一、诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白质的原核表达载体构建研究（论文文献综述）
霍雨佳[1]（2021）在《大鼠CDON与IZUMO1和JUNO的相互作用及对受精的影响》文中认为哺乳动物的有性生殖过程包括生殖细胞（精子和卵子）发生、受精、着床和胚胎发育等环节,其中受精是最为重要的步骤。精子与卵子结合并融合形成受精卵是受精的中心环节,这一环节的分子机制尚不清楚。已发现精子膜蛋白IZUMO1与它在卵细胞膜上的受体蛋白JUNO识别是精卵粘附的先决条件之一,但仅仅有IZUMO1-JUNO相互作用还不足以导致细胞膜融合,应该有其他配子蛋白参与了精卵融合。本实验鉴定了Hedgehog信号的辅助受体CDON与JUNO和IZUMO1的相互作用,并测定了CDON对受精率的影响,评估CDON在精卵融合过程中发挥的作用。首先克隆大鼠cdon的cDNA编码区。将这一片段分别插入到pET-28a、pGAD-T7和pCMV-C-Flag质粒中构建pET-cdon原核表达载体、pGAD-cdon酵母表达载体和pCMV-Flag-cdon真核表达载体。将pET-cdon原核表达载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达HISCDON融合蛋白,分离纯化融合蛋白免疫小鼠得到HIS-CDON腹水多克隆抗体。利用自制的抗体进行大鼠卵巢的免疫荧光染色实验,结果显示:CDON在大鼠卵巢组织中广泛存在,主要存在于卵细胞膜和周围的颗粒细胞中。对大鼠卵细胞和精子的免疫荧光共定位实验显示:CDON局部定位于MII期卵母细胞膜上,且与JUNO存在共定位,但在精子上不表达。使用自制的CDON抗体分别孵育大鼠的卵细胞和精子,使其受精并统计受精率。结果表明:精子和卵子经过抗体处理后受精率下降,但不显着。将pGAD-cdon酵母表达载体与实验室保存的pGBK-Juno和pGBKIzumo1进行酵母双杂交实验,结果显示CDON与JUNO和IZUMO1均存在相互作用。将构建好的pCMV-Flag-cdon真核表达载体与实验室保存的pCMV-HAJuno和pCMV-HA-Izumo1进行免疫共沉淀和Western blot分析。进一步说明CDON与JUNO和IZUMO1均存在相互作用。本实验发现CDON与JUNO和IZUMO1在体内外均具有相互作用,且在卵巢和卵母细胞膜上均有表达,提示CDON在精卵融合过程中发挥一定的作用。
任丽君[2]（2021）在《猫干扰素ω和干扰素γ的可溶性原核表达、纯化及安全性初步评价》文中提出干扰素是机体免疫细胞在诱导剂的作用下产生的具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性的糖蛋白,根据其来源、生物学性质及活性,分为Ⅰ型和Ⅱ型。猫干扰素ω（FeIFN-ω）属于Ⅰ型干扰素,在抗病毒和抗肿瘤方面发挥着重要作用,猫干扰素γ（FeIFN-γ）属于Ⅱ型干扰素,在宿主抵御胞内病原体中起关键作用。虽然干扰素的研究历史已久,但有关FeIFN-ω和FeIFN-γ的可溶性表达及其应用鲜见报道。本文主要对FeIFN-ω和FeIFN-γ基因进行克隆、原核可溶性表达及纯化,并对其安全性进行初步评价,以期为FeIFN-ω和FeIFN-γ的临床应用奠定基础。根据NCBI收录的FeIFN-ω和FeIFN-γ基因序列,在生物信息学分析的基础上设计引物,从猫肝脏cDNA中克隆不含信号肽的成熟FeIFN-ω和FeIFN-γ基因,构建原核表达载体pET28a-SUMO-FeIFN-ω和pET28a-SUMO-FeIFN-γ,分别在BL21（DE3）和Rosetta（DE3）感受态细胞中诱导表达,并优化表达条件,Ni柱纯化融合蛋白,SUMO酶切除标签,分子截留柱纯化得到无标签成熟的FeIFN-ω和γ,小鼠腹腔注射初步评价其安全性。结果表明,（1）以猫肝脏cDNA为模板扩增出522 bp和444 bp的FeIFN-ω和FeIFN-γ成熟蛋白基因,构建的p MD19-T-FeIFN-ω和p MD19-T-FeIFN-γ克隆质粒转化DH5α细胞,提取的质粒经PCR、双酶切和测序鉴定,大小和序列正确。（2）以该序列构建原核表达载体pET28a-SUMO-FeIFN-ω和pET28a-SUMO-FeIFN-γ,分别转化BL21（DE3）和Rosetta（DE3）感受态细胞,诱导表达出大小约35 ku和34 ku的融合蛋白,且主要存在于超声破碎细胞的上清液中,为可溶性表达;诱导表达的最佳IPTG终浓度浓度分别为0.6 mmol/L和0.8 mmol/L、时间分别为6 h和9 h、温度均为16℃。（3）纯化结果显示分别获得约35 ku和34 ku的单一条带,酶切除SUMO标签后通过分子截留,分别得到约18 ku和17 ku的成熟FeIFN-ω和FeIFN-γ蛋白,浓度分别为0.79 mg/m L和0.86 mg/m L。（4）小鼠急性毒性试验结果表明无不适临床症状和组织剖检变化,体重无显着差异（P>0.05）,血液生化指标除FeIFN-ω中0.2 mg/只剂量组的GLU和FeIFN-γ中0.3 mg/只剂量组的ALT高于对照组（P<0.05）之外,其他各指标与对照组比较无显着差异（P>0.05）,各组中肝、脾、肺、肾4个组织结构正常,无明显炎性细胞浸润和纤维化等病理组织变化。综上所述,本试验利用大肠杆菌原核表达系统建立了FeIFN-ω和FeIFN-γ可溶性的体外表达体系,获得了成熟FeIFN-ω和FeIFN-γ蛋白,为其开发应用奠定了基础。
牛金中[3]（2021）在《罗非鱼NCC亚群的构成解析及其活性调控因子半乳糖凝集素（Galectins）的功能研究》文中进行了进一步梳理鱼类非特异性细胞毒性细胞（NCC）是自然杀伤细胞（NK）进化上的前体细胞,与NK细胞功能相似,除了非特异性的细胞杀伤作用,还具有免疫调节功能,然而NCC类群及其活性调控机理尚不清楚。本文以我国南方重要的淡水养殖品种尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）为研究对象开展了三方面的研究:一、通过单细胞测序构建了罗非鱼NCC的单细胞转录图谱,鉴定出4个NCC亚群;二、通过转录组数据筛选到系列差异表达的半乳糖凝集素（Galectin）基因家族,通过酵母双杂交及GST Pull-down技术对该类蛋白与NCC受体蛋白非特异性细胞毒性细胞受体Ⅰ型（NCCRP-1）的相互作用进行了鉴定;三、针对与NCC活性调控相关的Gal-2与Gal-8开展了功能研究。取得的主要研究结果如下:1、通过高通量10x单细胞测序获得硬骨鱼免疫细胞图谱及NCC亚群信息。在对罗非鱼进行Poly I:C免疫刺激24 h后,取对照组和处理组的罗非鱼头肾并分离淋巴白细胞,通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）对24,062个淋巴细胞的转录本进行了分析,构建了罗非鱼淋巴细胞图谱。根据细胞异质性和已知标志物,将头肾淋巴细胞分为B细胞、T细胞、NCC和单核/巨噬细胞（Mo/MΦ）四种类型,WGCNA预测NCC群体的调控网络,鉴定出4个中枢基因（STBD1、VWF、PGP和GRN）和1个转录因子（Hvcn1）,并根据细胞异质性和细胞内功能基因的表达,进一步将NCC鉴定出memory-like NCC、mature NCC、immature NCC和pre-NCC4个亚群。2、与NCC互作的Gals蛋白鉴定。（1）从上述单细胞测序数据中筛选差异表达的Gal基因并进行克隆,获得5个Gal基因:Gal-2（OnGal-2）,Gal-3（OnGal-3）,Gal-4（OnGal-4）,Gal-8（OnGal-8）,Gal-9（OnGal-9）,序列特征分析显示基因均无信号肽,均含有至少一个碳水化合物识别域（CRD）以及碳水化合物识别位点（V-N,H-N-R以及W-E-R）,这一结构特征与其他物种的Gal蛋白序列特征一致。（2）分别构建Gal的酵母双杂交诱饵质粒,与NCCRP-1进行互作验证,发现Gal-2可与NCCRP-1相互作用;（3）构建OnGal原核表达载体（GST标签载体）,利用percoll密度梯度方法分离NCC,通过GST Pull-down技术从NCC裂解物中钓取互作蛋白,结果显示r OnGal-2和r OnGal-8筛选鉴定到共同的胞内互作蛋白为基质金属蛋白酶（MMP）;（4）亚细胞定位分析显示MMP与OnGal-2/OnGal-8在细胞内共定位。3、分析了依赖于NCCRP-1受体的OnGal-2的免疫调节功能及其对NCC的活性调控。（1）首先通过qRT-PCR分析OnGal-2的组织分布情况,该基因分布于健康罗非鱼的组织中,其中大脑表达水平最高,其次是脾脏、肝脏、肠道、心脏、胸腺、肌肉、皮肤、头肾和鳃。无乳链球菌刺激后,OnGal-2在胸腺、头肾、脾脏以及单核/巨噬细胞的表达量显着上调,表明OnGal-2参与了罗非鱼抗菌免疫应答。（2）随后制备重组蛋白r OnGal-2（His标签蛋白）对其功能开展系列研究。体外凝集实验发现r OnGal-2对G+（无乳链球菌,海豚链球菌,巴氏葡萄球菌和格氏乳球菌）和G-菌（大肠杆菌、哈维弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌）具有凝集和结合作用,多种糖类（LPS、LTA、Gal、Man以及Mal）能削弱r OnGal-2对细菌的结合,并且r OnGal-2能够促进单核/巨噬细胞对细菌的吞噬作用;r OnGal-2可以增强NCC效应基因（Fas L、NK-lysin、Perforin和Granzyme）表达及杀伤活性。（3）双荧光素酶报告系统检测结果表明OnGal-2能够激活NF-κB、IFN-1、STAT1以及ISRE信号通路;表明OnGal-2可能通过与MMP的结合参与NCCRP-1介导的NCC活性调控。（4）进一步的体内实验发现r OnGal-2注射至罗非鱼体内后可显着提高血清的抗菌活性（ALKP、ACP、LZM）和抗氧化能力（CAT、POD、SOD）,还能减少无乳链球菌感染后头肾、脾脏和肝脏中的载菌量、减轻组织损伤,且能调控NCC效应基因的相对表达量,从而提高感染后罗非鱼的相对存活率。4、研究了不依赖于NCCRP-1受体的OnGal-8免疫调节作用。（1）q RT-PCR分析显示OnGal-8在所有检查的组织中广泛存在,其中在脾脏中具有最高表达水平。在无乳链球菌刺激后,脾脏、头肾和脑的OnGal-8转录水平显着上调。（2）体外实验结果表明,OnGal-8重组蛋白（r OnGal-8）可以凝集红细胞、无乳链球菌和嗜水气单胞菌,结合无乳链球菌、嗜水气单胞菌和各种PAMP（脂多糖、脂蛋白、Poly I:C、肽聚糖、半乳糖、甘露糖和麦芽糖）。此外,r OnGal-8还能调节单核/巨噬细胞炎症相关基因表达、促进吞噬和呼吸爆发作用以及增强NCC的杀伤作用。（3）双荧光素酶报告基因检测结果表明OnGal-8过表达抑制NF-κB、IFN-1、STAT1以及ISRE信号通路活性,表明OnGal-8可以通过与MMP的互作参与对NCC的调控;（4）体内实验结果显示,OnGal-8过表达可通过调节血清抗菌活性（AKP、ACP和LZM）和抗氧化能力（CAT、POD和SOD）、降低感染组织中细菌的载量、减轻组织损伤以及增强NCC效应基因（CAS、FADD、Perforin1、Granzym和Fas L）表达来提高无乳链球菌感染后罗非鱼的存活率。
郭军培[4]（2021）在《猪GRP多克隆抗体的制备与应用及其对Leydig cells睾酮分泌的影响》文中进行了进一步梳理胃泌素释放肽（Gastrin-releasingpeptide,GRP）是1979年从猪的胃组织中分离得到的一种神经肽,是哺乳动物蛙皮素样肽家族中的一员,在体内GRP通过与其受体（Gastrin-releasing peptide receptor,GRPR）结合发挥多种生理功能。GRP及其受体在多种动物的神经系统和外周组织中广泛表达,参与调控体内多种生物学作用,包括:促进正常/肿瘤细胞的增殖分化、促进胰液分泌、调节应激和恐惧等情绪性行为、参与调控摄食和节律等。自GRP发现以来,目前大多数关于GRP及其受体功能的研究都集中于人和大小鼠上,关于猪体内GRP的表达及其生物学作用的研究较缺乏。为研究GRP在猪体内的分布情况,我们首先制备了猪GRP多克隆抗体,并研究了GRP蛋白在猪体内的分布。本课题组前期研究结果表明,GRP可能对公猪的生殖功能具有调控作用,因此本试验以猪Leydig cells为模型,研究GRP对猪Leydig cells睾酮分泌/合成、增殖及凋亡的影响。通过以上研究旨在发现GPR在猪体内可能存在的生理功能及对猪Leydig cells的影响,为进一步研究GRP对公猪生殖相关激素的调控机制奠定基础。1.猪GRP多克隆抗体的制备本试验通过大肠杆菌原核表达技术,构建了重组表达载体pET32a（+）-pGRP,并转化到表达菌株BL21（DE3）获得pGRP融合蛋白表达菌株,IPTG诱导表达菌株获得Histag-pGRP融合蛋白,以纯化后的融合蛋白为免疫原,制定免疫程序免疫试验动物后获得抗血清,即为制备的多克隆抗体。具体如下:（1）根据猪GRP基因序列,设计并合成添加酶切位点的引物序列;通过PCR扩增获得pGRP目的片段,包括全长开放阅读框（441 bp）,编码146个氨基酸;随后与pMD19T连接构建pMD19T-pGRP重组质粒;将pMD19T-pGRP和pET32a（+）质粒经双酶切线性化后连接构建pET32a（+）-pGRP重组表达载体;并转化至表达菌株BL21（DE3）中获得BL21（DE3）-pET32a（+）-pGRP融合蛋白表达菌株。（2）利用IPTG诱导BL21（DE3）-pET32a（+）-pGRP融合蛋白表达菌株获得His-tag-pGRP融合蛋白,并对获得的蛋白进行检测和纯化。（3）制定免疫程序后,以纯化后的融合蛋白为免疫原免疫试验动物家兔,并获得抗血清;采用ELISA检测抗血清的效价为1:50,000,并通过Western Blot检测抗血清的反应原性;纯化后的抗血清即为制备的多克隆抗体。