一、Development of Transgenic Cotton Resistant to Fungal Diseases and of Mutants by T-DNA Insertional Mutagenesis（论文文献综述）
王彩云,侯俊,周茂嫦,徐庆祝,张翔宇,阮培均[1]（2021）在《天麻抗真菌蛋白研究进展》文中指出天麻抗真菌蛋白是从我国传统中草药天麻中分离到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白质,对许多植物病原菌具有很强的抑制作用。该研究综述了天麻抗真菌蛋白的特性、作用机理、GAFP基因克隆、表达载体构建、转基因研究等内容,以期为天麻抗真菌蛋白的开发及综合利用提供参考。
吴朝峰[2]（2020）在《棉花腺体形成相关基因GhERF105的功能分析》文中研究说明棉花是世界上最重要的经济作物之一,棉籽是纤维和蛋白的重要来源。然而,存在于色素腺体的棉酚毒素限制了棉籽的开发利用,长时间食用棉酚,会引起人和单胃动物消化系统的代谢紊乱。同时,棉酚又是棉花体内特有的天然毒素,能提高棉株对某些真菌、病害和虫害的拮抗作用。因此,挖掘色素腺体发生的相关基因、解析腺体形成的分子机制、选育低酚棉品种一直是育种家孜孜追求的目标和方向。基于棉花色素腺体2套近等基因系叶片转录组数据比较分析,我们获得了一个差异表达的AP2/ERF转录因子,命名为Gh ERF105。为了探究其功能,通过生物信息学、基因表达、乙烯诱导、VIGS、酵母单（双）杂等方法对其进行分析。主要研究结果如下:（1）Gh ERF105基因编码区全长711bp,编码236个氨基酸。蛋白质分子量为26.26k Da,理论p I 7.72。二级结构预测存在α-螺旋（22.88%）,β-转角（3.81%）,延伸链（13.14%）和无规则卷曲（60.17%）。Gh ERF105蛋白在第91-155个氨基酸之间存在1个AP2结构域。亚细胞定位预测Gh ERF105可能位于细胞核。进化树分析显示Gh ERF105蛋白与海岛棉、亚洲棉、陆地棉和雷蒙德氏棉中的同源蛋白的相似性较高,说明该类蛋白在棉属的进化中比较保守。（2）利用荧光定量PCR对无腺体和有腺体棉花材料及不同组织部位中Gh ERF105基因的表达情况进行分析。结果表明,Gh ERF105基因在有腺体陆地棉品种中棉所12、17、辽7和陆地棉遗传标准系TM-1的叶片和茎中相对表达量均高于显性无腺体品种中棉所12、辽7和隐性无腺体品种中棉所12、17。同时,该基因在有腺体陆地棉中棉所12子叶、真叶、叶柄、下胚轴、茎、花萼、花瓣及铃壳等部位的相对表达量明显高于无腺体棉中棉所12。推测Gh ERF105基因可能与腺体形成有关。（3）利用VIGS技术对Gh ERF105基因进行功能分析,发现Gh ERF105基因沉默后,有腺体中12植株新生的叶片腺体数目大幅度减少和棉酚含量降低。证明Gh ERF105基因参与叶片腺体形成和棉酚合成。（4）将Gh ERF105和GFP蛋白融合构建p BI121-Gh ERF105-GFP表达载体,将其注射烟草叶片进行亚细胞定位,结果发现Gh ERF105-GFP蛋白在烟草细胞核中表达。利用酵母单杂交实验证明Gh ERF105基因能够特异性识别和结合靶基因启动子上的GCC-box和DER作用元件,表明Gh ERF105是一个典型的ERF转录因子。（5）以有腺体陆地棉品种中棉所12和显性无腺体品种中棉所12为材料,克隆了Gh ERF105基因上游2000 bp的启动子序列并对其进行初步分析,生物信息学分析表明,Gh ERF105基因启动子序列中含有大量的TATA-box和CAAT-box保守元件,以及光调控元件,ABRE,ARE,ERE,GCN4-motif,TC-rich repeats等多个顺式作用元件。诱导表达分析表明Gh ERF105明显受乙烯利诱导上调表达,在喷施乙烯利8 h后,Gh ERF105表达量达到最高值,表明Gh ERF105基因参与到乙烯信号转导途径。（6）构建酵母诱饵表达载体p DHB1-Gh ERF105,并对其进行自激活和毒性检测。结果显示,诱饵蛋白Gh ERF105不能单独启动NMY51菌株中报告基因表达,并且对酵母细胞无毒性。通过酵母双杂交实验共筛选到52个可能与Gh ERF105互作的蛋白,挑选出7个蛋白质再次进行共转验证和α-galactosidase检测,结果表明这7个蛋白质均与Gh ERF105蛋白互作。同时,采用双分子荧光互补试验进一步确认了互作结果。综上所述,Gh ERF105基因可能通过乙烯信号通路来参与棉花色素腺体的形成,为解析棉花腺体形成的分子机制提供理论依据,为培育新的低酚棉品种提供候选基因和辅助筛选标记。
秦涛[3]（2019）在《GhPUB17在棉花抗黄萎病中的功能鉴定》文中进行了进一步梳理黄萎病是造成世界棉花产量和品质降低的主要病害之一。研究棉花抗病机制,鉴定抗病基因可为棉花抗病分子育种提供理论基础和基因资源。在植物抗病过程中,多种蛋白质、酶的相互合作,共同完成了植物抗病信号的产生和传递。泛素化修饰系统是真核生物体内主要的蛋白质调控路径,广泛参与了对生物体内大多数蛋白质的修饰降解行为。近年来研究发现,众多E3泛素连接酶参与了不同物种对相应病原菌的抗性调节。本研究对棉花一个参与抗黄萎病调控的E3泛素连接酶基因的功能进行了研究,并对棉花中PUB基因家族进行了聚类分析,取得的主要结果如下:1.序列分析表明,我们获得的对棉花黄萎病有响应的E3泛素连接酶基因与拟南芥中具有免疫调节作用的PUB17具有较高的同源性,故命名为GhPUB17。表达分析发现利用棉花黄萎病菌株V991,植物抗生物逆境相关激素SA和MeJA体外处理棉花幼苗后,提取总RNA检测GhPUB17表达水平,结果发现GhPUB17均被诱导上调表达。鉴于此结果,我们对其在棉花中的表达量进行了调控,详细研究其抗黄萎病功能。2.通过病毒介导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）及RNAi干涉技术抑制GhPUB17在棉花中的表达,棉花植株对黄萎病菌的抗性得以增强。超量表达GhPUB17后,转基因棉花材料对黄萎病的抗性明显弱于野生型对照及抑制GhPUB17基因表达的材料。接种灰霉病原菌后发现,所有棉花材料对该病原的抗性无显着性差异,表明GhPUB17可能特异性参与了棉花对黄萎病的抗性调控。3.使用qRT-PCR方法检测GhPUB17各种转基因株系材料接种黄萎病菌后抗病相关基因的表达变化。结果发现JA和SA信号路径标志基因在各个取样时间点的表达趋势一致,不因GhPUB17株系不同而存在差异,这说明GhPUB17在棉花抗病信号网络中的作用位置可能独立于SA和JA信号路径。4.通过蛋白互作实验鉴定到棉花亲环素GhCyP3可以与GhPUB17互作。通过VIGS方法抑制GhCyP3表达后接种V991,发现棉苗的抗病性降低,表明其在棉花抗黄萎病过程中具有正向调控作用。进一步研究发现GhCyP3蛋白能够抑制GhPUB17的E3泛素连接酶活性。此外本研究还发现,GhCyP3蛋白本身具有抗菌肽活性,体外培养状态下可有效抑制黄萎病菌孢子的增殖。这些结果证明GhCyP3在棉花抗黄萎病方面存在多重调控作用。5.为了本课题后续对PUB基因家族成员的功能进行系统性分析,我们对棉花基因组中的PUB基因进行了检索。以拟南芥的PUB基因序列为参考,我们在陆地棉基因组中BLAST比对发现了77个PUB基因家族成员。聚类分析后发现,这77个基因可分为14类。通过对棉花组织表达与黄萎病菌诱导表达转录组数据的分析,我们发现这些基因在棉花各组织差异表达,且其表达量受黄萎病菌诱导。我们从已发表的267份棉花栽培品种的重测序数据中选取了124份,并调查了这些棉花材料对黄萎病的抗性数据。同时我们分析了这124份材料基因组中PUB基因的变异情况,并将其与材料的抗性相关联,发现部分PUB基因编码区与启动子区域的SNP与InDel位点可能与棉花对黄萎病的抗性相关联。以上研究结果证明棉花E3泛素连接酶GhPUB17负调控棉花抗黄萎病,但亲环素GhCyP3可以抑制GhPUB17活性,并抑制病原菌生长,同时PUB基因家族的其他成员可能也参与了棉花对黄萎病的免疫调控。这为棉花抗病分子育种提供了理论基础和基因资源。
付健美[4]（2018）在《通过基因差异表达及蛋白互作研究抗虫转基因水稻在不同环境条件下的非预期效应》文中认为限制转基因水稻商业化种植的一个重要因素是其环境安全问题,其中转基因水稻逃逸出农田生态系统后,能否在自然生态系统中持续存在下去甚至进一步扩散,是转基因水稻商业化种植必须解决的环境安全问题之一。抗虫转基因水稻在农田生态系统中的适合度及转录组水平上的基因差异表达已有较多研究和报道,但是对其在自然生态系统中的适合度及其基因差异表达、蛋白互作尚未见报道。本研究以商业化潜力较大的转cry1Ab/c水稻华恢1号（HH1）、转cry1 C*/bar基因水稻TIC-19及其亲本水稻明恢63（MH63）为材料,模拟自然生态系统中的杂草竞争、荒地土壤、盐碱土壤条件:（1）研究了其在上述不同种植条件的适合度;（2）利用组学技术研究转cry1C*/bar基因水稻T1C-19在杂草竞争和荒地土壤条件下的基因差异表达;（3）探索了 HH1表达的外源蛋白Cry1Ab/c与水稻内源蛋白的相互作用、外源Cry1Ab/c蛋白的细胞膜定位及其与水稻内源膜蛋白的相互作用,以及外源Cry1Ab/c蛋白与水稻开花蛋白的互作。本研究结果可为抗虫转基因水稻华恢1号、TIC-19的商品化种植提供环境安全方面的科学依据。具体结果如下:1.模拟不同自然条件下抗虫转基因水稻华恢1号和T1C-19的适合度本研究以抗虫转基因水稻HH1、T1C-19为研究材料,模拟了其在不同自然条件下抗虫转基因水稻HH1和T1C-19的株高、分蘖数、地上干生物量等营养生长指标和单株饱粒数、单株饱粒重等生殖指标以及外源Bt蛋白的表达量:在模拟农田土壤和盐碱土壤条件下,盐碱土壤条件的2个外源Bt蛋白的表达量均较农田土壤条件更低。对于转基因水稻HH1,相同土壤条件下的分蘖数以及生物量等营养生长指标和单株饱粒数、单株饱粒重等生殖指标均显着低于亲本水稻MH63,呈现现出显着的适合度代价,同时这种适合度代价在盐碱土壤条件更为明显。对于转基因水稻T1C-19,其在农田土壤条件下的株高、分蘖数以及生物量等营养生长指标和单株饱粒数、单株饱粒重等生殖生长指标均显着低于亲本水稻MH63;盐碱土壤条件下,T1C-19仅分蘖数及生物量显着低于亲本水稻MH63,其余营养生长指标与亲本水稻MH63没有显着差异,但是单株饱粒数、单株饱粒重等生殖生长指标显着高于亲本水稻MH63。另外,在农田土壤条件和盐碱土壤条件下,HH1较MH63的抽穗期平均延迟了12d和25d,T1C-19与MH63的抽穗期相似。在模拟无杂草竞争的荒地土壤、杂草竞争的农田土壤和杂草竞争的荒地土壤3种胁迫种植条件下,转基因水稻HH1、T1C-19的外源Bt蛋白的表达量显着低于无杂草竞争的农田土壤条件。对于HH1,在无杂草竞争的农田和荒地土壤条件下,除株高外,分蘖数、叶面积、叶SPAD值以及生物量等营养生长指标和单株饱粒数、单株饱粒重等生殖指标均显着低于亲本水稻MH63,呈现出显着适合度成本。在杂草竞争的农田和荒地土壤条件下,HH1的株高、分蘖数、生物量等营养生长指标与MH63没有显着差异,但单株饱粒数、单株饱粒重以及结实率显着高于亲本水稻MH63。对于T1C-19,在无杂草竞争的农田和荒地土壤条件下,分蘖数、叶面积、叶SPAD值以及生物量等营养生长指标和单株饱粒数、单株饱粒重等生殖能力均显着低于亲本水稻MH63。然而在杂草竞争的农田和荒地土壤条件下,T1C-19的株高、分蘖数、地上部干生物量等营养生长指标及单株饱粒数、单株饱粒重以及结实率均与亲本MH63水稻没有显着差异。2.杂草竞争和荒地土壤种植条件下抗虫转基因水稻T1C-19的基因差异表达以转基因水稻T1C-19及其亲本水稻MH63为研究材料,在模拟无杂草竞争的农田和荒地土壤和杂草竞争的农田和荒地土壤4种种植条件下,通过测定水稻的转录组和蛋白组,研究了其基因差异表达:转录组测序结果表明:4种种植条件下,与MH63相比,T1C-19总计有3786个差异基因,其中150个为共有差异基因,占整个水稻转录组的0.4%,分析这些共有差异基因由外源基因插入引起。另外对于T1C-19和MH63,与无杂草竞争的农田土壤（对照）相比,无杂草竞争的荒地土壤条件的差异基因数量分别为1084个和1234个,杂草竞争的农田土壤条件的差异基因数量为963个和1226个,杂草竞争的荒地土壤条件的差异基因数量为1053个和1505个,总计有2743和2200个,占水稻整个转录组的8.50%和6.86%,该结果表明种植条件对水稻的基因表达有显着影响,且显着高于外源基因插入对水稻的基因表达影响。上述与外源基因插入相关的150个共有差异基因可以显着富集到植物的光合作用（Lhb1、Lhcb2、Lhcb3和Lhcb5）、光反应的节律变化（FKF1、PRR）、植物细胞内吞作用及植物细胞凋亡信号通路中（HSP70）。采用qPCR技术验证了显着富集在这4条通路中的7个共有差异基因在T1C-19和MH63中的mRNA表达量发现,在上述4种种植条件下T1C-19均较MH63显着下调,与转录组测序结果一致。采用双分子荧光互补技术证实了外源Cry1C*蛋白可与该4条通路上的光合天线蛋白Lhb1等6个共有差异基因表达的内源蛋白互作。另外,尽管转基因水稻T1C-19与亲本水稻MH63在3种不同胁迫种植条件下的差异表达基因数目和表达量均有一些差异,却能显着富集到相似的功能通路中,推测外源cry1C*/bar基因插入可能并不会显着改变转基因水稻T1C-19对胁迫种植条件的适应性。蛋白组测序结果显示:4种种植条件下,与MH63相比,T1C-19总计有2177个差异蛋白,其中121个为共有差异蛋白,占整个水稻蛋白组的1.7%,分析这些共有差异蛋白由外源基因插入引起。对于T1C-19和MH63,与无杂草竞争的农田土壤条件相比,无杂草竞争的荒地土壤条件的差异蛋白数量分别为411个和300个,杂草竞争的农田土壤条件的差异蛋白数量为662个和430个,杂草竞争和荒地土壤复合条件下的差异蛋白数量为309个和375个,总计有1028个和839个,占水稻整个蛋白组的15.52%和11.87%,该结果表明种植条件对水稻内源蛋白的表达有显着影响,且远远高于外源基因对水稻内源蛋白表达的影响。对这些共有的差异表达蛋白在生物学功能分类上进行KEGG通路分析,结果显示:T1C-19与MH63相比,121个差异表达蛋白仅显着富集到叶绿体的核糖体参与的信号通路中。另外,尽管转基因水稻T1C-19与亲本水稻MH63在3种不同胁迫种植条件下的差异表达蛋白数目和表达量均有一些差异,却能显着富集到相似的功能通路中,推测外源cry1C*/bar基因插入可能并不会显着改变转基因水稻T1C-19对胁迫种植条件的适应性。3.抗虫转基因水稻华恢1号外源Cry1Ab/c蛋白与水稻内源蛋白互作的研究以转基因水稻华恢1号为研究材料,用酵母双杂交技术筛选到了可能与Cry1Ab/c蛋白互作的抗逆反应类、氧化还原反应类（主要光合作用）、物质代谢类以及其他未知功能的水稻内源蛋白60个,并用亚细胞共定位、双分子荧光互补、免疫共沉淀技术验证了 6个光合作用内源蛋白、9个抗逆反应内源蛋白与外源Cry 1Ab/c蛋白发生互作的真实性。采用原位免疫组化、免疫荧光、细胞膜蛋白和细胞质蛋白分离的Western blot技术以及亚细胞定位技术,以水稻和烟草叶片为材料,发现外源Cry1Ab/c蛋白主要定位于细胞膜内膜上,并可以与细胞膜蛋白V-H+-ATPase和Ca2+-ATPase发生相互作用。采用酵母双杂交、亚细胞共定位、双分子荧光互补、免疫共沉淀技术研究了外源Cry1Ab/c蛋白与水稻5个抽穗期主效蛋白的互作,发现HH1外源Cry1Ab/c蛋白仅与水稻抽穗期核心主效蛋白成花素Hd3a间存在相互作用,且Hd3a的mRNA转录水平较MH63显着下调,均可能在转基因水稻HH1抽穗期推迟中起关键作用。
