一、共转染野生型p16,p53抑癌基因对HL-60细胞的抑制作用（论文文献综述）
张灵丽[1]（2021）在《新型p53截短体Δ107p53在急性髓系白血病中的作用研究》文中提出目的:通过对本院2015-2020年初发AML患者临床样本的收集,回顾性分析了伴有TP53截短突变的AML患者的临床特征及其预后意义,并且从细胞水平对Δ107p53这一新型p53截短体的生物学功能进行研究,以期探讨p53截短体对AML患者的影响,进而为AML患者的个体化治疗提供依据。方法:1、AML患者临床病历的收集回顾性分析本院2015年3月-2020年1月收治的243例（M3除外）初发AML患者的临床资料,记录其临床特征、免疫表型、细胞遗传学和分子生物学特征,分析患者生存情况及影响其预后的主要因素。2、截短体Δ107p53三维蛋白结构分析利用I-TASSER在线工具对p53蛋白全长及Δ107p53蛋白的三维结构进行预测,使用Pymol软件（v1.3.1）对所预测的蛋白质进行突变构建及结构比对分析。3、慢病毒表达体系的构建和稳定克隆的筛选从Gene Bank检索TP53基因（Gen Bank:NM＿000546）的cDNA全长序列,跟据Δ107p53的缺失位点和R175H-p53的突变位点得出其CDS区的全长序列,将该序列插入pCDH1-MCS1-EF1-copGFP表达质粒中,构建pCDH1-Δ107p53,pCDH1-R175H-p53,pCDH1-WT-p53和pCDH1-空载表达载体,采用一代测序的方法鉴定目的质粒是否构建成功。选用TP53基因缺失的人类早幼粒细胞白血病细胞系HL60作为本次实验的模式细胞。通过脂质体法共转染人胚肾细胞系293T细胞,48h和96h分别收集病毒液,并感染HL60细胞。构建细胞模型分别如下:Δ107p53为实验组,R175H-p53为阳性对照组,WT-p53为阴性对照组,pCDH1-空载为空载体对照组。通过流式分选仪分选GFP阳性细胞,通过有限稀释法筛选稳定表达克隆株,并通过一代测序及Western blot鉴定细胞模型中目的基因的表达。4、CCK-8法和软琼脂糖克隆形成试验检测Δ107p53对HL60细胞增殖的影响利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测各组细胞的增殖能力。每组细胞设置3个复孔,分别检测0h,24h,48h,72h和96h各组细胞的吸光度值,用此来反映各组细胞的增殖情况。用软琼脂糖克隆形成试验来验证结果,每组细胞设置3个复孔,每孔接种2000个细胞,2周后扫描拍照,使用Image J软件对其集落大小和数目进行分析。5、流式细胞术检测Δ107p53对HL60细胞周期的影响收集上述四组稳定克隆细胞,预冷PBS洗涤2次后混悬计数。采用碘化丙啶（PI）对处于对数增长期的各组细胞的DNA进行染色,利用流式细胞仪检测其荧光强度来反映DNA的含量,用Mod Fit LT软件对其结果进行分析,以此来计算处于G0/G1期,S期和G2/M期的细胞比例。6、RT-qPCR和Western blot检测p21和bax的表达使用Trizol法提取各组细胞内的总RNA,利用荧光定量PCR（RT-qPCR）检测p53下游基因P21和BAX的表达。利用Western blot检测p53,p21和bax的表达,使用BCA法对蛋白进行定量,使用Alpha View SA软件对蛋白条带进行分析。结果:1、p53截短体与AML患者预后不良明显相关243例AML患者中,有213例无TP53的突变,17例点突变和13例截短突变。与野生组相比,截短突变组和点突变组患者完全缓解率（CR）更低（P<0.001）,无病生存期（DFS）和总生存期（OS）更短（P<0.001）。这一结果提示TP53截短突变与点突变对AML患者的预后影响类似,均表现为DFS和OS变短,预后变差。2、截短体Δ107p53蛋白三维结构明显改变利用I-TASSER工具对p53蛋白全长及Δ107p53蛋白的三维结构进行预测,使用Pymol软件（v1.3.1）对其结构进行分析比对,结果显示Δ107p53的蛋白结构发生明显改变,该截短突变导致p53的部分DNA结合区（DBD）,全部核定位信号结构域（NLS）和部分四聚化结构域缺失,构象突变最终可能会影响p53的正常生物学功能。3、慢病毒表达体系的构建和稳定克隆的筛选通过一代测序的结果显示,TP53各序列均已正确插入pCDH1-MCS1-EF1-copGFP载体中,并且转化结果显示均有GFP的强表达,提示各慢病毒表达载体:pCDH1-Δ107p53,pCDH1-R175H-p53和pCDH1-WT-p53构建成功。用慢病毒感染HL60细胞并利用有限稀释法筛选稳定表达细胞克隆,流式检测其阳性率达95%以上。Western blot的结果显示有目的基因的表达,提示各表达载体均已成功转入HL60细胞系中,各细胞模型构建成功。4、截短体Δ107p53对HL60细胞有明显的促增殖作用CCK-8结果显示,Δ107p53组在48h后开始明显增殖,与WT-p53组相比,差异有统计学意义（P<0.001）。克隆形成试验结果表明,Δ107p53克隆数量与克隆体积均高于WT-p53组,以上结果提示:截短体Δ107p53具有和R175H-p53同样的促细胞增殖效应。5、截短体Δ107p53促进细胞周期由G0/G1期向S期过渡流式细胞仪检测G0/G1期,S期和G2/M期各期细胞的比例,其结果显示,与WT-p53组相比,Δ107p53和R175H-p53的G0/G1期细胞比例均降低,S期细胞比例均升高,差异有统计学意义（P<0.001）。这一结果提示Δ107p53和R175H-p53都促进细胞周期由G0/G1期向S期过渡。6、截短体Δ107p53抑制了p21和bax的表达RT-qPCR的结果显示,Δ107p53组与WT-p53组相比,P21和BAX的表达明显减低（P<0.001）,Western blot结果与此结果一致,该结果提示,Δ107p53可抑制p21和bax的表达。结论:1.从临床数据分析得出,具有p53截短体的AML患者表现为DFS和OS变短,预后变差。2.细胞水平实验证明,新型截短体Δ107p53能够促进细胞增殖,其可能是通过抑制bax的表达来实现的,并通过抑制p21的表达来促进细胞周期由G0/G1期向S期过渡从而发挥其致癌作用。
魏鑫[2]（2021）在《CircHIPK3在急性髓系白血病发病中作用及机制的初步研究》文中研究指明目的:急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是骨髓造血干细胞恶性克隆性疾病。病理过程表现为髓系干细胞恶性克隆增殖,进而抑制正常造血细胞产生和生长。临床症状主要表现为发热、贫血和出血等等。目前关于AML的病因尚不明确,可能与遗传因素、环境因素、理化刺激有关。随着新型化疗药物、靶向药物的产生及骨髓移植技术的发展,AML的治疗和预后得到显着提高,但仍有大部分病人存在原发耐药、复发及预后不良,因此探讨AML的发病机制、寻找新的治疗靶点和预后相关的分子标志物迫在眉睫。CircRNA是一类特殊的具有闭合环状结构的非编码RNA,因其反向剪接成环的特殊结构,不易被RNA酶降解,在不同物种和生物进化过程中高度保守,具有组织特异性和发育过程的表达特异性。近年来关于circRNA的研究日益增多,多项研究表明,其在多种病理生理过程中发挥重要作用。尤其是在各类恶性肿瘤中,已证实circRNA发挥癌基因或抑癌基因的作用参与肿瘤的发生发展。目前关于AML和circRNA的相关性研究报道不多,circRNA在AML中的表达情况及其作用机制需进一步深入研究。多项研究表明circHIPK3在多种实体恶性肿瘤中存在明显差异表达,发挥癌基因或抑癌基因作用参与肿瘤发生进展,在部分肿瘤中可作为特异的生物学标志物评判疗效、提示预后。但circHIPK3在急性髓系白血病中的表达情况、生物学功能及作用机制尚无研究。本研究应用Realtime-PCR检测circHIPK3在急性髓系白血病患者中的表达情况,并分析表达水平与FAB分型、染色体异常、基因突变及预后情况之间的相关性;合成相应的circHIPK3干扰si RNA转染AML细胞系,通过CCK8、流式细胞术检测细胞增殖、凋亡和细胞周期的变化,Western Blot检测细胞凋亡和周期相关蛋白的变化,探讨circHIPK3在体外对AML生物学功能的影响;通过生信分析预测与circHIPK3结合的miRNA及靶基因,双荧光素酶验证靶向结合,细胞Rescue实验等验证circHIPK3发挥分子海绵机制影响AML的生物学行为。研究方法:1.本实验收集AML患者60例,正常对照30例,应用Realtime-PCR方法检测circHIPK3表达情况,分析其与FAB分型、染色体异常、基因突变、疗效和临床预后的相关性。2.验证circHIPK3在AML细胞系中的表达情况,选取基因表达高的细胞系HL-60和U937,合成circHIPK3的si RNA瞬时转染至细胞内。通过CCK8检测细胞增殖情况、流式细胞术检测细胞凋亡和周期情况、Western Blot检测细胞周期和凋亡相关蛋白,验证circHIPK3体外对于AML细胞系生物学行为的影响。3.RNA核质分离实验验证circHIPK3的亚细胞定位;应用starbase和miRDB、microrna等数据库预测circHIPK3和miR-193a-3p及miR-193a-3p与靶基因c-Kit的相互作用关系;双荧光素酶报告基因实验验证其靶向结合;通过Realtime-PCR检测AML患者骨髓单个核细胞和细胞系中miR-193a-3p和c-Kit的表达情况并分析与circHIPK3的相关性;应用Realtime-PCR及Western Blot检测circHIPK3表达变化对miR-193a-3p和c-Kit表达的影响;检测miR-193a-3p表达变化对c-Kit表达的影响;细胞Rescue实验验证circHIPK3发挥分子海绵作用,吸附miR-193a-3p,通过circHIPK3/miR-193a-3p/c-Kit轴参与AML的生物学行为。4.统计学分析。实验数据使用SPSS22.0及Graph Pad Prism 7.0软件进行统计学处理。细胞实验每组数据至少重复三次。患者样本中分类变量以率或构成比表示,差异分析使用卡方检验;连续变量应用Kolmogorov-Smirnov方法检验其正态分布性,符合正态分布的以均数±标准差表示,差异分析应用独立样本T检验;不符合正态分布的连续数据以中位数、四分位数间距表示,差异分析应用非参数秩和检验方法;采用Kaplan-Meier生存曲线进行预后分析,应用log-rank检验进行差异分析;单因素和COX多因素分析评估预后危险因素;以p<0.05表示统计学具有显着差异。结果:1.circHIPK3在AML中的表达及临床意义1.1与正常对照组相比,AML初诊患者circHIPK3的表达水平显着上调。1.2 circHIPK3的表达水平在AML的FAB、染色体分型和特征性基因突变类型中有所差异;初诊AML患者中,circHIPK3的表达水平和患者骨髓原始细胞比例和FLT3突变情况呈正相关;生存分析结果显示,AML总体患者和正常核型患者组低表达circHIPK3具有更优的总生存时间和无复发生存时间,差异具有统计学意义。单因素和多因素COX回归分析提示circHIPK3是评估AML患者预后的独立风险因素。2.circHIPK3对急性髓系白血病细胞系细胞功能的影响2.1 circHIPK3在急性髓系白血病细胞系中高表达。2.2 HL-60和U937细胞中circHIPK3表达水平相对更高,选择此两个细胞系进行si RNA敲减效率验证,其中circHIPK3 si RNA1片段敲减效率更高,选择此片段进行后续试验。2.3 CCK8实验结果显示与空白组和阴性对照组相比,si-circHIPK3组AML细胞增殖能力显着减低。2.4流式细胞术结果显示与空白组和阴性对照组相比,si-circHIPK3组AML细胞凋亡比例明显升高,同时Western blot结果提示凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3表达明显上调、抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下降。2.5流式细胞术结果显示与空白组和阴性对照组相比,si-circHIPK3组AML细胞更多的阻滞于G1期,进入S期比例明显下调,同时Western blot结果提示细胞周期蛋白cyclin D1表达明显下调。3.circHIPK3作用AML的分子机制研究3.1核质分离试验结果提示circHIPK3主要定位于细胞浆中。3.2 RNase R实验证实circHIPK3的环状结构存在。3.3 si RNA敲减circHIPK3后不影响其线性转录本HIPK3的表达。3.4 miR-193a-3p是circHIPK3的下游靶基因:生物信息学预测circHIPK3可靶向结合miR-193a-3p,miR-193a-3p在AML患者和细胞系中低表达,在患者中与circHIPK3呈负相关,双荧光素酶报告基因检测进一步确定两者靶向结合,敲减circHIPK3可以上调miR-193a-3p的表达。3.5 c-Kit是miR-193a-3p调控的下游靶基因:生物信息学预测miR-193a-3p和c-Kit靶向结合,并与circHIPK3存在共同结合位点,circHIPK3和c-Kit可竞争结合miR-193a-3p,c-Kit基因在AML细胞系和患者中明显高表达,在AML患者中和miR-193a-3p的表达呈明显负相关,双荧光素酶报告基因进一步确定两者靶向关系,过表达miR-193a-3p可以抑制c-Kit表达。3.6 circHIPK3通过靶向miR-193a-3p影响c-Kit表达调控AML的生物学行为:在AML患者中circHIPK3表达水平和c-Kit明显正相关,敲减circHIPK3后可抑制c-Kit的表达,共转染miR-193a-3p inhibitor可以部分回复circHIPK3敲减对c-Kit表达的影响,同时共转染miR-193a-3p inhibitor可以部分回复circHIPK3减低对HL-60和U937细胞的增殖、凋亡和周期的影响,Western blot结果提示凋亡和周期相关蛋白cleaved Caspase-3、Bcl-2和cyclin D1表达水平部分回复。结论:1.circHIPK3在AML患者中明显高表达,并与部分反映AML肿瘤负荷的指标密切相关,高表达circHIPK3的AML患者预后不佳,circHIPK3表达情况是评估AML预后的独立风险因素。2.circHIPK3在髓系白血病细胞系中高表达,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,发挥癌基因作用。3.circHIPK3发挥分子海绵作用,竞争性抑制miR-193a-3p,进而调控靶基因c-Kit,通过circHIPK3/miR-193a-3p/c-Kit轴调控AML生物学行为。
