 1.3.13 目的基因和载体双酶切 |
| 1.3.14 酶切产物纯化 |
| 1.3.15 连接反应 |
| 1.3.16 连接产物转化 |
| 1.3.17 重组质粒双酶切验证 |
| 1.3.18 色氨酸合成酶工程菌诱导表达 |
| 1.3.19 色氨酸合成酶活性测定 |
| 1.3.20 酶转化液丙酮酸测定 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 trp BA和trpA基因的PCR扩增及相关重组质粒构建 |
| 1.4.2 基因序列测定 |
| 1.4.3 SDS-PAGE蛋白电泳检测基因表达产物 |
| 1.4.4 反应温度对酶活影响 |
| 1.4.5 pH对酶活影响 |
| 1.4.6 底物浓度对酶活影响 |
| 1.4.7 酶促反应进程 |
| 1.4.8 氨基酸分析仪测定 |
| 1.5 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 水/有机溶剂双相体系中色氨酸合成酶酶法合成L-色氨酸及其衍生物 |
| 第一节 水/有机溶剂双相体系中色氨酸合成酶酶法合成L-色氨酸 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验部分 |
| 1.2.1 菌体培养 |
| 1.2.2 酶法合成L-色氨酸及酶活测定 |
| 1.3 结果与讨论 |
| 1.3.1 有机溶剂影响 |
| 1.3.2 有机溶剂体积分数影响 |
| 1.3.3 反应温度影响 |
| 1.3.4 水相pH影响 |
| 1.3.5 底物摩尔比对酶活影响 |
| 1.3.6 底物浓度对酶活影响 |
| 1.3.7 表面活性剂对酶活影响 |
| 1.3.8 酶添加量对反应速率影响 |
| 1.3.9 酶促反应进程 |
| 1.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二节 水/有机溶剂双相体系中色氨酸合成酶酶法合成2-甲基-L-色氨酸 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验部分 |
| 1.2.1 菌体培养 |
| 1.2.2 酶法合成L-2-甲基色氨酸及酶活测定 |
| 1.3 结果与讨论 |
| 1.3.1 有机溶剂影响 |
| 1.3.2 有机溶剂体积分数影响 |
| 1.3.3 反应温度和pH影响 |
| 1.3.4 底物浓度对酶活影响 |
| 1.3.5 表面活性剂对酶影响 |
| 1.3.6 金属离子对酶活影响 |
| 1.3.7 酶促反应进程 |
| 1.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 多羟基化合物对色氨酸合成酶催化活性影响及其动力学研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 试剂与仪器 |
| 1.2.2 菌体培养 |
| 1.2.3 酶法合成L-色氨酸及酶活测定 |
| 1.3 结果与讨论 |
| 1.3.1 多羟基化合物对色氨酸合成酶活性影响 |
| 1.3.2 反应温度和pH对酶活影响 |
| 1.3.3 底物浓度对酶活影响 |
| 1.3.4 酶促反应进程 |
| 1.3.5 酶促反应动力学常数测定 |
| 1.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 色氨酸合成酶催化合成L-半胱氨酸及其衍生物研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 试剂与仪器 |
| 1.2.2 菌体培养 |
| 1.2.3 色氨酸合成酶底物特异性测定 |
| 1.2.4 酶促反应条件优化 |
| 1.2.5 酶活力测定 |
| 1.3 结果与讨论 |
| 1.3.1 色氨酸合成酶底物特异性 |
| 1.3.2 pH对酶活性影响 |
| 1.3.3 温度对酶活性影响 |
| 1.3.4 底物摩尔比对反应影响 |
| 1.3.5 底物浓度对反应影响 |
| 1.3.6 反应时间进程 |
| 1.3.7 半胱氨酸及其衍生物制备 |
| 1.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶拆分N-乙酰-D,L-氨基酸 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.3 结果与讨论 |
| 1.3.1 pH值对酶促反应影响 |
| 1.3.2 温度对酶促反应影响 |
| 1.3.3 表面活性剂对酶促反应影响 |
| 1.3.4 金属离子对酶促反应影响 |
| 1.3.5 底物浓度对酶促反应影响 |
| 1.3.6 酶促反应时间动态变化 |
| 1.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第七章 总结与展望 |
| 主要结论 |
| 前景展望 |
| 攻读博士学位期间发表论文与申请专利 |