2.GRP在猪体内的分布定位和表达本部分主要通过IHC和Western Blot检测GRP蛋白在猪组织中的分布表达情况。结果表明:GRP蛋白在猪的中枢神经系统和外周组织器官中都有表达,其中在中枢神经系统GRP蛋白主要表达在下丘脑、小脑等组织;在外周组织中主要表达在胃肠道和泌尿生殖道。综上所述,GRP蛋白在猪体内的广泛存在表明GRP可能对猪的多种生理功能具有调节作用。3.GRP对猪Leydigcells的影响为研究GRP对猪Leydig cells的影响,我们使用一定浓度的GRP处理猪Leydig cells,收集上清和蛋白样品分别进行如下检测:检测GRPR蛋白在Leydig cells中表达,结果表明一定浓度（1和10 nM）的GRP可以显着促进GRPR蛋白的表达;检测上清中睾酮分泌和睾酮合成相关蛋白（StAR、CYP11A1和HSD3B2）表达的影响,结果表明GRP能够促进睾酮的分泌,其中1和10nM的GRP能够显着增加睾酮的浓度（P<0.01和P<0.05）;Western Blot结果也表明不同浓度GRP处理细胞对睾酮合成相关蛋白（StAR、CYP11A1和HSD3B2）的表达有一定的促进作用;进一步检测了GRP对Leydig cells细胞增殖和凋亡的影响,CCK-8结果表明GRP对细胞活性有一定的作用,GRP浓度为1和10nM时能够显着增加细胞数量（P<0.01和P<0.05）;Western Blot检测结果表明一定浓度的GRP对Cyclin B1蛋白表达有促进作用,但是对PCNA影响不显着;同时流式细胞术检测结果表明一定剂量的GRP能够促进细胞凋亡并促进凋亡相关蛋白的表达;检测了GRP处理对G-蛋白偶联受体信号通路中pPKC/PKC和pPKA/PKA蛋白表达的影响,结果显示一定浓度的GRP能够增加pPKC/PKC的比值,但是对pPKA/PKA的比值影响不显着。该论文构建重组表达载体pET32a（+）-pGRP并制备猪GRP多克隆抗体,通过IHC和Western Blot检测GRP蛋白猪体内的分布和表达情况,结果表明GRP蛋白在猪组织中具有广泛的分布表达,表明GRP在猪体内可能具有多种生理功能。该论文进一步研究GRP对猪睾丸间质细胞睾酮的分泌和合成的影响,结果表明一定浓度的GRP能够促进睾酮分泌并调节睾酮合成相关蛋白的表达;另外,研究结果还表明一定浓度的GRP对睾丸间质细胞的细胞增殖和凋亡也有影响;并发现GRP/GRPR系统对睾丸间质细胞的调节作用可能是通过pPKC/PKC途径。
阮涌[5]（2021）在《BLM-EZH2相互作用影响前列腺癌细胞增殖的分子机制研究》文中研究指明Rec Q-BLM解旋酶在DNA的修复、复制、重组和转录等细胞代谢过程和维持基因组的稳定性中具有非常重要的作用。BLM基因的缺陷将引起人类Bloom综合症（Bloom syndrome,BS）,且易患前列腺癌、乳腺癌、肺癌等癌症。其中,2020年前列腺癌（Prostate cancer,PCa）在我国男性恶性肿瘤中发病率居第七位,死亡率居第十位,PCa已逐渐成为影响我国男性生命健康的常见肿瘤之一。有研究表明BLM在PCa细胞系中高表达,在干扰或过表达BLM后,PC3细胞恶性程度相应的降低或增强;EZH2蛋白是多梳抑制复合物2（Polycomb Repressive Complex 2,PRC2）的成员之一,也有研究表明EZH2蛋白与PCa的发生存在密切关系。本论文深入研究了BLM、EZH2与PCa相互关联性,阐明了BLM/EZH2/MDM2/P53的信号调控轴途径,从分子、细胞、组织和动物水平探索了BLM与EZH2蛋白相互作用对PCa的影响及其机制。其主要研究结果如下:1.BLM与EZH2蛋白主要定位于细胞核内,实验发现这两个蛋白其存在相互作用,预测它们在PCa组织的m RNA中表达水平呈极显着正相关应用Western Bloting实验检测发现BLM在PCa细胞系中高表达,以BLM为诱饵蛋白,通过免疫共沉淀实验联合质谱分析发现与BLM存在相互作用的蛋白有541个,利用TCGA和STRING数据库分析可视化了BLM的相互作用蛋白网络及它们在细胞内的调控关系,其中EZH2蛋白是其相互作用的蛋白之一,且BLM与EZH2在PCa中的表达呈极显着正相关(P-Value=7.9e-74)。在此基础上,我们应用GST Pull down发现BLM与EZH2存在直接相互作用,进一步通过间接免疫荧光实验发现BLM与EZH2主要定位于细胞核。2.BLM与EZH2蛋白在PCa组织中高表达,BLM与EZH2在PCa临床样本中的免疫组化得分呈极显着正相关分别应用BLM和EZH2抗体对50例PCa组织、20例增生组织和9例前列腺组织进行免疫组化研究。发现BLM和EZH2蛋白在PCa组织中相比于正常前列腺高表达,且分别呈显着（P<0.05）和极显着（P<0.01）差异,BLM和EZH2的高表达均与患者的T分期（P=0.030,P=0.012）、临床分期（P=0.030,P=0.012）和Gleason分数（P=0.006,P=0.029）存在显着或极显着相关性,但是与年龄、Gleason分级、淋巴结转移和远处转移没有显着相关性,BLM与EZH2在PCa临床样本中的免疫组化得分呈极显着正相关（P<0.001）。3.干扰BLM和EZH2蛋白能够显着抑制PC3细胞的增殖、迁移和侵袭,并可能存在BLM/EZH2/P53的信号调控轴利用BLM特异性抑制剂处理PC3细胞5天后,进行活细胞计数检测,发现ML216的药物浓度与细胞活性呈负相关,且药物处理组与阴性对照组相比差异极显着（P<0.001）,检测细胞周期发现其能够引起PC3细胞在G0/G1期细胞数量的增加。应用si RNA分别单独或同时干扰BLM和EZH2时,发现si BLM和si EZH2的联合干扰能够更加显着抑制PC3细胞的增殖、迁移和侵袭能力,且能够上调PC3细胞中P53蛋白的表达水平,结合生物信息学分析发现在PC3细胞中可能存在BLM/EZH2/P53的信号调控轴。4.体内外实验进一步阐明了在PC3细胞中存在BLM/EZH2/MDM2/P53的信号调控轴以EZH2为诱饵蛋白进行了ChIP-seq试验,发现EZH2蛋白并未能够直接结合P53启动子区,而是通过调控MDM2启动子区间接调控P53蛋白的表达。通过体外实验发现过表达EZH2,能促进PC3细胞的增殖、迁移和侵袭,但在同时干扰BLM时,能够部分削弱其增强效应,反之,在干扰EZH2时,则能减弱了PC3细胞的增殖、迁移和侵袭,而在同时过表达BLM时,能够部分抵消EZH2干扰时的减弱效应,体内裸鼠成瘤实验结果也与上述结果一致。表明在PC3细胞中存在BLM/EZH2/MDM2/P53的信号调控轴。综上,本研究发现BLM与EZH2蛋白主要定位于细胞核,通过免疫共沉淀联合质谱分析和Pull down实验发现BLM与EZH2蛋白存在直接相互作用,生物信息学分析显示BLM与EZH2在PCa的发生中均高表达且呈显着相关性,并在PCa组织中进一步印证了BLM与EZH2的相关性。通过干扰BLM和EZH2蛋白能够显着抑制PC3细胞增殖、迁移和侵袭,体内外实验揭示了在PC3细胞中存在BLM/EZH2/MDM2/P53的信号调控轴途径。弄清BLM-EZH2相互作用影响前列腺癌细胞增殖分子机制,以Rec Q-BLM解旋酶为小分子抗癌药物的靶标,另辟和建立治疗前列腺癌的新途径和新方法,具有重要的理论价值和应用前景。
刘晓晓[6]（2021）在《克氏原螯虾Yippee-2和Yippee-5基因的鉴定及其功能的研究》文中指出克氏原螯虾是我国重要的经济养殖虾品种之一,开展克氏原螯虾免疫与发育调控机理研究对于提高其抗逆能力和养殖产量及新品种选育具有重要的理论与实践意义。YPEL蛋白是一种在真核生物中具有高度保守性的锌指结合蛋白,广泛参与多种细胞的生理过程,但其在甲壳类动物先天免疫反应中的功能尚不明确。本实验克隆了YPEL蛋白家族中的Yippee-2和Yippee-5两个基因,并探讨了它们对克氏原螯虾先天免疫反应的影响,取得的结果如下:1、在克氏原螯虾中分别克隆获得了长为345 bp和360 bp的Yippee-2和Yippee-5基因的开放阅读框（ORF,open reading frame）。Yippee-2基因编码114个氨基酸,预测蛋白分子量为13 k Da,而Yippee-5基因编码119个氨基酸,预测蛋白大小为14 k Da。Yippee-2和Yippee-5蛋白都具有一个保守的Yippee-Mis18结构域。多重序列比对和进化树分析表明Yippee-2和Yippee-5蛋白在真核生物中都具有氨基酸序列的高度保守性,其中,Yippee-2与福寿螺的相似度达95%,Yippee-5与美国白对虾的相似度达84%。2、分别构建了pGEX4T-1-Yippee-2和PET-32a-Yippee-5重组表达质粒,并用不同浓度的IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blot结果分析表明Yippee-2和Yippee-5重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。利用GST亲和层析柱纯化获得了Yippee-2重组蛋白,利用Ni-NTA亲和层析柱纯化获得了Yippee-5重组蛋白。3、通过Far western blot证实了Yippee-2蛋白与Yippee-5蛋白可发生相互作用。4、通过荧光定量PCR检测Yippee-2和Yippee-5基因在不同组织的分布情况。结果表明Yippee-2和Yippee-5基因在血淋巴细胞、肝胰腺、胃、心脏、鳃、肠和肌肉中均有表达,其中Yippee-2基因在心脏中表达量最高,而Yippee-5基因在血细胞中的表达量最高。5、LPS和poly（I:C）刺激后,Yippee-2和Yippee-5基因的m RNA水平在肝胰腺、肠、肌肉和鳃中的表达模式均具有显着的变化。不同刺激条件下,Yippee-2和Yippee-5基因表达水平均在鳃组织中变化最大。相对于poly（I:C）处理,Yippee-2和Yippee-5基因对LPS的刺激反应更为灵敏。6、Yippee-2和Yippee-5基因RNA干扰后,在鳃、肌肉和肝胰腺组织中Bax、Cyto C、p53、Caspase-3、ATF2、Crustin、ALF和Cactus等细胞凋亡及免疫基因的表达水平均受到显着影响,表明它们可能参与了p53和Toll信号通路的调节。
韩聪[7]（2020）在《宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究》文中研究表明猪圆环病毒2型（porcine circovirus type,PCV2）引起猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus-associated diseases,PCVDs）,PCV2感染首先侵害机体的免疫系统,引起机体产生免疫抑制从而对多种病原易感,导致感染猪群病死率显着升高,生产性能明显下降,给养猪业造成巨大的经济损失。PCV2基因组包含11个重叠的开放阅读框（ORFs）,其中最重要的是ORF2,ORF2编码的衣壳蛋白Cap是PCV2的唯一结构蛋白,在病毒复制过程中,Cap参与了病毒基因组的入核以及成熟病毒粒子的组装。信号传导及转录激活蛋白5（signal transducer and activator of transcription5,STAT5）是一种多功能的转录因子,具有与DNA结合的特性。核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin 1,NPM1）是一种多功能的宿主蛋白,不仅参与多种细胞生理活动,还在多种病毒的复制过程中发挥重要作用。热休克蛋白40 B6（heat shock protein40 B6,DNAJB6）属于热休克蛋白40（Hsp40）家族成员之一,参与细胞中蛋白的折叠、转运、蛋白复合物的组装、错误折叠蛋白的降解以及病毒复制的调控。但是,有关STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制迄今未见报道。本论文首先通过免疫共沉淀筛选并鉴定了与Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6,然后分别研究STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制,研究结果将为进一步探索PCV2致病机制奠定基础。研究取得以下结果。1.以Cap抗体进行免疫共沉淀,筛选到Cap的关键宿主细胞互作蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6。分别设计针对stat5、npm1及dnajb6的引物进行PCR,扩增出猪源stat5、npm1及dnajb6基因,克隆入真核表达载体p CI-neo,酶切和测序鉴定结果显示,p CI-His-STAT5、p CI-Flag-NPM1及p CI-Flag-DNAJB6载体构建成功。与人源及鼠源的序列比较结果显示,猪源STAT5氨基酸序列与鼠源STAT5的同源性最高（96.3%）。猪源NPM1氨基酸序列与人源NPM1的同源性最高（98.2%）。猪源DNAJB6氨基酸序列与人源DNAJB6的同源性最高（90.9%）。1 MOI的PCV2感染PK-15,间接免疫荧光染色后发现,Cap与STAT5和NPM1在细胞核中发生共定位,与DNAJB6在细胞核和细胞质中均发生共定位。PCV2感染后28 d扑杀猪,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结中均能检测到STAT5、NPM1和DNAJB6,与对照组相比,NPM1、STAT5的m RNA水平和蛋白水平在各种组织中均未见明显差异（p>0.05）,而DNAJB6在肺脏、肾脏及淋巴结中的m RNA水平和蛋白水平显着高于对照组（p<0.05）。2.将p EGFP-Cap和p CI-His-STAT5共转染至HEK293T后免疫共沉淀结果显示,Cap与STAT5存在互作。GST-pull down检测发现,Cap与STAT5不能直接结合。