温超[3]（2020）在《miR-34a靶向调控HDAC1基因对急性髓系白血病细胞凋亡的影响》文中研究指明目的:探讨急性髓系白血病细胞中miR-34a对HDAC1的调控作用以及对细胞凋亡的影响。方法:1.将miR-34a mimics、miR-34a inhibitor、miR-34a scramble转染到HL-60细胞中,通过调控急性髓系白血病细胞中miR-34a表达,观察人急性髓细胞白血病细胞细胞增殖和凋亡,明确miR-34a对急性髓细胞白血病细胞细胞增殖和凋亡的影响。2.观察在miR-34a对急性髓细胞白血病细胞细胞增殖和凋亡的影响过程中,HDAC1是否miR-34a的靶基因。Western blot检测miR-34a表达改变后HDAC1蛋白表达情况。3.构建含HDAC1 3’UTR的双荧光素酶报告载体,利用双荧光素酶报告实验验证miR-34a与HDAC1的作用位点。构建不含HDAC13’UTR的表达载体,回复实验验证miR-34a与HDAC1的相互作用。结果:1、miR-34a对HL-60细胞增殖和凋亡的影响（1）HL-60细胞中miR-34a表达qRT-PCR检测显示,miR-34a mimics转染HL-60细胞后,miR-34a表达水平与miR-NC组和Blank组比较显着升高（P<0.05）,而将miR-34a inhibitor转染细胞后,miR-34a表达水平较miR-NC组和Blank组比较显着降低（P<0.05）。Blank组与miR-NC组比较无统计学差异（P>0.05）。（2）调控miR-34a对HL-60细胞增殖和凋亡的影响转染细胞48h后,CCK8实验显示,与miR-NC组和Blank组相比,miR-34a组细胞增值率显着降低（P<0.05）,72和96h后差异更为显着。inhibitor组转染细胞48h后,细胞的增殖活力较对照组显着升高（P<0.05）,72和96 h后差异更加显着。Blank组和miR-NC组在各时间点比较差异无统计学意义（P>0.05）。Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞检测发现miR-34a mimics转染细胞后,细胞凋亡率较Blank组和miR-NC组显着升高（P<0.05）;而miR-34a inhibitor转染HL-60细胞后,细胞凋亡率较较Blank组和miR-NC组显着降低（P<0.05）。2、miR-34a促进HL-60细胞凋亡的作用与其对HDAC1表达调控关系将miR-34a mimics转染HL-60细胞后,HDAC1蛋白表达与对照组相比显着降低,而降miR-34aa inhibitor转染HL-60细胞后,HDAC1蛋白表达较对照组显着升高这显示HDAC1可能是miR-34a的作用靶点。（2）将HDAC1野生型与突变型3′UTR区与双荧光报道载体pmirGLO连接,将重组载体与miR-34a mimics或miR-34a Scramble两两组合共转染到HL-60细胞中,比较各组荧光信号的强弱。结果显示,HDAC1-mut和miR-34a mimics共转染细胞后,细胞的荧光信号值与对照组（miR-NC和HDAC1-mut共转染组）相比无明显变化（P>0.05）,而将miR-34a mimics和HDAC1-wt共转染细胞后荧光信号值与对照组比较显着降低（P<0.05）。提示,miR-34a能够与HDAC1的3′UTR区结合,抑制HL-60细胞中HDAC1蛋白表达。（3）构建不含HDAC1 mRNA 3′UTR区的真核表达载体pcDNA3.1-HDAC1,将pcDNA3.1-HDAC1与miR-34a mimics共同转染HL-60细胞。结果显示将pcDNA3.1-HDAC1与miR-34a mimics共转染HL-60细胞后,细胞的凋亡率显着降低,而将miR-34a mimics转染细胞后,细胞的凋亡率显着升高。这提示将不含3’UTR的pcDNA3.1-HDAC1转染到HL-60细胞后,能够回复miR-34a引起的促凋亡作用。miR-34a是通过作用HDAC1 3’UTR种子区结合,发挥促凋亡抑制作用。结论:1、AML细胞族HL-60中过表达miR-34a显示细胞的增殖活力降低,凋亡率升高;而抑制miR-34a抑制细胞凋亡。miR-34a能够促进AML细胞凋亡,发挥抑癌基因的作用。2、HDAC1是miR-34a的靶基因,miR-34a通过与HDAC1 mRNA的3’UTR区结合,促进HL-60细胞的凋亡。
尹小林[4]（2020）在《组蛋白去甲基化酶RBP2和RNA结合蛋白Lin28B介导慢粒急变的调控机制》文中指出研究背景慢性粒细胞白血病（Chronic Myeloid Leukemia,CML,简称慢粒）是一种由染色体t（9;22）易位形成BCR-ABL融合基因为特征的骨髓增殖性肿瘤,BCR-ABL融合基因编码的融合蛋白具有异常的酪氨酸激酶活性,由此激活下游信号通路导致疾病的发生。慢粒自然病程分为慢性期（Chronic phase,CP）、加速期（Accelerated phase,AP）和急变期（Blastphase,BP）。酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）能够抑制BCR-ABL的酪氨酸激酶活性,是慢粒的首选治疗方法,多数慢性期患者应用TKIs治疗后能够长期生存,然而慢粒一旦急变,TKIs疗效不佳,致死率极高,中位生存期仅为6个月。慢粒急变机制复杂,尚未完全阐明,因此解析慢粒急变机制及其关键调控分子,是有效防控慢粒急变的科学前提。慢粒急变是一个多步骤、多变化的过程,由于慢粒急变过程通常伴随BCR-ABL高表达和过度激活状态,不受控制的BCR-ABL激活被认为是促进慢粒急变的驱动力,因此,慢粒急变存在BCR-ABL依赖机制。另外,研究发现,除癌基因的激活或扩增、抑癌基因的功能缺失或者突变等遗传学打击之外,信号通路关键分子调控异常和表观遗传学失衡等也参与慢粒急变,因而慢粒急变还存在BCR-ABL非依赖途径。视网膜母细胞瘤结合蛋白2（RBP2）属于KDM5家族,靶向作用于组蛋白H3第四位赖氨酸（H3-K4）的二甲基化和三甲基化（Me2/Me3）,介导组蛋白去甲基化。同时RBP2含有一个组蛋白去甲基化酶标志性基序的JmjC结构域,发挥转录调节功能,从而调控多种细胞生物学过程。近年来,RBP2被报道参与胃癌、肺癌、乳腺癌、恶性胶质瘤、肾癌、卵巢癌和肝癌等多种肿瘤的发生发展。我们团队在前期研究中发现RBP2在慢粒急变期表达明显下调,通过调控miR-21以BCR-ABL非依赖途径介导慢粒急变的进程。然而,R1BP2是否可以通过BCR-ABL依赖途径介导慢粒急变仍不清楚,值得进一步研究。Lin28B是Lin28家族的一种RNA结合蛋白,可识别结合RNA3’UTR基序,从而调控靶基因的表达,介导多种生物学功能。Lin28B在多种肿瘤中高表达,包括淋巴瘤、神经母细胞瘤,结肠癌和肝癌等。研究发现Lin28B在急性髓系白血病中高表达,通过调控miRNAlet-7促进白血病细胞增殖异常和细胞周期紊乱,且受转录因子NF-κB调控,在白血病干细胞维持中起关键作用,因此具有干预AML潜在靶点的特征。新近研究还发现Lin28B同家族的Lin28A还具有DNA结合蛋白作用。然而,目前在慢粒中尚无Lin28B相关研究,是否在慢粒急变中发挥作用也尚需探究。本研究发现RBP2和Lin28B在慢粒急变中表达异常,通过在细胞分子水平、动物整体水平和人体骨髓组织水平等研究,我们发现组蛋白去甲基化酶RBP2以BCR-ABL依赖的途径、RNA结合蛋白Lin28B调控miR-181d转录以BCR-ABL非依赖的途径促进慢粒急变。此为探究RBP2和Lin28B在慢粒急变中作用及其调控机制提供新的思路。研究目的:（一）探究RBP2在慢粒急变中以BCR-ABL依赖途径介导的效应与机制。（二）探究Lin28B在慢粒急变中以BCR-ABL非依赖途径介导的效应与机制。研究方法和研究结果:（一）组蛋白去甲基化酶RBP2通过调控PTEN以BCR-ABL依赖的途径介导慢粒急变（1）过表达RBP2抑制白血病细胞的增殖在慢粒急变细胞K562和MEG01中转染RBP2过表达质粒,应用EdU细胞增殖实验和软琼脂克隆形成实验检测RBP2对于白血病细胞增殖的作用。结果提示RBP2过表达显着抑制白血病细胞的增殖能力。（2）检测RBP2与BCR-ABL之间的相互作用应用Western blot检测BCR-ABL 阳性细胞系（K562和MEG01）与BCR-ABL阴性细胞系（HL60和U937）中RBP2的表达。结果提示RBP2在BCR-ABL阳性细胞系中表达水平明显低于BCR-ABL阴性细胞系中表达,提示RBP2与BCR-ABL存在相关性。在K562细胞、MEG01细胞和慢粒患者原代细胞中转染RBP2过表达质粒,应用Western blot和qRT-PCR的方法检测,发现在过表达RBP2后,BCR-ABL的活性形式,即磷酸化BCR-ABL（p-BCR-ABL）水平明显降低,而BCR-ABL的总蛋白水平和mRNA水平并未见明显降低,提示RBP2在转录后水平调控BCR-ABL的磷酸化水平。（3）探究RBP2调控磷酸化BCR-ABL（p-BCR-ABL）的机制在K562和MEG01细胞中转染RBP2过表达质粒后,应用qRT-PCR方法检测调控磷酸化相关分子PTEN、SHP1、PP2A、SET和PTP1B的表达水平,发现仅PTEN的mRNA表达水平明显升高。在齐鲁医院收集42例慢粒慢性期和急变期患者骨髓标本,应用qRT-PCR检测发现RBP2和PTEN的mRNA表达呈现正相关的关系。进一步在K562和MEG01细胞中转染RBP2过表达质粒,用Western blot实验检测发现PTEN的蛋白水平明显上升。在慢粒患者骨髓细胞中转染RBP2过表达质粒,应用qRT-PCR实验检测发现PTEN的mRNA水平随之上升。提取杂合型敲基因小鼠与野生型小鼠的骨髓细胞,应用qRT-PCR实验检测发现随着RBP2表达下调,PTEN的表达水平也明显降低。以上结果说明,RBP2在慢粒患者原代细胞、慢粒急变细胞系和小鼠体内均能转录调控PTEN的表达。（4）探究RBP2调控PTEN表达的机制分别将空载质粒、RBP2过表达野生型质粒和RBP2酶活性突变的过表达质粒（RBP2 H483A）转染进 K562 和 MEG01 细胞中,应用 Western blot 及 qRT-PCR检测发现野生型RBP2过表达质粒能够显着上调PTEN的mRNA和蛋白水平,而酶活性突变的过表达质粒RBP2H483A不影响PTEN表达,说明RBP2调控PTEN的表达依赖其去甲基化酶活性。在K562细胞中应用染色质免疫共沉淀（ChIP）实验发现RBP2能够结合在PTEN启动子区域。随后在K562细胞中转染RBP2过表达质粒后进行ChIP实验,结果提示随着RBP2过表达,RBP2在PTEN启动子区域富集明显增加,而H3K4me2和H3K4me3在PTEN启动子区域富集明显减少。提示RBP2结合在PTEN启动子区域依赖其去甲基化酶活性。在HEK293细胞中转染RBP2过表达质粒或者RBP2 H483A质粒后,共转染PTEN启动子或者PTEN启动子结合位点突变的荧光素酶报告质粒,进行双荧光素酶活性实验。检测发现过表达RBP2后PTEN启动子活性明显升高,而RBP2 H483A对PTEN启动子活性没有明显影响,RBP2过表达质粒和RBP2H483A质粒对于结合位点突变型PTEN启动子活性均没有明显影响。以上结果说明RBP2可以调控PTEN启动子活性,且该作用依赖于其去甲基化酶活性。（5）PTEN调控磷酸化BCR-ABL（p-BCR-ABL）表达的机制研究在K562细胞中转染PTEN siRNA和MEG01细胞中转染PTEN过表达质粒,应用Westernblot及qRT-PCR实验检测,发现随着PTEN表达降低,BCR-ABL、STAT5和ERK的磷酸化水平均明显上升,而过表达PTEN后,BCR-ABL、STAT5和ERK的磷酸化水平则明显降低,BCR-ABL的mRNA表达水平并未随着PTEN的变化而改变。在K562细胞和共转染BCR-ABL与PTEN过表达质粒的HEK293细胞中,进行蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）实验,结果证实内源性和外源性的PTEN与BCR-ABL均可以相互结合。说明PTEN是通过与BCR-ABL相互结合,介导BCR-ABL去磷酸化。（6）BCR-ABL调控RBP2的表达水平分别在不同时间或不同浓度伊马替尼（IM）处理K562细胞后,进行Western blot和qRT-PCR实验,发现伴随伊马替尼（IM）处理时间的延长或者浓度的提高,RBP2的mRNA和蛋白水平呈现逐步上升的趋势,提示抑制BCR-ABL激酶活性能够诱导RBP2的表达。进一步在K562细胞中分别转染BCR-ABL siRNA或者BCR-ABL过表达质粒,然后应用Western blot及qRT-PCR方法检测RBP2及BCR-ABL的mRNA及蛋白表达水平,结果发现改变BCR-ABL的表达后,RBP2的mRNA和蛋白表达水平受到BCR-ABL的负性调控,表明BCR-ABL能够在转录水平上负性调控RBP2的表达。（7）RBP2通过BCR-ABL依赖途径调控白血病细胞增殖在K562和MEG01细胞中分别共转染RBP2过表达质粒与BCR-ABL过表达质粒、单独转染RBP2过表达质粒或者空载质粒,应用EdU和软琼脂克隆形成实验检测白血病细胞增殖的变化。结果提示过表达RBP2抑制白血病细胞增殖,而过表达BCR-ABL可以逆转RBP2过表达对于细胞增殖的抑制能力,说明RBP2抑制白血病细胞的增殖主要通过BCR-ABL通路。（二）RNA结合蛋白Lin28B通过调控miR-181d以BCR-ABL非依赖途径介导慢粒急变（1）Lin28B的表达在慢粒急变中明显上升在GEO数据库GSE4170数据集中,比较29种RNA结合蛋白在慢粒慢性期和急变期的表达差异,发现RNA结合蛋白Lin28B在慢粒急变中变化最为明显。