| 附图1 L-色氨酸~1H-NMR(500MHz,D_2O) |
| 附图2 L-色氨酸质谱图 |
| 附图3 L-胱氨酸~1H-NMR(500MHz,D20) |
| 附图4 L-胱氨酸质谱图 |
| 致谢 |
（5）腈水解酶催化生产蛋氨酸的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋氨酸概述 |
| 1.1.1 蛋氨酸简介 |
| 1.1.2 蛋氨酸的研究概况 |
| 1.1.3 蛋氨酸的合成 |
| 1.1.4 蛋氨酸的应用 |
| 1.2 腈类化合物概述 |
| 1.3 腈水解酶概述 |
| 1.3.1 腈水解酶的来源及性质 |
| 1.3.2 腈水解酶的作用机理 |
| 1.3.3 腈水解酶的应用 |
| 1.4 固定化技术概述 |
| 1.4.1 细胞的固定化 |
| 1.4.2 细胞固定化技术的应用 |
| 1.4.3 固定化反应器 |
| 1.5 论文的选题意义与研究内容 |
| 1.5.1 选题意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 静息细胞催化2-氨基-4-甲硫基丁腈制备蛋氨酸的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌种与培养基 |
| 2.2.2 主要试剂与仪器 |
| 2.2.3 微生物转化反应与酶活定义 |
| 2.2.4 分析检测方法 |
| 2.2.5 反应体系pH对酶活的影响 |
| 2.2.6 反应温度对酶活的影响 |
| 2.2.7 金属离子对转化的影响 |
| 2.2.8 底物浓度对催化生产蛋氨酸的影响 |
| 2.2.9 静息细胞的批次转化实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 标准曲线的绘制 |
| 2.3.2 反应体系pH对酶活的影响 |
| 2.3.3 腈水解酶的pH稳定性 |
| 2.3.4 转化温度对酶活的影响 |
| 2.3.5 腈水解酶的温度稳定性 |
| 2.3.6 金属离子对转化的影响 |
| 2.3.7 底物浓度对转化的影响 |
| 2.3.8 静息细胞的批次转化实验 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 细胞固定化方法的选择及固定化条件优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 化学试剂 |
| 3.2.2 菌种及培养方法 |
| 3.2.3 固定化细胞的制备方法 |
| 3.2.4 固定化细胞酶活力的测定和定义 |
| 3.2.5 固定化细胞机械强度的测定 |
| 3.2.6 海藻酸钠固定化细胞制备条件优化 |
| 3.2.7 固定化细胞转化条件优化 |
| 3.2.8 固定化细胞批次转化制备蛋氨酸 |
| 3.2.9 分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 固定化方法的选择 |
| 3.3.2 固定化细胞制备条件优化 |
| 3.3.3 固定化细胞转化条件的研究 |
| 3.3.4 固定化细胞批次转化蛋氨酸 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 固定化反应器中催化生产蛋氨酸的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 试剂与材料 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 微生物培养 |
| 4.2.4 细胞固定化方法 |
| 4.2.5 转化液中蛋氨酸的分离提取 |
| 4.2.6 分析方法 |
| 4.2.7 固定化反应器的选择 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 两种反应器性能的比较 |
| 4.3.2 填充床反应器高径比(H/D)的选择 |
| 4.3.3 底物流加方式对填充床反应器转化能力的影响 |
| 4.3.4 底物浓度对填充床反应器转化能力的影响 |
| 4.3.5 填充床反应器的稳定性 |
| 4.3.6 填充床反应器的动力学模型的建立 |
| 4.3.7 转化液中蛋氨酸的分离提取 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 附录Ⅰ |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）生物法生产蛋氨酸的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 腈类化合物概述 |
| 1.2 腈水解酶概述 |
| 1.2.1 腈水解酶的来源及性质 |
| 1.2.2 腈水解酶的作用机制 |
| 1.3 蛋氨酸概述 |
| 1.3.1 蛋氨酸的性质 |
| 1.3.2 蛋氨酸的用途 |
| 1.3.3 蛋氨酸的市场现状 |