曾旋睿[5]（2017）在《大豆品质改良相关基因GmAGL1,GmDof11和GmDof4的遗传转化研究》文中提出大豆（Glycine max（L.）Merri.）既是重要的粮食和经济作物,又是油料和饲料的重要来源。随着大豆需求量逐年增大,我国大豆消费越来越多的依赖进口,这对我国农业生产和国家粮食安全构成了潜在的威胁。因此,研究大豆增产和品质改良相关机理,自主培育高产优质的大豆新种质,提升我国大豆产业国际竞争力,是大豆产业相关研究人员的重要目标。转基因技术作为一种有效的种质创新和品种改良方法,已经应用在许多作物中,并得到了 一些优良品种。目前大豆转基因方法以根瘤农杆菌介导法和基因枪法为主,经过多年的改良,这两个体系已经趋向成熟。通过转基因可以对大豆种子成分如蛋白质和氨基酸组成、油脂含量和构成,以及异黄酮、大豆皂苷、肌醇等生理活性成分进行改良,还可以增强大豆的生物和非生物胁迫抗性。目标基因的选择是大豆转基因工作中的重要部分。转录因子（transcription factor）是一组通过调节下游靶基因的表达调控细胞进程的基因。它们能够与目的基因发生特异性结合并对转录有激活或抑制作用,对转录调控网络的构建至关重要。MADS-box基因家族和Dof基因家族都是大豆中重要的转录因子家族,参与调控植物生长发育的许多生理生化进程。MADS-box转录因子在植物生长和发育,特别是生殖器官的发育中起着重要的作用。大豆的生殖生长与产量密切相关,MADS-box基因很有可能对大豆种子产量和种子成分具有重要影响。Dof转录因子参与光响应和与光周期相关的开花调控、花器官发育、种子发育、植物储藏物质合成以及次生代谢物合成及防御反应等多种生物学过程,也与种子的生长发育密切相关。因此,我们在这两个基因家族中选择了几个基因进行遗传转化研究,主要研究结果如下:（1）基因型的限制是大豆转化率低下的重要原因,因此选择合适的大豆基因型作为受体,是提高转化效率的关键。本研究首先利用GUS基因在植物体中瞬时表达的特点,对约40个不同基因型大豆种质材料的农杆菌敏感性进行了比较,再结合大豆种子的发芽率、不定芽再生效率、增殖系数以及对不同大豆基因型对筛选剂的敏感性等因素,筛选适宜的受体基因型。在此基础上,以带有MADS-box家族基因GmSEP3的pMDC83-GmSEP3为载体,用筛选出的大豆基因型作为受体材料进行遗传转化试验以验证筛选结果。研究结果表明,不同基因型的大豆材料对根瘤农杆菌的敏感性差异较大。在本研究涉及的品种中,对农杆菌较敏感（GUS瞬时表达较高）且再生、增殖效率较高的品种有:猴子毛、88-1、Jack、Williams、大粒黄。在不同的筛选条件下,不同基因型的材料敏感性存在较大差异,在实际实验操作中,应根据筛选剂来选择适合的受体。本实验中筛选得到的五个大豆基因型都可以成功转入pMDC83-GmSEP3,为日后的遗传转化研究提供了更多受体选择。（2）将从大豆花中分离出的MADS-box基因GmAGL1转入大豆中进行功能研究,结果发现GmAGL1表达量高的转基因植株不仅提前开花和成熟,并且花瓣发育也受到影响。在长日照条件下,GmAGL1过表达植株比短日照条件下提前开花的现象更为显着。转录组分析发现光受体基因CRY2和部分昼夜节律基因下调表达,以及开花促进基因LHY、GI和花发育相关基因LFY、SEP1、SEP3、AP1、FUL上调表达,共同促进了转基因大豆开花。而其他开花调节途径:春化途径、GA途径和自主途径的相关基因表达差异都比较小。这些结果表明GmAGL1过表达对开花的促进作用主要通过光周期途径完成。过表达GmAGL1转基因植株提前开花、生育期缩短,但转基因大豆的产量和油脂、蛋白含量并没有减少,这对生产轮作具有积极意义。（3）以GmCAX1作为选择标记基因进行大豆遗传转化。GmCAX1基因可以编码一种阳离子/质子反向运输体,有利于调节离子平衡,从而降低植物对离子的敏感程度,经验证具有耐Li+作用,有希望作为一种新型的标记基因来使用。我们以GmCAX1为抗性标记将Dof转录因子GmDof11转化大豆,获得了耐LiCl的转基因植株,并建立了一种通过水培处理筛选和鉴定转基因后代的方法。经水培筛选得到的存活转基因植株经转基因检测全部为阳性。过表达GmDof11提高了大豆种子油脂的含量,蛋白质含量没有降低,暗示GmDof11可能在大豆种子储藏物质的形成方面发挥作用。（4）通过在大豆品种Jack和猴子毛中过表达Dof转录因子GmDof4,得到多个阳性植株。对GmDof4表达量高的转基因植株进行表型分析发现,在两个受体品种中,过表达GmDof4基因都可以显着增加分枝数、分枝长度,并因此提高了结荚数、种子数和单株产量。对转基因种子的油脂和蛋白含量进行分析发现,与野生型受体相比,转基因大豆种子中的油脂含量显着提高,储藏蛋白含量下降。在大豆中过表达GmDof4提高大豆产量和种子油脂含量,在生产上具有重要意义,也为我们深入研究GmDof4基因在大豆中的功能提供了实验材料和研究方向。
聂萍萍[6]（2017）在《miR825/825*在蜡质芽孢杆菌AR156介导的系统抗病性及OsAGO2在水稻稻瘟病抗性中的功能研究》文中研究指明蜡质芽孢杆菌AR156是一株植物根围促生细菌,可以诱导植物对病原物产生广谱抗病性,其中最主要的是诱导系统抗病性（induced systemic resistance,ISR）。ISR是由根围有益微生物介导的系统诱导抗病性,它对病原菌并没有直接的杀死或抑制作用,而是通过诱导植物的抗病反应来达到防治病害的目的。小分子RNA广泛参与调控植物的免疫反应,但它在AR156诱导的拟南芥对灰霉病菌（Botrytis cinerea）的系统抗病性中的作用尚不清楚。小分子RNA是必须与Argonatue蛋白（AGOs）结合发挥作用,才能调控靶标基因的沉默。因此研究AGOs在抗病性中的作用及其机制对于阐述小分子RNA在其中的功能具有重要意义。本论文的主要目的是研究miR825/825*在蜡质芽孢杆菌AR156介导的ISR中的作用机制。因此在拟南芥中,对影响ISR的miR825/825*进行了详细的功能分析;在水稻中,对OsAGO2缺失突变体的稻瘟病抗病性表型进行了细致分析,并对OsAGO2互作蛋白进行了筛选和鉴定。主要研究内容包括:一、AR156介导拟南芥对灰霉病的诱导系统抗病性研究。诱导抗病反应是植物响应病原菌侵染的一种有效的植物防卫反应。前期研究发现蜡质芽孢杆菌AR156能够诱导拟南芥产生对丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000（Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000）的系统抗病性。灰霉菌（Botrytis cinerea）是一种死体营养型病原菌,能引起灰霉病,是一种世界性的重要病害。然而,AR156是否介导拟南芥对灰霉病菌的诱导抗病性还是未知的。本研究发现通过对拟南芥根部灌根AR156预处理后,可诱导拟南芥产生有效的ISR增强植物的抗病免疫反应。这种保护机制是通过AR156灌根预处理和灰霉菌侵染后产生了有效的ISR防卫反应,例如PR1蛋白的积累、活性氧的积累和胼胝质的沉积。本研究还发现,在sid2-2缺失突变体和NahG过表达株系中,AR156能诱导拟南芥产生有效的ISR来抵抗灰霉菌的侵染;而在jar1,ein2和npr1三种缺失突变体中,AR156丧失了对灰霉菌的诱导抗病能力。本研究表明了 AR156介导的ISR是依赖于JA/ET信号通路和NPR1,而不依赖于SA信号通路。此外,本研究也发现用AR156预处理的植物能快速增强MAPK信号级联反应,以及FRK1和WRKY53基因的表达,它们都是参与PTI反应的关键因子。这些研究结果表明,AR156介导的ISR是依赖于JA/ET信号通路和NPR1,并且激活PTI参与拟南芥抗灰霉病的免疫反应。二、miR825/825*在AR156诱导的拟南芥系统抗病性中的作用。为了分析小分子RNA在AR156诱导植物系统抗病性中的作用机制,前期研究发现miR825/825*在AR156诱导拟南芥产生对Pst DC3000的系统抗病性过程中起负调控作用。然而,在AR156介导拟南芥产生对灰霉病菌的诱导抗病性过程中miR825/825*会起到什么样的作用还是未知的。为了研究植物内源miR825/825*在调控植物诱导抗病性的机理,本研究通过对 Col-0（野生型）、miR825/825*OE（过表达）、miR825/825*STTM（功能抑制）等转基因株系进行了致病性测定、防卫相关基因的表达、ROS积累和胼胝质沉积检测,发现miR825/825*功能抑制突变体表现出对病原真菌灰霉病菌的抗病性,与此相反,miR825/825*过表达株系对灰霉病菌更敏感。此外,本研究通过Western blot和qRT-PCR检测了 MPK6和MPK3蛋白的表达,以及防卫相关基因的表达情况,分析结果显示miR825/825*参与调控AR156激活的PTI。这些研究结果表明在拟南芥中,AR156可以通过抑制miR825和miR825*的表达,引起其靶标基因的上调,从而激活植物体自身的防卫反应,诱导植物产生系统抗病性。三、OsAGO2参与调控水稻对稻瘟病的免疫反应。本研究发现OsAGO2在稻瘟病菌亲和菌株Guy11侵染后被显着诱导表达,在稻瘟病菌非亲和菌株JS153侵染后被显着抑制表达。osago2缺失突变体株系对亲和菌株Guy11的抗病能力、活性氧积累量和胼胝质的沉积明显增强,而对非亲和菌株JS153的抗病能力、活性氧积累量和胼胝质的沉积明显减弱。从而说明OsAGO2参与调控水稻抗稻瘟病的免疫反应。然而,为了进一步探究OsAGO2在响应水稻对稻瘟菌的免疫反应过程中依赖的具体信号通路。通过利用荧光定量PCR检测了稻瘟菌侵染osago2缺失突变体中的水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）信号通路相关防卫基因的表达情况。发现在亲和菌株Guy11侵染后SA合成和信号通路相关基因被显着诱导表达,在非亲和菌株JS153侵染后则呈现相反的趋势;JA合成和信号通路相关基因的表达量变化相对较弱。由于SA是植物先天免疫反应的一个重要信号分子,受活体和半活体病原菌的侵染诱导产生,是PAMP诱导的免疫（PTI）、效应因子诱导的免疫（ETI）及系统获得抗病性（SAR）的重要组成部分。因此本研究进一步检测了分别在Guy11和JS153侵染不同时间段后,水稻日本晴（NPB）和osago2缺失突变体中SA和SAG的含量。通过研究发现在Guy11侵染条件下,与NPB相比,osago2缺失突变体中的SA和SAG的含量均显着增加;而在JS153侵染条件下,与NPB相比,osago2缺失突变体中的SA和SAG的含量均显着减少。这些结果表明OsAGO2在参与调控水稻抗稻瘟病的免疫反应过程中主要是依赖SA信号通路的。四、OsAGO2互作蛋白的筛选与鉴定。为了分析OsAGO2介导的RNA沉默信号通路及分子机制,本研究分别利用酵母双杂交和亲和纯化的方法对水稻OsAGO2的互作蛋白进行筛选。本文首先利用酵母双杂交系统以OsAGO2为诱饵蛋白,筛选水稻日本晴cDNA文库,从而获得与OsAGO2互作的蛋白OsPAL1;其次,利用亲和纯化的方法来筛选OsAGO2物理互作的蛋白。通过质谱分析,鉴定到了一系列候选蛋白,如蛋白翻译起始因子OsIF4A1,并对其结构特点进行了分析。随后成功地在烟草中对OsPAL1及候选蛋白进行了表达,并利用免疫共沉淀（Co-IP）的方法对酵母双杂交和亲和纯化的结果进行了验证。本研究结果证实了 OsPAL1与OsAGO2互作、OsIF4A1与OsAGO2互作。