在齐鲁医院收集的慢粒慢性期和急变期患者骨髓标本,应用qRT-PCR和免疫荧光检测发现Lin28B的mRNA和蛋白表达水平在急变期相较于慢性期都明显上升,提示Lin28B可能参与了慢粒急变的进程。（2）检测Lin28B对于慢粒急变细胞增殖的影响应用慢病毒感染K562和MEG01细胞系构建Lin28B稳定敲除的细胞系,应用EdU实验检测发现在敲除Lin28B后,白血病细胞增殖能力明显下降。（3）检测Lin28B与白血病细胞分化之间的关系分别用DMSO和PMA处理K562和MEG01细胞诱导其向巨噬细胞样和粒细胞样分化,应用Western blot和qRT-PCR检测发现白血病细胞诱导分化后,Lin28B的mRNA和蛋白表达水平明显下降,说明Lin28B参与白血病细胞分化受阻。（4）探究Lin28B调控miR-181d的机制应用慢病毒感染K562和MEG01细胞系,构建Lin28B稳定干扰细胞系,应用qRT-PCR实验检测发现随着Lin28B表达下降,miR-181d的表达水平也明显下降。提示miR-181d是Lin28B的潜在靶基因。在K562和HL60细胞中进行染色质免疫共沉淀（ChIP）实验,检测发现Lin28B能够结合在miR-181d的启动子区域。然后在K562和HL60细胞中敲除Lin28B的表达,进行双荧光素酶活性实验发现Lin28B敲除后miR-181d启动子的荧光素酶活性明显降低。以上结果说明,Lin28B结合在miR-181d启动子区域激活其转录。（5）miR-181d直接调控靶基因PDCD4表达的机制在 K562 和 HL60 细胞中分别转染 miR-181d mimics 或者 miR-181d inhibitor或者相对应的对照,应用Western blot检测发现升高miR-181d的表达后,PDCD4的蛋白水平可见显着下降。反之,降低miR-181d表达后,PDCD4的蛋白水平明显上升。提示PDCD4是miR-181d的潜在靶基因。随后,构建PDCD43’UTR以及PDCD43’UTRmut（结合位点突变）双荧光素酶报告质粒。在K562和HL60细胞系中分别转染miR-181d mimics、miR-181d inhibitor或者相应的对照,共转染荧光素酶报告质粒,进行双荧光素酶报告实验提示过表达miR-181d抑制PDCD4 3’UTR荧光素酶的活性,降低miR-181d的表达则会上调PDCD4 3’UTR荧光素酶的活性,而miR-181d表达变化对结合位点突变的PDCD4 3’UTR mut荧光素酶活性并没有明显影响。以上结果说明miR-181d通过结合在PDCD4 3’UTR调控PDCD4的表达。（6）NOD-SCID小鼠体内实验证明敲除Lin28B能够抑制白血病细胞生长应用亚致死剂量的X射线辐射NOD-SCID小鼠,24小时后将1 × 1 06个Lin28B稳定敲除K562细胞以及对照K562细胞分别皮下注射在小鼠两侧腋窝,每隔3天测量一次肿瘤体积,于18天后处死小鼠,测量肿瘤重量。结果提示Lin28B敲除组小鼠肿瘤体积生长速度和重量明显小于对照组,说明在体内敲除Lin28B能够抑制白血病细胞的增殖能力。研究结论:1.发现组蛋白去甲基化酶RBP2通过结合在PTEN启动子区域激活其转录;PTEN与BCR-ABL相互结合,介导BCR-ABL去磷酸化;由此构成“RBP2/PTEN/BCR-ABL”调控轴,以BCR-ABL依赖途径介导慢粒急变。2.发现RNA结合蛋白Lin28B通过结合在miR-181d启动子区域激活其转录,miR-181d表达水平增高;miR-181d结合于PDCD4 3’UTR区域,抑制PDCD4的表达;由此构成“Lin28B/miR-181d/PDCD4”调控轴,以BCR-ABL非依赖途径介导慢粒急变。
曲艺[5]（2020）在《长链非编码RNA HOXA-AS2对急性髓系白血病的作用及机制研究》文中认为目的:急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）的发生发展是多因素共同介导的多步骤过程,涉及多种调控分子改变。其中,遗传学畸变,包括染色体数目和/或结构异常、重现性基因突变或缺失等,相互作用、协同驱动AML的产生,同时也是影响患者临床预后的重要因素。目前AML中这些已知的遗传分子改变被广泛应用于区分疾病分型、指导个性化治疗以及评估预后风险,使得患者的五年生存率有了显着提升。但是,仍然有部分患者预后不良;特别的是,相同遗传亚型患者的治疗效果和临床结局也并非一致,提示这些病例可能伴有至今还未被发现的分子水平异常。因此,更进一步探究疾病发生发展的机制,挖掘新的关键调控分子对提高AML的疗效与长期生存率至关重要。90%的人类基因组DNA转录为非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）,其中转录本长度超出200个核苷酸者被归类为长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）,因其开放阅读框架长度不足而不能编码蛋白或编码能力极低。lncRNA的表达存在组织特异性与时间空间特异性,在细胞核和细胞浆中均有分布,可与DNA分子、RNA分子和蛋白质相互结合互相作用,从表观遗传学水平、转录水平和转录后水平等层面调节靶基因表达,在物种进化、生物体发育和衰老、细胞稳态维系、物质代谢和疾病发生发展等众多生理病理进程中扮演重要角色。在造血系统中,lncRNA能够维持干细胞的自我更新,促进造血细胞的定向分化与成熟,参与造血免疫系统的发育和激活。近年来,越来越多的研究发现AML中存在特定lncRNA表达异常。这些lncRNA在AML中发挥近似原癌基因或抑癌基因的作用,与疾病的启动、维持、发展及复发密切相关,更有文献报道lncRNA还参与AML细胞对化疗敏感或耐药的发生。深入研究lncRNA,为理解AML的本质提供全新视野,有利于理清AML发病和治疗的分子调控机制,为疾病诊断、靶向治疗和预后评估提供新的思路。同源盒基因（homeobox gene,HOX）是造血干/祖细胞分化成熟的主控基因,在正常造血过程中不可或缺,其表达异常可导致白血病的发生与发展。研究发现大量lncRNA位于HOX基因簇中或与之相关,包括HOTAIR、HOTAIRM1和HOTTIP等。HOX基因簇lncRNA在AML的恶性进程中起至关重要的调控作用,影响细胞增殖、分化、周期和凋亡等生物学行为。临床上,HOX基因簇lnc RNA被证实与AML患者诊断分型和生存结局有明确的关联性,可作为有效的生物学标志指导治疗和评估预后。HOXA-AS2是长度为1048个核苷酸,定位于7号染色体长臂1区5带7q15.1,处于HOXA3和HOXA4基因间的反义lncRNA。研究显示HOXA-AS2在多种恶性实体肿瘤中异常高表达,与肿瘤的发病、侵袭、转移及预后关系密切。在实体种瘤中,HOXA-AS2可通过调节组蛋白修饰、作为分子海绵吸附抑制mi RNA表达等方式发挥促癌功能。但是在AML中,HOXA-AS2的表达、临床意义、生物学功能及分子作用机制尚不清楚。鉴于此,本研究旨在检测HOXA-AS2在急性髓系白血病中的表达情况,分析其表达水平与患者临床资料的相关性及意义,研究HOXA-AS2对人髓系白血病细胞株生物学行为的影响,探索HOXA-AS2在AML中作用的下游目的基因及调控分子机制,为AML的诊疗提供全新的的生物学标志物及相应的实验理论基础。研究方法:1.收集初治成人AML患者108例、非恶性血液病对照者36例的骨髓标本,免疫磁珠分选法分离6例健康产妇脐血CD34阳性细胞标本,qRT-PCR实验检测HOXA-AS2的表达差异,分析研究HOXA-AS2表达水平与AML患者临床分型、实验室指标、疗效和长期生存等参数的相关性。2.HOXA-AS2的体外功能研究:培养人髓系白血病细胞株,qRT-PCR实验检测各细胞株内源性HOXA-AS2的表达,选用相对高水平表达HOXA-AS2的细胞株,感染慢病毒介导的靶向HOXA-AS2的shRNA以下调其表达水平,应用CCK-8、流式细胞术、EdU染色、Hoechst染色、Western-blot等实验观察敲减HOXA-AS2对人髓系白血病细胞增殖、分化、周期及凋亡等生物学行为的影响。3.HOXA-AS2调控的分子机制研究:核质分离结合qRT-PCR实验明确HOXAAS2在人髓系白血病细胞中的亚细胞定位;qRT-PCR和Western Blot实验检测敲减HOXA-AS2后邻近基因HOXA3、HOXA4表达的改变;通过文献检索推测HOXAAS2可能通过PI3K/AKT信号通路发挥作用,SOX4是HOXA-AS2潜在靶基因之一,Western Blot实验检测敲减HOXA-AS2后PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的改变;qRT-PCR和Western Blot实验检测敲减HOXA-AS2后SOX4表达的变化;qRTPCR实验检测AML患者中SOX4和HOXA-AS2的表达关系;分别共转染shRNA control+vector、shRNA control+SOX4 OE、HOXA-AS2 shRNA+vector、HOXA-AS2shRNA+SOX4 OE质粒,应用CCK-8、流式细胞术、Western blot实验探索HOXA-AS2是否通过SOX4发挥作用;生物信息学预测能与HOXA-AS2和SOX4 3’UTR区共同结合的miR-124-3p,使用qRT-PCR实验检测敲减HOXA-AS2后miR-124-3p表达的改变;转染miR-NC及miR-124-3p mimic质粒,qRT-PCR和Western blot实验检测上调miR-124-3p表达后HOXA-AS2和SOX4表达的变化;qRT-PCR实验检测AML患者中miR-124-3p与HOXA-AS2、SOX4的表达关系;双荧光素酶报告基因实验明确miR-124-3p是否分别与HOXA-AS2和SOX4 3’UTR在相同的位点靶向结合;在已感染shRNA control和HOXA-AS2 shRNA的细胞株中再分别转染miRNC及miR-124-3p inhibitor质粒,qRT-PCR和Western Blot实验检测共转染各组中SOX4表达的变化;应用CCK-8实验、流式细胞术探索miR-124-3p在AML中的生物学作用;应用CCK-8、流式细胞术、Western blot实验研究HOXA-AS2和miR-124-3p、miR-124-3p和SOX4双重作用下髓系白血病细胞生物学行为的变化。4.细胞实验每组重复3次。所得实验数据应用GraphPad Prism 6.0和SPSS 22.0软件进行统计学分析,其中分类变量以率或构成比表示,差异分析使用卡方检验;连续变量使用Kolmogorov-Smirnov法检验数据分布正态性,正态分布的连续变量以均数±标准差表示,差异分析使?独?样本t检验,非正态分布的连续变量以中位数、四分位数间距表示,差异分析使用非参数秩和检验;生存分析使用KaplanMeier法,差异分析应用log-rank检验,多因素分析应用Cox回归模型;所有检验均为双侧检验,P值<0.05表示差异有统计学意义。结果:1.HOXA-AS2在AML中的表达及临床意义1.1与非恶性血液病对照组和CD34阳性细胞组比较,初治AML患者中HOXAAS2的表达水平显着上调。1.2 HOXA-AS2的表达水平在FAB亚型、染色体核型分型与特征性基因突变类型中有所差异;AML患者中,高HOXA-AS2表达与高外周血白细胞计数、高骨髓原始细胞比例、微小残留病阳性、染色体预后危险分层高危以及早期死亡成正相关;AML患者获得完全缓解后HOXA-AS2的表达水平较初诊时明显下调;生存分析显示,高HOXA-AS2表达的AML患者总生存时间及无复发生存时间相对更短于HOXA-AS2低表达者,其中在染色体核型正常患者中,这种差异有统计学意义,进一步进行单因素和多因素分析发现高HOXA-AS2表达是染色体核型正常患者预后不佳的独立危险因素。2.HOXA-AS2对人髓系白血病细胞株生物学行为的影响2.1 HOXA-AS2在不同人髓系白血病细胞株中的表达水平较对照组均显着上调。2.2 HL-60和K562细胞株中内源性HOXA-AS2的表达水平相对更高,在这2株细胞系中感染3条不同的HOXA-AS2 shRNAs,其中HOXA-AS2 shRNA1和HOXA-AS2 shRNA2的敲减效率相对更高（敲减效率超过70%）,在后续实验中应用此2条shRNAs。2.3 CCK-8实验结果显示HOXA-AS2敲减组的细胞增殖能力较阴性对照组和空白组显着减弱;Western Blot实验结果显示HOXA-AS2敲减组中增殖相关蛋白PCNA的表达水平较阴性对照组和空白组显着下调。2.4流式及EdU染色实验结果显示HOXA-AS2敲减组中细胞被阻滞于G0/G1期,进入S期的细胞比例较阴性对照组和空白组明显下调;Western Blot实验结果显示HOXA-AS2敲减组中周期调控相关蛋白cyclin D1及CDK4的表达较阴性对照组和空白组明显受抑制。2.5流式及Hoechst染色实验结果显示HOXA-AS2敲减组细胞凋亡比例较阴性对照组和空白组明显增加;Western Blot实验结果显示HOXA-AS2敲减组凋亡相关蛋白cleaved PARP、cleaved Caspase 3、cleaved Caspase 9和BAX蛋白表达水平较阴性对照组和空白组均显着上调,抗凋亡蛋白BCL2表达明显受抑制。2.6流式检测结果显示HOXA-AS2敲减组CD11b阳性细胞比例与阴性对照组和空白组比较未见明显差异。3.HOXA-AS2作用AML的分子机制研究3.1 HOXA-AS2在人髓系白血病细胞质和细胞核中均有表达,但主要表达于细胞质。3.2 HL-60和K562细胞敲减HOXA-AS2后其邻近基因HOXA3和HOXA4的表达均无显着变化。3.3 HL-60和K562细胞敲减HOXA-AS2后磷酸化PI3K、磷酸化AKT蛋白表达水平显着下调,P21和P27蛋白表达水平明显上调。HL-60和K562细胞敲减HOXA-AS2后SOX4 mRNA和蛋白表达水平均明显下调;AML患者中SOX4显着高表达、且与HOXA-AS2的表达成正相关;过表达SOX4部分恢复敲减HOXA-AS2对HL-60和K562细胞增殖抑制、阻滞细胞周期于G0/G1期及诱导凋亡的作用。3.4 HL-60和K562细胞敲减HOXA-AS2后miR-124-3p的表达显着上调;HL-60和K562细胞上调miR-124-3p的表达后显着降低HOXA-AS2的表达水平,SOX4的表达也受明显抑制;AML患者中miR-124-3p显着低表达且与HOXA-AS2和SOX4的表达成负相关;双荧光素酶报告基因实验证实miR-124-3p可分别与HOX-AS2和SOX4 3’UTR在相同位点靶向结合;同时敲减HOXA-AS2并下调miR-124-3p表达的髓系白血病细胞中SOX4 mRNA和蛋白的表达水平较单纯敲减HOXA-AS2细胞组显着降低,但明显高于单纯下调miR-124-3p表达细胞组。3.5 miR-124-3p在AML中起抑癌作用,上调miR-124-3p表达能够抑制HL-60和K562细胞增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期及诱导细胞凋亡,其生物学功能与敲减HOXA-AS2的趋势一致。3.6下调mi R-124-3p表达能够部分挽救敲减HOXA-AS2引起的HL-60和K562细胞增殖抑制、G0/G1期细胞阻滞及细胞凋亡增加,下调miR-124-3p表达所导致的促进髓系细胞白血病生长的作用也被HOXA-AS2 shRNA部分逆转。3.7过表达SOX4能够部分逆转上调miR-124-3p表达所引起的HL-60和K562细胞增殖抑制、周期阻滞于G0/G1期及诱导细胞凋亡的作用。结论:1.HOXA-AS2在急性髓系白血病患者中高表达,与反映病情严重的临床参数成正相关;高HOXA-AS2表达患者预后趋势不佳,在染色体核型正常患者中,HOXA-AS2高表达是预后不良的独立危险因素。2.HOXA-AS2在髓系白血病细胞系中高表达,起促癌作用,促进髓系白血病细胞增殖、抑制细胞凋亡,对细胞分化无显着影响。3.HOX-AS2靶向结合miR-124-3p,减弱其对SOX4的负性调控作用,从而促进髓系白血病细胞的生长。