用stat5 si RNA处理PK-15后,测定PCV2感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数。结果显示,干扰效率最高si RNA#1组的PCV2DNA拷贝数显着低于非特异性si RNA转染组的病毒拷贝数（p<0.05）。PCV2 DNA序列中包含有GAS样基序（5’TTCTCTGAA3’）,该基序是STAT5保守的结合位点,DNA pull down试验证实PCV2 DNA GAS样基序突变的感染性克隆（PCV2-MDS）不能与STAT5结合,而野生型PCV2 DNA能与STAT5结合。用等量的野生型PCV2和PCV2-MDS感染PK-15 12 h、24 h,FISH检测病毒DNA复制显示,与野生型PCV2感染的细胞相比,在PCV2-MDS感染24 h的细胞中靶向病毒基因组DNA复制链（负链）的探针（RFP）和靶向病毒基因组模板链（正链）的探针（CP）阳性细胞数量都显着降低（p<0.05）;荧光定量PCR检测显示,在感染后12 h及24 h,PCV2MDS感染细胞中病毒DNA拷贝数显着低于野生型PCV2感染细胞（p<0.05）。3.干扰npm1的PK-15再用PCV2感染24 h后发现,与对照组相比,转染靶向npm1特异性si RNA#1的细胞中,病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。利用CRISPR/Cas9技术构建npm1敲除的PK-15,与野生型细胞相比npm1敲除的PK-15细胞中病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。GST-pull down结果显示,STAT5能与NPM1直接互作,NPM1与PCV2 Cap直接互作。构建NPM1及其截短体原核表达载体和Cap截短体真核表达载体,GST-pull down确定NPM1与Cap的结合区域分别为NPM1的151-158 aa及Cap的136-153 aa。将Cap 147位精氨酸及148位组氨酸突变为丙氨酸的PCV2突变毒株（PCV2-Nm A）感染PK-15后发现,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A感染的细胞中病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。荧光原位杂交结果显示,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A细胞中RFP及CP阳性细胞数量均显着降低（p<0.05）。4.以1 MOI PCV2感染PK-15,与对照组相比,DNAJB6 m RNA水平在感染36 h后显着增加（p<0.05）,48 h进一步增加（p<0.01）,DNAJB6的蛋白水平与m RNA水平变化一致。分别用不同剂量PCV2感染PK-15 36 h发现,DNAJB6表达量随PCV2感染剂量的增加而增加。免疫共沉淀显示DNAJB6与Cap互作,GST-pull down明确互作区域为DNAJB6的1-99 aa和Cap的162-234 aa。用等量PCV2分别感染野生型PK-15、dnajb6敲除的PK-15(PKDNAJB6-/-)以及dnajb6未敲除的PK-15(PKDNAJB6+/+)48h发现,与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中Cap蛋白和病毒产生水平显着降低（p<0.05）。与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显着降低（p<0.01）。用等量PCV2感染野生型PK-15、dnajb6过表达PK-15(PKDNAJB6)及转染空载体的PK-15（PKV）发现,与野生型PK-15和PKV相比,PKDNAJB6中Cap蛋白和病毒产生水平显着增加（p<0.05）,并且PKDNAJB6中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显着升高（p<0.05）。构建DNAJB6与Cap互作位点缺失质粒p CI-CapΔ162-234和p CI-DNAJB6ΔJ。分别转染p CI-Cap、p CI-CapΔ162-234和p CI-neo于稳定表达GFP-LC3的PK-15 24 h发现,与转染p CI-Cap的细胞相比,转染p CI-CapΔ162-234的细胞中自噬小体数量显着降低（p<0.01）。在稳定表达GFP-LC3的PKp DNAJB6-/-中先分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo质粒,再感染等量的PCV2或转染等量的p CI-Cap质粒发现,与转染p CI-DNAJB6的细胞相比,p CI-DNAJB6ΔJ转染细胞中自噬小体数量显着降低（p<0.01）,且病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.01）。用自噬抑制剂3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6-/-后分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo后再用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理转染p CI-DNAJB6的PKp DNAJB6-/-中病毒产生水平显着下降（p<0.01）。3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6后用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理的细胞中病毒产生水平显着降低（p<0.01）。用atg5 si RNA处理PKp DNAJB6后再用等量PCV2感染发现,抑制atg5的表达显着降低PCV2诱导的自噬小体的形成及病毒产生水平。本研究筛选到与PCV2 Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6。发现STAT5与Cap间接互作,STAT5还与PCV2 DNA的GAS样基序结合,获得了复制能力低于野生型PCV2的GAS样基序突变毒株。发现NPM1能与Cap和STAT5直接互作,鉴定出NPM1与Cap互作区域,获得了PCV2 Cap 147、148位点突变的毒株,该毒株的复制能力显着低于野生型PCV2。PCV2感染上调DNAJB6的表达,且Cap 162-234 aa与DNAJB6 1-99 aa直接结合,突变DNAJB6/Cap互作位点、自噬抑制剂处理或抑制atg5基因表达都能显着降低PCV2感染诱导的自噬小体和病毒产生水平。本论文研究结果阐明了宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中的作用及机制,为进一步揭示PCV2的致病机制提供理论依据。
张文颖[8]（2020）在《日本七鳃鳗L-STAT3基因的克隆及功能初探》文中研究说明作为最原始的无颌类脊椎动物,日本七鳃鳗（Lampetra japonica）是研究免疫起源与进化的重要模式生物[1]。STAT3（Signal transducer and activator of transcription 3）是重要的信号转导与转录因子,参与细胞多种生理过程。研究显示,日本七鳃鳗L-STAT3可通过上调表达应答七鳃鳗肠道希瓦氏菌（Shewanella sp.）免疫,因此推测L-STAT3参与了七鳃鳗适应性免疫调控的过程。关于日本七鳃鳗L-STAT3的研究目前还未见报道,因此L-STAT3的功能研究可为分析七鳃鳗应答肠道共生菌免疫刺激的适应性免疫过程提供理论基础。基于此,本论文的具体研究内容如下:1、日本七鳃鳗白细胞应答希瓦氏菌免疫刺激差异表达蛋白质组的鉴定本研究利用Label-free定量蛋白质组学技术鉴定了日本七鳃鳗白细胞应答肠道希瓦氏菌免疫的差异表达蛋白质,从中获得25个差异表达蛋白质,其中上调表达的蛋白质有9个,下调表达的蛋白质有16个。利用实时定量PCR技术（q PCR）进一步验证了差异表达蛋白质在转录水平上的表达。在检测的10个蛋白质中只有蛋白酶体亚单位β-5型蛋白质的表达与蛋白质组检测水平一致。可能原因是差异蛋白质的表达存在不同水平的调控使得编码基因在转录水平和蛋白质水平表达量不一致。2、日本七鳃鳗L-STAT3的克隆、生物信息学及表达模式分析在所有差异表达蛋白质中,STAT3表达显着上调。将该基因进行了全长克隆,测序后发现该基因ORF区为2124 bp,编码708个氨基酸,根据氨基酸序列比对结果,该基因与其他物种来源的STAT3同源性较高,因此将该基因命名为L-STAT3。利用生物信息学预测并分析了L-STAT3编码氨基酸的结构特性和理化特征,并预测了该蛋白的结构。选取具有代表性的物种构建了STAT3的进化树,发现L-STAT3在进化上与七鳃鳗保持一致。3、日本七鳃鳗L-STAT3的原核表达、多克隆抗体制备及表达定位分析将L-STAT3的部分亲水性片段进行克隆并构建到p Cold I载体中,获得原核表达重组质粒。在E.coli Rosetta中表达并纯化了该蛋白。利用纯化蛋白制备得到anti-STAT3多克隆抗体,并验证了抗体的特异性。在转录水平上,希瓦氏菌刺激可使得L-STAT3在七鳃鳗心脏、肝脏、肠及肌肉中表达上调,而在白细胞及其他四种组织中表达下调。通过Western Blot技术对L-STAT3在日本七鳃鳗各组织的体内表达情况进行了检测。结果表明,经希瓦氏菌免疫刺激后,日本七鳃鳗L-STAT3蛋白在肾脏、鳃、肌肉、白细胞相对表达量较高。与对照组相比,希瓦氏菌刺激使得L-STAT3蛋白在白细胞、鳃、髓及肌肉中表达上调。免疫荧光显示L-STAT3蛋白主要定位于七鳃鳗髓样小体细胞的细胞质中,少量存在于细胞核。4、日本七鳃鳗L-STAT3的功能初探为了获得L-STAT3活性蛋白质,利用毕赤酵母表达系统构建并优化了L-STAT3的表达。将L-STAT3序列根据毕赤酵母基因表达特点进行稀有密码子优化后构建到毕赤酵母表达载体p PICZαA中,得到的重组质粒在毕赤酵母GS115中表达,在BMMY培养基中成功实现甲醇诱导分泌表达,在始终保持1%甲醇诱导终浓度的条件下,29oC 250rpm摇床培养120 h重组蛋白表达量达到最高。后期我们将对重组蛋白进行纯化和去内毒素处理,并探索不同浓度重组蛋白对细胞活性的影响。此外,构建了L-STAT3基因的真核表达载体,将去内毒素重组质粒瞬时转染到HEK-293T和Hela细胞,L-STAT3过表达提高了HEK-293T和Hela细胞的存活率。综上,本论文以希瓦氏菌诱导的七鳃鳗白细胞差异蛋白质组学为切入点,鉴定获得了应答希瓦氏菌免疫的差异表达蛋白质,为后续研究七鳃鳗适应性免疫系统发育的机制奠定了理论基础;对L-STAT3基因进行了功能初探,分析了该基因对于促进HEK-293T和Hela细胞增殖的作用,该结果为进一步探究七鳃鳗细胞增殖的作用过程提供了研究基础。
詹凡玢[9]（2019）在《团头鲂tlrs及irfs基因的克隆、表达及其功能研究》文中指出团头鲂（Megalobrama amblycephala）是我国特有的经济淡水鱼类之一,但是随着团头鲂养殖密度的增加以及养殖环境的恶化,导致其抗病能力降低,病害频发,尤其是由嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染引起的细菌性败血症严重影响了团头鲂养殖业的发展,造成了巨大的经济损失,为了解决鱼类养殖中病害多发的问题,越来越多的研究学者开始研究鱼类的免疫应答反应及其调控机制。因此,本研究通过对团头鲂Toll样受体（toll like receptors,tlrs）及干扰素调节因子（interferon regulatory factors,irfs）基因表达及其功能等方面进行分析,有利于掌握其在调节团头鲂抗细菌免疫应答中的作用,为鱼类细菌性疾病的预防和治疗提供基础参考资料。本研究主要结果如下:1.鉴定出4个能够特异性识别细菌组分的tlrs基因,分别为团头鲂tlr5a（Matlr5a）、Matlr5b、Matlr9和Matlr21。序列分析表明,4个MaTlrs都具有典型的TLR蛋白结构特征,包括胞外LRR（Leucine-rich repeat）结构区域,胞内TIR（Toll/interleukin-1 receptor）结构区域及跨膜TM（Transmembrane）结构区域,并预测了胞外LRRCT结构域和胞内TIR结构域的蛋白质3D结构,分析发现二者均呈现较为保守的结构特征,并且LRRCT结构域符合α螺旋和β折叠串联结构的特征。系统进化分析显示MaTlr5a、MaTlr5b、MaTlr9和MaTlr21分别属于TLR5亚家族,TLR7亚家族和TLR11亚家族。利用荧光定量PCR方法检测Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21基因在组织中的表达量,结果显示,其在所有检测的组织中均有表达,并且在免疫器官和淋巴样组织中的表达量相对较高。此外研究还发现,嗜水气单胞菌可以有效的诱导Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21基因在感染后团头鲂的肝脏、脾脏、肾脏、肠和鳃中上调表达。2.克隆得到11个团头鲂irfs（Mairfs）基因,利用Clustal W和SMART在线分析蛋白质序列特征,结果显示,这11个蛋白质都属于非跨膜蛋白并且无信号肽序列,除了MaIrf1和MaIrf2,其余MaIrfs都含有两个保守功能域:IRF和IRF3功能域。预测11个MaIrfs蛋白质的氨基端和羧基端3D结构,结果显示,同一家族的Irfs因子蛋白质的氨基端结构几乎一样,显示出极高的保守性。系统进化分析显示11个MaIrfs分别属于IRF1亚家族,IRF3亚家族,IRF4亚家族和IRF5亚家族。利用荧光定量PCR方法检测了11个Mairfs基因在组织中的表达情况,发现其在所有检测的组织均有表达,而且在免疫器官和淋巴样组织中的表达量相对较高。