柴启超[7]（2017）在《陆地棉类病变突变体的发现、功能解析及抗病育种利用》文中进行了进一步梳理程序性细胞死亡（PCD）不仅存在于植物生长发育过程,并且参与植物对生物和非生物胁迫的应答。受到病原菌侵染后,植物会产生超敏反应,它是植物主动的程序性细胞死亡的过程。类病变突变体是一类在没有受到生物和非生物胁迫下,植物自身产生坏死病斑的突变材料。其产生坏死病斑的过程类似于植物的超敏反应。大多数类病变突变体都具有增强的病菌抗性。所以类病变突变体是研究植物PCD和抗病机制的重要工具。黄萎病是一种严重的真菌病害,具有寄主多样性。许多重要的粮食及经济作物都是黄萎病的寄主,其中包括番茄、马铃薯、棉花等。棉花是世界上重要的经济作物和纤维来源,其中陆地棉的种植面积最为广阔,占全球棉花种植面积的90%以上。然而由于陆地棉缺少免疫或高抗黄萎病抗源,培育高产优质抗黄萎病品种一直是困扰育种家的一个难题。我们首次在陆地棉品种中发现了一个类病变突变体,命名为Ghlmm。将棉花类病变突变体Ghlmm与陆地棉遗传标准系TM-1杂交,F1植株表型为野生型。F1植株自交得到F2群体共有763株,其中有209株表型为Ghlmm表型,554株为野生型。卡方值为2.202,符合孟德尔遗传定律3:1分离比,由此说明Ghlmm突变体表型是由隐性单基因控制的质量性状。通过本实验室构建的高密度遗传连锁图谱,我们将GhLMM基因定位到D5染色体上,在标记NAU7928和S2393之间,两个标记的物理距离为371kb。此区间内共有25个基因,其中只有12个基因在TM-1叶片转录组测序中FPKM值大于1。qPCR检测发现,与W0相比,只有GhD05G2237和GhD05G2254在突变体中表达量显着下降。我们在TM-1,W0和Ghlmm中分别克隆了GhD05G2237和GhD05G2254基因及其A亚组的同源基因。GhD05G2254基因在3个材料中序列并没有差异。GhD05G2237在Ghlmm的127bp处出现了单核苷酸突变。由GGA突变为TGA,形成了终止密码子,造成了基因的提前终止。在W0中分别沉默GhD05G2237和GhD05G2254,并观察沉默后表型。VIGS结果发现,沉默GhD05G2254后,W0仍然表现为野生型,叶片上并没有出现坏死斑。而沉默GhD05G2237后叶片出现了类似Ghlmmm突变体叶片局部坏死的表型。根据突变位点设计突变体位点具有扩增产物的SNP引物,发现F2群体中209株突变体表型植株全部具有扩增产物没有分离,而野生型表型的植株表现1:2的无带和有带的分离,说明GhD05G2237为突变基因。根据基因注释结果,Gh D05G2237编码ALAD蛋白（5-氨基乙酰丙酸脱水酶）,其功能是将2分子的5氨基乙酰丙酸（ALA）转化为1分子的胆色素原（PBG）。这一过程是合成所有四吡咯化合物必须经历的。植物中四吡咯化合物主要有叶绿素、血红素、亚铁血红素等,参与植物的光合作用,呼吸作用,氮的同化过程。全基因扫描发现,TM-1中ALAD基因只有两条:位于D亚组的GhD05G2237,命名为GhLMMD;位于A亚组的GhA05G3720,命名为GhLMMA。GhLMMA和GhLMMD在棉花中具有组成型表达的模式,其A、D亚组基因的表达水平基本相同,且在叶片、纤维及胚珠发育早期表达量相对较高。GhLMM基因定位在叶绿体中,这与其参与植物四吡咯合成的功能是对应的。对来源于17个物种的23个ALAD基因进行进化分析发现,在调查的所有物种中,ALAD基因数量最多的只有2条,其结构上也十分相似。说明ALAD基因进化上非常保守,功能十分重要。在转录水平上检测W0和Ghlmm中GhLMMA和GhLMMD的基因表达,发现Ghlmm的根、茎、叶中,GhLMMD基因的表达极显着下降,而GhLMMA却没有显着性变化。在蛋白水平上,Ghlmm叶片中的ALAD酶活极显着下降。GhLmmA基因并没有补偿GhLMMD功能丧失,说明GhLMM基因具有剂量效应。生理数据表明Ghlmm突变体细胞死亡是由于GhLMM基因剂量不足导致ALA积累和ROS的爆发所引起的。室内黄萎病抗性鉴定发现Ghlmm具有显着增强的黄萎病抗性。为研究其抗病机理,我们用W0和Ghmmm叶片进行转录组测序。以q值<0.05,表达差异4倍为筛选标准,共发现2069个差异表达基因。其中1541个基因上调表达,528个基因下调表达。GO富集结果显示Ghlmm中与胁迫,防卫反应,植物免疫等相关基因被显着富集。qPCR结果显示,在Ghlmm突变体根、茎、叶中,PR1、2、3、4、5、6、10七种不同类型的PR基因都有显着的上调表达。PR基因的表达受SA信号调控。SA检测发现,在茎和叶片中,Ghlmm的SA的含量显着高于W0。表明SA的积累和组成型表达抗病基因赋予了 Ghlmm突变体显着增强的黄萎病抗性。突变体中ALA的积累引起ROS的爆发,ROS是如何激活SA信号通路导致PR基因的表达?针对此问题我们检测了Ghlmm突变体叶片中SA合成调控基因。我们发现SA上游合成调控基因GhEDS1和GhPAD4以及SA合成关键基因GhPAL都显着上调表达。并且它们受到过氧化氢诱导后都显着上调表达。另外SA可以抑制CAT酶活,突变体中SA的积累导致CAT的酶活受到了显着的抑制。AIP（2-氨基茚满-2-磷酸）可以通过抑制PAL的酶活抑制SA的合成。当突变体喷施AIP之后,W0和Ghlmm突变体叶片中SA含量也显着下降到相同水平,叶片细胞死亡的表型消失。突变体PR基因表达都显着下降到与WO相同水平。ROS染色发现,Ghmmm突变体ROS含量下降。在突变体中ROS和SA具有循环放大的效应,并且此效应是引起Ghlmm突变体PCD所必需的。为研究GhLMM基因的剂量效应在调控植物生长发育和抗病之间的关系,我们设计了 2个实验。其一、通过外施不同浓度LA（乙酰丙酸）来模拟GhLMM基因的抑制表达。我们发现,喷施0、1、5、10、20、30mM的LA 24小时后,喷施20mM和30mM的W0叶片表现出Ghlmm突变体表型,而10mM具有不明显的细胞死亡现象。0、1、5mM LA喷施后,棉花叶片不形成坏死斑。随着LA喷施的浓度的增加,ALA、过氧化氢、SA的含量也随着增加。并且PR基因的表达趋势也是随着LA浓度的增加,表达量升高。通过传统的遗传实验,配制W0和Ghlmm突变体杂种F1代,并检测其抗病性,及各项生理指标。结果发现F1植株抗病性及各项生理指标都处于三个材料中间水平。Ghlmm突变体分别与TM-1、军棉1号的杂种F1代黄萎病抗性鉴定得到了相同的结果。四个GhLMM基因拷贝的WT（AADD）生长正常,但是抗病信号通路没有激活;三个拷贝的（W0 × Ghlmm）F1（AADd）生长正常,抗病信号通路激活;两个拷贝的Ghlmm突变体（AAdd）发生PCD,抗病信号强烈激活。而VIGS将GhLMM沉默后,植株最终死亡。综合以上实验我们得出,GhLMM基因的剂量效应能够调节植物生长和抗病之间的能量分配,使植物以最小的生长代价达到最大的抗病效果。
吴雪莉[8]（2017）在《超表达CdNF-YC和CdSAMDC提高海滨雀稗抗逆性研究》文中指出海滨雀稗（Paspalums vaginatium O.Swartz）是一种重要的暖季型草坪草,具有优良的草坪性状,在我国长江以南地区的高尔夫球场被广泛应用。海滨雀稗作为盐土植物,能严格调节对钠的摄取量,是目前最耐盐的暖季型草坪草种。海滨雀稗对干旱和低温的耐受能力低于大多数暖季型草坪草,极大限制了它在我国北方干旱和半干旱盐渍土地区的推广种植。因此,亟需开展海滨雀稗的耐旱耐寒育种,培育耐旱耐低温的新种质。本研究以海滨雀稗为研究对象,首次建立了高效的农杆菌介导的遗传转化体系。通过农杆菌介导转化的方法,用含有Hpt标记基因和GUS报告基因的pCAMBIA1305.2载体,浸染海滨雀稗胚性愈伤组织。通过确定潮霉素最佳筛选压以及优化农杆菌转化方法,建立了高效稳定的遗传转化方法:菌液浓度OD600=0.6、添加100 μMAS、0.01%Silwet L-77、超声波处理5 min、真空处理20 min条件下,共培养2d,可以获得高的GUS瞬时转化效率。最高GUS瞬时转化效率可达98.8%,平均GUS瞬时转化效率87.1%。通过PCR、Southern blot检测证明T-DNA成功在海滨雀稗基因组中表达,平均转化效率为8%。我们利用农杆菌介导转化的方法,将狗牙根NF-YC整合到海滨雀稗基因组中,首次成功获得了表达CdNF-YC的转基因海滨雀稗新种质。与此同时,将狗牙根SAMDC基因和具有草铵膦抗性的bar基因同时整合到海滨雀稗基因组中,首次成功获得了具有除草剂抗性的表达CdSAMDC的转基因海滨雀稗新种质。通过PCR、Southern blot检测,证明T-DNA成功在海滨雀稗基因组中表达。通过qRT-PCR分析,转基因海滨雀稗中CdNF-YC的相对表达量显着高于野生型;在干旱、低温、盐处理条件下,转基因海滨雀稗中CdSAMDC的相对表达量显着高于野生型。过表达bar基因的转基因海滨雀稗具有明显的BASTA除草剂抗性。NF-YC核转录因子通过与其他调控因子相互作用,激活或抑制下游基因的表达,参与调控逆境应答。干旱条件下,表达CdNF-YC的转基因海滨雀稗株系具有显着更低的相对电导率,显着更高的叶片相对含水量以及复水后存活率,耐旱性显着提高。过表达CdNF-YC的转基因海滨雀稗对高盐的耐受力也进一步提高。在高盐胁迫条件下,表达CdNF-YC海滨雀稗株系具有显着更低的叶片枯黄率,保持了显着更高的叶片含水量、根系重量、光系统Ⅱ最大光化学效率和叶绿素含量。在高盐条件下,转基因海滨雀稗通过保持体内更低的Na+含量,和更高的K+含量以及K+/Na+比,从而显着提高了耐盐性。在干旱、盐胁迫条件下,转基因海滨雀稗中CdNF-YC基因激活胁迫响 应 基因 PvDREB2A、PvDREB1B、PvLEA3、PvP5CS1、PvABI 的表达,相对表达量均显着高于野生型。ABA处理,显着提高了PvLEA3、PvP5CS1、PvABI基因的相对表达量,且转基因株系显着高于野生型;而PvDREB2A、PvDREB1B的诱导表达量变化较小。SAMDC基因通过调节海滨雀稗体内不同形态、不同种类的多胺合成与代谢,调控对不同逆境的应答反应。干旱胁迫下,表达CdSAMDC转基因海滨雀稗具有更低的相对电导率,更高的相对含水量和复水后存活率,并显着高于野生型,获得了更高的耐旱能力。转基因株系的游离态的腐胺Put、亚精胺Spd含量显着高于野生型;而结合态、束缚态及精胺Spm含量虽升高,但差异不显着。表达CdSAMDC转基因海滨雀稗的低温耐受能力显着提高,具有显着低于野生型的低温半致死温度;低温处理后的存活率显着高于野生型。低温胁迫条件下,转基因株系3种形态的腐胺Put含量均显着高于野生型。游离态亚精胺无显着差异,而结合态、束缚态的亚精胺Spd含量显着低于野生型。游离态精胺Spm显着高于野生型;结合态、束缚态精胺Spm稍高于野生型。与此同时,表达CdSAMDC转基因株系的耐盐性也得到进一步的提高。在高盐胁迫下,转基因海滨雀稗具有显着更高的光合作用能力、K+含量、K+/Na+比。转基因株系中游离态的腐胺Put、精胺Spm含量,显着高于野生型;游离态亚精胺Spd含量显着低于野生型;束缚态多胺差异均不显着。CdSAMDC基因通过调控体内多胺代谢,显着提高了转基因株系体内GABA含量,参与海滨雀稗对干旱、低温、盐的抵御过程。本研究首次建立了海滨雀稗稳定的农杆菌转化体系,同时获得了表达CdNF-YC和CdSAMDC的转基因新种质,显着提高了海滨雀稗的耐旱性、耐寒性、耐盐性,以及除草剂的抗性。
蔡义强[9]（2016）在《外源基因插入对禾谷镰孢菌次生代谢产物DON毒素合成影响的风险评估》文中研究表明禾谷镰抱菌（Fusarium graminearum）是引起小麦赤霉病的最主要病原菌之一。赤霉病分布广泛,破坏性极强,在世界各个麦区都有发生。它不仅影响小麦的产量,还因病原菌的侵染产生次生代谢产物单端抱霉烯族毒素（以DON为主）,污染小麦的品质。食用病麦或其加工成的食品会引起人畜中毒,严重影响人类的食品安全。随着转基因技术的发展,特别是在农业上的应用,转基因食品不断出现。然而,转基因食品的安全性一直是我们担忧的问题。科学家们注重外源基因本身的安全性,而忽略了外源基因整合到宿主后带来的危害。本文将用能正常产生次生代谢产物DON毒素的禾谷镰孢菌为研究材料,用外源基因即潮霉素磷酸转移酶基因（hph）和Bt毒蛋白基因（CrylAc）定点或随机插入禾谷镰孢菌中,通过检测突变体产DON的能力,评估外源基因插入的风险。防治小麦赤霉病的多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂,已经引起了禾谷镰抱菌的抗药性问题。研究发现,在田间分离得到的抗多菌灵菌株的β 2微管蛋白的167、198位氨基酸发生了点突变,且能提升禾谷镰孢菌产DON的能力。通过高通量测序发现,167位点突变的菌株能引起1036个基因上调,401个基因下调。为探究外源基因的插入对毒素合成的影响,通过潮霉素磷酸转移酶基因（hph）和Bt毒蛋白基因（CrylAc）分别定点插入到禾谷镰孢菌的beta2微管蛋白的167和198位点,分析病菌产DON的能力。结果发现:同一个外源基因插入不同位点或不同外源基因插入同一位点,都引起了 DON毒素的相同倍数的下降,与beta2敲除体产毒一致。同时,突变体的毒素合成基因tri5的表达量也呈下降趋势。由此推测,不同外源基因的定点插入带来的风险可能是一致的。外源基因的随机插入存在一定的不确定性。为研究外源基因随机插入禾谷镰孢菌中对病菌产DON的影响,通过原生质体遗传转化的方法将潮霉素磷酸转移酶基因（hph）和Bt毒蛋白基因（CrylAc）分别转移到禾谷镰孢菌中,各获得1000个随机插入突变体。从以上突变体中各随机选取250个突变体,使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）定量毒素合成基因tri5的表达。从hph和CrylAc随机插入突变体中分别随机选取2个上调表达和2个下调表达的突变体进行离体毒素和致病力验证,结果与tri5定量表达的结果一致,证明了定量数据的准确性。从定量数据统计的结果发现,hph随机插入突变体tri5基因上调与下调2、5倍以上的比例分别为1:1和1.3:1;CrylAc随机插入突变体tri5基因上调与下调2、5倍以上的比例分别为3.4:1和6.3:1。hph随机插入对tri5的表达的影响分布均匀,而CrylAc随机插入更多的影响tri5的上调表达。根据概率分布直方图也可以看出,CrylAc随机插入突变体的趋势线相对偏右,即CrylAc具有影响tri5上调表达的趋势。因此,不同外源基因的插入对禾谷镰孢菌产DON的影响不同,可能具有一定的偏向性,所以随机插入的方法是具有风险的。以外源基因随机插入影响tri5基因上下调2倍以上的突变体为研究材料,通过Tail-PCR扩增hph和CrylAc的侧翼序列,并与Fusarium graminearum的基因文库进行比对,找到外源基因的插入位点。通过以上方法共找到29个基因,其中10个hph随机插入影响下调表达的基因,7个上调表达的基因,这些基因主要是几丁质合成相关基因、氨基酸合成相关蛋白酶基因、氧化还原酶基因等;6个CrylAc随机插入影响下调表达基因,6个上调表达基因,这些基因包括内吞锚定相关蛋白基因、磷酸果糖激酶基因等。现以CrylAc随机插入引起tri5表达量上调2倍的FGSG01445和下调11倍的FGSG05569为例,用外源基因hph和neo分别定点插入到CrylAc在FGSG01445基因和FGSG05569基因的插入位点。结果表明,三个外源基因的定点插入FGSG01445基因对tri5的表达影响一致,突变体产DON毒素的能力都提高,且不同突变体之间毒素的含量不存在显着性差异（P<0.05）,突变体的致病力增强。三个外源基因定点插入FGSG05569基因对tri5的表达都是下调,突变体产DON毒素的能力都下降,且不同突变体之间毒素的含量不存在显着性差异（P<0.05）,突变头的致病力下降。以上结果进一步证明了hph、neo和CrylAc的定点插入对DON的影响是一致的,不会因为外源基因的不同影响DON,而是与插入的位点有关。