林晓骥[6]（2019）在《miR-148b通过Ezrin蛋白调控弥漫性大B细胞淋巴瘤药物敏感性的研究》文中指出研究背景和目的:miRNAs是一类长度为二十几个核苷酸的内源性非编码调控RNA,通过靶基因mRNA裂解或序列特异性翻译抑制来发挥重要作用,参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物学过程。目前很多研究结果揭示在许多肿瘤中存在着miRNAs的调控异常,从而影响着肿瘤的发生发展、转移和浸润。弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）中最常见的类型。CHOP方案是目前被证实的治疗DLBCL的最经典治疗方案,然而超过50%的患者仍会出现耐药或复发的现象。现研究发现miRNAs与弥漫大B细胞淋巴瘤耐药性存在密切相关。miR-148b位于人染色体12q13.13上,在结肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤等多种肿瘤组织中普遍存在表达异常。多个研究表明,上调MiR-148b可以逆转非小细胞肺癌细胞株对顺铂的耐药性,而miR-148b的上调同样可以增加人Burkitt淋巴瘤Raji细胞株对放疗的敏感性。然而,miR-148b在DLBCL耐药中的作用还没有得到研究。因此,本研究旨在研究miR-148b在DLBCL的耐药中的潜在作用和机制,为逆转耐药和靶向治疗提供新的理论思路。实验方法:1.收集DLBCL患者的新鲜肿瘤组织,根据CHOP方案治疗反应情况分为CHOP敏感组和CHOP耐药组,实时荧光定量PCR 比较两组miR-148b表达情况。2.采用低浓度药物浓度递增的方法建立人DLBCL耐药细胞株CRL2631/CHOP,采用CCK-8方法比较不同浓度CHOP对CRL2631细胞和耐药株CRL2631/CHOP细胞的活性影响,以及采用Western blot方法检测MDR-1蛋白水平在CRL2631细胞和CRL2631/CHOP细胞的表达情况。3.收集CRL2631细胞和CRL2631/CHOP细胞的总RNA,实时荧光定量PCR 比较两组miR-148b的表达情况。4.根据生物信息学预测软件,寻找miR-148b潜在的靶基因。采用经典的双荧光素酶报告基因实验,将野生型/突变型Ezrin 3’ UTR荧光素酶报告载体和miR-148b inhibitor/miR-148b mimic共转染CRL2631细胞,按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒,分别检测各组细胞荧光素酶和海肾荧光素酶信号,并以海肾荧光素酶活性作为对照,计算荧光素酶相对活性。5.分别将miR-148b inhibitor和miR-148b mimic转染CRL2631细胞后,采用实时荧光定量PCR和Western blot检测Ezrin mRNA和蛋白的表达情况。6.通过实时荧光定量PCR和Western blot分别比较DLBCL患者CHOP敏感组与CHOP耐药组两组和CRL2631细胞与CRL2631/CHOP细胞两组的Ezrin mRNA和蛋白表达水平,并分析DLBCL患者的Ezrin mRNA和miR-148b表达的相关性。7.分别将 miR-148b inhibitor、NC、si-Ezrin 和 si-control 转染至 CRL2631 细胞,采用CCK-8方法检测不同浓度CHOP对各组CRL2631细胞的活性影响,并采用Western blot检测各组Ezrin和MDR-1的表达情况。8.分别将 miR-148b mimic、pre-NC、pcDNA-Ezrin 和 pcDNA 转染至 CRL2631/CHOP细胞,采用CCK-8方法检测不同浓度CHOP对各组CRL2631/CHOP的活性影响,并采用Western blot检测各组Ezrin和MDR-1的表达情况。9.分别将agomir-148b与agomir-NC转染CRL2631/CHOP细胞,然后在裸鼠背部皮下接种成瘤,采用CHOP方案进行处理后观察比较两组皮下移植瘤生长情况;取下肿瘤组织,采用实时荧光定量PCR检测两组的miR-148b表达情况;采用实时荧光定量PCR和Western blot检测两组Ezrin的mRNA和蛋白表达情况。结果:1.诱导产生了人DLBCL耐药细胞株CRL2631/CHOP;相比较CRL2631细胞,CRL2631/CHOP细胞对CHOP的敏感性下降,IC50值明显升高,MDR-1蛋白水平表达也显着提高。2.DLBCL患者CHOP敏感组肿瘤组织的miR-148b表达水平显着高于CHOP耐药组,而CRL2631/CHOP细胞的miR-148b表达水平显着低于CRL2631细胞。3.通过生物信息学软件（RAID v2.0）预测发现,Ezrin是miR-148b的直接靶基因。相对于对照组,miR-148b mimic+野生型Ezrin 3’UTR载体（WT）组荧光素酶活性明显降低,而miR-148bmimic+突变型Ezrin 3’UTR载体（MUT）组荧光素酶活性无明显改变。相反,在miR-148b inhibitor+WT组,荧光素酶活性与对照组显着提升,而miR-148b inhibitor+MUT组的荧光素酶活性改变与对照组比较并无显着差异。4.上调miR-148b的表达后,CRL2631细胞的Ezrin mRNA和Ezrin蛋白的表达量均较对照组显着下降。另外,与对照组相比,miR-148b的表达下调后,CRL2631细胞的Ezrin mRNA和蛋白表达量呈显着提升。5.DLBCL患者CHOP敏感组的Ezrin mRNA和蛋白表达水平显着低于CHOP耐药组,而CRL2631/CHOP细胞的Ezrin mRNA和蛋白均表达水平显着高于CRL2631细胞;进一步发现,DLBCL患者中,miR-148b与Ezrin mRNA表达存在直线负性相关关系。6.miR-148b inhibitor转染CRL2631细胞后,Ezrin的蛋白表达上调,细胞对CHOP的敏感性下降,IC50值明显升高,MDR-1蛋白水平表达也显着提高;共同转染miR-148b inhibitor 和 si-Ezrin 后,miR-148b inhibitor+si-Ezrin组 CRL2631 细胞的 Ezrin蛋白表达较miR-148b inhibitor组明显降低,细胞对CHOP敏感性显着提升,MDR-1蛋白水平表达下降。7.miR-148b mimic转染CRL2631/CHOP细胞后,Ezrin的蛋白表达下调,细胞对CHOP的敏感性增强,IC50值明显下降,MDR-1蛋白表达水平也显着下降;而共同转染 miR-148b mimic 和 PcDNA-Ezrin 后,miR-148b mimic+PcDNA-Ezrin 组CRL2631/CHOP细胞的Ezrin蛋白表达较miR-148b mimic组明显上调,细胞对CHOP敏感性显着下降,MDR-1蛋白水平表达明显上升。8.裸鼠在CHOP处理后,agomir-148b组皮下移植瘤体积较agomir-NC组显着减小;另外,而agomir-148b组的miR-148b表达水平显着高于agomir-NC组,而agomir-148b组的Ezrin mRNA和蛋白均表达水平显着低于agomir-NC组。结论:1.miR-148b在耐药性DLBCL患者及CRL2631/CHOP细胞中呈现低表达。2.Ezrin在耐药性DLBCL患者及CRL2631/CHOP细胞中呈现高表达3.Ezrin为miR-148b的靶基因4.miR-148b通过靶向调控Ezrin调节DLBCL细胞对CHOP的耐药性6.本研究结果有助于探索DLBCL细胞耐药性中的关键作用的分子及其调控机制,为逆转耐药和靶向治疗提供新的理论思路。
郑卓军[7]（2018）在《MicroRNA-183-5p靶向Erbin调控急性髓系白血病增殖与分化的机制研究》文中研究指明急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种常见的血液系统恶性肿瘤。成人总体发病率75.3/10万人,死亡率53.4/10万人,发病率和死亡率在成人所有恶性肿瘤中位居第13位及第9位。目前AML治疗进展缓慢,尽管对AML的生物学特征的理解日渐深入,新的靶向治疗药物被研发使用,但总体生存率仍低。具有自我更新能力的白血病干细胞是白血病细胞恶性增殖的“罪魁祸首”,而这些细胞具有高增殖、低凋亡、分化阻滞、耐药等特性,导致白血病病人在化疗放疗得到完全缓解后复发率仍非常高。AML发病机制复杂,异质性极高,绝大部分类型治疗效果差,预期生存期短。分子生物学特征是判断AML预后的重要标志之一。超过95%的AML病人至少携带1种体细胞突变。目前临床常用预后相关基因仍然存在较大局限性。因此发现新的预后因素,探索其功能,阐明在AML环境中的作用机制,在AML诊断及治疗中具有重要意义。络氨酸激酶受体Erb B2（v-erb-b2 avian erythroblast leukemia viral oncogene homolog 2）基因,也被称为HER2（human epidermal growth factor receptor 2）作为一种癌基因已被广泛研究和认知。它通过激活经典络氨酸激酶下游分子如RAS、MAPK,诱导肿瘤细胞有丝分裂增强,并由此导致多种肿瘤预后不良。2000年,Borg通过酵母双杂交法发现了一个新的PDZ（PSD95/discs large/ZO-1）蛋白,它在上皮细胞中作为Erb B2的交互作用蛋白发挥作用,故将其命名为Erbin（Erb B2 interacting protein,也称为Erbin）。Erbin属于一种全新的PDZ蛋白家族,称为LAP（leucine-rich repeat and PDZ domain）家族。Erbin的功能目前尚不十分清楚,其在大多数人组织中表达,在脑、心脏、肾脏、肌肉及胃组织中较为丰富,对维持细胞结构完整、调节细胞增殖和分化、发育过程中器官形态的发生及信号转导途径等具有重要作用。Erbin在实体肿瘤的发生发展中的功能尚存在争议,在急性髓系白血病中的功能及机制尚不明确。miRNAs是一种广泛存在的对基因进行微调的分子,约占人类基因组总基因数的2%-3%。从结构上来说,miRNAs是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA,约22nt,通过5’端6-8个序列（种子序列）与其靶基因的m RNA分子的3’端非编码区域（3’UTR）互补配对在转录后水平上对基因的表达进行负调控,一个miRNA可以调控多个靶基因。miRNA可导致m RNA的降解或翻译抑制,从而进一步调控多种生物学行为如发育的进程、干细胞分化、细胞凋亡、疾病以及肿瘤发生等。既往研究表明,miR-183在肿瘤中通常呈高表达。miR-183在肿瘤细胞中高表达常伴随等位基因失衡,染色体断裂、复制数增加等,常表现为致癌作用。迄今为止,有关miR-183与Erbin在AML中的研究较少。本研究通过体外、体内实验及临床验证揭示了Erbin与AML发生、发展的关系,Erbin在AML可抑制细胞增殖,促进幼稚细胞分化成熟,起抑癌作用。并通过生物信息学预测,体外实验验证miR-183-5p对Erbin在AML中的调控,通过免疫荧光素酶报告基因及功能挽救实验证实miR-183-5p对Erbin的直接靶向作用,表明miR-183-5p通过靶向Erbin调控AML的增殖、分化能力,miR-183-5p/Erbin通路是AML潜在的治疗靶点。第一部分体外研究Erbin对AML细胞增殖、分化作用及信号通路的影响研究目的:通过体外实验探索及分析Erbin对AML增殖及分化功能的影响及相关机制。研究方法:通过定量PCR和Western Blot检测4种AML细胞株HL60、THP-1、SHI-1和U937中内源性Erbin表达,并挑选出相对表达高及低的细胞各1株。转染Erbin过表达质粒慢病毒使其在低表达细胞株中过表达,转染sh RNA慢病毒使Erbin在高表达细胞株中下调。用过CCK8及流式细胞术检测上述两种细胞和各自空载体对照组细胞周期、增殖、凋亡及分化情况,以及与细胞周期调节蛋白p21Waf1/CIP1、p27Kip1表达的关系。结果:U937中Erbin相对表达量较高,HL60和SHI-1细胞中表达量较低,HL-60与SHI-1表达量无显着性差异。过表达Erbin的HL60细胞48h细胞活性较对照组显着降低,G2/M期细胞比例较对照组降低,凋亡率较对照组增高,细胞周期调节蛋白p21Waf1/CIP1、p27Kip1表达升高,分化程度较对照组升高。