研究还发现,嗜水气单胞菌感染团头鲂后,可以有效的调控这些基因在肝脏、脾脏、肾脏、肠和鳃中的表达变化,参与机体抗嗜水气单胞菌的免疫应答。通过原核表达系统获得团头鲂核因子κB抑制蛋白β（MaIκB-β）可溶性蛋白,以及MaIrf1和MaIrf2不可溶蛋白,并对其进行抗菌性试验,结果显示获得的MaIκB-β可溶性蛋白在体外试验中并没有抗菌作用,但Western-Blot（WB）和Immuno-Fluorescence（IF）试验结果显示在嗜水气单胞菌感染的过程中,干扰素调节因子与炎症因子都参与了抗菌免疫应答。3.通过构建真核表达质粒,在鲤EPC细胞研究了团头鲂4个Matlrs在信号传导过程中功能的相似性及差异性,利用GFP融合蛋白对其进行亚细胞定位,激光共聚焦结果显示MaTlr5a、MaTlr5b、MaTlr9和MaTlr21蛋白质都位于细胞质中,其中MaTlr5a和MaTlr5b与早期内涵体和晚期内涵体位于不同位置,而MaTlr9和MaTlr21与早期内涵体和晚期内涵体都位于同一位置。利用过表达载体研究Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21全长基因对干扰素相关免疫因子的转录调控,结果表明其均能诱导irf3、irf7、isg15、mx1、pkr和viperin的上调,说明团头鲂4个Matlrs的信号传导过程是相似的,但是其上调的时间与上调基因表达量的程度是不同的,对viperin、isg15和irf7上调程度较高,pkr上调程度最小,而且Matlr5b最先调控干扰素通路,可能发挥主要功能,Matlr21最后调控,可能在信号传导过程中发挥辅助作用。因此它们在执行功能中可能有差异,但是都能够参与机体抗病原体的免疫应答。4.利用克隆方法获得6个Mairfs启动子序列,序列分析发现其启动子序列中都有核转录因子κB（NF-κB）位点。利用双荧光素酶报告试验探究了Matlrs对Mairfs启动子的调控关系,而且在人类293T细胞和鲤EPC细胞这两种细胞系中得到的结果相似,说明此信号传递的过程不受物种限制。双荧光素酶报告试验结果显示团头鲂Matlr5a和Matlr9能够促进Mairf7启动子活性,但是不能促进其他基因的启动子活性;Mairf5b能够促进Mairf1和Mairf7启动子的活性,而Matlr21并不能促进任何Mairfs启动子活性,说明Matlrs对Mairfs启动子的调控较为复杂。利用细胞凋亡试验研究过表达Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21后,在细菌感染细胞过程中对细胞凋亡的调控,试验结果显示MaTlr5a,MaTlr9和MaTlr21都能够在一定程度上抑制了细胞凋亡,而MaTlr5b在一定程度上促进了细胞凋亡。综上所述,在团头鲂Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21以及Mairf1、Mairf2、Mairf3、Mairf4a、Mairf4b、Mairf5、Mairf6、Mairf7、Mairf8、Mairf9和Mairf10在抵抗嗜水气单胞菌感染过程中能够调控机体免疫,通过二者的相互作用,能够更好的保护机体免受病原体的入侵,但是Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21在信号传导及行使功能过程中具有一定的差异,这为进一步探究鱼类Tlr及Irf信号通路在抗细菌过程中的调控奠定基础。
刘俊[10]（2019）在《Survivin在不同年龄牦牛组织器官内表达检测及其多克隆抗体的制备》文中研究说明研究目的 牦牛是高原特有物种,依据其自身的解剖学和生理学特性能够很好地适应高原的特殊环境。存活素（Survivin）作为凋亡抑制蛋白（IAP）家族最小成员既能参与细胞的增殖分化也能参与细胞的凋亡代谢。Caspase-3作为凋亡信号通路的关键因子对疾病和细胞凋亡起着重要的调节作用。本文通过研究survivin生物信息学特性,及其在新生和成年健康牦牛各组织器官中的表达差异,并分析survivin和caspase-3在三个年龄组免疫器官的基因和蛋白表达水平及特异性定位,为进一步研究survivin对牦牛不同组织器官,尤其是机体免疫功能的调控机理提供重要的理论依据。此外,本文通过构建survivin重组质粒,诱导表达重组蛋白,并制备良好的兔源多克隆抗体。为进一步开展牦牛survivin相关研究及牦牛机体其他因子抗体的制备奠定试验基础。材料与方法1.试验材料:健康牦牛（新生组,2-5日龄,n=5;半岁组,5-7月龄,n=5;成年组,3-4岁,n=5）组织器官（心脏,肝脏,肺脏,大脑,肾脏,睾丸,脾脏,淋巴结及胸腺）,成年大耳白兔,n=4。2.试验方法:（1）采用RT-PCR方法克隆牦牛survivin编码区基因,利用生物信息学软件及官方网站对目的基因进行生物信息学分析。（2）采用qRT-PCR、Western blot和免疫组织化学（IHC）方法对survivin在新生和成年组牦牛不同组织器官（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑和睾丸）中的基因、蛋白水平和阳性定位情况进行分析。并用SPSS21.0软件的单因素方差分析法对survivin基因和蛋白的表达量进行差异性分析。（3）采用qRT-PCR、Western blot和免疫组织化学方法对survivin和caspase-3在新生、半岁及成年组牦牛免疫器官（脾脏、胸腺和淋巴结）中的基因、蛋白水平及定位情况进行分析。并用SPSS21.0软件的单因素方差分析法对survivin和caspase-3基因及蛋白的表达量进行差异性分析。（4）采用大肠杆菌表达系统对克隆的重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot方法鉴定重组蛋白。将纯化重组蛋白免疫健康成年大耳白兔制备多克隆抗体,用Western blot、间接ELISA技术及免疫组织化学技术鉴定多克隆抗体。结果 1.成功克隆了牦牛survivin编码区基因（GenBank:KX121425.1）,survivin基因编码的蛋白质含有103个氨基酸,分子量为11.8374 kDa,理论等电点为5.325pI,存在12个磷酸化位点;且为可溶性,非跨膜蛋白;根据克隆基因序列预测出了survivin的二级和三级结构。以上结论说明,survivin在进化中既具有高度保守性,也存在种属特异性。2.Survivin在新生及成年组牦牛各组织器官中均有表达,在相同器官中,survivin的表达水平成年组高于新生组。在相同年龄组中,survivin在牦牛心脏和肝脏中始终处于相对高水平表达。免疫组织化学结果显示,survivin阳性表达主要集中在细胞质中。新生组survivin主要定位在心脏的心肌细胞,肝脏的肝细胞,脾脏的红髓,肺脏的各级支气管,肾脏的近端小管和远端小管（近端小管的阳性表达强于远端小管）,大脑的神经纤维及睾丸的肌样细胞。与新生组相比,成年组的survivin阳性定位具有一定的差异性:成年组肺部survivin除了在各级支气管有表达,还在肺泡上皮细胞有表达;成年组survivin主要定位在各级生精细胞及睾丸间质细胞中。3.在新生、半岁及成年组牦牛免疫器官中的表达结果显示,相同年龄组,survivin在脾脏中的表达最高,胸腺次之,淋巴结最低,其中survivin基因在脾脏的表达水平和survivin蛋白在淋巴结表达水平分别呈极显着差异（P<0.01）;相同器官,survivin的表达水平随年龄增长呈下调趋势,且差异极显着（P<0.01）。而caspase-3的表达水平与survivin大致呈相反趋势。此外,牦牛三个年龄组免疫器官中survivin和caspase-3的阳性定位一致,主要分布在淋巴结的髓质,胸腺的胸腺小体及脾脏的红髓和边缘区。4.成功构建原核表达重组质粒,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定,目的蛋白约为16.5 kDa,且以包涵体形式存在;纯化蛋白经Western blot分析鉴定,能与阳性血清特异性结合,说明具有较好的反应原性;重组表达蛋白免疫大耳白兔后分离的血清经Western blot分析能与重组蛋白特异性结合,说明重组蛋白能够诱导机体产生相应抗体,具有较好的免疫原性。间接ELISA数据表明制备的多克隆抗体具有良好的抗体效价。制备的多克隆抗体能够用于免疫组织化学试验。结论1.本文通过分析牦牛survivin编码区核苷酸序列生物信息学特性,说明牦牛survivin基因在生物进化过程中的高度保守性及种属特异性。2.本文通过检测survivin在新生和成年牦牛不同器官的表达和定位情况,说明survivin可能参与牦牛各组织器的功能调节。为进一步研究survivin对牦牛不同组织器官生理功能的调控机理提供重要的理论依据。3.本文通过检测survivin和caspase-3在不同年龄牦牛免疫器官的表达和定位情况,说明survivin可能在caspase-3参与的凋亡通路上参与免疫器官适应性以减缓牦牛免疫器官的衰老进度。为进一步研究survivin对牦牛机体免疫功能的调控机理提供重要的理论依据。4.本文通过构建牦牛survivin重组质粒,诱导表达重组蛋白,制备的兔源多克隆抗体能够用于免疫组织化学、Western blot及间接ELISA试验。为牦牛机体其他因子抗体的制备奠定试验基础,也为以后开展牦牛survivin相关研究提供理论基础。
二、诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白质的原核表达载体构建研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白质的原核表达载体构建研究（论文提纲范文）
（1）大鼠CDON与IZUMO1和JUNO的相互作用及对受精的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 CDON的研究进展 |
| 1 Hedgehog信号家族概述 |
| 1.1 HH信号通路的命名及分类 |
| 1.2 HH信号通路的主要成员 |
| 1.3 HH信号蛋白的结构和释放 |
| 1.4 HH信号传导依赖于初级纤毛 |
| 1.5 HH信号通路在癌症中的作用 |
| 1.6 HH信号通路在肝纤维化中的作用 |
| 1.7 HH信号通路在生殖细胞中的作用 |
| 2 CDON的基本特性 |
| 2.1 CDON的发现及结构 |
| 2.2 CDON的表达、激活和转换 |
| 3 CDON的生物学功能 |
| 3.1 CDON与骨骼发育 |
| 3.2 CDON与心脏病的治疗 |
| 3.3 CDON与神经发育 |
| 3.4 CDON与胎儿发育 |
| 第二章 大鼠CDON与 IZUMO1和JUNO相互作用的鉴定及对受精的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验载体及引物 |
| 2.1.4 实验细胞、菌株及动物 |
| 2.1.5 常用溶液配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠卵巢组织总RNA的提取 |
| 2.2.2 大鼠卵巢cDNA的合成 |
| 2.2.3 大鼠卵巢cDNA的检测 |
| 2.2.4 大鼠cdon CDS区全长的克隆 |
| 2.2.4.1 设计与合成克隆引物 |
| 2.2.4.2 cdon CDS全长克隆 |
| 2.2.4.3 构建cdon过渡载体并测序 |
| 2.2.5 pET-cdon的原核表达及抗体制备 |
| 2.2.5.1 pET-cdon原核表达载体的引物设计 |
| 2.2.5.2 pET-cdon原核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.2.5.3 pET-cdon的原核表达 |
| 2.2.5.4 HIS-CDON融合蛋白的鉴定 |
| 2.2.5.5 HIS-CDON融合蛋白的纯化 |
| 2.2.5.6 BCA法测定HIS-CDON融合蛋白的浓度 |
| 2.2.5.7 制备鼠源Anti-HIS-CDON融合蛋白的腹水多克隆抗体及检测 |
| 2.2.6 CDON在大鼠卵巢、卵细胞和精子上的免疫荧光定位实验 |
| 2.2.6.1 CDON在大鼠卵巢上的定位 |
| 2.2.6.2 CDON在 MII期卵母细胞上的定位 |
| 2.2.6.3 CDON在精子上的定位 |
| 2.2.7 抗体抑制精卵融合 |
| 2.2.8 酵母双杂交实验 |
| 2.2.8.1 pGAD-cdon酵母表达载体的引物设计 |
| 2.2.8.2 构建pGAD-cdon酵母表达载体 |
| 2.2.8.3 pGAD-cdon酵母表达载体转化酵母感受态 |
| 2.2.8.4 酵母双杂交 |
| 2.2.9 免疫共沉淀实验 |
| 2.2.9.1 pCMV-Flag-cdon真核表达载体的引物设计 |
| 2.2.9.2 构建pCMV-Flag-cdon真核表达载体 |
| 2.2.9.3 HEK293T cell的培养 |
| 2.2.9.4 转染HEK293T cell |
| 2.2.9.5 细胞蛋白的提取并检测 |
| 2.2.9.6 Co-IP |
| 3 结果 |
| 3.1 大鼠cdon CDS区全长的克隆 |
| 3.1.1 大鼠卵巢cDNA的检测 |
| 3.1.2 大鼠cdon cDNA的克隆 |
| 3.1.3 大鼠Blunt-cdon过渡载体PCR鉴定 |
| 3.2 大鼠pET-cdon原核表达及抗体制备 |
| 3.2.1 大鼠pET-cdon原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 大鼠HIS-CDON蛋白的原核表达 |
| 3.2.3 大鼠HIS-CDON蛋白的纯化及鉴定 |
| 3.2.4 绘制蛋白标准曲线和测定HIS-CDON蛋白浓度 |