| 1.4 蛋氨酸生产工艺 |
| 1.4.1 化学法生产蛋氨酸 |
| 1.4.1.1 丙烯醛法 |
| 1.4.1.2 氨基内酯法 |
| 1.4.1.3 丙二酸酯法 |
| 1.4.1.4 固液相转移催化法 |
| 1.4.2 生物法生产蛋氨酸 |
| 1.4.2.1 酶拆分法制备L-蛋氨酸 |
| 1.4.2.2 发酵法生产蛋氨酸 |
| 1.4.2.3 化学-酶法生产蛋氨酸 |
| 1.5 论文的选题意义及研究内容 |
| 1.5.1 选题意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 产腈水解酶基因工程菌的构建表达及酶学性质的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 菌种、质粒及培养基 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 基因工程菌的构建 |
| 2.2.3.1 腈水解酶基因组的提取 |
| 2.2.3.2 腈水解酶基因NIT的PCR扩增 |
| 2.2.3.3 水解酶基因NIT的克隆 |
| 2.2.3.4 大肠杆菌E.coli JM109感受态的制备 |
| 2.2.3.5 目的基因的转化 |
| 2.2.3.6 重组质粒的提取 |
| 2.2.3.7 重组表达质粒的构建 |
| 2.2.3.8 菌落PCR |
| 2.2.4 腈水解酶基因的诱导表达 |
| 2.2.5 酶活定义及检测 |
| 2.2.6 腈水解酶分离纯化及SDS-PAGE电泳分析 |
| 2.2.7 pH对酶活的影响 |
| 2.2.8 腈水解酶的pH稳定性 |
| 2.2.9 温度对酶活的影响 |
| 2.2.10 酶的温度稳定性 |
| 2.2.11 金属离子对酶活的影响 |
| 2.2.12 底物特异性 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 腈水解酶在大肠杆菌中的表达及分离纯化 |
| 2.3.2 蛋白含量测定 |
| 2.3.3 分析检测方法的建立 |
| 2.3.4 重组腈水解酶活力测定 |
| 2.3.5 pH对酶活的影响 |
| 2.3.6 酶的pH稳定性 |
| 2.3.7 温度对酶活的影响 |
| 2.3.8 酶的温度稳定性 |
| 2.3.9 金属离子对酶活的影响 |
| 2.3.10 酶促反应动力学 |
| 2.3.11 底物特异性 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组大肠杆菌J10-4产腈水解酶工艺条件优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌种及初始培养基 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.2.3 细胞培养 |
| 3.2.4 酶活定义及转化条件 |
| 3.2.5 分析检测方法和生物量的测定 |
| 3.2.6 菌种培养时间 |
| 3.2.7 不同种类培养基对菌体生长以及产酶的影响 |
| 3.2.8 诱导剂种类和浓度对菌体生长和酶活的影响 |
| 3.2.9 诱导温度对菌体生长和酶活的影响 |
| 3.2.10 诱导时间对菌体生长和酶活的影响 |
| 3.2.11 初始pH对菌体生长和酶活的影响 |
| 3.2.12 摇瓶装液量对菌体生长和酶活的影响 |
| 3.2.13 接种量对菌体生长和酶活的影响 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 种子培养时间的确定 |
| 3.3.2 不同种类培养基对菌体生长以及产酶的影响 |
| 3.3.3 LB培养基成份优化 |
| 3.3.4 诱导剂种类和浓度对菌体生长和酶活的影响 |
| 3.3.5 诱导温度对菌体生长和酶活的影响 |
| 3.3.6 诱导时间对菌体生长和酶活的影响 |
| 3.3.7 初始pH对菌体生长和酶活的影响 |
| 3.3.8 摇瓶装液量对菌体生长和酶活的影响 |
| 3.3.9 接种量对菌体生长和酶活的影响 |
| 3.3.10 摇瓶发酵菌体生长和产酶曲线 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 静息细胞催化转化2-氨基-4-甲硫基丁腈制备蛋氨酸条件优化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌种及培养基 |
| 4.2.2 细胞培养条件 |
| 4.2.3 微生物转化反应及酶活定义 |
| 4.2.4 转化pH值对酶活的影响 |
| 4.2.5 水解酶的pH稳定性 |
| 4.2.6 转化温度对酶活的影响 |
| 4.2.7 水解酶的热稳定性 |
| 4.2.8 金属离子对腈水解酶活性的影响 |
| 4.2.9 底物浓度对水解酶活性的影响 |