张小兵[10]（2015）在《转G2-aroA基因抗草甘膦棉花植株的获得及特异性检测》文中指出棉花是我国重要的经济作物,在国民经济中占据着非常重要的战略地位。棉田杂草丛生,会严重影响棉花的产量和质量。棉田化学除草是棉花生产中降低成本、提高经济效益的根本途径。草甘膦是一种灭生性除草剂,具有广谱、高效、低毒和无残留的优点;但是,其在杀灭田间杂草的同时,也会伤害农作物。利用基因工程技术,培育和推广具有草甘膦抗性的棉花新品种,对于利用草甘膦进行棉田化学除草具有重要意义。目前,国内可用于商业化的抗除草剂棉花尚未见报道。开展具有自主知识产权的抗除草剂转基因棉花的研究,对我国棉花产业具有重大意义。本研究运用农杆菌介导法,将具有自主知识产权的抗草甘膦基因G2-aroA转入珂字棉312中,获得了抗草甘膦转基因棉株,并对其进行了抗性鉴定和分子生物学分析,为该种质的开发利用提供了科学依据。研究结果如下:1.抗草甘膦转基因棉花的获得以珂字棉312下胚轴为外植体,用卡那霉素作为抗性筛选剂,通过农杆菌介导法,将菊花Rubisco小亚基基因启动子驱动的G2-aroA基因导入了棉花基因组中,获得了10个转化事件（T0）。这些转化事件,都能正常开花结实。卡那霉素、草甘膦筛选试验和PCR检测、Southern Blot等分子生物学分析,均证实G2-aroA基因已成功导入了棉花基因组中。2.转基因棉花后代遗传分析T0代转基因植株自交种子,种成株行（T1）。田间卡那霉素抗性鉴定结果,经χ2卡方检验,表明各转化子（T1）均符合单位点插入的3:1分离规律,与分子生物学检测结果一致。3.转基因棉花草甘膦抗性鉴定对田间性状优异的抗草甘膦转基因棉花BG2-7,用浓度分别为0‰、1‰、2‰、4‰、8‰和10‰的草甘膦溶液,进行喷施鉴定。非转基因棉花对草甘膦非常敏感,2‰草甘膦（大田推荐施用浓度）处理就全部死亡。转基因棉花,2‰草甘膦处理能够正常生长;随草甘膦浓度的增加,转基因棉花的生长受抑制情况逐渐明显;10‰草甘膦（5倍大田推荐浓度）处理仍能缓慢生长,开花结实。草甘膦抗性鉴定结果表明,转基因棉花BG2-7具有较高的草甘膦抗性。4.转基因棉花BG2-7外源插入基因的侧翼序列分析通过TAIL-PCR和普通PCR扩增,获得了转基因棉花BG2-7外源DNA插入片段的侧翼序列。本研究所导入的外源基因,插入到了棉花基因组第十一号染色体上,5ˊ端位于染色体的第61,253,333处;棉花基因组序列与外源基因5ˊ端之间有31 bp的棉花微卫星序列;外源基因Left boder缺失84 bp碱基,Right boder缺失298 bp碱基,棉花基因缺失30 bp碱基;。5.转基因棉花BG2-7特异性检测方法的建立依据获得的侧翼序列信息,分别设计BG2-7转化事件外源基因5ˊ端和3ˊ端特异性PCR检测引物。经筛选,分别确定引物GTCATAACGTGACTCCCTTAATTCTCC/CCTATTACACGGCTATGC为特异性PCR5ˊ端检测引物,引物TCCTTTCGCTTTCTTCCCTT/ACACTTACATGGCGTCTTCT为3ˊ端检测引物,建立了BG2-7转化事件的特异性检测方法。5ˊ端的检测灵敏度,可以达到44个拷贝;3ˊ端的检测灵敏度可以达到88个拷贝。另外,还依据侧翼序列信息,设计了复合PCR引物。引物ATGGAAGGGCTGTTGATACA/TCTGACATCATGGATCGCAA扩增棉花基因组序列,引物TCGCTTTCTTCCCTTCCTTT/TCTGACATCATGGATCGCAA扩增3ˊ端特异性序列,分别进行PCR扩增,建立了BG2-7转化事件纯合子的筛选方法。
二、Development of Transgenic Cotton Resistant to Fungal Diseases and of Mutants by T-DNA Insertional Mutagenesis（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Development of Transgenic Cotton Resistant to Fungal Diseases and of Mutants by T-DNA Insertional Mutagenesis（论文提纲范文）
（1）天麻抗真菌蛋白研究进展（论文提纲范文）
| 1 天麻抗真菌蛋白基因的克隆 |
| 2 天麻抗真菌蛋白的特点 |
| 3 天麻抗真菌蛋白的抑菌活性 |
| 4 天麻抗真菌蛋白的作用机制 |
| 4.1 天麻抗真菌蛋白的作用位点 |
| 4.2 天麻抗真菌蛋白的合成部位 |
| 5 天麻抗真菌蛋白表达载体构建 |
| 6 天麻抗真菌蛋白的应用 |
| 6.1 天麻抗真菌蛋白基因转化辣椒的研究 |
| 6.2 天麻抗真菌蛋白基因转化棉花的研究 |
| 6.3 天麻抗真菌蛋白基因转化烟草的研究 |
| 6.4 天麻抗真菌蛋白基因转化大豆的研究 |
| 6.5 天麻抗真菌蛋白基因转化油菜的研究 |
| 6.6 天麻抗真菌蛋白基因转化小麦的研究 |
| 6.7 天麻抗真菌蛋白基因转化李树的研究 |
| 6.8 天麻抗真菌蛋白基因转化水稻的研究 |
| 6.9 天麻抗真菌蛋白基因转化其它作物的研究 |
| 7 展望 |
| 7.1 天麻抗真菌蛋白的作用机制探讨 |
| 7.2 天麻抗真菌蛋白的协同作用探讨 |
（2）棉花腺体形成相关基因GhERF105的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花色素腺体和棉酚 |
| 1.1.1 棉花色素腺体性状 |
| 1.1.2 棉酚的结构和特性 |
| 1.1.3 色素腺体与棉酚的关系 |
| 1.1.4 色素腺体研究的重要性 |
| 1.2 色素腺体性状控制基因的遗传研究 |
| 1.2.1 棉花色素腺体相关控制基因遗传研究 |
| 1.2.2 棉花色素腺体相关复等位基因的遗传研究 |
| 1.3 显性无腺体基因GL_2~e的研究 |
| 1.3.1 GL_2~e基因的发现与遗传分析 |
| 1.3.2 GL_2~e基因的研究进展 |
| 1.4 棉花色素腺体发育相关基因的克隆 |
| 1.5 棉酚生物合成途径及相关基因的研究 |
| 1.5.1 棉酚的生物合成途径 |
| 1.5.2 棉酚生物合成途径中有关基因的研究 |
| 1.6 低酚棉育种进展 |
| 1.7 植物ERF转录因子研究进展 |
| 1.7.1 ERF转录因子 |
| 1.7.2 ERF类转录因子转录激活活性的调控 |
| 1.7.3 ERF转录因子在非生物胁迫中的作用 |
| 1.7.4 ERF转录因子在生物胁迫中的作用 |
| 1.8 VIGS技术在验证基因功能中的应用 |
| 1.8.1 VIGS技术简介 |
| 1.8.2 VIGS技术在棉花基因功能研究中的应用 |
| 1.9 DUALhunter酵母双杂交系统简介及应用 |
| 1.10 双分子荧光互补技术(BiFC)及其应用 |
| 1.11 研究目的与意义 |
| 第二章 腺体形成相关的候选基因GhERF105克隆与功能分析 |
| 2.1 实验仪器、材料与方法 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 菌株和表达载体 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 棉苗的培育 |
| 2.1.6 棉花总RNA提取 |
| 2.1.7 cDNA合成及质量验证 |
| 2.1.8 质粒大量提取 |
| 2.1.9 PCR产物扩增 |
| 2.1.10 PCR产物纯化 |
| 2.1.11 热击法转化大肠杆菌感受态 |
| 2.1.12 菌液PCR |
| 2.1.13 测序与序列比对 |
| 2.1.14 重组质粒小量提取 |
| 2.1.15 冻融法转化农杆菌感受态 |
| 2.1.16 棉酚含量测定 |
| 2.1.17 荧光定量PCR结果统计分析 |
| 2.1.18 候选基因生物信息学分析 |
| 2.1.19 qRT-PCR验证候选基因在有腺体和无腺体材料中的差异性表达 |
| 2.1.20 病毒诱导的基因沉默(VIGS)筛选棉花腺体相关基因 |
| 2.1.21 陆地棉GhERF105基因组织特异性分析 |
| 2.1.22 陆地棉GhERF105基因在有腺体和无腺体序列分析 |
| 2.1.23 候选基因GhERF105启动子的作用元件分析 |
| 2.1.24 陆地棉GhERF105基因启动子在有腺体和无腺体序列分析 |
| 2.1.25 陆地棉GhERF105基因诱导表达分析 |
| 2.1.26 陆地棉GhERF105蛋白亚细胞定位 |
| 2.1.27 酵母双杂交 |
| 2.1.28 互作蛋白亚细胞定位 |
| 2.1.29 双分子荧光互补(BiFC)验证 |
| 2.1.30 酵母单杂交 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RNA纯度检测 |
| 2.2.2 陆地棉GhERF105基因克隆 |
| 2.2.3 陆地棉GhERF105生物信息学分析 |
| 2.2.4 陆地棉候选基因GhERF105在不同棉花品种叶茎差异性表达 |
| 2.2.5 利用VIGS方法获得棉花沉默候选基因植株 |
| 2.2.6 陆地棉GhERF105基因组织特异性分析 |
| 2.2.7 陆地棉GhERF105基因诱导表达分析 |
| 2.2.8 陆地棉GhERF105蛋白的亚细胞定位 |
| 2.2.9 陆地棉GhERF105基因在不同棉花材料叶片中序列分析 |
| 2.2.10 陆地棉GhERF105基因启动子作用元件分析、序列和活性分析 |
| 2.2.11 陆地棉Gh ERF105 基因与Gh MYC2-like的关系 |
| 2.2.12 酵母双杂交筛选互作蛋白 |
| 2.2.13 互作蛋白的亚细胞定位 |
| 2.2.14 Bi FC验证Gh ERF105 与互作蛋白的互作 |
| 2.2.15 Gh ERF105与GCC-box及 DRE顺式作用元件结合和转录激活活性的分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 陆地棉GhERF105蛋白序列分析 |
| 2.3.2 陆地棉GhERF105基因表达分析 |
| 2.3.3 陆地棉GhERF105基因与腺体形成或棉酚代谢的关系 |
| 2.3.4 陆地棉GhERF105基因启动子序列分析 |
| 2.3.5 陆地棉GhERF105基因诱导表达分析 |
| 2.3.6 陆地棉GhERF105基因其他功能分析 |
| 2.3.7 陆地棉GhERF105基因作用机制推测 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 后续研究与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 引物序列汇表 |
| 附录B 实验试剂和培养基配制 |
| 附录C 候选基因的功能注释 |
| 附录D 互作蛋白的功能注释 |
| 附录E 作者介绍 |
| 致谢 |
（3）GhPUB17在棉花抗黄萎病中的功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 棉花生产与棉花黄萎病概述 |
| 1.2 植物先天免疫系统——PTI与 ETI |
| 1.2.1 PAMPs引起的宿主免疫反应 |
| 1.2.2 Effectors引起的宿主免疫反应 |
| 1.3 棉花与黄萎病菌互作 |
| 1.4 植病互作与泛素-蛋白酶体系统 |
| 1.4.1 泛素-蛋白酶体系统 |
| 1.4.2 泛素化系统与植物抗病免疫 |
| 1.5 植物亲环素与植物抗病免疫 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料和病原菌菌株 |
| 2.1.2 转化载体及菌株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 陆地棉基因组中PUB基因家族的发掘 |
| 2.2.2 PCR扩增获得GhPUB17 基因序列 |
| 2.2.3 GhPUB17 基因稳定转化陆地棉品系“YZ1” |
| 2.2.3.0 载体构建 |
| 2.2.3.1 棉花转基因步骤 |
| 2.2.3.2 转基因棉株的鉴定 |
| 2.2.4 VIGS实验 |
| 2.2.4.1 载体构建 |
| 2.2.4.2 材料准备 |
| 2.2.4.3 VIGS操作 |
| 2.2.4.4 基因抑制效果的检测 |
| 2.2.5 实验材料接种 |
| 2.2.5.1 棉花材料的准备 |
| 2.2.5.2 黄萎病接种检测与灰霉接种检测 |
| 2.2.6 qRT-PCR检测棉花内源抗病相关基因变化 |
| 2.2.7 酵母双杂交实验 |
| 2.2.8 原核表达GhPUB17和GhCyP3 蛋白 |
| 2.2.9 GST-Pulldown实验 |
| 2.2.10 GFP-GhPUB17与GFP-GhCyP3 蛋白亚细胞定位 |
| 2.2.11 双分子黄色荧光互补实验BiFC |
| 2.2.12 分裂荧光素酶互补实验SLC |
| 2.2.13 GhPUB17的E3 泛素连接酶酶活鉴定 |
| 2.2.14 蛋白GhCyP3 抑制GhPUB17的E3 泛素连接酶活性试验 |
| 2.2.15 蛋白HIS-GhCyP3 抑菌试验 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 GhPUB17 基因的克隆及序列比较 |
| 3.2 GhPUB17受MeJA、SA及黄萎病菌诱导表达 |
| 3.3 瞬时抑制GhPUB17 表达增强棉花对黄萎病菌的抗性 |
| 3.4 稳定抑制GhPUB17 表达和超量表达GhPUB17 转基因棉花株系的获得和检测 |
| 3.5 GhPUB17 负调控棉花对黄萎病菌的抗性 |
| 3.6 GhPUB17 不参与棉花对灰霉病原菌的抗性调控 |
| 3.7 GhPUB17 介导的棉花抗黄萎病调控行为不依赖于JA和 SA信号路径 |
| 3.8 体外实验证明GhPUB17与GhCyP3 互作 |
| 3.9 体内实验证明GhPUB17与GhCyP3 互作 |
| 3.10 GhPUB17 蛋白具有E3 泛素连接酶活性 |