| 3.2.5 鼠源HIS-CDON腹水多克隆抗体的检测 |
| 3.3 CDON在大鼠卵巢上的定位 |
| 3.4 CDON在大鼠MII期卵母细胞上的定位 |
| 3.5 CDON在大鼠精子上的定位 |
| 3.6 CDON抗体处理大鼠精卵后的受精率统计 |
| 3.7 酵母双杂交 |
| 3.7.1 pGAD-cdon酵母表达载体的构建 |
| 3.7.2 酵母菌落PCR鉴定 |
| 3.7.3 酵母双杂交 |
| 3.7.4 杂交后酵母在缺陷型培养基上的生长情况 |
| 3.8 免疫共沉淀 |
| 3.8.1 pCMV-Flag-cdon真核表达载体的构建 |
| 3.8.2 转染后细胞总蛋白的鉴定 |
| 3.8.3 Western blot检测免疫沉淀的蛋白 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CDON在生殖细胞的定位 |
| 4.2 CDON的蛋白结构分析 |
| 4.3 CDON对受精影响的分析 |
| 5 小结和创新点 |
| 5.1 小结 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间参与的科研项目和发表的论文 |
（2）猫干扰素ω和干扰素γ的可溶性原核表达、纯化及安全性初步评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 干扰素的产生 |
| 1.2 干扰素的分类 |
| 1.3 干扰素的分子结构 |
| 1.3.1 Ⅰ型干扰素的分子结构 |
| 1.3.2 Ⅱ型干扰素的分子结构 |
| 1.4 干扰素的受体及分布 |
| 1.4.1 干扰素受体 |
| 1.4.2 干扰素受体的分布 |
| 1.5 干扰素的生物学功能及其作用机制 |
| 1.5.1 干扰素抗病毒作用及机制 |
| 1.5.2 干扰素抗肿瘤作用及机制 |
| 1.5.3 干扰素免疫调节作用及机制 |
| 1.5.4 控制细胞凋亡及机制 |
| 1.6 IFN-ω和 IFN-γ的研究进展 |
| 1.7 基因工程干扰素的安全性评价 |
| 1.8 研究的目的与意义 |
| 第二章 猫干扰素ω的可溶性表达及纯化制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 FeIFN-ω蛋白的生物信息学分析 |
| 2.2.2 重组质粒PET-28a-SUMO-FeIFN-ω的构建 |
| 2.2.3 重组质粒pET28a-SUMO-FeIFN-ω的诱导表达及条件优化 |
| 2.2.4 SUMO-FeIFN-ω融合蛋白的可溶性分析 |
| 2.2.5 猫干扰素ω的纯化制备 |
| 2.2.6 FeIFN-ω蛋白浓度的测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 FeIFN-ω蛋白的生物信息学分析 |
| 2.3.1.1 FeIFN-ω蛋白理化性质预测分析 |
| 2.3.1.2 FeIFN-ω蛋白亲水性预测分析 |
| 2.3.1.3 FeIFN-ω蛋白信号肽预测分析 |
| 2.3.1.4 FeIFN-ω氨基酸序列分析 |
| 2.3.2 重组质粒pET-28a-SUMO-FeIFN-ω的构建 |
| 2.3.2.1 猫肝脏总RNA的提取 |
| 2.3.2.2 目的基因的PCR扩增 |
| 2.3.2.3 克隆质粒p MD19-T-FeIFN-ω的 PCR和双酶切鉴定 |
| 2.3.2.4 表达质粒pET28a-SUMO-FeIFN-ω的 PCR和双酶切鉴定 |
| 2.3.3 重组质粒pET28a-SUMO-FeIFN-ω的诱导表达及条件优化 |
| 2.3.3.1 重组质粒pET28a-SUMO-FeIFN-ω在感受态细胞BL21(DE3)中的诱导表达 |
| 2.3.3.2 SUMO-FeIFN-ω融合蛋白诱导表达IPTG浓度的优化 |
| 2.3.3.3 SUMO-FeIFN-ω融合蛋白诱导表达温度的优化 |
| 2.3.3.4 SUMO-FeIFN-ω融合蛋白诱导表达时间的优化 |
| 2.3.4 SUMO-FeIFN-ω融合蛋白的可溶性分析 |
| 2.3.5 猫干扰素ω的纯化制备 |
| 2.3.5.1 SUMO-FeIFN-ω融合蛋白的纯化 |
| 2.3.5.2 SUMO-FeIFN-ω融合蛋白的酶切与纯化 |
| 2.3.6 FeIFN-ω蛋白浓度的测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 猫干扰素γ的可溶性表达及纯化制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 FeIFN-γ蛋白的生物信息学分析 |
| 3.2.2 重组质粒PET-28a-SUMO-FeIFN-γ的构建 |
| 3.2.3 重组质粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ的诱导表达及条件优化 |
| 3.2.4 SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的可溶性分析 |
| 3.2.5 猫干扰素γ的纯化制备 |
| 3.2.6 FeIFN-γ蛋白浓度的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 FeIFN-γ蛋白的生物信息学分析 |
| 3.3.1.1 FeIFN-γ蛋白理化性质预测分析 |
| 3.3.1.2 FeIFN-γ蛋白亲水性预测分析 |
| 3.3.1.3 FeIFN-γ蛋白信号肽预测分析 |
| 3.3.1.4 FeIFN-γ氨基酸序列分析 |
| 3.3.2 重组质粒PET-28a-SUMO-FeIFN-γ的构建 |
| 3.3.2.1 目的基因的PCR扩增 |
| 3.3.2.2 克隆质粒p MD19-T-FeIFN-γ的 PCR和双酶切鉴定 |
| 3.3.2.3 表达质粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ的 PCR和双酶切鉴定 |
| 3.3.3 重组质粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ的诱导表达及条件优化 |
| 3.3.3.1 重组质粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ在感受态细胞Rosseta(DE3)中的诱导表达 |
| 3.3.3.2 SUMO-FeIFN-γ融合蛋白诱导表达IPTG浓度的优化 |
| 3.3.3.3 SUMO-FeIFN-γ融合蛋白诱导表达温度的优化 |
| 3.3.3.4 SUMO-FeIFN-γ融合蛋白诱导表达时间的优化 |
| 3.3.4 SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的可溶性分析 |
| 3.3.5 猫干扰素γ的纯化制备 |
| 3.3.5.1 SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的纯化 |
| 3.3.5.2 SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的酶切和纯化 |
| 3.3.6 FeIFN-γ蛋白浓度的测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 FeIFN-ω和 FeIFN-γ的安全性评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂的配置 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 小鼠的分组与给药 |
| 4.2.2 临床观察 |
| 4.2.3 血液生化指标分析 |
| 4.2.4 组织病理学检测 |
| 4.2.5 数据统计学处理 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 临床表现 |
| 4.3.2 血液生化指标分析 |
| 4.3.3 组织病理检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（3）罗非鱼NCC亚群的构成解析及其活性调控因子半乳糖凝集素（Galectins）的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 鱼类的免疫系统 |
| 1.1.1 免疫器官 |
| 1.1.2 免疫细胞 |
| 1.1.3 免疫分子 |
| 1.2 NCC的研究现状 |
| 1.3 Galectin家族研究进展 |
| 1.3.1 Galectin家族的分类 |
| 1.3.2 Galectin家族基因的结构 |
| 1.3.3 Galectin基因的免疫调节功能 |
| 1.3.3.1 Galectin与 T细胞 |
| 1.3.3.2 Galectin与炎症反应 |
| 1.3.3.3 Galectin与 NK细胞 |
| 1.3.4 硬骨鱼Galectin的研究概述 |
| 1.4 单细胞转录组测序研究进展 |
| 1.4.1 scRNA-Seq的实验原理 |
| 1.4.2 scRNA-Seq的局限 |
| 1.4.3 scRNA-Seq的应用 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 罗非鱼淋巴细胞的单细胞转录组分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验用鱼 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 罗非鱼及细胞处理 |
| 2.2.2 单细胞RNA测序 |
| 2.2.3 RNA-seq数据处理 |
| 2.2.4 质量控制和数据量化 |
| 2.2.5 细胞聚类 |
| 2.2.6 差异表达基因(DEG)分析 |
| 2.2.7 NCC亚群的WGCNA分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 测序数据质控和表达定量 |
| 2.3.2 单细胞亚群分类 |
| 2.3.3 基于标记分子细胞类群的鉴定 |
| 2.3.4 NCC的 DEGs分析 |
| 2.3.5 WGCNA分析结果 |
| 2.3.6 细胞亚聚类和NCC亚群鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 头肾白细胞中鉴定出四种免疫细胞群 |
| 2.4.2 WGCNA分析揭示NCC的基因调控网络 |
| 2.4.3 四个NCC亚群的确定 |
| 3 与NCCRP-1 互作的Gals蛋白鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验用鱼 |
| 3.1.2 实验用细胞 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.1.5 实验引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 罗非鱼Galectin基因的克隆与分析 |
| 3.2.1.1 Gals基因的ORF克隆 |
| 3.2.1.2 Gals的序列分析 |
| 3.2.2 酵母双杂交验证与NCCRP-1 的互作蛋白 |
| 3.2.2.1 载体构建 |
| 3.2.2.2 准备酵母感受态细胞(LiAc Method) |
| 3.2.2.3 pGBKT7和pGADT7 共转化酵母菌株AH109 |
| 3.2.2.4 x-gal检测实验 |
| 3.2.3 GST Pull-down验证与NCC互作蛋白 |
| 3.2.3.1 原核表达载体的构建及诱饵蛋白准备 |
| 3.2.3.2 诱饵蛋白固定化 |
| 3.2.3.3 目的蛋白(NCC裂解液蛋白)的准备 |
| 3.2.3.4 目的蛋白质捕获 |
| 3.2.3.5 诱饵-目的蛋白洗脱 |
| 3.2.3.6 目的蛋白的收集 |
| 3.2.3.7 MS质谱鉴定及分析 |
| 3.2.4 亚细胞定位分析显示MMP与 OnGal-2/OnGal-8 在细胞内定位 |
| 3.2.4.1 MMP的克隆及真核表达载体的构建 |
| 3.2.4.2 OnGal-2/OnGal-8 绿色荧光真核表达载体构建 |
| 3.2.4.3 细胞复苏及传代。 |
| 3.2.4.4 细胞共转染 |
| 3.2.4.5 细胞爬片、固定及DAPI染色 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 NCC中 Gals的表达情况 |
| 3.3.2 OnGals基因克隆与分析 |
| 3.3.2.1 OnGals的基因克隆 |
| 3.3.2.2 OnGals基因结构分析 |
| 3.3.2.3 OnGals多序列比对 |
| 3.3.2.4 OnGals进化树分析 |
| 3.3.3 OnGals与 NCCRP-1 互作结果 |
| 3.3.4 OnGals与 NCC蛋白互作结果 |
| 3.3.4.1 OnGals蛋白表达 |
| 3.3.4.2 Pull-down及质谱分析结果 |
| 3.3.5 亚细胞共定位结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 依赖于NCCRP-1 受体的OnGal-2 的免疫调节功能及对NCC活性调控的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验用鱼 |
| 4.1.2 实验用细菌 |
| 4.1.3 实验用细胞 |
| 4.1.4 实验试剂 |
| 4.1.5 实验仪器 |