| 4.2.10 产物添加量对底物转化速率的影响 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 转化体系pH值对酶活的影响 |
| 4.3.2 腈水解酶的pH稳定性 |
| 4.3.3 转化温度对酶活的影响 |
| 4.3.4 水解酶的热稳定性 |
| 4.3.5 金属离子对菌体酶活性的影响 |
| 4.3.6 底物添加量对酶活性的影响 |
| 4.3.7 不同浓度底物的转化进程 |
| 4.3.8 产物浓度对底物转化速率的影响 |
| 4.4 总结 |
| 参考文献 |
| 第五章 5L发酵罐产酶条件优化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌种及培养基 |
| 5.2.2 种子液培养 |
| 5.2.3 5L发酵罐初始培养条件 |
| 5.2.4 生物量测定 |
| 5.2.5 转化条件及酶活定义 |
| 5.2.6 葡萄糖的测定 |
| 5.2.7 初始葡萄糖浓度的优化 |
| 5.2.8 碳源补加对发酵的影响 |
| 5.2.9 氮源补加对发酵的影响 |
| 5.2.10 诱导时机和诱导剂浓度的优化 |
| 5.2.11 恒定pH补料对发酵的影响 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 葡萄糖标准曲线的测定 |
| 5.3.2 5L发酵罐分批发酵 |
| 5.3.3 选择分批补料发酵的依据 |
| 5.3.4 初始葡萄糖浓度的优化 |
| 5.3.5 碳源补加对发酵的影响 |
| 5.3.6 氮源补加对发酵的影响 |
| 5.3.7 诱导时机和诱导剂浓度的优化 |
| 5.3.8 恒定pH补料对发酵的影响 |
| 5.3.9 分批补料发酵稳定性实验 |
| 5.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 附录Ⅰ |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）低排放循环工艺生物转化法生产β-丙氨酸的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1.1 天冬氨酸家族主要氨基酸高产菌株的选育策略 |
| 1.1.1 L-苏氨酸 |
| 1.1.2 L赖氨酸 |
| 1.2 生物反应与分离耦合工艺在氨基酸领域的研究进展 |
| 1.2.1 生物反应与分离耦合过程的定义 |
| 1.2.2 生物反应与分离耦合过程的分类 |
| 1.2.3 生物反应与分离耦合中分离技术的选择 |
| 1.2.4 生物反应与分离耦合过程在氨基酸领域的分离技术及应用 |
| 1.2.5 生物反应与分离耦合过程在氨基酸领域的发展趋势 |
| 参考文献 |
| 第二章 优化重组大肠杆菌生产PanD酶发酵工艺的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 发酵培养基初始pH值对重组菌株产酶活力的影响 |
| 2.3.2 补料配方补加浓度的选择 |
| 2.3.3 最适补料时间的选择 |
| 2.3.4 不同培养条件下菌种发酵性能的比较 |
| 2.3.5 麦芽汁替代发酵培养基中麦芽糖的研究 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 转化反应体系及条件的优化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 转化反应底物溶液类型的选择 |
| 3.3.2 转化反应条件的优化 |
| 3.3.3 溶氧的控制对转化反应的影响 |
| 3.3.4 表面活性剂对转化反应的影响 |
| 3.3.5 无机盐离子对转化反应的影响 |
| 3.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 转化液中产物分离工艺的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 树脂处理类型的选择 |
| 4.3.2 吸附动力学曲线 |
| 4.3.3 初始浓度对树脂吸附的影响 |
| 4.3.4 温度对树脂吸附的影响 |
| 4.3.5 pH对树脂吸附影响 |
| 4.3.6 吸附流速 |
| 4.3.7 洗脱条件的优化 |
| 4.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 低排放循环转化工艺的研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 循环转化工艺装置的设计 |
| 5.3.2 循环转化过程废气废液的回用设计 |
| 5.3.3 循环体系中底物添加工艺的研究 |
| 5.3.4 循环转化反应体系中表面活性剂X对酶稳定性的研究 |
| 5.3.5 循环转化反应体系中酶活变化规律研究 |
| 5.3.6 732阳离子交换树脂重复利用性能的考察 |
| 5.3.7 低排放循环转化工艺综合条件利用研究 |