| 3.11 GhCyP3 可抑制GhPUB17的E3 泛素连接酶活性 |
| 3.12 GhCyP3 正调控棉花对黄萎病抗性 |
| 3.13 GhCyP3 具有抗菌肽活性 |
| 3.14 棉花PUB基因家族进化分析 |
| 3.14.1 棉花中PUB基因的预测与分类 |
| 3.14.2 PUB基因在棉花不同组织中的表达模式多样化 |
| 3.14.3 棉花中PUB基因受黄萎病菌诱导表达或抑制 |
| 3.14.4 PUB基因编码区及启动子区域变异位点的发掘 |
| 3.14.4.1 .PUB基因编码区区域的SNP位点 |
| 3.14.4.2 PUB基因编码区区域的InDel位点 |
| 3.14.4.3 PUB基因启动子区域的SNP位点 |
| 3.14.4.4 PUB基因启动子区域的InDel位点 |
| 3.14.5 陆地棉PUB基因与棉花栽培品种对黄萎病的抗性差异关联分析 |
| 3.14.5.1 124份棉花栽培种材料对棉花黄萎病的抗性调查 |
| 3.14.5.2 棉花PUB基因变异与栽培材料对黄萎病抗性关联分析 |
| 3.14.6 PUB17 基因参与棉花对黄萎病菌抗性调控 |
| 4 讨论 |
| 4.1 棉花中PUB17 基因的作用模式区别于其在茄科和十字花科植物中的作用模式 |
| 4.2 E3 泛素连接酶GhPUB17 具有特别的受调控模式 |
| 4.3 亲环素GhCyP3 与棉花抗黄萎病调控 |
| 4.4 棉花中PUB基因家族可能参与对黄萎病的免疫调控 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读期间已发表论文 |
| 致谢 |
（4）通过基因差异表达及蛋白互作研究抗虫转基因水稻在不同环境条件下的非预期效应（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 转基因作物的发展历史和现状 |
| 1.1 全球转基因作物商品化现状 |
| 1.2 我国转基因作物的研究现状 |
| 2 转Bt(Bacillus thuringiensis)基因抗虫水稻的研究现状 |
| 2.1 Bt基因的结构与功能 |
| 2.1.1 Cry毒素蛋白的三维模型(3D-Cry) |
| 2.1.2 Cry毒素蛋白的种类和防治对象 |
| 2.1.3 Cry毒素蛋白的作用模型 |
| 2.2 转Bt抗虫基因水稻的研究现状 |
| 2.2.1 第一代抗虫转基因水稻的释放和安全证书的获得 |
| 2.2.2 新型抗虫转基因水稻的发展 |
| 3 转Bt基因水稻的适合度评估 |
| 3.1 自身杂草化 |
| 3.2 外源基因漂移 |
| 3.3 杂交后代的适合度 |
| 4 转Bt基因水稻的非预期效应研究 |
| 4.1 非预期效应的定义 |
| 4.2 非预期效应产生的可能原因 |
| 4.2.1 转基因植株的构建过程 |
| 4.2.2 额外表达外源蛋白消耗的物质与能量 |
| 4.2.3 外源蛋白与亲本水稻内源蛋白的互作 |
| 5 非预期效应的检测评价技术 |
| 5.1 定向评价技术在转基因作物非预期效应检测中的应用 |
| 5.2 “组学”技术在转基因作物非预期效应检测中的应用 |
| 5.2.1 转录组学 |
| 5.2.2 蛋白组学 |
| 5.2.3 代谢组学 |
| 5.2.4 组学联用技术 |
| 5.3 蛋白互作技术在转基因作物非预期效应检测中的应用前景 |
| 6 本研究的目的与意义 |
| 第二部分 模拟不同自然条件下抗虫转基因水稻华恢1号和T1C-19的适合度 |
| 第1章 盐碱土壤和农田土壤条件下抗虫转基因水稻华恢1号和T1C-19的适合度 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 水稻 |
| 1.2 土壤 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.4 酶联免疫法测定外源Bt蛋白表达量 |
| 1.5 水稻营养生长和生殖生长的适合度指标测定 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 外源Bt蛋白表达 |
| 2.1.1 外源Cry1Ab/c蛋白 |
| 2.1.2 外源Cry1C~*抗虫蛋白表达 |
| 2.2 外源cry1Ab/c基因对水稻营养和生殖指标的影响 |
| 2.2.1 株高 |
| 2.2.2 分蘖数 |
| 2.2.3 剑叶SPAD值 |
| 2.2.4 生物量 |
| 2.2.5 生殖生长指标 |
| 2.3 外源cry1C~*/bar基因对水稻营养和生殖生长指标的影响 |
| 2.3.1 株高 |
| 2.3.2 分蘖数 |
| 2.3.3 剑叶叶长、叶宽和叶面积 |
| 2.3.4 剑叶SPAD值 |
| 2.3.5 生物量 |
| 2.3.6 生殖生长指标 |
| 3 讨论 |
| 3.1 外源Bt蛋白表达 |
| 3.2 2个土壤条件对转Bt基因水稻营养生长的影响 |
| 3.3 2个土壤条件对转Bt基因水稻生殖生长的影响 |
| 第2章 杂草竞争和荒地土壤种植条件下抗虫转基因水稻华恢1号和T1C-19的适合度 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.1.1 水稻 |
| 1.1.2 土壤 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 试验设计 |
| 1.2.2 ELISA测定外源蛋白表达量 |
| 1.2.3 水稻营养生长和生殖生长的适合度指标测定 |
| 1.2.4 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 外源Bt蛋白表达 |
| 2.1.1 外源Cry1Ab/c蛋白的表达 |
| 2.1.2 外源Cry1C~*蛋白的表达 |
| 2.2 外源cry1Ab/c基因对水稻营养和生殖生长指标的影响 |
| 2.2.1 株高 |
| 2.2.2 分蘖数 |
| 2.2.3 剑叶长、宽和面积 |
| 2.2.4 剑叶SPAD值 |
| 2.2.5 生物量 |
| 2.2.6 生殖生长指标 |
| 2.3 外源cry1C~*/bar基因对水稻营养与生殖生长指标的影响 |
| 2.3.1 株高 |
| 2.3.2 分蘖数 |
| 2.3.3 剑叶长、宽和叶面积 |
| 2.3.4 剑叶SPAD值 |
| 2.3.5 生物量 |
| 2.3.6 生殖生长指标 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 杂草竞争和荒地土壤条件下抗虫转基因水稻T1C-19的基因差异表达 |
| 第3章 杂草竞争和荒地土壤条件下抗虫转基因水稻T1C-19的基因差异表达-转录组水平 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 供试材料和种植条件 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 转基因水稻T1C-19外源基因转录水平的检测 |
| 1.2.2 差异基因的筛选和分析 |
| 1.2.3 RT-QPCR检测T1C-19和MH63差异基因的表达量 |
| 1.2.4 双分子荧光互补技术验证外源Cry1Ab/c蛋白与共有差异基因表达蛋白的互作 |
| 1.2.5 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 转基因水稻T1C-19外源基因转录水平的检测 |
| 2.2 外源基因插入对水稻差异基因表达的影响 |
| 2.2.1 共有差异基因数目 |
| 2.2.2 共有差异基因表达量的层次聚类分析 |
| 2.2.3 共有差异基因的GO富集分析 |
| 2.2.4 共有差异基因的KEGG富集分析 |
| 2.3 胁迫种植条件对水稻差异基因表达的影响 |
| 2.3.1 差异基因数目 |
| 2.3.2 KEGG功能富集分析 |
| 2.4 定量PCR检测T1C-19和MH63差异基因的表达量 |
| 2.5 外源Cry1C~*蛋白与共有差异基因表达蛋白的互作 |
| 3 讨论 |
| 3.1 外源基因对转基因水稻转录组的影响 |
| 3.2 逆境条件对转基因水稻差异基因表达的影响 |
| 3.3 表型差异与转录组结果的相关性分析 |
| 第4章 杂草竞争和荒地土壤条件下抗虫转基因水稻T1C-19的基因差异表达-蛋白组水平 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 供试材料和种植条件 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 转基因水稻T1C-19外源蛋白表达水平的检测 |
| 1.2.2 蛋白提取及质量检测 |
| 1.2.3 差异蛋白的筛选和分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 转基因水稻T1C-19外源Cry1C~*蛋白和Bar蛋白表达水平的检测 |
| 2.2 外源基因对水稻差异蛋白表达的影响 |
| 2.2.1 共有差异蛋白数目 |
| 2.2.2 共有差异蛋白表达量的层次聚类分析 |
| 2.2.3 共有差异蛋白GO富集分析 |
| 2.2.4 共有差异蛋白的KEGG富集分析 |
| 2.3 3种胁迫种植条件对水稻差异蛋白表达的影响 |
| 2.3.1 差异蛋白数目 |
| 2.3.2 差异蛋白的KEGG富集分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 外源基因对转基因水稻T1C-19蛋白组的影响 |
| 3.2 逆境条件对转基因水稻T1C-19蛋白组的影响 |
| 第四部分 抗虫转基因水稻华恢1号外源Cry1Ab/c蛋白与水稻内源蛋白互作的研究 |
| 第5章 抗虫转基因水稻华恢1号外源Cry1Ab/c蛋白与水稻内源蛋白组的相互作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料及种植条件 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 主要试验菌株、载体及试剂 |
| 1.1.3 所用引物 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 酵母双杂初筛与外源Cry1Ab/c蛋白互作的水稻内源蛋白 |
| 1.2.2 农杆菌介导的外源Cry1Ab/c蛋白和内源蛋白在烟草细胞中表达的瞬时表达体系构建 |
| 1.2.3 外源Cry1Ab/c蛋白与内源蛋白的亚细胞共定位 |
| 1.2.4 外源Cry1Ab/c蛋白与内源蛋白的双分子荧光互补 |
| 1.2.5 外源Cry1Ab/c蛋白与内源蛋白免疫共沉淀 |
| 2 结果 |
| 2.1 酵母双杂初筛与外源Cry1Ab/c蛋白互作的水稻内源蛋白 |
| 2.1.1 截断的Cry1Ab/c诱饵菌株的自激活验证图 |
| 2.1.2 Y2H Gold共转化系统对文库的筛选结果 |
| 2.1.3 Y2H Gold-Y187双杂系统对文库的筛选结果 |
| 2.1.4 初筛与外源Cry1Ab/c蛋白互作的内源蛋白数目统计结果 |
| 2.1.5 外源Cry1Ab/c蛋白筛选的互作内源蛋白统计结果 |
| 2.2 外源Cry1Ab/c蛋白与功能明确内源蛋白互作真实性的验证 |
| 2.2.1 外源Cry1Ab/c蛋白与水稻内源蛋白的亚细胞定位 |
| 2.2.2 亚细胞共定位技术检测外源Cry1Ab/c蛋白与水稻内源蛋白的互作可能性 |
| 2.2.3 双分子荧光互补技术检测外源Cry1Ab/c蛋白与水稻内源蛋白的互作 |
| 2.2.4 免疫共沉淀技术检测外源Cry1Ab/c蛋白与水稻内源蛋白的互作 |
| 3 讨论 |
| 3.1 蛋白互作在转Bt基因水稻非预期效应产生机制探索中的应用 |
| 3.2 与光合作用候选蛋白的互作及可能的生物学功能 |
| 3.3 与抗逆反应候选蛋白的互作及可能的生物学功能 |
| 第6章 常规栽培条件下抗虫转基因水稻华恢1号外源Cry1Ab/c蛋白的细胞膜定位及其与水稻内源膜蛋白的相互作用 |
| 1 试验材料和方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 主要试验菌株、载体及试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 外源Cry1Ab/c蛋白在水稻叶肉细胞中的定位 |
| 1.2.2 外源Cry1Ab/c蛋白的亚细胞定位 |
| 1.2.3 Western blot技术验证外源Cry1Ab/c蛋白在细胞质和细胞膜中表达量 |
| 1.2.4 外源Cry1Ab/c蛋白与水稻细胞膜蛋白的相互作用 |
| 2 结果 |
| 2.1 外源Cry1Ab/c蛋白的细胞定位 |
| 2.1.1 水稻叶肉细胞中的定位 |
| 2.1.2 外源Cry1Ab/c蛋白的亚细胞定位 |
| 2.1.3 Western blot技术验证外源Cry1Ab/c蛋白在细胞质和细胞膜中表达量 |
| 2.2 外源Cry1Ab/c蛋白与水稻细胞膜蛋白的相互作用 |
| 2.2.1 酵母双杂点对点验证 |
| 2.2.2 V-H~+-ATPase和Ca~(2+)-ATPase的亚细胞定位 |
| 2.2.3 双分子荧光互补 |
| 2.2.4 免疫共沉淀技术 |
| 3 讨论 |
| 第7章 盐碱土壤条件下抗虫转基因水稻华恢1号外源Cry1Ab/c蛋白与水稻开花蛋白的互作 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.1.1 植物材料和生长条件 |
| 1.1.2 主要试验菌株、载体及试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 HH1外源cry1Ab/c基因转录水平和蛋白表达水平的检测 |
| 1.2.2 HH1外源Cry1Ab/c蛋白与5个抽穗期主效蛋白的互作 |
| 1.2.3 外源Cry1Ab/c蛋白与Hd3a主效蛋白互作后Hd3a蛋白表达水平的检测 |