| 4.1.6 实验引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 OnGal-2 的表达模式分析 |
| 4.2.1.1 实验用鱼的处理及样品收集 |
| 4.2.1.2 qRT-PCR检测基因表达 |
| 4.2.2 OnGal-2 体外过表达研究 |
| 4.2.2.1 过表达载体的构建 |
| 4.2.2.2 细胞转染 |
| 4.2.2.3 双荧光素酶报告系统分析 |
| 4.2.3 OnGal-2 体外蛋白功能研究 |
| 4.2.3.1 His标签原核表达载体构建 |
| 4.2.3.2 细菌凝集试验 |
| 4.2.3.3 细菌结合实验 |
| 4.2.3.4 多糖结合实验 |
| 4.2.3.5 单核/巨噬细胞吞噬实验 |
| 4.2.3.6 OnGal-2对NCC效应基因表达研究 |
| 4.2.3.7 OnGal-2对NCC杀伤活性研究 |
| 4.2.4 OnGal-2 体内蛋白功能研究 |
| 4.2.4.1 罗非鱼注射及样品采集 |
| 4.2.4.2 NCC效应基因表达情况 |
| 4.2.4.3 血清酶活测定 |
| 4.2.4.4 组织载菌量测定 |
| 4.2.4.5 组织切片 |
| 4.2.4.6 罗非鱼存活率 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 OnGal-2 的表达模式 |
| 4.3.1.1 OnGal-2 的组织分布 |
| 4.3.1.2 OnGal-2 的时序表达结果 |
| 4.3.2 双荧光素表达结果 |
| 4.3.3 OnGal-2 蛋白体外功能研究 |
| 4.3.3.1 rOnGal-2 蛋白表达 |
| 4.3.3.2 rOnGal-2 对细菌的凝集作用 |
| 4.3.3.3 rOnGal-2 对细菌的结合作用 |
| 4.3.3.4 rOnGal-2 与多糖对细菌的竞争结合作用 |
| 4.3.3.5 rOnGal-2 对单核/巨噬细胞的吞噬促进作用 |
| 4.3.3.6 rOnGal-2对NCC效应基因表达分析 |
| 4.3.3.7 rOnGal-2对NCC杀伤活性分析 |
| 4.3.4 OnGal-2 蛋白体内功能研究 |
| 4.3.4.1 rOnGal-2 对罗非鱼血清酶活的作用 |
| 4.3.4.2 rOnGal-2 对罗非鱼组织载菌量的作用 |
| 4.3.4.3 rOnGal-2 对罗非鱼组织损伤的作用 |
| 4.3.4.4 rOnGal-2对NCC效应基因表达的作用 |
| 4.3.4.5 rOnGal-2 对罗非鱼存活率的作用 |
| 4.4 讨论 |
| 5 不依赖于NCCRP-1 受体的OnGal-8 的免疫调节功能及对NCC活性调控的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验用鱼 |
| 5.1.2 实验用细菌 |
| 5.1.3 实验用细胞 |
| 5.1.4 实验试剂 |
| 5.1.5 实验仪器 |
| 5.1.6 实验引物 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 OnGal-8 的表达模式 |
| 5.2.1.1 实验用鱼处理及组织取样 |
| 5.2.1.2 罗非鱼单核/巨噬细胞的处理及样品收集 |
| 5.2.1.3 qRT-PCR检测基因表达模式 |
| 5.2.2 OnGal-8 体外蛋白功能研究 |
| 5.2.2.1 rOnGal-8 的血凝作用研究 |
| 5.2.2.2 rOnGal-8 对细菌凝集作用研究 |
| 5.2.2.3 rOnGal-8 对细菌结合作用研究 |
| 5.2.2.4 rOnGal-8 对多糖的结合研究 |
| 5.2.2.5 rOnGal-8 对细菌生长抑制作用研究 |
| 5.2.2.6 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞炎症因子作用研究 |
| 5.2.2.7 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞吞噬作用研究 |
| 5.2.2.8 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞呼吸爆发作用研究 |
| 5.2.2.9 rOnGal-8对NCC杀伤活性研究 |
| 5.2.3 OnGal-8 体外过表达研究 |
| 5.2.4 OnGal-8 体内过表达研究 |
| 5.2.4.1 罗非鱼注射及检测 |
| 5.2.4.2 血清酶活检测 |
| 5.2.4.3 组织载菌量检测 |
| 5.2.4.4 组织切片检测 |
| 5.2.4.5 NCC效应基因表达检测 |
| 5.2.4.6 罗非鱼存活率检测 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 OnGal-8 的表达模式分析 |
| 5.3.1.1 OnGal-8 的组织表达分析 |
| 5.3.1.2 OnGal-8 的时序表达分析 |
| 5.3.2 OnGal-8 体外蛋白功能分析 |
| 5.3.2.1 rOnGal-8 对血细胞及细菌的凝集作用 |
| 5.3.2.2 rOnGal-8 对细菌的结合作用 |
| 5.3.2.3 rOnGal-8 对多糖的竞争结合作用 |
| 5.3.2.4 rOnGal-8 对细菌生长的抑制作用 |
| 5.3.2.5 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞炎症因子表达的作用 |
| 5.3.2.6 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞的促吞噬作用 |
| 5.3.2.7 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞呼吸爆发作用 |
| 5.3.2.8 rOnGal-8对NCC杀伤活性分析 |
| 5.3.3 OnGal-8 体外过表达分析 |
| 5.3.4 OnGal-8 体内过表达分析 |
| 5.3.4.1 OnGal-8 对罗非鱼血清酶活的作用 |
| 5.3.4.2 OnGal-8 对罗非鱼组织载菌量的作用 |
| 5.3.4.3 OnGal-8 对罗非鱼组织损伤的作用 |
| 5.3.4.4 OnGal-8对NCC效应基因表达的作用 |
| 5.3.4.5 OnGal-8 对罗非鱼存活率的作用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 OnGal-8 的基因表达分析 |
| 5.4.2 OnGal-8 体外蛋白功能分析 |
| 5.4.3 OnGal-8 体外过表达分析 |
| 5.4.4 OnGal-8 体内过表达分析 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（4）猪GRP多克隆抗体的制备与应用及其对Leydig cells睾酮分泌的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 文献综述: 胃泌素释放肽及其受体与睾丸间质细胞研究进展 |
| 1 胃泌素释放肽及其受体研究进展 |
| 1.1 胃泌素释放肽及其受体的发现 |
| 1.2 胃泌素释放肽及其受体在体内的表达 |
| 1.3 胃泌素释放肽及其受体在体内的功能研究 |
| 1.4 GRP多克隆抗体的制备 |
| 2 睾丸间质细胞研究进展 |
| 2.1 睾丸间质细胞 |
| 2.2 生殖相关激素睾酮 |
| 2.3 睾丸间质细胞的增殖与凋亡 |
| 3 研究目的及意义 |
| 第1章 猪胃泌素释放肽的原核表达及其多克隆抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.2 重组载体的构建 |
| 1.3 融合蛋白pGRP的获得 |
| 1.4 多克隆抗体的制备 |
| 2 结果 |
| 2.1 pET32a(+)-pGRP重组载体的构建 |
| 2.2 His-tag-pGRP融合蛋白的获得 |
| 2.3. pGRP多克隆抗体的获得 |
| 3 讨论 |
| 第2章 GRP蛋白在猪体内的分布与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1仪器和试剂 |
| 1.2 GRP在猪外周组织的分布情况 |
| 1.3 GRP蛋白在猪组织中的表达情况 |
| 2 结果 |
| 2.1 GRP在猪外周组织的分布情况 |
| 2.2 GRP蛋白在猪组织中的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 第3章 GRP对猪睾丸间质细胞睾酮分泌和合成的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.2 细胞培养和处理 |
| 1.3 GRP对Leydig cells中GRPR表达的影响 |
| 1.4 GRP对猪Leydig cells睾酮分泌的影响 |
| 1.5 GRP对Leydig cells睾酮合成相关蛋白表达的影响 |
| 1.6 GRP对Leydig cells细胞增殖的影响 |
| 1.7 GRP对Leydig cells凋亡的影响 |
| 1.8 GRP对Leydig cells增殖和凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 1.9 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 GRPR在Leydig cells中的表达情况 |
| 2.2 GRP对猪Leydig cells睾酮分泌及睾酮合成相关蛋白的影响 |
| 2.3 GRP对猪Leydig cells细胞活性的影响 |
| 2.4 GRP对猪Leydig cells细胞凋亡的影响 |
| 2.5 GRP对猪Leydig cells中pPKA/PKA和pPKC/PKC蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）BLM-EZH2相互作用影响前列腺癌细胞增殖的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 文献综述 |
| 1 前列腺癌 |
| 1.1 PCa发病现状 |
| 1.2 PCa形成因素 |
| 1.3 PCa发生发展分子机制 |
| 1.4 PSA与PCa的关系 |
| 2 肿瘤分子标志物与PCa |
| 2.1 肿瘤分子标志物与癌症 |
| 2.2 PCa的肿瘤分子标志物 |
| 2.3 肿瘤标志物在PCa药物靶向治疗中的应用 |
| 3 BLM解旋酶 |
| 3.1 BLM解旋酶的结构与功能 |
| 3.2 BLM解旋酶的细胞生物学功能 |
| 3.3 BLM解旋酶与肿瘤 |
| 4 EZH2 蛋白 |
| 4.1 EZH2蛋白的结构与分子功能 |
| 4.2 EZH2蛋白与肿瘤 |
| 5 BLM、EZH2与PCa |
| 5.1 BLM、EZH2在PCa的靶向研究 |
| 5.2 BLM和EZH2与PCa的相关性分析 |
| 6.本研究的目的意义 |
| 7.研究内容与技术路线 |
| 7.1 研究内容 |
| 7.2 技术路线 |
| 第一章 BLM相互作用蛋白筛选和MS鉴定及BLM/EZH2 的定位 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要实验仪器 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 细胞系 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 蛋白提取 |
| 2.3 蛋白含量测定(BCA微孔酶标仪法) |
| 2.4 免疫共沉淀(免疫磁珠法) |
| 2.5 SDS-PAGE电泳 |
| 2.6 Western Blotting检测 |
| 2.7 生物信息学分析 |
| 2.8 原核表达载体构建和蛋白诱导表达 |
| 2.9 原核蛋白提取 |
| 2.10 GST-pull down |
| 2.11 间接免疫荧光 |
| 2.12 高效液相色谱质谱分析 |
| 2.13 数据统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 BLM蛋白在RWPE-1、PC3、22RV-1、LNcap细胞中的表达 |
| 3.2 免疫沉淀联合质谱分析,筛选与BLM具有互作的蛋白 |
| 3.3 生物信息学分析筛选互作蛋白 |
| 3.4 Co-IP正反向验证BLM与EZH2存在相互作用 |
| 3.5 BLM蛋白与EZH2蛋白体外相互作用验证 |
| 3.6 前列腺癌细胞中BLM与EZH2的亚细胞定位 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 BLM及EZH2蛋白在前列腺癌组织中的表达水平及其关联 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验标本 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 免疫组化实验 |
| 2.2 生物信息学分析 |
| 2.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 BLM和EZH2在癌组织和对照组织中的差异性比较 |
| 3.2 BLM和EZH2在癌组织和对照组织中的表达分布 |
| 3.3 BLM和EZH2在前列腺组织中的表达与临床病理资料相关性分析 |