| 5.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 附录1. β-丙氨酸与L-天冬氨酸高效液相色谱检测法 |
| 攻读硕士学位期间主要科研成果 |
（8）高密度限氧酵母发酵木糖生产乙醇及其细胞应激乙醇耐受机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 国内外生物乙醇的发展 |
| 1.2.1 国外生物乙醇的研究 |
| 1.2.2 我国生物乙醇的研究 |
| 1.3 木质纤维原料制取乙醇的研究 |
| 1.3.1 木质纤维原料 |
| 1.3.2 木质纤维原料的预处理 |
| 1.3.3 纤维素和半纤维素的水解 |
| 1.3.4 葡萄糖和木糖的发酵 |
| 1.3.5 乙醇发酵工艺 |
| 1.3.6 乙醇的分离和回收 |
| 1.3.7 发酵产物的综合利用和发酵液的处理 |
| 1.4 发酵菌种的选育 |
| 1.4.1 自然发酵菌种 |
| 1.4.2 基因工程菌 |
| 1.5 高密度细胞技术在生物乙醇中的发展及应用 |
| 1.5.1 高密度细胞 |
| 1.5.2 高密度细胞培养及发展现状 |
| 1.5.3 影响高密度限氧发酵菌发酵木糖的因素 |
| 1.6 课题的提出、意义及主要内容 |
| 1.6.1 课题的提出及意义 |
| 1.6.2 主要的研究内容 |
| 1.7 本研究的创新之处 |
| 第二章 纤维乙醇工艺中酸处理秸秆反应条件的优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 原料 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 秸秆的预处理与酶解 |
| 2.2.2 二次回归优化预处理过程 |
| 2.3 分析方法 |
| 2.3.1 DNS法测定木糖含量 |
| 2.3.2 秸秆纤维结构分析 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 不同稀硫酸浓度对木糖含量影响 |
| 2.4.2 稀酸处理时间对秸秆水解木糖含量影响 |
| 2.4.3 液固比对酸处理秸秆中木糖含量影响 |
| 2.4.4 二次回归正交设计分析 |
| 2.4.5 预处理和酶解后秸秆原料的结构分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 高密度限氧酵母菌的培养 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 主要仪器和试剂 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.2 培养方法 |
| 3.2.1 种子培养 |
| 3.2.2 摇瓶增殖培养 |
| 3.2.3 摇瓶分批发酵 |
| 3.3 分析方法 |
| 3.3.1 细胞生长曲线测定 |
| 3.3.2 细胞干重测定 |
| 3.3.3 残糖浓度测定 |
| 3.3.4 乙醇浓度测定 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 高密度限氧酵母菌的培养 |
| 3.4.2 PH对高密度细胞发酵的影响 |
| 3.4.3 培养温度对高密度细胞发酵的影响 |
| 3.4.4 转速对高密度细胞发酵的影响 |
| 3.4.5 底物浓度对高密度细胞发酵的影响 |
| 3.4.6 限氧条件对高密度细胞发酵的影响 |
| 3.5 高密度限氧酵母菌发酵机理的初步探讨 |
| 3.5.1 氧及其传递与转速的关系 |
| 3.5.2 底物浓度与转速的关系 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 高密度限氧酵母菌发酵木糖 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 主要仪器和试剂 |
| 4.1.3 培养基 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 摇瓶增殖培养 |
| 4.2.2 摇瓶分批发酵 |
| 4.2.3 高密度酵母的循环利用 |
| 4.2.4 高浓度木糖发酵 |
| 4.2.5 高密度限氧酵母菌发酵水解液 |
| 4.3 分析方法 |
| 4.3.1 细胞干重测定 |
| 4.3.2 残糖浓度测定 |
| 4.3.3 乙醇浓度测定 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 高密度限氧酵母菌的循环发酵性 |
| 4.4.2 对比游离细胞的乙醇发酵能力 |
| 4.4.3 发酵高浓度木糖的能力 |
| 4.4.4 高密度限氧酵母菌发酵半纤维素水解液 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 高密度限氧酵母菌应激乙醇的耐受性机理 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株 |