| 1.2.4 水稻5个抽穗期主效基因mRNA转录水平的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 HH1外源cry1Ab/c基因转录和蛋白表达水平的检测 |
| 2.2 外源Cry1Ab/c蛋白与抽穗期主效蛋白的亚细胞共定位 |
| 2.3 外源Cry1Ab/c蛋白与5个抽穗期主效蛋白的互作 |
| 2.3.1 酵母双杂技术检测外源Cry1Ab/c蛋白与5个抽穗期主效蛋白互作 |
| 2.3.2 双分子荧光互补技术检测外源蛋白与5个抽穗期主效蛋白互作 |
| 2.3.3 免疫共沉淀技术检测外源Cry1Ab/c蛋白与Hd3a主效蛋白互作 |
| 2.4 外源Cry1Ab/c蛋白与Hd3a主效蛋白互作后Hd3a蛋白表达水平的检测 |
| 2.5 抽穗期主效基因mRNA表达量的分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）大豆品质改良相关基因GmAGL1,GmDof11和GmDof4的遗传转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表及其英汉对照 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 大豆遗传转化中常用的方法 |
| 1.1 农杆菌介导法 |
| 1.2 基因枪法 |
| 1.3 其他转化技术的应用 |
| 2 转基因方法在大豆种子成分和农艺性状改良中的应用 |
| 2.1 改良种子成分 |
| 2.2 增强生物和非生物抗性 |
| 3 植物转录因子相关研究 |
| 3.1 转录因子的特征 |
| 3.2 MADS-box转录因子 |
| 3.3 Dof转录因子 |
| 4 大豆转基因研究的目的和意义 |
| 4.1 转基因方法对大豆研究的意义 |
| 4.2 大豆转基因研究的发展前景 |
| 4.3 本文研究的目的和意义 |
| 第二章 大豆遗传转化受体筛选及MADS-box基因GmSEP3遗传转化初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同基因型大豆候选材料萌发率比较 |
| 2.2 不同基因型大豆候选材料GUS染色情况 |
| 2.3 候选大豆材料再生和增殖情况 |
| 2.4 候选大豆材料对不同筛选剂的敏感性比较 |
| 2.5 GmSEP3转基因大豆植株的获得和阳性鉴定 |
| 2.6 GmSEP3过表达植株的表型观察 |
| 3 讨论 |
| 3.1 受体材料的选择对大豆转基因研究的影响 |
| 3.2 不同基因型大豆对不同筛选剂的敏感性存在差异 |
| 3.3 MADS-box基因GmSEP3的作用 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 过表达MADS-box基因GmAGL1遗传转化研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转基因植株的获得和GmAGL1表达模式 |
| 2.2 GmAGL1过表达植株出现早花、早熟表型,花器官发育也受到影响 |
| 2.3 SD/LD条件下转基因植株都比对照提前开花 |
| 2.4 转基因大豆植株的农艺性状分析 |
| 2.5 过表达GmAGL1转基因植株的转录组分析 |
| 2.6 MADS-box基因表达差异和MADS-box蛋白含量分析 |
| 2.7 转基因植株光周期途径基因出现显着差异 |
| 2.8 其他开花调控途径的基因表达变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 MADS-box基因影响花器官发育 |
| 3.2 GmAGL1主要通过光周期途径促进开花 |
| 3.3 过表达GmAGL1对大豆生产的影响 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 过表达Dof基因GmDof11基因遗传转化初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 菌株和载体 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转基因植株的获得和阳性鉴定 |
| 2.2 转基因植株的GmDof11表达量分析 |
| 2.3 转基因植株的拷贝数鉴定 |
| 2.4 转基因植株的农艺性状分析 |
| 2.5 转基因植株的蛋白和油脂含量分析 |
| 2.6 T3代转基因植株LiCl耐受性研究 |
| 3 讨论 |
| 3.1 以GmCAX1作为抗性标记基因的可行性 |
| 3.2 GmDof11转录因子的作用 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 过表达Dof基因GmDof4基因遗传转化初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 菌株和载体 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转基因植株的获得和阳性鉴定 |
| 2.2 转基因株系的GmDof4相对表达量分析 |
| 2.3 转基因植株的拷贝数鉴定 |
| 2.4 转基因植株的农艺性状分析 |
| 2.5 转基因植株的蛋白和油脂含量分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 GmDof4基因的主要功能 |
| 3.2 植物分枝的影响因素及大豆分枝的相关研究 |
| 3.3 过表达GmDof4基因对大豆生产的意义 |
| 4 本章小结 |
| 全文结论和创新点 |
| 全文结论 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表或待发表的研究论文 |
| 致谢 |
（6）miR825/825*在蜡质芽孢杆菌AR156介导的系统抗病性及OsAGO2在水稻稻瘟病抗性中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 蜡质芽孢杆菌生防机理及灰霉病研究进展 |
| 1 芽孢杆菌生防机理研究 |
| 1.1 抑菌作用 |
| 1.2 溶菌作用 |
| 1.3 竞争作用 |
| 1.4 拮抗作用 |
| 1.5 诱导系统抗病性 |
| 1.5.1 诱导系统抗病性的诱导因子 |
| 1.5.2 诱导系统抗病性的表达 |
| 1.5.3 重要防卫反应 |
| 1.5.4 诱导系统抗病性的信号传递 |
| 2 蜡质芽孢杆菌的总结与展望 |
| 3 灰霉病及灰霉病菌的研究进展 |
| 3.1 灰霉病及灰霉病菌的危害及病征 |
| 3.2 灰霉病的侵染方式及侵染循环 |
| 3.3 灰霉病的致病机制及Small RNAs在其中的作用 |
| 参考文献 |
| 第二章 Small RNAs与AGOs蛋白家族参与植物内源免疫反应研究进展 |
| 1 参与Small RNAs合成的基本成分及作用 |
| 1.1 Dicer蛋白 |
| 1.2 AGO蛋白 |
| 1.3 RNA依赖性RNA聚合酶 |
| 2 microRNAs的生物合成及作用机制 |
| 2.1 microRNAs的生物合成 |
| 2.2 microRNAs的作用机制 |
| 3 siRNAs的生物合成及作用机制 |
| 3.1 siRNAs的生物合成 |
| 3.2 siRNAs的作用机制 |
| 4 Small RNAs在植物内源免疫反应中的抗病作用 |
| 5 microRNAs在植物与病原菌互作中的作用 |
| 6 总述 |
| 参考文献 |
| 第三章 稻瘟病及稻瘟病菌研究进展 |
| 1 稻瘟病及稻瘟病菌 |
| 1.1 稻瘟病的危害 |
| 1.2 稻瘟病的生活史及侵染循环过程 |
| 2 稻瘟病菌侵染过程的信号转导与调控机制 |
| 2.1 稻瘟病菌分生孢子的形成机制 |
| 2.2 寄主植物表面信号识别机制 |
| 2.3 稻瘟病菌附着胞形成机制 |
| 3 水稻抗性基因的研究概况 |
| 4 水稻与稻瘟病菌互作机制研究进展 |
| 4.1 植物免疫系统 |
| 4.1.1 PAMP-triggered immunity |
| 4.1.2 Effector-triggered immunity |
| 4.2 病原菌效应分子的毒性机制 |
| 4.3 植物抗病防卫基因 |
| 参考文献 |
| 下篇 研究内容 |
| 第一章 AR156介导拟南芥对灰霉病的诱导系统抗病性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物和供试菌株的培养及保存 |
| 1.2 培养基及试剂配制 |
| 1.3 生防菌AR156悬浮液的制备 |
| 1.4 灰霉病菌孢子悬浮液的制备 |
| 1.5 植物总蛋白的提取及PR1蛋白检测 |
| 1.6 蜡质芽孢杆菌AR156诱导拟南芥对灰霉菌抗病性表型测定 |
| 1.7 荧光定量PCR检测防卫相关基因的表达 |
| 1.8 突变体过氧化氢积累量测定 |
| 1.9 突变体胼胝质沉积测定 |
| 1.10 Western blot检测MPK6和MPK3蛋白的表达 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 AR156能产生有效的ISR抵抗灰霉菌的侵染 |
| 2.2 AR156能诱导PR1蛋白的表达、过氧化氢的积累和胼胝质的沉积 |
| 2.3 AR156介导的ISR是依赖于JA/ET信号通路和NPR1 |
| 2.4 AR156能激活防卫相关基因的表达、过氧化氢的积累和胼胝质的沉积 |
| 2.5 AR156能激活PTI参与植物的免疫反应 |
| 2.6 SA、JA/ET信号通路及NPR1参与AR156介导的诱导系统抗病性 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 miR825/825*在AR156诱导拟南芥对灰霉病系统抗病性中的作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物和供试菌株的培养及保存 |
| 1.2 培养基及试剂配制 |
| 1.3 生防菌AR156悬浮液的制备 |
| 1.4 灰霉病菌孢子悬浮液的制备 |
| 1.5 miRNAs转基因植物的构建 |
| 1.6 Northern blot |
| 1.6.1 转膜 |
| 1.6.2 化学交联 |
| 1.6.3 探针的制备 |
| 1.6.4 预杂交 |
| 1.6.5 杂交 |
| 1.6.6 洗膜 |
| 1.6.7 压片 |
| 1.7 植物总蛋白的提取及PR1蛋白检测 |
| 1.8 AR156诱导拟南芥对灰霉菌抗病性表型测定 |
| 1.9 过氧化氢积累量测定 |
| 1.10 胼胝质沉积测定 |
| 1.11 Western blot检测MPK6和MPK3蛋白的表达 |
| 1.12 miRNAs靶标基因的预测和分析 |
| 1.13 植物总RNA的提取及荧光定量PCR检测 |
| 1.14 miRNAs靶标基因的克隆及靶标关系验证 |
| 1.15 miRNAs靶标基因在AR156诱导拟南芥对灰霉菌抗病性表型测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 miR825/825~*参与调控AR156诱导拟南芥对灰霉菌的系统抗病性 |
| 2.2 miR825/825~*参与调控AR156激活的ISR |
| 2.3 miR825/825~*过表达或者功能抑制抑制突变体参与调控AR156诱导的防卫相关基因的表达、过氧化氢的积累和胼胝质的沉积 |
| 2.4 miR825/825~*过表达或者功能抑制突变体参与调控AR156介导的PTI影响了植物的基础免疫反应 |
| 2.5 miR825/825~*靶标植物内源R基因参与调控AR156介导的拟南芥对灰霉病菌的免疫反应 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 OsAGO2参与调控水稻对稻瘟病的免疫反应 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物和供试菌株的培养和保存 |
| 1.2 单一插入纯合子osago2缺失突变体的筛选及验证 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 水稻Genome DNA的提取 |
| 1.2.3 PCR验证及测序分析 |
| 1.3 OsAGOs基因转录水平检测 |
| 1.3.1 植物总RNA的提取 |
| 1.3.2 荧光定量PCR检测 |
| 1.4 突变体过氧化氢和胼胝质测定 |
| 1.4.1 突变体过氧化氢积累量测定 |
| 1.4.2 突变体胼胝质沉积量测定 |
| 1.5 突变体致病性测定 |
| 1.5.1 水稻喷雾接种 |
| 1.5.2 水稻叶片病斑统计和分级 |
| 1.5.3 水稻叶鞘注射侵入率统计和分级 |
| 1.6 荧光定量PCR检测突变体中防卫相关基因的表达 |
| 1.7 突变体中水杨酸含量的测定 |
| 1.7.1 水杨酸(SA)和水杨酸葡萄糖苷(SAG)提取 |
| 1.7.2 水杨酸含量测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 筛选到单一插入位点osago2纯合子 |
| 2.2 OsAGO2在侵染阶段差异表达 |
| 2.3 osago2缺失突变体影响了过氧化氢的积累 |
| 2.4 osago2缺失突变体影响了胼胝质的沉积 |
| 2.5 osago2缺失突变体参与稻瘟病菌的致病过程 |
| 2.5.1 osago2缺失突变体影响了稻瘟病菌的致病能力 |
| 2.5.2 osago2缺失突变体影响了稻瘟病菌的侵染能力 |
| 2.6 osago2缺失突变体影响了水杨酸相关基因的表达 |
| 2.7 osago2缺失突变体影响了水杨酸的含量 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 OsAG02互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物 |
| 1.2 培养基及试剂配制 |
| 1.3 AGOs蛋白序列及系统发育树 |