| 3.4 生物信息学分析前列腺癌组织和正常组织中蛋白表达情况 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 BLM和EZH2干扰对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 细胞系 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞蛋白提取和浓度测定 |
| 2.3 蛋白的WB检测 |
| 2.4 siRNA干扰序列的合成 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 细胞存活率检测 |
| 2.7 细胞周期检测 |
| 2.8 细胞侵袭和迁移实验 |
| 2.9 细胞划痕实验 |
| 2.10 细胞克隆形成实验 |
| 2.11 细胞增殖实验(MTS法) |
| 2.12 数据统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 前列腺癌细胞系的侵袭、迁移和增殖能力检测 |
| 3.2 BLM特异性抑制剂对PC3细胞活性及细胞周期的影响 |
| 3.3 BLM、EZH2和P53蛋白干扰前后在癌细胞中的表达情况 |
| 3.4 干扰BLM和EZH2后对PC3细胞增殖、迁移、侵袭、划痕愈合和克隆形成的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 BLM和EZH2干扰或表达对前列腺癌细胞的影响及其机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 细胞系及载体 |
| 1.4 实验试剂及配制方法 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞蛋白提取和浓度测定 |
| 2.3 蛋白的WB检测 |
| 2.4 重组质粒的构建 |
| 2.5 ChIP-seq实验 |
| 2.6 双荧光素酶活性的检测 |
| 2.7 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 2.8 数据统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 ChIP-seq实验检测EZH2可能作用的启动子区 |
| 3.2 利用双荧光素酶实验验证EZH2蛋白与MDM2启动子区的结合 |
| 3.3 干扰或过表达BLM和EZH2对PC3细胞P53和MDM2蛋白的影响 |
| 3.4 干扰或过表达BLM和EZH2对PC3细胞增殖、迁移、侵袭、划痕愈合、克隆形成的影响 |
| 3.5 BLM和EZH2相互作用对PC3细胞P53信号通路的影响 |
| 3.6 裸鼠成瘤实验检测BLM和EZH2对PC3细胞成瘤能力的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论、创新点及展望 |
| 1.结论 |
| 2.创新点 |
| 3.展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ:在读博士期间取得的科研成果 |
| 附录Ⅱ:论文涉及的试剂配方 |
（6）克氏原螯虾Yippee-2和Yippee-5基因的鉴定及其功能的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究目的与意义 |
| 1.2 研究内容 |
| 1.2.1 Yippee-2和Yippee-5 基因序列的克隆及分析 |
| 1.2.2 Yippee-2和Yippee-5 的原核表达及蛋白纯化 |
| 1.2.3 Yippee-2和Yippee-5 蛋白的相互作用 |
| 1.2.4 Yippee-2和Yippee-5组织表达分布 |
| 1.2.5 免疫刺激对Yippee-2和Yippee-5 基因表达的影响 |
| 1.2.6 RNA干扰对细胞凋亡及免疫相关基因表达的影响 |
| 1.3 技术路线 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要生化试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Yippee-2和Yippee-5 基因的克隆 |
| 2.3.2 Yippee-2和Yippee-5 基因原核表达 |
| 2.3.3 重组蛋白的检测及纯化 |
| 2.3.4 组织表达特征分析 |
| 2.3.5 Yippee-2和Yippee-5 蛋白的互作 |
| 2.3.6 免疫刺激对Yippee-2和Yippee-5基因表达模式的影响 |
| 2.3.7 RNA干扰对细胞凋亡及免疫相关基因表达的影响 |
| 2.3.8 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 克氏原螯虾Yippee-2和Yippee-5 基因生物信息学分析 |
| 3.2 克氏原螯虾Yippee-2和Yippee-5 基因的扩增 |
| 3.3 原核表达载体的构建 |
| 3.4 蛋白表达及纯化 |
| 3.4.1 蛋白表达 |
| 3.4.2 蛋白纯化 |
| 3.4.3 Western Blot分析 |
| 3.5 Yippee-2和Yippee-5 蛋白的相互作用 |
| 3.6 Yippee-2和Yippee-5基因的组织分布研究 |
| 3.7 免疫刺激对Yippee-2和Yippee-5 基因表达的影响 |
| 3.8 RNA干扰对细胞凋亡及免疫相关基因表达水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（7）宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 动物病毒与宿主细胞蛋白互作研究进展 |
| 1.1 宿主细胞蛋白在动物病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.1.1 NPM蛋白家族 |
| 1.1.2 Hsp家族成员 |
| 1.1.3 组蛋白分子伴侣 |
| 1.1.4 MCM家族成员 |
| 1.1.5 STAT家族成员 |
| 1.1.6 TRIM家族成员 |
| 1.1.7 波形蛋白 |
| 1.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作研究进展 |
| 1.2.1 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒吸附和入胞过程中作用与机制 |
| 1.2.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒入核和复制过程中作用与机制 |
| 1.2.3 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒出核及出胞过程中作用与机制 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白筛选与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 2.1.2 载体及主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白的筛选 |
| 2.2.2 stat5克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 npm1克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.5 不同种属来源的STAT5、NPM1及DNAJB6 序列比对 |
| 2.2.6 激光共聚焦检测STAT5、NPM1及DNAJB6 亚细胞定位 |
| 2.2.7 试验动物及分组设计 |
| 2.2.8 STAT5、NPM1、DNAJB6的m RNA水平检测 |
| 2.2.9 组织STAT5、NPM1、DNAJB6 表达情况检测 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCV2 Cap宿主互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 2.3.2 stat5克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.3 npm1克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.5 STAT5序列比对分析 |
| 2.3.6 NPM1序列比对分析 |
| 2.3.7 DNAJB6序列比对分析 |
| 2.3.8 STAT5在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.9 NPM1在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.10 DNAJB6在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.11 STAT5在PCV2 感染猪组织中的表达量变化 |
| 2.3.12 NPM1在PCV2 感染猪组织中的表达变化 |
| 2.3.13 DNAJB6在PCV2 感染猪组织中的表达变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 宿主细胞蛋白STAT5在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒及菌种 |
| 3.1.2 载体、主要试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 stat5原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 免疫共沉淀检测Cap和 STAT5 的互作 |
| 3.2.3 GST-pull down检测Cap和 STAT5 的互作 |
| 3.2.4 干扰stat5 表达对PCV2 复制的影响 |
| 3.2.5 DNA pull-down检测STAT5与PCV2 DNA互作区域 |
| 3.2.6 PCV2 DNA结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定 |
| 3.2.7 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况 |
| 3.2.8 荧光定量PCR检测突变毒株的DNA拷贝数 |
| 3.2.9 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 STAT5原核表达载体的鉴定 |
| 3.3.2 免疫共沉淀检测Cap与 STAT5 互作 |
| 3.3.3 GST-pull down鉴定Cap和 STAT5 互作 |
| 3.3.4 干扰stat5 表达显着抑制 PCV2 的复制 |
| 3.3.5 PCV2突变毒株的构建与鉴定 |
| 3.3.6 DNA pull down验证PCV2 DNA与 STAT5 互作区域 |
| 3.3.7 突变毒株PCV2-MDS在细胞内的复制情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 宿主细胞蛋白NPM1在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 4.1.2 载体和主要试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 干扰npm1 表达对PCV2 复制影响 |
| 4.2.2 干扰npm1 表达对PCV2 Cap表达影响 |
| 4.2.3 利用CRISPR/Cas9 系统敲除PK-15中npm1 |
| 4.2.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建 |
| 4.2.5 Cap及截短体真核表达载体的构建 |
| 4.2.6 GST-pull down检测Cap及其截短体与NPM1 的互作 |
| 4.2.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株的构建与鉴定 |
| 4.2.8 荧光定量PCR检测PCV2 突变毒株的复制水平 |
| 4.2.9 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 干扰npm1对Cap表达和PCV2 DNA复制影响 |
| 4.3.2 npm1敲除的 PK-15 建立与鉴定 |
| 4.3.3 GST-pull down 检测 Cap、NPM1 以及 STAT5 之间的互作 |
| 4.3.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.5 Cap及截短体真核表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.6 GST-pull down确定NPM1与Cap互作区域 |
| 4.3.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定 |
| 4.3.8 PCV2 突变毒株PCV2-Nm A复制水平 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 宿主细胞蛋白DNAJB6在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 5.1.2 载体和主要试剂 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 荧光定量PCR检测PCV2 拷贝数 |
| 5.2.2 western blotting检测DNAJB6和Cap的表达 |