| 5.1.2 主要仪器和试剂 |
| 5.1.3 培养基 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 摇瓶增殖培养 |
| 5.2.2 摇瓶测定酵母细胞的乙醇耐受性 |
| 5.3 分析方法 |
| 5.3.1 细胞干重测定 |
| 5.3.2 残糖浓度测定 |
| 5.3.3 乙醇浓度测定 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 外加乙醇对高密度细胞浓度的影响 |
| 5.4.2 外加乙醇对发酵残糖的影响 |
| 5.4.3 外加乙醇对细胞产乙醇能力的影响 |
| 5.4.4 对比游离细胞的乙醇耐受性 |
| 5.5 高密度限氧酵母菌应激乙醇的耐受性机理 |
| 5.5.1 乙醇对酵母细胞生理的影响 |
| 5.5.2 细胞的乙醇耐受性与结构相关 |
| 5.5.3 细胞乙醇耐受性与基因有关 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士研究生期间发表的文章 |
| 致谢 |
（9）氨基酰化酶产生菌米曲霉发酵条件的优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 氨基酰化酶 |
| 1.2.1 氨基酰化酶概述 |
| 1.2.2 氨基酰化酶的结构 |
| 1.2.3 氨基酰化酶的性质 |
| 1.2.4 氨基酰化酶的来源 |
| 1.2.5 氨基酰化酶的国内外研究概况 |
| 1.3 米曲霉 |
| 1.3.1 米曲霉简介 |
| 1.3.2 米曲霉发酵主要产物及其应用 |
| 1.3.3 工业发酵中米曲霉的主要应用 |
| 1.4 发酵 |
| 1.4.1 固体发酵法 |
| 1.4.2 液体深层发酵法 |
| 1.4.3 固定化细胞发酵法 |
| 1.5 正交试验 |
| 1.6 本文研究的主要内容 |
| 第二章 实验设备及药品 |
| 2.1 实验所需设备 |
| 2.1.1 主要设备 |
| 2.1.2 其他设备器材 |
| 2.2 实验药品试剂 |
| 2.2.1 实验药品 |
| 2.2.2 实验溶液 |
| 2.2.3 实验菌种 |
| 2.2.4 实验所用培养基的配制 |
| 第三章 标准曲线及酶活的测定 |
| 3.1 测定标准曲线 |
| 3.1.1 茚三酮显色法测定氨基酸含量的原理 |
| 3.1.2 实验药品与器材 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.1.5 实验数据 |
| 3.2 酶活测定方法 |
| 3.2.1 氨基酰化酶酶活的测定原理 |
| 3.2.2 待测液的制备及测定 |
| 3.2.3 酶活的计算 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 实验讨论 |
| 第四章 培养基组成对米曲霉产氨基酰化酶的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 碳源种类和浓度的选择 |
| 4.2.2 氮源种类和浓度的选择 |
| 4.2.3 磷酸盐种类和浓度的选择 |
| 4.2.4 镁离子对米曲霉产氨基酰化酶的影响 |
| 4.2.5 表面活性剂对米曲霉产氨基酰化酶的影响 |
| 4.2.6 底物对米曲霉产氨基酰化酶的影响 |
| 第五章 培养条件对米曲霉产氨基酰化酶的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 接种量对米曲霉产氨基酰化酶的影响 |
| 5.2.2 时间对米曲霉产氨基酰化酶的影响 |
| 5.2.3 pH 值对米曲霉产氨基酰化酶的影响 |
| 5.2.4 温度对米曲霉产氨基酰化酶的影响 |
| 5.2.5 溶氧量对米曲霉产氨基酰化酶的影响 |
| 第六章 采用正交试验优化培养基 |
| 6.1 试验因素及水平 |
| 6.2 正交试验结果 |
| 第七章 诱变前后米曲氨基酰化酶表达量的研究 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 菌种 |
| 7.1.2 原料 |
| 7.1.3 仪器 |
| 7.1.4 试验溶液 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 培养基 |
| 7.2.2 斜面培养 |
| 7.2.3 发酵培养 |
| 7.2.4 氨基酰化酶的提纯和结构测定 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 第八章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）嗜热脂肪芽孢杆菌氨基酰化酶基因在大肠杆菌中的克隆，表达及细胞固定化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1.1 氨基酸的研究历史与应用 |