| 1.4 sAGO2的克隆及表达载体的构建 |
| 1.5 酵母转化系统 |
| 1.6 水稻cDNA文库的构建 |
| 1.7 大肠杆菌超级感受态细胞的制备和转化方法 |
| 1.7.1 大肠杆菌JM109超级感受态细胞的制备 |
| 1.7.2 大肠杆菌JM109超级感受态细胞的转化方法 |
| 1.8 农杆菌感受态细胞的制备和转化方法 |
| 1.8.1 农杆菌GV3101/EHA105冻融感受态细胞的制备 |
| 1.8.2 农杆菌GV3101/EHA105冻融感受态细胞的转化方法 |
| 1.9 烟草中农杆菌介导的瞬时表达 |
| 1.10 水稻原生质体的提取和转化方法 |
| 1.10.1 水稻原生质体的提取 |
| 1.10.2 PEG介导水稻原生质体的转化方法 |
| 1.11 水稻总蛋白的提取 |
| 1.12 亲和纯化试验流程 |
| 1.13 质谱分析 |
| 1.14 候选蛋白功能域分析 |
| 1.15 Co-IP验证 |
| 1.16 Westerb blot检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Yeast two-hybrid筛选OsAGO2互作蛋白 |
| 2.2 Yeast two-hybrid验证OsAGO2与OsPAL1在体内互作 |
| 2.3 亲和纯化筛选OsAGO2的靶标蛋白 |
| 2.4 OsAGO2互作蛋白的质谱鉴定结果分析 |
| 2.5 候选蛋白功能域分析 |
| 2.6 Co-IP验证候选蛋白与OsAGO2的互作关系 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结及创新点 |
| 附录 试验常用培养基 |
| 攻读博士学位期间发表的研究论文 |
| 致谢 |
（7）陆地棉类病变突变体的发现、功能解析及抗病育种利用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本文所用主要缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 程序性细胞死亡与类病变突变体的研究进展 |
| 1. 程序性细胞死亡(PCD) |
| 1.1 植物生长发育中的PCD |
| 1.1.1 大孢子细胞的PCD |
| 1.1.2 绒毡层细胞的的PCD |
| 1.1.3 自交不亲和性诱导的PCD |
| 1.1.4 助细胞的死亡和花粉管的破裂 |
| 1.1.5 木质部管状分子形成过程中的PCD |
| 1.1.6 叶片和花器官的衰老中的PCD |
| 1.2 环境影响触发的PCD |
| 1.2.1 盐胁迫导致的PCD |
| 1.2.2 干旱胁迫导致的PCD |
| 1.2.3 病原菌侵染导致的PCD |
| 2. 类病变突变体的研究进展 |
| 2.1 叶绿素的合成和降解过程 |
| 2.2 鞘脂类和氧化脂类等脂肪酸的代谢过程 |
| 2.3 植物的防卫免疫通路 |
| 2.4 胞内运输过程 |
| 2.5 核内信号的整合及调控基因表达过程 |
| 2.6 离子流或者ROS合成代谢过程 |
| 第二章 植物抗病机制的研究进展 |
| 1. PT1 |
| 2 ETI |
| 3 系统获得性抗性(SAR) |
| 3.1 SAR中的信号分子 |
| 3.1.1 SA |
| 3.1.2 脂类分子 |
| 3.1.3 活性氧(ROS) |
| 3.2 SA介导的信号通路 |
| 3.2.1 SA的合成 |
| 3.2.2 EDS1与PAD4 |
| 3.2.3 NPR1 |
| 3.2.4 TGA转录因子 |
| 3.2.5 病程相关蛋白PR |
| 3.3 SAR的健康代价 |
| 第三章 棉花的图位克隆与抗黄萎病研究进展 |
| 1. 棉属的起源与栽培品种的分类 |
| 1.1 棉属的起源 |
| 1.1.1 二倍体种的单源起源 |
| 1.1.2 异源四倍体起源 |
| 1.2 棉花栽培品种的分类 |
| 2. 关于棉花质量性状基因的图位克隆 |
| 2.1 质量性状的遗传研究方法 |
| 2.1.1 棉花的遗传标准系 |
| 2.1.2 遗传实验和对性试验 |
| 2.1.3 基于PCR技术的分子标记 |
| 2.2 质量性状图位克隆 |
| 2.2.1 海岛棉显性无腺体基因Gl_2~e的图位克隆 |
| 2.2.2 棉花叶形基因L_2的图位克隆 |
| 2.2.3 棉花显性光子基因(N1)的精细定位 |
| 2.2.4 棉花密生绒毛(T1)的精细定位 |
| 2.2.5 棉花Li1突变体的精细定位 |
| 2.2.6 棉花僵瓣棉im突变体的精细定位 |
| 2.2.7 棉花红株R1基因的精细定位 |
| 3. 关于棉花的抗黄萎病研究 |
| 3.1 棉花黄萎病病原菌 |
| 3.2 棉花抗黄萎病的研究进展 |
| 3.2.1 JA信号通路的基因的研究 |
| 3.2.2 钙离子信号的基因研究 |
| 3.2.3 木质素代谢过程基因的研究 |
| 3.2.4 多胺代谢途径相关基因的研究 |
| 3.2.5 ROS信号相关基因的研究 |
| 3.2.6 产生抗菌物质的基因的研究 |
| 本研究的目的和意义 |
| 第二部分 研究报告 |
| 第四章 棉花类病变突变体Ghlmm的精细定位、图位克隆及特征分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料与定位群体构建 |
| 1.2 棉花DNA的提取 |
| 1.3 标记扩增与电泳 |
| 1.3.1 引物来源 |
| 1.3.2 分子标记的扩增 |
| 1.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.4 遗传连锁图与物理图谱的构建 |
| 1.5 候选基因定量PCR分析 |
| 1.5.1 棉花RNA提取 |
| 1.5.2 CONA第一链的合成 |
| 1.5.3 荧光定量PCR |
| 1.6 基因克隆 |
| 1.6.1 候选基因的PCR扩增 |
| 1.6.2 候选基因PCR产物回收 |
| 1.6.3 候选基因PCR产物连接 |
| 1.6.4 候选基因连接产物转化 |
| 1.6.5 候选基因PCR产物测序 |
| 1.7 病毒介导的基因沉默技术(VIGS) |
| 1.7.1 GV3101农杆菌感受态的制备 |
| 1.7.2 重组质粒转入农杆菌 |
| 1.7.3 菌液准备及棉花子叶注射 |
| 1.8 组织器官特异表达 |
| 1.9 亚细胞定位 |
| 1.10 ALAO基因进化分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 拙花类病变突变体Ghlmm的发现及遗传分析 |
| 2.1.1 Ghlmm突变体的表型描述 |
| 2.1.2 Ghlmm突变体的遗传分析 |
| 2.2 精细定位 |
| 2.3 候选基因GhLMM的预测 |
| 2.4 候选基因Gh_D05G2254的排除 |
| 2.5 GhLMM基因功能简介 |
| 2.6 GhLMM基因组织特异表达分析 |
| 2.7 GhLMM基因亚细胞定位 |
| 2.8 ALAD基因家族的进化分析 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 棉花突变体的图位克隆 |
| 3.2 Gh_D05G2237基因提前终止导致Ghlmm突变体表型 |
| 3.3 GhLMM基因特征分析 |
| 第五章 棉花类病变突变体Ghlmm的黄萎病抗体鉴定及机理研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 生理数据的测定 |
| 1.2.1 ALA含量的测定 |
| 1.2.2 PBG含量测定 |
| 1.2.3 ALAD酶活测定 |
| 1.2.4 SA含量测定 |
| 1.2.5 ROS染色 |
| 1.2.6 过氧化氢检测 |
| 1.2.7 丙二醛(MDA)含量测定 |
| 1.2.8 过氧化氢酶(CAT)酶活测定 |
| 1.3 外施乙酰丙酸(LA) |
| 1.4 黄萎病病菌培养 |
| 1.4.1 黄萎病菌V991的活化及保存 |
| 1.4.2 PDA培养基 |
| 1.4.3 液体察氏培养基 |
| 1.5 黄萎病室内抗性鉴定 |
| 1.5.1 接种方法 |
| 1.5.2 病级调查 |
| 1.5.3 棉花体内黄萎病的定量检测 |
| 1.5.4 劈杆实验及徒手切片实验 |
| 1.5.5 病菌复苏实验 |
| 1.6 转录组测序 |
| 1.7 AIP处理 |
| 1.8 GhLMMD基因在E.coli中的表达、纯化和酶活性鉴定 |
| 1.8.1 原核表达载体的构建 |
| 1.8.2 GhLMMD在大肠杆菌中的表达 |
| 1.8.3 GhLMMD蛋白纯化 |
| 1.8.4 GhLMMD蛋白酶活测定 |
| 1.8.5 蛋白SDS-PAGE检测 |
| 1.8.6 蛋白Westen Blot检测 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 Ghlmm中ALA积累导致ROS产生 |
| 2.2 Ghlmm具有显着增强的黄萎病抗性 |
| 2.3 Ghlmm中抗病分子机理 |
| 2.4 突变体中ROS和SA的循环放大效应 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 引起Ghlmm突变体PCD的原因 |
| 3.2 Ghlmm突变体的抗病机制 |
| 3.3 叶绿体与抗病 |
| 第六章 GhLMM基因的剂量效应在棉花黄萎病抗性育种中的应用 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 相关生理数据的测定 |
| 1.3 LA处理 |
| 1.4 黄萎病病菌的培养 |
| 1.5 黄萎病抗性的室内鉴定 |
| 1.6 PR基因的表达分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 LA处理 |
| 2.2 (WO×Ghlmm) F_1黄萎病抗性鉴定 |
| 2.3 (WO×Ghlmm) F_1黄萎病抗性机理 |
| 2.4 Ghlmm突变体在抗病育种中的尝试 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 GhLMM基因在调控植物生长和抗病反应中具有剂量效应 |
| 3.2 Ghlmm突变体可应用于陆地棉黄萎病抗病育种 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附表1 全文用到的引物 |
| 附表2:ALAD基因在各个物种中的信息 |
| 附表3 生物进程GO富集 |
| 附表4 Ghlmm突变体中差异表达的PR基因 |
| 攻读博士学位期间发表及待发表论文 |
| 致谢 |
（8）超表达CdNF-YC和CdSAMDC提高海滨雀稗抗逆性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 海滨雀稗抗逆性研究进展 |
| 1.1 海滨雀稗的耐盐性研究 |
| 1.1.1 海滨雀稗对盐胁迫的形态学反应 |
| 1.1.2 海滨雀稗耐盐性机理研究 |
| 1.1.3 海滨雀稗耐盐性评价 |
| 1.2 海滨雀稗的耐旱性研究 |
| 1.2.1 海滨雀稗对干旱胁迫的形态学响应 |
| 1.2.2 海滨雀稗耐旱性评价 |
| 1.3 海滨雀稗耐寒性 |
| 1.3.1 海滨雀稗对低温胁迫的生理生化反应 |
| 1.3.2 海滨雀稗耐寒性评价 |
| 2 NF-Y转录因子与植物耐逆性 |
| 2.1 植物转录因子概述 |
| 2.2 NF-Y转录因子参与植物逆境响应 |
| 3 多胺与植物抗逆性 |
| 3.1 多胺代谢参与植物逆境响应 |
| 3.2 SAMDC基因与植物抗逆性 |
| 3.3 多胺代谢与GABA的生物学功能 |
| 4 禾本科草的转基因育种研究进展 |
| 4.1 植物转基因研究概况 |
| 4.2 农杆菌介导的禾本科草的转化研究进展 |
| 5 研究的目的和意义 |
| 第二章 海滨雀稗遗传转化体系的建立 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料 |
| 2.2 菌株、质粒、引物 |
| 2.3 工具酶及主要试剂 |
| 2.4 外植体的消毒、接种 |
| 2.5 离体再生培养基 |
| 2.6 诱导并继代胚性愈伤组织 |
| 2.7 不同基因型的愈伤组织对再生率的影响 |
| 2.8 不同培养基对的再生率的影响 |
| 2.9 农杆菌的培养方法 |
| 2.10 农杆菌侵染过程 |
| 2.11 潮霉素筛选压的选择 |
| 2.12 优化农杆菌介导的遗传转化条件 |
| 2.13 抗性愈伤组织筛选与再生 |
| 2.14 GUS基因瞬时、稳定表达染色 |
| 2.15 GUS表达效率和转化效率的统计 |
| 2.16 抗性植株PCR检测 |
| 2.17 Southern blot检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 建立高效的离体再生体系 |
| 3.2 潮霉素筛选压的确定 |
| 3.3 转化条件的优化 |
| 3.4 农杆菌介导的转化体系的建立 |
| 3.5 GUS表达效率与转化效率统计 |
| 3.6 抗性再生植株的分子检测与表型鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 外植体基因型和培养基对愈伤组织诱导、再生的影响 |
| 4.2 潮霉素浓度对遗传转化的影响 |
| 4.3 乙酰丁香酮对遗传转化的影响 |
| 4.4 共培养时间对遗传转化的影响 |
| 4.5 菌液浓度对遗传转化的影响 |
| 4.6 表面活性剂对遗传转化的影响 |
| 4.7 超声波及真空处理对遗传转化的影响 |
| 第三章 表达CdNF-YC和CdSAMDC转基因海滨雀稗的鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料 |
| 2.2 菌株、质粒、引物 |
| 2.3 植物材料养护管理 |
| 2.4 除草剂抗性鉴定 |
| 2.5 质粒提取 |
| 2.6 酶切鉴定 |