下调Erbin的U937细胞48h细胞活性较对照组显着增高,G2/M期细胞比例较对照组升高,p21Waf1/CIP1、p27Kip1表达减低,分化程度较对照组降。差异具有统计学意义。结论:体外Erbin在AML细胞中通过抑制细胞增殖、细胞周期,促进细胞凋亡及细胞分化来发挥抗肿瘤活性。第二部分体内研究Erbin对AML增殖及分化的影响研究目的:体内实验验证Erbin对AML增殖及分化功能的影响。研究方法:构建裸鼠AML荷瘤及对照模型,对模型鉴定分析Erbin在体内的作用。肿瘤组织行免疫组化,外周血镜检髓系白血病细胞浸润程度,肝脏及脾脏行病理学活检,流式细胞术检测骨髓细胞CD33表达阳性率。结果:Erbin过表达HL-60组荷瘤小鼠较其对照组小鼠肿瘤体积小,免疫组化显示p RAF、p ERK1/2、CD11b较对照组高表达,外周血涂片显示髓系白血病细胞浸润较对照组降低,骨髓细胞CD33阳性率较对照组降低,肝脏、脾脏HE染色光镜下原始细胞比例无显着差异;Erbin下调U937组荷瘤小鼠其对照组小鼠肿瘤体积大,免疫组化显示p RAF、p ERK1/2、CD11b较对照组低表达,外周血涂片显示髓系白血病细胞浸润较对照组增加,骨髓细胞CD33表达较对照组升高,肝脏、脾脏HE染色光镜下原始细胞比例无显着差异。结论:Erbin在体内可抑制AML细胞增殖、促进细胞凋亡及细胞分化,与体外实验的结果相符。第三部分hsa-miR-183-5p直接靶向作用Erbin调控AML细胞的增殖研究目的:探讨miR-183-5p对Erbin的调控机制以及对AML细胞生物学行为的影响。研究方法:通过生物信息学预测,定量PCR在AML细胞株HL60及937中筛选可能调控Erbin的miR。定量PCR及Western blot验证目标miR对Erbin的调控。CCK8及流式细胞术检测目标miR在HL60及937细胞中影响细胞周期、增殖、凋亡的情况,荧光素酶报告基因及功能挽救实验验证miR-183-5p与Erbin的直接结合作用。临床样本检测miR-183-5p/Erbin的表达水平。结果:经筛选miR-183-5p被认为可能参与调控Erbin。经PCR及Western blot验证,miR-183-5p可在m RNA及蛋白水平调控Erbin的表达。miR-183-5p通过调控Erbin的表达调节RAS/RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT/Fox O3a通路的磷酸化水平,经CCK8及流式细胞术检测,miR-183-5p可调控HL-60/U937细胞的增殖、凋亡和细胞周期。免疫荧光素酶报告基因及功能挽救实验证实miR-183-5p与Erbin存在直接结合与调控。Erbin在AML患者体内水平明显低于健康对照组,pri-miR-183-5p及mature-miR-183-5p在AML患者体内水平显着高于正常对照组。差异具有统计学意义。结论:miR-183-5p通过与Erbin直接结合调控AML的增殖
谢月[8]（2017）在《EZH2在急性髓细胞白血病中的临床意义及作用研究》文中研究指明目的急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种造血干细胞恶性克隆性疾病,常伴有多种分子遗传学异常,临床预后异质性强,尽管目前在AML的分子生物学研究方面已取得重要进展,但复发、难治仍是AML治疗的难题,所以寻找治疗AML的新型药物对延长患者生存期具有重要意义。zeste基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2,EZH2）在多种肿瘤中高表达,有研究表明EZH2抑制剂有抗肿瘤作用,且其抑制组蛋白甲基化作用与DNA甲基化之间存在交叉。本课题旨在研究EZH2在AML中的表达及与AML临床特征、预后之间的相关性,同时探讨EZH2抑制剂在AML中的作用,及其联合去甲基化药物在AML中的作用,为AML的治疗提供新的靶点。方法采用实时定量PCR方法检测99例AML患者骨髓单个核细胞中EZH2的表达;应用EZH2抑制剂GSK126处理AML细胞株HL60、K562后,采用CCK8法检测细胞增殖率、定量PCR检测EZH2基因表达量、流式细胞术检测细胞凋亡、Western blot检测cleaved caspase-3蛋白的表达;进一步将5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-CdR,DAC）与EZH2抑制剂GSK126联合作用于HL60、K562细胞,检测细胞增殖率并计算联合指数（CI）、EZH2基因的表达量、凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表达水平。结果在99例初发AML患者骨髓单个核细胞中EZH2基因呈现高表达,且EZH2高表达组中预后不良患者比例、12个月复发率明显高于低表达组（52.0%vs 28.6%,p=0.045）,（54.8%vs 23.1%,p=0.015）。EZH2抑制剂 GSK126 处理 HL60、K562细胞48小时后,随着GSK126浓度的增高,EZH2表达量降低,细胞增殖抑制率和凋亡率逐渐增高,cleaved caspase-3蛋白的表达量增加。EZH2抑制剂GSK126和DAC联合作用HL60、K562细胞48 h后,细胞增殖抑制率及凋亡率均明显高于GSK126及DAC单药组,EZH2基因表达量明显低于DAC单药组,cleaved caspase-3蛋白表达量明显高于DAC单药组。结论EZH2在初发AML中呈现高表达,其高表达与AML不良预后相关;EZH2抑制剂GSK126有抗AML细胞生长及促进凋亡的作用,EZH2可能是AML的潜在治疗靶点。EZH2抑制剂GSK126和DNA甲基化抑制剂地西他滨可协同抑制AML的细胞生长,促进凋亡,可为临床治疗AML提供新思路。
张睿[9]（2014）在《地西他滨对HL-60细胞株、Molt-4细胞株的作用和机制研究》文中认为目的：探讨地西他滨（decitabine,DAC）对急性髓系白血病细胞株HL-60和急性淋系白血病细胞株Molt-4可能的作用和机制。方法：用不同浓度DAC作用HL-60和Molt-4细胞24h、48h和72h,采用改良MTT法检测HL-60和Molt-4细胞的增殖抑制作用；Annexin V-FITC/PI双染法及PI单染法流式细胞仪检测DAC对这两种细胞凋亡及细胞周期的影响；RT-PCR检测DAC对这两种细胞P15、IER3、DNMT1、DNMT3A、DNMT3BmRNA表达作用的影响。结果：（1）MTT结果显示：DAC对HL-60和Molt-4细胞均有增殖抑制作用,并呈时间和剂量依赖性,且DAC对HL-60细胞的增殖抑制作用强于Molt-4细胞。24、48、72h, HL-60细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为：5.78×104、44.86、0.614；Molt-4细胞分别为：3.07×106、6.30×103、3.06×102。（2） Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡结果显示：随着作用时间和药物浓度的增加,DAC对HL-60和Molt-4细胞株均有促凋亡和坏死作用,尤以凋亡为主,且对HL-60细胞的促凋亡和坏死作用均强于Molt-4细胞。（3）PI单染法流式细胞仪结果显示：DAC作用后使HL-60细胞G2/M期的细胞比例增加,Molt-4细胞G0/G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,有时效和量效关系。（4） RT-PCR结果显示：HL-60和Molt-4细胞株P15、IER3mRNA的基础表达水平均较低,DAC作用后,两株细胞P15、IER3mRNA的表达随药物浓度的增加而增加,尤以作用24h增加幅度最大。但也各有特点：（1）HL-60细胞在24h,5umol/L,P15、IER3mRNA的表达量最大,分别为1.377±0.095,1.113±0.002。（2）Molt-4细胞IER3mRNA的最大表达量则是出现在24h最大药物浓度200umol/L作用下。（5）DAC作用后,两株细胞：（1） DNMT1mRNA的表达均减少；（2）DNMT3AmRNA的表达均无明显影响；（3） DNMT3BmRNA的表达在HL-60细胞中减少,在Molt-4细胞中也呈一定在下降趋势。结论：（1）DAC呈时间和剂量依赖性抑制HL-60细胞和Molt-4细胞的生长,阻滞HL-60细胞于G2/M期,阻滞Molt-4细胞于S期,并促进HL-60细胞和Molt-4细胞的凋亡,其对HL-60细胞的增殖抑制作用及促细胞凋亡作用均强于Molt-4细胞。（2）在HL-60细胞和Molt-4细胞中,DAC可能主要通过抑制DNMT1的活性,降低P15和IER3基因的甲基化水平,而上调P15和IER3基因的表达。（3）IER3基因在血液系统恶性肿瘤中可能扮演一种抑癌基因的角色,随着对IER3基因在恶性血液疾病中作用机制和表观遗传学改变的深入研究,其可能成为恶性血液疾病靶向治疗的新靶点。（4）DAC对髓系细胞株的作用强于淋系细胞株,这是否提示我们可将DAC优先用于髓系白血病的治疗和巩固治疗的临床探索和研究中。
卢菲[10]（2014）在《急性髓性白血病耐药相关miRNA分子功能及作用机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景：急性髓性白血病（acute myeloid leukemia, AML）是一种异质性很强的恶性克隆性疾病,严重影响人类的健康。近年来,随着化疗、造血干细胞移植、基因靶向治疗以及生物免疫治疗等多种治疗方法的发展,AML患者的完全缓解率及5年无病生存率均较前有所改善,但是仍有大部分患者出现耐药和复发,预后不良。白血病多药耐药（multidrug resistance, MDR）的产生是导致化疗失败的关键因素,也是造成白血病患者复发、难治的重要原因。白血病多药耐药是指白血病细胞对一种化疗药物产生耐药后,同时对不同化学结构和不同作用机理的多种化疗药物产生交叉耐药的现象,包括原发性耐药与继发性耐药。MDR产生机制非常复杂,包括药物外排介导的耐药、MDR相关酶类异常所致耐药、药物作用靶点基因突变、肿瘤干细胞、细胞凋亡受抑、周期阻滞、药代动力学的改变等。因此从多个角度阐明AML多药耐药的机制,寻找有效逆转多药耐药的方法,不仅是克服AML多药耐药的重要思路,也是准确评估预后、改善患者生存率的必由之路。MicroRNA （miRNAs）是一类长度为19-25nt,序列高度保守的内源性非编码小RNA分子。成熟miRNA通过与目的基因3’端非编码（3’-UTR）区结合促使靶基因抑制或蛋白降解,在转录或转录后水平调控基因表达,广泛参与细胞的增殖、凋亡、分化、免疫系统、个体发育以及机体代谢等一系列生命过程。近年来研究发现,白血病中miRNA表达谱存在差异表达,在白血病形成及疾病进展过程中,miRNA参与癌细胞生物程序的调控,表现出癌基因或抑癌基因的作用。但是,关于miRNA在AML耐药过程中的作用机制尚不十分明确,有待于进一步研究。因此,筛选在AML耐药中起关键作用的miRNA并阐明其具体作用机制,研究急性髓性白血病中miRNA的异常表达与临床化疗敏感性、预后的关系,可以为难治/复发AML的早期预警和检测提供新的生物学标记物,对于提高难治/复发AML诊疗水平具有重要的临床意义。研究目的：筛选并鉴定出参与AML多药耐药的miRNA分子；研究该miRNA分子在成人AML骨髓标本中的表达,分析其与临床特征的关系；明确该miRNA分子在AML多药耐药中的作用；进一步确定该miRNA分子的靶基因,并探讨其参与AML多药耐药的机制,从而为逆转AML耐药带来全新的治疗思路和方案。研究方法：1.应用miRNA芯片技术筛选AML敏感与耐药细胞株之间差异表达的miRNA分子,选取差异倍数较高的miRNA分子作为候选分子。2.标本采集：收集120例AML患者和40例健康对照者的骨髓标本,其中AML患者标本分为初诊组（56例）,完全缓解组（44例）以及复发／难治组（20例）。采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离收集标本中骨髓单个核细胞,-80℃保存备用。3.实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real-time RT-PCR）法检测miR-29b的表达情况：采用mirVanaTM miRNA Isolation试剂盒提取AML患者骨髓单个核细胞及AML细胞株中miRNA,应用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription （RT）试剂盒将miRNA逆转录为cDNA,应用TaqMan探针Real-time RT-PCR方法检测AML患者骨髓单个核细胞及AML细胞株miR-29b表达水平,验证芯片结果。4. miR-29b, AFlq和CD44分子在AML耐药中的作用。4.1细胞转染：应用Lipofectamine2000分别将miR-29b模拟物（mimic）或抑制剂（inhibitor）及各自阴性对照转染AML敏感与耐药细胞株,48小时后收集各组细胞,Real time RT-PCR检测转染后miR-29b表达情况。4.2病毒包装及细胞感染：分别包装携带AF1q表达载体或AF1q shRNA的慢病毒,感染AML敏感或耐药细胞株,上调或下调AF1q表达,48小时后荧光显微镜观测感染效率,应用Blastin药物筛选获得稳定感染细胞,Real timeRT-PCR、Western blot方法检测病毒感染稳筛后AF1q表达情况。4.3载体构建：构建携带CD44shRNA的真核表达载体,转染AML耐药细胞株,Real time RT-PCR和Western blot实验方法检测转染后CD44表达情况。4.4CCK8法检测药物敏感性：将稀释成一定浓度梯度的化疗药物阿霉素（DOX）,阿糖胞苷（Ara-C）,去甲氧柔红霉素（IDA）分别加入改变miR-29b, AF1q和CD44分子表达后的各组细胞,孵育48小时,CCK8法检测AML敏感及耐药株细胞对化疗药物的敏感性,分别计算各组细胞对三种化疗药物的IC50值。