| 1.1.1 氨基酸的研究历史 |
| 1.1.2 氨基酸的应用 |
| 1.1.3 蛋氨酸的研究 |
| 1.2 氨基酰化酶 |
| 1.2.1 氨基酰化酶的结构与性质 |
| 1.2.2 氨基酰化酶的来源 |
| 1.2.3 氨基酰化酶的制备方法 |
| 1.3 酶和菌体的固定化 |
| 1.3.1 酶和细菌的固定化方法 |
| 1.3.2 菌体的固定化 |
| 1.3.3 固定化酶的酶学性质 |
| 1.3.4 固定化酶的应用 |
| 1.4 本研究目的和研究工作 |
| 第二章 嗜热脂肪芽孢杆菌氨基酰化酶基因在E.coli中的克隆和表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌种、载体和试剂 |
| 2.2.2 培养基、试剂和抗生素 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细菌基因组DNA的抽提 |
| 2.3.2 PCR扩增 |
| 2.3.3 核酸琼脂糖凝胶电泳与DNA片段的胶回收 |
| 2.3.4 amaA基因在pMD-18T载体上的克隆 |
| 2.3.5 质粒的抽提 |
| 2.3.6 amaA-pET-28a(+)表达载体的构建 |
| 2.3.7 转化 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 PCR嗜热脂肪芽孢杆菌氨基酰化酶amaA基因 |
| 2.4.2 氨基酰化酶amaA基因DNA片段鉴定 |
| 2.4.3 重组表达载体的构建 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 含amaA酶基因的E.coli工程菌的诱导表达条件研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌种和质粒 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 样品的预处理 |
| 3.3.2 蛋白质SDS-PAGE电泳 |
| 3.3.3 蛋白浓度的测定 |
| 3.3.4 酶活的测定 |
| 3.3.5 诱导表达条件的优化研究 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 SDS-PAGE蛋白电泳结果 |
| 3.4.2 蛋白标准曲线的制作 |
| 3.4.3 L-蛋氨酸标准曲线 |
| 3.4.4 amaA基因在E.coli工程菌中的诱导表达结果 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 含amaA基因的E.coli工程菌的固定化及其酶学性质研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌种 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 大肠杆菌湿菌体的获得 |
| 4.3.2 菌体的直接固定化 |
| 4.3.3 酶反应进程曲线的制作 |
| 4.3.4 反应初速度和底物浓度关系的研究 |
| 4.3.5 温度对酶活性的影响 |
| 4.3.6 pH对酶活性的影响 |
| 4.3.7 酶的热稳定性 |
| 4.3.8 pH稳定性 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 含amaA-pET28a(+)的E.coli工程菌的固定化 |
| 4.4.2 氨基酰化酶的酶学性质研究 |
| 4.4.3 固定化菌体细胞的操作稳定性和保存稳定性研究 |
| 4.5 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、工程菌固定化细胞生产L-蛋氨酸完成中试（论文参考文献）
- [1]重组微生物全细胞催化高效合成丙谷二肽[D]. 李益民. 大连理工大学, 2020(07)
- [2]系统代谢工程改造大肠杆菌生产L-蛋氨酸[D]. 李华. 江南大学, 2017(01)
- [3]生物酶法制备手性氨基酸及其衍生物研究[D]. 王治元. 南京大学, 2013(01)
- [4]酶法合成色氨酸和非天然氨基酸及其催化机理研究[D]. 徐礼生. 南京大学, 2013(01)
- [5]腈水解酶催化生产蛋氨酸的研究[D]. 吴丛伟. 浙江工业大学, 2013(03)
- [6]生物法生产蛋氨酸的研究[D]. 党万利. 浙江工业大学, 2012(07)
- [7]低排放循环工艺生物转化法生产β-丙氨酸的研究[D]. 吴瑶瑶. 浙江工业大学, 2012(06)
- [8]高密度限氧酵母发酵木糖生产乙醇及其细胞应激乙醇耐受机理的研究[D]. 黄丽霖. 湖南工业大学, 2011(07)
- [9]氨基酰化酶产生菌米曲霉发酵条件的优化[D]. 王霞. 内蒙古工业大学, 2010(04)
- [10]嗜热脂肪芽孢杆菌氨基酰化酶基因在大肠杆菌中的克隆，表达及细胞固定化研究[D]. 苏志鹏. 复旦大学, 2009(02)