| 2.7 PCR产物回收纯化 |
| 2.8 目的片段和目的载体的连接 |
| 2.9 转化大肠杆菌感受态及阳性克隆筛选 |
| 2.10 农杆菌EHA105电激感受态细胞的制备 |
| 2.11 电激转化农杆菌及阳性克隆筛选 |
| 2.12 抗性植株PCR检测 |
| 2.13 Southern blot检测 |
| 2.14 数据统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 获得转基因抗性再生植株 |
| 3.2 PCR鉴定 |
| 3.3 Southern blot鉴定 |
| 3.4 除草剂抗性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 获得表达CdNF-YC转基因海滨雀稗新种质 |
| 4.2 获得表达CdSAMDC转基因海滨雀稗新种质 |
| 4.3 获得抗除草剂转基因海滨雀稗新种质 |
| 第四章 表达CdNF-YC海滨雀稗的耐逆性分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料处理 |
| 2.2 实时定量PCR引物 |
| 2.3 植物总RNA提取 |
| 2.4 RNA样品检测 |
| 2.5 第一链cDNA的合成 |
| 2.6 实时定量PCR |
| 2.7 相对电导率 |
| 2.8 叶片相对含水量 |
| 2.9 复水后存活率 |
| 2.10 叶片枯黄率 |
| 2.11 地下部生物量 |
| 2.12 最大光化学效率 |
| 2.13 叶绿素含量 |
| 2.14 离子含量测定 |
| 2.15 数据统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转基因海滨雀稗的基因表达量分析 |
| 3.1.1 转基因海滨雀稗的CdNF-YC和Hpt表达 |
| 3.1.2 CdNF-YC调控海滨雀稗相关胁迫基因的表达 |
| 3.2 转基因海滨雀稗的耐旱性分析 |
| 3.3 转基因海滨雀稗的耐盐性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 表达CdNF-YC基因调控胁迫相关基因的表达 |
| 4.2 表达CdNF-YC提高海滨雀稗的耐旱性 |
| 4.3 表达CdNF-YC提高海滨雀稗的耐盐性 |
| 第五章 表达CdSAMDC海滨雀稗的耐逆性分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料处理 |
| 2.2 实时定量PCR引物 |
| 2.3 植物总RNA提取 |
| 2.4 RNA样品检测 |
| 2.5 第一链cDNA的合成 |
| 2.6 实时定量PCR |
| 2.7 叶片中多胺含量的测定 |
| 2.8 相对电导率 |
| 2.9 叶片相对含水量 |
| 2.10 复水后存活率 |
| 2.11 叶片枯黄率 |
| 2.12 地下部生物量 |
| 2.13 最大光化学效率 |
| 2.14 叶绿素含量 |
| 2.15 离子含量测定 |
| 2.16 半致死温度的测定 |
| 2.17 低温存活率 |
| 2.18 数据统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转基因海滨雀稗的SAMDC表达量分析 |
| 3.2 转基因海滨雀稗内源多胺含量对逆境的响应 |
| 3.3 转基因海滨雀稗内源GABA含量对逆境的响应 |
| 3.4 转基因海滨雀稗的耐旱性分析 |
| 3.5 转基因海滨雀稗的耐寒性分析 |
| 3.6 转基因海滨雀稗的耐盐性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 表达CdSAMDC提高海滨雀稗的耐旱性 |
| 4.2 表达CdSAMDC提高海滨雀稗的耐寒性 |
| 4.3 表达CdSAMDC提高海滨雀稗的耐盐性 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1 主要结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（9）外源基因插入对禾谷镰孢菌次生代谢产物DON毒素合成影响的风险评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略说明表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 禾谷镰孢菌单端孢霉烯族毒素的研究进展 |
| 1.1 禾谷镰孢菌毒素类型 |
| 1.1.1 单端孢霉烯族毒素 |
| 1.2 单端孢霉烯族毒素的生物合成途径 |
| 1.3 单端孢霉烯族毒素降解途径 |
| 2 转基因食品的研究现状 |
| 2.1 转基因技术 |
| 2.2 转基因食品的发展 |
| 2.2.1 国际植物转基因食品的发展 |
| 2.2.2 国内植物转基因食品的发展 |
| 2.3 植物转基因常用的目的基因 |
| 2.3.1 品质改良基因 |
| 2.3.2 抗除草剂基因 |
| 2.3.3 抗病基因 |
| 2.3.4 抗虫基因 |
| 2.4 植物转基因的方法 |
| 2.4.1 农杆菌介导法 |
| 2.4.2 基因枪法 |
| 2.5 植物转基因食品的优势 |
| 2.5.1 减少农药使用,保护环境 |
| 2.5.2 提高产量,降低生产成本,增加农民收入 |
| 2.5.3 改良作物的遗传品质 |
| 2.6 植物转基因食品的弊端 |
| 2.6.1 毒性问题 |
| 2.6.2 过敏性问题 |
| 2.6.3 抗生素的抗性问题 |
| 2.6.4 非预期效应问题 |
| 3 本文研究目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 hph和Cry1Ac定点插入对禾谷镰孢次生代谢产物DON毒素生物合成的影响研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 转化片段 |
| 1.2.1 潮霉素磷酸转移酶基因(hph) |
| 1.2.2 Bt毒蛋白基因(Cry1Ac) |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 DNA和RNA的提取 |
| 1.5.1 禾谷镰孢菌基因组DNA提取(CTAB法) |
| 1.5.2 禾谷镰孢菌基因组RNA提取 |
| 1.6 qRT-PCR反应 |
| 1.6.1 RNA反转 |
| 1.6.2 qRT-PCR |
| 1.7 原生质体转化方法 |
| 1.8 hph和Cry1Ac定点插入突变体的获得及验证 |
| 1.8.1 载体构建 |
| 1.8.2 突变体验证 |
| 1.9 突变体表型测定 |
| 1.10 突变体产DON能力及毒素合成基因表达测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 定点插入突变体验证 |
| 2.2 定点插入突变体表型的变化 |
| 2.3 定点插入突变体产DON的能力 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 hph和Cry1Ac随机插入对禾谷镰孢菌次生代谢产物DON毒素生物合成的影响研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 转化片段 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 试剂 |
| 1.5 DNA和RNA提取 |
| 1.6 qRT-PCR反应 |
| 1.7 原生质体转化方法 |
| 1.8 hph和Cry1Ac随机插入突变体的获得及验证 |
| 1.9 突变体毒素合成基因tri5的表达量测定 |
| 1.10 致病力测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 随机插入突变体验证 |
| 2.2 hph随机插入突变体毒素合成基因tri5的表达 |
| 2.3 Cry1Ac随机插入突变体毒素合成基因tri5的表达 |
| 2.4 突变体离体毒素验证 |
| 2.5 突变体致病力验证 |
| 2.6 随机插入突变体毒素合成基因tri5的表达量的概率分布直方图 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 外源基因随机插入禾谷镰孢菌的位点研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 DNA和RNA提取 |
| 1.5 qRT-PCR反应 |
| 1.6 原生质体转化方法 |
| 1.7 突变体单拷贝插入验证 |
| 1.8 突变体毒素合成基因tri5的表达测定 |
| 1.9 致病力测定 |
| 1.10 Tail-PCR扩增随机插入突变体的hph和Cry1Ac的侧翼序列 |
| 1.11 Tail-PCR产物的纯化、测序及比对 |
| 1.12 毒素合成水平验证 |
| 1.12.1 载体构建 |
| 1.12.2 突变体验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 外源基因单拷贝插入验证 |
| 2.2 Tail-PCR定位hph在F.graminearum中的插入位置 |
| 2.3 Tail-PCR定位Cry1Ac在F.graminearum中的插入位置 |
| 2.4 hph、neo和Cry1Ac定点插入FGSG_01445和FGSG_05569的突变体验证 |
| 2.5 hph、neo和Cry1Ac分别定点插入基因FGSG_01445和FGSG_05569中的突变体的表型测定 |
| 2.6 hph、neo和Cry1Ac分别定点插入基因FGSG_01445和FGSG_05569中的突变体产DON能力 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）转G2-aroA基因抗草甘膦棉花植株的获得及特异性检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 我国棉田杂草的研究现状 |
| 1.1.1 棉田杂草的发生规律 |
| 1.1.2 棉田杂草的防控措施 |
| 1.2 除草剂发展与应用 |
| 1.2.1 除草剂的发展概况 |
| 1.2.2 除草剂分类和特点 |
| 1.3 草甘膦除草剂研究现状 |
| 1.3.1 草甘膦的作用机制 |
| 1.3.2 草甘膦的作用靶标 |
| 1.3.3 草甘膦抗性获得的机制 |
| 1.4 棉花抗除草剂基因工程发展现状 |
| 1.4.1 外源基因的遗传转化方法 |
| 1.4.2 我国草甘膦抗性基因的发掘概况 |
| 1.4.3 抗除草剂棉花研究进展 |
| 1.5 研究的目的意义及研究思路 |
| 第二章 转基因抗草甘膦棉花的获得及遗传分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 转基因抗草甘膦棉花的获得 |
| 2.2.2 转基因棉花的PCR检测 |
| 2.2.3 转基因棉花的卡那霉素筛选 |
| 2.2.4 转基因棉花的草甘膦筛选 |
| 2.2.5 荧光定量PCR方法检测转基因棉花的拷贝数 |
| 2.2.6 转基因棉花的Southern检测 |
| 2.2.7 转基因棉花的反转录PCR检测 |
| 2.2.8 转基因棉花的Western检测 |
| 2.2.9 转基因棉花的遗传学分析 |
| 2.2.10 转基因棉花草甘膦耐受性鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 转基因棉花外源基因侧翼序列分析及特异性检测方法建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料和所需试剂 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 外源插入基因侧翼序列的获得 |
| 3.2.2 插入结构特征分析 |
| 3.2.3 转基因棉花BG2-7 特异性PCR检测方法的建立 |
| 3.2.4 转基因棉花BG2-7 纯合子筛选方法的建立 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 全文结论及创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、Development of Transgenic Cotton Resistant to Fungal Diseases and of Mutants by T-DNA Insertional Mutagenesis（论文参考文献）
- [1]天麻抗真菌蛋白研究进展[J]. 王彩云,侯俊,周茂嫦,徐庆祝,张翔宇,阮培均. 北方园艺, 2021(08)
- [2]棉花腺体形成相关基因GhERF105的功能分析[D]. 吴朝峰. 华中农业大学, 2020(05)
- [3]GhPUB17在棉花抗黄萎病中的功能鉴定[D]. 秦涛. 华中农业大学, 2019(01)
- [4]通过基因差异表达及蛋白互作研究抗虫转基因水稻在不同环境条件下的非预期效应[D]. 付健美. 南京农业大学, 2018
- [5]大豆品质改良相关基因GmAGL1,GmDof11和GmDof4的遗传转化研究[D]. 曾旋睿. 南京农业大学, 2017(07)
- [6]miR825/825*在蜡质芽孢杆菌AR156介导的系统抗病性及OsAGO2在水稻稻瘟病抗性中的功能研究[D]. 聂萍萍. 南京农业大学, 2017(04)
- [7]陆地棉类病变突变体的发现、功能解析及抗病育种利用[D]. 柴启超. 南京农业大学, 2017(07)
- [8]超表达CdNF-YC和CdSAMDC提高海滨雀稗抗逆性研究[D]. 吴雪莉. 南京农业大学, 2017(05)
- [9]外源基因插入对禾谷镰孢菌次生代谢产物DON毒素合成影响的风险评估[D]. 蔡义强. 南京农业大学, 2016(02)
- [10]转G2-aroA基因抗草甘膦棉花植株的获得及特异性检测[D]. 张小兵. 中国农业科学院, 2015(03)