4.5流式细胞术检测细胞凋亡：选取一定浓度的阿霉素（DOX）,阿糖胞苷（Ara-C）,去甲氧柔红霉素（IDA）分别加入改变miR-29b, AF1q和CD44分子表达后各组细胞,作用48小时后,经AnnexinV/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡率。5. MiR-29b/AF1q/CD44作用轴调控机制研究。5.1生物信息学方法预测miR-29b分子可能调控的下游靶基因AF1q, Real-time RT-PCR、Western blot实验检测miR-29b分子表达变化对靶基因AF1q表达水平影响。5.2双荧光素酶报告实验验证miR-29b与下游靶基因AF1q结合作用：构建AF1q基因3’-UTR区野生及突变型荧光素酶报告载体,检测miR-29b上调后荧光素酶活性的改变。5.3Real-time RT-PCR、Western blot实验检测AF1q、CD44在AML细胞株及上述收集AML骨髓标本中mRNA及蛋白水平的表达情况,统计分析miR-29b和AF1q、CD44表达相关性。5.4AF1q对下游基因CD44表达水平影响：收集稳定筛选后AFlq上调或下调AML细胞株,Real-time RT-PCR, Western blot实验检测AF1q分子表达变化对下游基因CD44在mRNA及蛋白表达水平影响。5.5MiR-29b对下游基因CD44表达水平影响：应用Lipofectamine2000分别将miR-29b mimic或miR-29b inhibitor及各自阴性对照转染AML细胞株,48小时后收集各组细胞,Real-time RT-PCR, Western blot实验检测miR-29b分子表达变化对下游基因CD44在mRNA及蛋白表达水平影响。5.6将DOX作用与AML细胞并分别于12h,24h,48h收集细胞,设不加药对照组。利用Real-time RT-PCR和Western blot方法检测AFlq和CD44表达。5.7细胞分组：①miR-29b mimic转染组；②miR-NC转染组；③AF1q表达载体转染组；④AF1q表达载体对照转染组；⑤miR-29b mimic+AF1q表达载体同时转染组；⑥miR-29b mimic+AF1q表达载体对照同时转染组；⑦miR-NC+AF1q表达载体对照同时转染组。CCK8法检测上述各组细胞药物敏感性,Western blot实验检测CD44表达水平。5.8双荧光素酶报告实验检测AFlq对CD44的转录调控作用：构建含有CD44启动子区域的荧光素酶报告载体,上调AFlq表达检测荧光素酶活性变化。5.9免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）实验检测AFlq蛋白与TCF7L2结合作用：构建携带有6myc标签AFlq基因全长表达载体,同时构建带有FLAG标签的TCF7L2表达载体,应用Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,Co-IP实验检测验证AFlq蛋白与TCF7L2结合作用。5.10蛋白染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, CHIP）实验检测TCF7L2与CD44分子启动子区域结合作用：通过生物信息学软件预测TCF7L2与CD44分子启动子区域具体结合位点,设计CD44引物序列,将TCF7L2分子表达载体转染HEK293细胞,CHIP实验检测TCF7L2与CD44分子启动子区域结合作用。6.统计分析：应用SPSS17.0软件处理数据,采用t检验和Mann-Whitney U秩和检验对数据分别进行差异性分析,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.芯片结果：应用miRNA芯片技术在K562与耐药株K562/A02、HL60与耐药株HL60/ADM间筛选出24种表达明显差异的miRNA分子,选择表达明显差异的miR-29b、miR-181b作为候选miRNA分子。2.验证芯片结果：Real time RT-PCR结果表明与AML敏感株K562、HL60相比较,miR-29b在耐药株K562/A02、 HL60/ADM中表达明显下调。3. miR-29b, AF1q和CD44分子在AML患者骨髓标本中的表达水平：3.1miR-29b在AML初诊组和难治／复发患者组中表达明显低于健康对照组；初诊AML患者miR-29b表达水平明显高于难治／复发组患者；完全缓解组AML患者miR-29b表达水平明显高于初诊组和难治／复发组患者；而健康对照组与完全缓解组相比较miR-29b表达水平无明显差异。3.2与健康对照组相比较,AFlq在AML初诊组和难治/复发患者组中表达明显上调；初诊组和难治/复发组AML患者AF1q表达水平明显高于完全缓解组患者；初诊AML患者AFlq表达水平明显低于难治/复发组患者；健康对照组与完全缓解组相比较AFlq表达水平无明显差异。3.3CD44分子在AML初诊组和难治/复发患者中表达明显高于健康对照组；初诊组和难治/复发组AML患者CD44表达水平较完全缓解组AML患者明显升高；初诊AML患者CD44表达水平较难治/复发组AML患者显着降低；完全缓解组与健康对照组与相比较CD44表达水平无明显差异。4. miR-29b, AF1q和CD44分子在AML多药耐药中的作用：4.1Real time RT-PCR结果证实miR-29b mimic可明显上调miR-29b在AML耐药细胞株中的表达水平,miR-29b inhibitor可显着下调miR-29b在AML敏感细胞株中的表达水平。4.2Real time RT-PCR、Western blot结果显示携带AFlq表达载体的慢病毒可有效上调AF1q表达,携带AF1q shRNA的慢病毒可有效下调AFlq表达。4.3将CD44shRNA真核表达载体转染AML耐药细胞后,Real time RT-PCR、 Western blot结果显示CD44表达水平较对照组明显下调。4.4miR-29b,AF1q和CD44分子表达变化对AML细胞药物敏感性的影响：CCK8检测发现,miR-29b表达上调,AFlq或CD44表达下调均明显增加了AML耐药细胞株（K562/A02、HL60/ADM）对化疗药物的敏感性；抑制miR-29b表达或上调AFlq表达明显降低了AML敏感细胞株（K562、HL60）对化疗药物的敏感性。4.5miR-29b, AF1q和CD44分子表达变化后对化疗药物诱导AML细胞凋亡的影响：AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率显示,miR-29b表达上调,AFlq或CD44表达下调后,化疗药物诱导的AML耐药细胞株（K562/A02、 HL60/ADM）凋亡率明显升高；抑制miR-29b表达或上调AFlq表达后,化疗药物诱导的AML敏感细胞株（K562、HL60）凋亡率明显下降。5. MiR-29b/AF1q/CD44作用轴调控机制研究：5.1采用生物信息学软件（target scan和pictar）预测AFlq为miR-29b下游靶基因。在AML耐药细胞株中有效上调miR-29b表达水平后,AF1q蛋白表达水平均明显降低; miR-29b表达水平明显下调后,AFlq蛋白表达水平明显升高。5.2双荧光素酶报告实验证实miR-29b直接结合与AF1q3’-UTR区的预测靶位点。5.3Real time RT-PCR、Western blot结果显示AFlq和CD44分子在AML耐药株K562/A02. HL60/ADM中表达水平显着高于AML敏感株K562、HL60。Spearman秩相关分析结果显示：miR-29b和AF1q的表达水平呈显着负相关关系；miR-29b和CD44的表达水平呈显着负相关；AF1q和CD44的表达水平呈显着正相关关系。5.4Real time RT-PCR、Western blot结果显示AFlq表达上调后,CD44分子表达明显上调；AFlq表达下调后,CD44分子表达亦明显下调。5.5Real time RT-PCR、Western blot结果显示,在AML耐药株中过表达miR-29b可明显下调CD44分子在mRNA和蛋白水平表达；抑制miR-29b表达可显着上调CD44分子在mRNA和蛋白水平表达。5.6CCK8. Western blot实验结果显示：AFlq表达上调可减弱miR-29b的逆转耐药作用以及对CD44的正调控作用。5.7Real time RT-PCR、Western blot结果显示：化疗药物作用于AML耐药细胞后,AF1q和CD44表达水平显着降低；并且随着时间延长,AF1q和CD44表达均逐渐下调,呈正相关关系。5.8双荧光素酶报告实验结果显示AFlq结合于CD44启动子区域,在转录水平调控CD44表达活性。5.9Co-IP实验证实AFlq蛋白与TCF7L2存在结合作用。5.10CHIP实验证实TCF7L2作用于CD44分子启动子区域。结论：1. MiRNA分子在AML敏感细胞株及耐药细胞株之间表达谱存在明显差异,提示miRNA分子可能参与AML耐药过程。2.逆转miR-29b在AML耐药细胞株中的表达水平后,明显增加了AML耐药细胞对化疗药物的敏感性和化疗药物诱导的细胞凋亡。3. MiR-29b, AF1q和CD44分子形成miR-29b/AF1q/CD44作用轴在AML耐药发生、发展过程中发挥重要作用,有望成为AML治疗的新靶点。4.AFlq通过与Wnt/β-catenin信号通路TCF7L2转录因子共同作用,在转录水平激活CD44表达。MiR-181b在急性髓性白血病多药耐药中的作用及机制研究研究目的：检测niR-181b在AML细胞株中的表达水平,验证芯片结果；检测miR-181b在成人AML骨髓标本及健康对照组中的表达,分析其与临床特征的关系；明确miR-181b在AML耐药中的作用；预测并验证miR-181b的靶基因,进一步探讨miR-181b参与AML耐药发生发展的分子机制,为白血病治疗提供新的靶点。研究方法：1.标本采集：收集AML病患共80例,健康对照20例。AML患者骨髓标本包括初诊组（31例）,完全缓解组（37例）和复发/难治组（12例）。采用淋巴细胞分离液（Ficoll）密度梯度离心法分离骨髓标本中单个核细胞,-80℃保存备用。2. Taqman探针Real-time RT-PCR法检测miR-181b的表达情况：mirVanaTM miRNA Isolation试剂盒提取AML细胞株miRNA, MicroRNA Reverse Transcription （RT）试剂盒逆转录获得cDNA, Taqman探针Real-time RT-PCR方法检测AML敏感及耐药细胞株miR-181b表达水平,验证芯片结果。3. miR-181b在AML骨髓标本中表达情况检测：Taqman探针Real-time RT-PCR法检测AML患者及健康对照骨髓单个核细胞中miR-181b表达水平,分析miR-181b表达与临床疗效、病程及预后的相关性。4. miR-181b在AML耐药中的生物学作用研究。4.1细胞转染：分别将miR-181b mimic及其阴性对照miR-NC, miR-181b inhibitor及其阴性对照miR-inNC转染AML耐药细胞株K562/A02与HL60/ADM,48小时后收集细胞,应用Real time RT-PCR方法检测转染后miR-181b表达情况。4.2CCK8法检测药物敏感性：将不同浓度梯度的DOX、Ara-C和IDA分别加入转染后的各组细胞,孵育48小时,CCK8法检测AML耐药细胞株对化疗药物敏感性并计算各组细胞对三种化疗药物的IC50值。4.3流式细胞术检测细胞凋亡：选取一定浓度的DOX、Ara-C和IDA分别作用与转染后各组细胞,作用48小时后,经AnnexinV/PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率。5.确定miR-181b分子的靶基因,进一步探讨其参与AML耐药的机制。5.1生物信息学方法预测miR-181b分子可能调控的下游靶基因。5.2Real-time RT-PCR、Western blot实验检测miR-181b分子表达上调或是下调后下游靶基因HMGB1和Mcl-1表达水平。5.3双荧光素酶报告实验验证miR-181b与下游靶基因结合作用：分别构建HMGB1和Mcl-1基因3’-UTR区野生及突变型荧光素酶报告基因载体,转染HEK293细胞检测miR-181b上调后对荧光素酶活性的影响。6. HMGB1在AML耐药中的生物学作用研究。6.1Real-time RT-PCR、Western blot实验检测HMGB1在AML细胞株及上述收集AML患者及健康对照标本中mRNA及蛋白的表达情况,分析HMGB1与临床疗效、病程及预后的相关性。6.2设计合成HMGB1siRNA,转染AML耐药细胞株,48小时后收集细胞,应用Real time RT-PCR和Western blot检测转染后HMGB1表达情况。6.3CCK8实验检测转染后AML细胞药物敏感性：将DOX、Ara-C和IDA三种化疗药物与各组细胞共孵育48小时后,CCK8法检测AML耐药细胞株对化疗药物敏感性的变化并比较各组细胞对三种化疗药物的IC50值。6.4流式细胞术检测转染后AML细胞凋亡：将DOX、Ara-C和IDA三种化疗药物作用于各组细胞48小时后, AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率。7.统计分析：应用SPSS17.0软件处理数据,采用t检验和Mann-Whitney U秩和检验对数据进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.验证芯片结果：miR-181b在AML耐药株K562/A02、HL60/ADM中表达较AML敏感株K562、HL60明显下降。2. miR-181b在AML患者骨髓标本中的表达水平：Real time RT-PCR结果显示miR-181b在AML初诊组和难治／复发患者组中表达明显低于健康对照组；初诊AML患者miR-181b表达水平较难治／复发组AML患者明显升高；完全缓解组AML患者miR-181b表达水平较初诊组和难治／复发组AML患者显着上调；健康对照组与完全缓解组相比较miR-181b表达水平无明显差异。3. miR-181b分子在AML多药耐药中的作用：3.1Real time RT-PCR结果显示：miR-181b mimic转染组AML细胞niR-181b表达水平较转染miR-NC组明显升高；miR-181b inhibitor转染组AML细胞miR-181b表达水平较转染miR-181binNC组明显降低。3.2miR-181b表达变化后对AML细胞药物敏感性的影响：miR-181b表达上调后,CCK8实验结果显示AML耐药细胞株（K562/A02、HL60/ADM）对化疗药物的敏感性显着增强。3.3miR-181b表达变化后对化疗药物诱导的AML细胞凋亡影响：miR-181b表达上调后,AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示化疗药物诱导的AML耐药细胞株（K562/A02、HL60/ADM）凋亡率明显升高。4.确定miR-181b的靶基因,进一步探讨其参与AML耐药的分子机制。4.1采用生物信息学软件（target scan和pictar）预测HMGB1和Mcl-1为miR-181b下游靶基因。4.2在AML耐药细胞株中过表达miR-181b可在转录后水平抑制HMGB1和Mcl-1表达。4.3双荧光素酶报告实验证实miR-181b直接结合于HMGB1和Mcl-13’-UTR区预测靶位点。5. HMGB1分子在AML耐药中的作用：5.1Real-time RT-PCR、Western blot实验结果显示：HMGB1在AML耐药株K562/A02、HL60/ADM中表达水平明显高于AML敏感株K562、HL60。5.2Real-time RT-PCR、Western blot实验结果显示：HMGB1在AML初诊组和难治／复发患者组中表达明显高于健康对照组；初诊组和难治／复发组AML患者HMGB1表达水平较完全缓解组AML患者明显升高；初诊AML患者HMGB1表达水平低于难治／复发组AML患者；完全缓解组与健康对照组相比较HMGB1表达水平无明显差异。5.3Real-time RT-PCR、Western blot结果显示：设计合成的HMGB1siRNA转染AML耐药细胞株48小时后可有效下调HMGB1表达。5.4CCK8实验结果显示：HMGB1表达下调明显增加了AML耐药细胞株（K562/A02. HL60/ADM）对化疗药物的敏感性。5.5AnnexinV/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率显示：HMGB1表达下调后,化疗药物诱导的AML耐药细胞株（K562/A02、HL60/ADM）凋亡率显着升高。结论：1. miR-181b在AML耐药株和难治/复发病患骨髓标本中表达明显下调,提示miR-181b可能在AML耐药过程中有潜在抑癌基因作用。2.在AML耐药细胞株过表达miR-181b可明显增加AML耐药细胞对化疗药物的敏感性和化疗药物诱导的细胞凋亡。3. HMGB1和Mcl-1表达下调为miR-181b发挥逆转耐药作用的可能机制之一。
二、共转染野生型p16,p53抑癌基因对HL-60细胞的抑制作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、共转染野生型p16,p53抑癌基因对HL-60细胞的抑制作用（论文提纲范文）
（1）新型p53截短体Δ107p53在急性髓系白血病中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 p53 截短体与AML患者预后不良明显相关 |
| 2.2 截短体Δ107p53 蛋白三维结构明显改变 |
| 2.3 慢病毒表达体系的构建和稳定克隆的筛选 |
| 2.4 截短体Δ107p53 对HL60 细胞有明显的促增殖作用 |
| 2.5 Δ107p53促进细胞周期由G0/G1期向S期过渡 |
| 2.6 Δ107p53抑制了p21和bax的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 TP53的选择性剪接异构体在人类肿瘤研究中的进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）CircHIPK3在急性髓系白血病发病中作用及机制的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 circHIPK3在AML患者中的表达情况和临床资料相关性分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂和耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 病例选择及分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 骨髓单个核细胞提取 |
| 2.3.2 细胞总RNA提取 |
| 2.3.3 反转录反应 |
| 2.3.4 实时定量荧光PCR反应 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 60例AML患者的临床基本情况 |
| 3.2 Circ HIPK3在AML患者中表达明显上调 |
| 3.3 AML患者不同分型中circHIPK3的表达情况 |
| 3.3.1 按FAB分型比较 |
| 3.3.2 按染色体核型分组比较 |
| 3.3.3 按AML特征性基因突变分组比较 |
| 3.4 circHIPK3的表达水平与患者临床资料的相关性 |
| 3.5 circHIPK3的表达水平与患者疗效的相关性 |
| 3.6 circHIPK3的表达水平与患者预后的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 circHIPK3对急性髓系白血病细胞系生物行为的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂、耗材和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂和耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏、培养、传代和冻存 |
| 2.3.2 细胞系RNA提取 |
| 2.3.3 逆转录反应 |
| 2.3.4 实时定量荧光PCR反应 |
| 2.3.5 细胞转染 |
| 2.3.6 CCK-8实验 |
| 2.3.7 流式细胞术检测细胞凋亡和周期 |
| 2.3.8 Western Blot实验 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 circHIPK3在急性髓系白血病细胞系中高表达 |
| 3.2 应用siRNA转染髓系白血病细胞株后circHIPK3敲减效率的检测 |
| 3.3 CCK-8检测细胞增殖情况 |
| 3.4 circHIPK3敲减后可促进急性髓系白血病细胞系凋亡 |
| 3.4.1 流式细胞术检测细胞凋亡情况 |
| 3.4.2 Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白的变化情况 |
| 3.5 circHIPK3敲减后可影响髓系白血病细胞发生G1周期阻滞 |
| 3.5.1 流式细胞术检测细胞周期变化 |
| 3.5.2 Western Blot检测细胞周期相关蛋白cyclin D1的变化情况 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 CircHIPK3作用AML的相关分子机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂、耗材和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂和耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验对象 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 病例标本 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏、培养、传代和冻存 |
| 2.3.2 核质分离实验及核、质RNA的提取 |
| 2.3.3 细胞总RNA提取 |
| 2.3.4 RNase R实验 |
| 2.3.5 circRNA、mRNA逆转录反应和miRNA逆转录反应 |
| 2.3.6 实时定量荧光PCR反应 |
| 2.3.7 细胞转染 |
| 2.3.8 CCK-8实验 |
| 2.3.9 实时定量荧光PCR反应 |
| 2.3.10 Western Blot实验 |
| 2.3.11 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 核质分离实验提示circHIPK3主要定位于髓系白血病细胞胞浆中 |
| 3.2 RNase实验证实circHIPK3的环状结构 |
| 3.3 siRNA敲减circHIPK3后不影响其线性转录本HIPK3的表达 |
| 3.4 miR-193a-3p是circHIPK3的下游靶基因 |
| 3.4.1 生物信息学预测circHIPK3可靶向结合miR-193a-3p |
| 3.4.2 miR-193a-3p在急性髓系白血病细胞系中低表达 |
| 3.4.3 miR-193a-3p在AML患者中低表达并与circHIPK3表达负相关 |
| 3.4.4 双荧光素酶报告基因检测验证circHIPK3和miR-193a-3p的靶向结合 |
| 3.4.5 敲减circHIPK3可以上调miR-193a-3p的表达 |
| 3.5 c-Kit是miR-193a-3p调控的下游靶基因 |
| 3.5.1 生物信息学预测miR-193a-3p和c-Kit靶向结合 |
| 3.5.2 c-Kit在急性髓系白血病细胞系中明显高表达 |
| 3.5.3 c-Kit在 AML患者中高表达并与miR-193a-3p表达呈负相关 |
| 3.5.4 双荧光素酶报告基因验证miR-193a-3p和c-Kit的靶向结合 |
| 3.5.5 过表达 miR-193a-3p可抑制c-Kit的表达 |
| 3.6 circHIPK3通过靶向miR-193a-3p影响c-Kit表达调控AML的生物学行为 |
| 3.6.1 circHIPK3靶向结合miR-193a-3p调控c-Kit的表达 |
| 3.6.2 circHIPK3通过miR-193a-3p调控AML细胞的生物学行为 |
| 3.6.3 共转染circHIPK3和miR-193a-3p inhibitor后细胞凋亡和周期相关蛋白变化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 CircHIPK3在血液系统恶性肿瘤中的表达 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（3）miR-34a靶向调控HDAC1基因对急性髓系白血病细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要缩略词及中英文对照表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 miR-34a对 AML增殖和凋亡的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要实验设备 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 主要实验试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 总RNA抽提 |
| 2.2.4 RNA逆转录获c DNA |
| 2.2.5 RNA完整性的检测 |
| 2.2.6 RNA的纯度和浓度检测 |
| 2.2.7 RT-PCR |
| 2.2.8 CCK-8 检测细胞增殖 |
| 2.2.9 流式细胞术分析各组细胞凋亡 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HL-60 细胞中miR-34a表达 |
| 2.3.2 CCK-8 检测细胞增殖 |
| 2.3.3 流式细胞术分析各组细胞凋亡能力 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 miR-34a通过作用于HDAC1 调节AML凋亡 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 主要实验设备 |
| 3.1.3 主要实验试剂 |
| 3.1.4 主要实验试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 生物信息学数据库分析显示miR-34a能够与HDAC1 mRNA 3 'UTR结合 |
| 3.2.2 WesternBlot检测HDAC1 蛋白表达 |
| 3.2.3 双荧光素酶报告基因实验 |
| 3.2.4 流式细胞术过表达pcDNA3.1-HDAC1 转染HL-60 后细胞凋亡 |
| 3.2.5 统计学分析 |
| 3.3 实验结果: |
| 3.3.1 生物信息学数据库分析显示miR-34a能够与HDAC1 mRNA3'UTR结合 |
| 3.3.2 WesternBlot检测各实验组HDAC1 蛋白表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 全文结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（4）组蛋白去甲基化酶RBP2和RNA结合蛋白Lin28B介导慢粒急变的调控机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 组蛋白去甲基化酶RBP2调控PTEN以BCR-ABL依赖途径介导慢粒急变 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 RNA结合蛋白Lin28B调控miR-181d以BCR-ABL非依赖途径介导慢粒急变 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文 |
（5）长链非编码RNA HOXA-AS2对急性髓系白血病的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 长链非编码RNA HOXA-AS2 在急性髓系白血病中的表达及临床意义 |
| 1前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂及仪器 |
| 2.1.1 主要试剂及耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验对象和分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 骨髓单个核细胞提取 |
| 2.3.2 免疫磁珠分选脐血CD34阳性细胞 |
| 2.3.3 细胞总RNA提取 |
| 2.3.4 cDNA逆转录反应 |
| 2.3.5 实时定量荧光 PCR 反应(q RT-PCR) |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 108例AML患者的基本情况 |
| 3.2 HOXA-AS2在AML患者中高表达 |
| 3.3 AML不同亚型中HOXA-AS2 的表达情况 |
| 3.3.1 FAB分型 |
| 3.3.2 染色体核型比较 |
| 3.3.3 特征性基因突变类型 |
| 3.4 HOXA-AS2 的表达水平与AML患者临床特征之间的关系 |
| 3.5 HOXA-AS2 的表达水平与AML患者疗效的关系 |
| 3.6 HOXA-AS2 的表达水平与AML患者预后的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 HOXA-AS2 对人髓系白血病细胞株细胞生物学行为的影响 |
| 1前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂、耗材及仪器 |
| 2.1.1 主要试剂、耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏、培养、传代及冻存 |
| 2.3.2 细胞总RNA的提取 |
| 2.3.3 逆转录及实时荧光定量反应检测HOXA-AS2 的表达 |
| 2.3.4 细胞感染 |
| 2.3.5 CCK-8实验 |
| 2.3.6 流式细胞术检测细胞分化、周期和凋亡 |
| 2.3.7 EdU染色实验 |
| 2.3.8 Hoechst染色实验 |
| 2.3.9 Western Blot实验 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HOXA-AS2 在人髓系白血病细胞株中高表达 |
| 3.2 髓系白血病细胞株感染慢病毒介导HOXA-AS2 sh RNA效率的检测 |
| 3.3 敲减HOXA-AS2 抑制髓系白血病细胞增殖 |
| 3.3.1 CCK-8实验检测细胞增殖变化 |
| 3.3.2 Western Blot实验检测增殖相关蛋白PNCA表达的变化 |
| 3.4 敲减HOXA-AS2 阻滞髓系白血病细胞周期于G0/G1期 |
| 3.4.1 流式细胞术检测细胞周期变化 |
| 3.4.2 EdU染色实验检测细胞周期变化 |
| 3.4.3 Western Blot实验检测周期相关蛋白cyclin D1、CDK4 表达的变化 |
| 3.5 敲减HOXA-AS2 诱导髓系白血病细胞凋亡 |
| 3.5.1 流式细胞术检测细胞凋亡变化 |
| 3.5.2 Hoechst染色实验检测细胞凋亡变化 |
| 3.5.3 Western Blot实验检测细胞凋亡相关蛋白的表达 |
| 3.6 敲减HOXA-AS2 对髓系白血病细胞分化无显着影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 长链非编码RNA HOXA-AS2 作用AML的分子机制研究 |
| 1前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂、耗材及仪器 |
| 2.1.1 主要试剂、耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验对象 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 患者标本 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏、培养、传代及冻存 |
| 2.3.2 核质分离实验及核、质RNA提取 |
| 2.3.3 细胞总RNA提取 |
| 2.3.4 lnc RNA及 m RNA的逆转录及实时荧光定量反应 |
| 2.3.5 miRNA逆转录及实时荧光定量反应 |
| 2.3.6 细胞转染 |
| 2.3.7 CCK-8实验 |
| 2.3.8 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡 |
| 2.3.9 Western Blot实验 |
| 2.3.10 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HOXA-AS2 在髓系白血病细胞中的亚细胞定位 |
| 3.2 敲减HOXA-AS2 对邻近基因的表达无显着影响 |
| 3.3 HOXA-AS2 通过调控SOX4 的表达促进髓系白血病细胞生长 |
| 3.3.1 敲减HOXA-AS2 抑制PI3K/AKT信号通路 |
| 3.3.2 敲减HOXA-AS2 下调SOX4 表达 |
| 3.3.3 髓系白血病细胞株和AML患者中SOX4 的表达及其与HOXA-AS2 表达的相关性 |
| 3.3.4 髓系白血病细胞株转染SOX4过表达质粒效率的检测 |
| 3.3.5 HOXA-AS2和SOX4 双重作用对髓系白血病细胞生物学行为的影响 |
| 3.4 HOXA-AS2 靶向结合mi R-124-3p调控SOX4 表达 |
| 3.4.1 敲减HOXA-AS2 上调mi R-124-3p表达 |
| 3.4.2 上调mi R-124-3p表达抑制HOXA-AS2 的表达 |
| 3.4.3 上调mi R-124-3p表达抑制SOX4 的表达 |
| 3.4.4 髓系白血病细胞株和AML患者中mi R-124-3p的表达及其与HOXA-AS2、SOX4表达的相关性 |
| 3.4.5 双荧光素酶报告基因实验验证mi R-124-3p分别与HOXA-AS2、SOX43,UTR靶向结合 |
| 3.4.6 共转染 HOXA-AS2 sh RNA 病毒和 mi R-124-3p inhibitor 质粒对 SOX4 表达的影响 |
| 3.5 上调miR-124-3p表达抑制髓系白血病细胞生长 |
| 3.6 HOXA-AS2和mi R-124-3p双重作用对髓系白血病细胞生物学行为的影响 |
| 3.7 mi R-124-3p和 SOX4 双重作用对髓系白血病细胞生物学行为的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）miR-148b通过Ezrin蛋白调控弥漫性大B细胞淋巴瘤药物敏感性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 miRNAs在血液系统恶性肿瘤发生及治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略 |
| 博士期间发表论文及参加课题 |
| 致谢 |
（7）MicroRNA-183-5p靶向Erbin调控急性髓系白血病增殖与分化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一部分 体外研究Erbin对 AML细胞增殖、分化作用及信号通路的影响 |
| 一 研究背景 |
| 二 研究方法 |
| 三 研究结果 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 体内研究Erbin对 AML增殖及分化的影响 |
| 一 研究方法 |
| 二 研究结果 |
| 三 讨论 |
| 四 结论 |
| 第三部分 hsa-miR-183-5p直接靶向作用Erbin调控AML细胞的增殖 |
| 一 研究背景 |
| 二 研究方法 |
| 三 研究结果 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 综述1 Erbin的结构和分子生物学功能 |
| 参考文献 |
| 综述2 MicroRNA-183家族的功能 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（8）EZH2在急性髓细胞白血病中的临床意义及作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（9）地西他滨对HL-60细胞株、Molt-4细胞株的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词一览表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 地西他滨对髓系白血病细胞株HL-60作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 地西他滨对淋系白血病细胞株Molt-4的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论总结 |
| 实验不足和今后的研究方向 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表文章 |
| 致谢 |
（10）急性髓性白血病耐药相关miRNA分子功能及作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 MiR-29b/AF1q/CD44作用轴调控急性髓性白血病多药耐药性的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1. 耐药细胞株鉴定 |
| 2. MiRNA芯片筛选结果 |
| 3. TaqMan探针Real-time RT-PCR方法验证芯片结果 |
| 4. MiR-29b分子在AML患者及对照组骨髓标本中的表达 |
| 5. MiR-29b在AML耐药中的作用 |
| 6. 确定miR-29b的靶基因,进一步探讨其参与AML耐药的机制 |
| 7. AF1q在白血病多药耐药中的功能研究 |
| 8. CD44在白血病多药耐药中的功能研究 |
| 9. MiR-29b/AF1q/CD44作用轴调控作用研究 |
| 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MiR-181b在急性髓性白血病多药耐药中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1. miR-181b表达水平检测 |
| 2. 过表达miR-181b可逆转AML耐药细胞株耐药 |
| 3. miR-181b相关下游靶基因预测及验证 |
| 4. HMGB1在白血病多药耐药中的功能研究 |
| 5. HMGB1对Mcl-1表达的影响 |
| 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 文献综述 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 一. MicroRNA生物学特性 |
| 二. MicroRNA调控肿瘤耐药相关蛋白 |
| 三. MicroRNA改变药物靶点 |
| 四. MicroRNA和细胞凋亡逃逸 |
| 五. MicroRNA和细胞周期调控 |
| 六. MicroRNA与肿瘤干细胞 |
| 七. MicroRNA转运 |
| 八. 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 文章创新点及意义 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 攻读学位期间参加的学术会议 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English articles Ⅰ |
| English articles Ⅱ |
四、共转染野生型p16,p53抑癌基因对HL-60细胞的抑制作用（论文参考文献）
- [1]新型p53截短体Δ107p53在急性髓系白血病中的作用研究[D]. 张灵丽. 山西医科大学, 2021(01)
- [2]CircHIPK3在急性髓系白血病发病中作用及机制的初步研究[D]. 魏鑫. 中国医科大学, 2021
- [3]miR-34a靶向调控HDAC1基因对急性髓系白血病细胞凋亡的影响[D]. 温超. 南昌大学, 2020(08)
- [4]组蛋白去甲基化酶RBP2和RNA结合蛋白Lin28B介导慢粒急变的调控机制[D]. 尹小林. 山东大学, 2020(08)
- [5]长链非编码RNA HOXA-AS2对急性髓系白血病的作用及机制研究[D]. 曲艺. 中国医科大学, 2020(01)
- [6]miR-148b通过Ezrin蛋白调控弥漫性大B细胞淋巴瘤药物敏感性的研究[D]. 林晓骥. 苏州大学, 2019(08)
- [7]MicroRNA-183-5p靶向Erbin调控急性髓系白血病增殖与分化的机制研究[D]. 郑卓军. 苏州大学, 2018(06)
- [8]EZH2在急性髓细胞白血病中的临床意义及作用研究[D]. 谢月. 南京医科大学, 2017(05)
- [9]地西他滨对HL-60细胞株、Molt-4细胞株的作用和机制研究[D]. 张睿. 昆明医科大学, 2014(01)
- [10]急性髓性白血病耐药相关miRNA分子功能及作用机制研究[D]. 卢菲. 山东大学, 2014(12)
标签：急性淋巴细胞性白血病论文; 细胞增殖论文; 慢粒白血病论文; 慢性粒细胞白血病论文; 基因合成论文;