| 5.2.3 间接免疫荧光检测Cap及 DNAJB6 的定位情况 |
| 5.2.4 免疫共沉淀检测Cap与 DNAJB6 的互作 |
| 5.2.5 DNAJB6及截短体原核表达载体的构建 |
| 5.2.6 Cap截短体真核表达载体的构建 |
| 5.2.7 DNAJB6突变体真核表达载体的构建 |
| 5.2.8 DNAJB6及截短体原核表达及纯化鉴定 |
| 5.2.9 GST-pull down检测Cap及 DNAJB6 的互作 |
| 5.2.10 激光共聚焦检测PCV2及PCV2 Cap诱导的自噬小体 |
| 5.2.11 相对荧光定量PCR检测DNAJB6的m RNA水平 |
| 5.2.12 利用si RNA干扰atg5 的表达 |
| 5.2.13 抑制试验 |
| 5.2.14 数据分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PCV2 感染上调PK-15中DNAJB6 的表达 |
| 5.3.2 DNAJB6与PCV2 Cap共定位 |
| 5.3.3 DNAJB6与PCV2 Cap的互作 |
| 5.3.4 DNAJB6全长及截短体原核表达载体的构建与鉴定 |
| 5.3.5 Cap截短体真核表达载体的构建与鉴定 |
| 5.3.6 鉴定DNAJB6与Cap的互作区域 |
| 5.3.7 dnajb6敲除的 PK-15 细胞鉴定 |
| 5.3.8 dnajb6敲除抑制自噬小体的形成和病毒复制 |
| 5.3.9 DNAJB6过表达促进自噬体的形成和病毒复制 |
| 5.3.10 DNAJB6与Cap的互作促进自噬体的形成 |
| 5.3.11 DNAJB6与Cap的互作通过增强自噬促进PCV2 复制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）日本七鳃鳗L-STAT3基因的克隆及功能初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 七鳃鳗及其适应性免疫系统简介 |
| 1.2 STAT3分子的结构特点 |
| 1.3 STAT3与疾病 |
| 1.3.1 STAT3与炎症 |
| 1.3.2 STAT3与癌症 |
| 1.4 本论文研究的目的及意义 |
| 2 希瓦氏菌(Shewanella sp.)诱导日本七鳃鳗白细胞差异表达蛋白质组的鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 动物材料 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 希瓦氏菌免疫七鳃鳗 |
| 2.2.2 七鳃鳗白细胞的分离 |
| 2.2.3 七鳃鳗白细胞总蛋白的提取 |
| 2.2.4 七鳃鳗外周血白细胞总蛋白的浓度测定 |
| 2.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.2.6 考马斯亮蓝染色 |
| 2.2.7 序列数据库检索和数据分析 |
| 2.2.8 七鳃鳗总RNA的提取 |
| 2.2.9 cDNA模板的制备 |
| 2.2.10 qPCR反应检测差异蛋白转录水平的表达 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 希瓦氏菌免疫七鳃鳗白细胞蛋白质组的变化 |
| 2.3.2 差异蛋白质的统计分析和功能分类 |
| 2.3.3 七鳃鳗白细胞的RNA提取 |
| 2.3.4 qPCR分析差异表达蛋白质在mRNA水平的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 3 七鳃鳗L-STAT3基因的全长克隆及生物信息学分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 动物材料 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.1.3 生物信息学分析软件网址 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物 |
| 3.2.2 七鳃鳗总RNA的提取 |
| 3.2.3 cDNA模板的制备 |
| 3.2.4 L-STAT3片段的全长扩增 |
| 3.2.5 L-STAT3片段的胶回收以及检测 |
| 3.2.6 L-STAT3片段与载体连接 |
| 3.2.7 转化 |
| 3.2.8 菌液检测 |
| 3.2.9 获得ORF区序列 |
| 3.2.10 生物信息学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 七鳃鳗总RNA提取 |
| 3.3.2 L-STAT3基因的克隆 |
| 3.3.3 七鳃鳗L-STAT3生物信息学分析 |
| 3.4 讨论 |
| 4 日本七鳃鳗L-STAT3的原核表达、蛋白纯化以及抗体验证 |
| 4.1 日本七鳃鳗L-STAT3原核表达及蛋白纯化 |
| 4.1.1 主要试剂与仪器 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 L-STAT3蛋白亲疏水性的分析 |
| 4.1.2.2 引物 |
| 4.1.2.3 PCR |
| 4.1.2.4 目的片段的回收 |
| 4.1.2.5 目的片段和原核表达载体的双酶切 |
| 4.1.2.6 目的片段与pColdI载体的连接与转化 |
| 4.1.2.7 原核表达的小量诱导 |
| 4.1.2.8 原核表达的大量诱导以及蛋白纯化 |
| 4.1.2.9 抗体制备 |
| 4.1.2.10 七鳃鳗总蛋白的提取 |
| 4.1.2.11 Western Bolt检测L-STAT3蛋白的表达 |
| 4.1.3 结果 |
| 4.1.3.1 日本七鳃鳗L-STAT3原核表达重组质粒的构建 |
| 4.1.3.2 日本七鳃鳗L-STAT3重组蛋白的诱导表达与纯化 |
| 4.1.3.3 重组蛋白Western Blot验证 |
| 4.2 日本七鳃鳗L-STAT3天然蛋白、重组蛋白抗体验证以及蛋白表达检测 |
| 4.2.1 七鳃鳗各组织总蛋白的提取及蛋白质浓度测定 |
| 4.2.2 qPCR检测L-STAT3在mRNA水平的表达 |
| 4.2.3 Western Bolt检测抗体、L-STAT3 蛋白的表达 |
| 4.2.4 免疫荧光检测L-STAT3在细胞中的定位 |
| 4.2.5 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 5 L-STAT3 在巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)中的诱导表达 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌株及质粒 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.1.3 毕赤酵母外源蛋白表达母液和培养基 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 L-STAT3基因合成和重组载体的构建 |
| 5.2.2 去内毒素空载和重组质粒提取、双酶切鉴定 |
| 5.2.3 线性化pPICZαA-L-STAT3重组质粒 |
| 5.2.4 毕赤酵母电转化 |
| 5.2.5 毕赤酵母基因组DNA的提取以及PCR鉴定 |
| 5.2.6 毕赤酵母基因组DNA的PCR鉴定 |
| 5.2.7 毕赤酵母诱导表达 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 L-STAT3基因合成、重组载体的构建以及双酶切鉴定 |
| 5.3.2 毕赤酵母基因组DNA提取及其PCR检测与鉴定 |
| 5.3.3 毕赤酵母的诱导表达 |
| 5.3.4 毕赤酵母重组蛋白的鉴定 |
| 5.4 讨论 |
| 6 L-STAT3功能初探 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 动物材料 |
| 6.1.2 主要试剂与仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 目的基因的合成以及重组载体的构建 |
| 6.2.2 去内毒素真核重组质粒提取、鉴定 |
| 6.2.3 HEK-293T、Hela细胞培养 |
| 6.2.4 瞬时转染 |
| 6.2.5 CCK-8试剂盒检测细胞活性 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 七鳃鳗L-STAT3基因合成以及重组表达载体的构建 |
| 6.3.2 p CDNA3.1(+)-e GFP-L-STAT3重组质粒的真核转染 |
| 6.3.3 HEK-293T、Hela细胞存活率检测 |
| 6.4 讨论 |
| 结论 |
| 本论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 附录A 主要试剂 |
| 附录B 主要仪器 |
| 附录C 引物序列 |
| 附录D KEGG通路注释 |
| 附录E L-STAT3 的碱基序列与氨基酸序列 |
| 附录F 毕赤酵母外源蛋白表达母液和培养基 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（9）团头鲂tlrs及irfs基因的克隆、表达及其功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 TLRs和 IRFs基因的研究进展 |
| 1.2.1 模式识别分子 |
| 1.2.2 Toll样受体的研究起源 |
| 1.2.3 脊椎动物的Toll样受体研究进展 |
| 1.2.4 脊椎动物的干扰素调节因子研究进展 |
| 1.2.5 TLR与 IRF的分类 |
| 1.2.6 IRFs在 Toll样受体信号通路中的作用 |
| 1.2.7 团头鲂病害及其免疫学研究 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 团头鲂tlrs基因序列的克隆及表达分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 主要设备与仪器 |
| 2.2.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2.2.4 嗜水气单胞菌的复壮、鉴定及生长曲线的测定 |
| 2.2.5 菌株半致死浓度的测定 |
| 2.2.6 样品采集 |
| 2.2.7 组织RNA提取 |
| 2.2.8 荧光定量cDNA的合成 |
| 2.2.9 基因序列克隆及测序 |
| 2.2.10 PCR和 qPCR |
| 2.2.11 序列生物信息学分析 |
| 2.2.12 数据分析 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 团头鲂tlrs序列的克隆及特征分析 |
| 2.3.2 Tlrs氨基酸序列分析 |
| 2.3.3 Tlrs蛋白质二级序列比对分析及三级结构预测 |
| 2.3.4 系统进化分析 |
| 2.3.5 嗜水气单胞菌的鉴定及生长曲线的绘制 |
| 2.3.6 团头鲂Matlrs的时空表达谱及病原刺激后的表达变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 团头鲂Matlrs序列分析及系统进化 |
| 2.4.2 团头鲂Matlrs组织表达分析及嗜水气单胞菌感染后的表达变化 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 团头鲂irfs基因序列的克隆及表达分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 团头鲂irfs序列克隆及特征分析 |
| 3.3.2 Irfs氨基酸序列分析 |
| 3.3.3 Irfs蛋白质二级序列比对分析及三级结构预测 |
| 3.3.4 系统进化分析 |
| 3.3.5 团头鲂Mairfs的时空表达谱及病原刺激后的表达变化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 团头鲂Mairfs序列分析及系统进化 |
| 3.4.2 团头鲂Mairfs组织表达分析及嗜水气单胞菌感染后的表达变化 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 团头鲂irfs及 IκB-β基因原核表达及抗菌性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 主要设备与仪器 |
| 4.2.3 主要试剂及试剂盒 |
| 4.2.4 基因序列的克隆及测序 |
| 4.2.5 原核表达载体的构建 |
| 4.2.6 融合蛋白的诱导表达 |
| 4.2.7 融合蛋白的纯化 |
| 4.2.8 多克隆抗体的制备 |
| 4.2.9 western-blot试验 |
| 4.3 结果及分析 |
| 4.3.1 重组质粒的构建 |
| 4.3.2 团头鲂MaIrfs与 IκB-β的原核表达 |
| 4.3.3 团头鲂IκB-β的纯化及抗体制备 |
| 4.3.4 western-blot验证抗体及获得纯蛋白的抗菌性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 团头鲂MaTlrs的亚细胞定位及信号传导功能研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试验材料 |
| 5.2.2 主要设备与仪器 |
| 5.2.3 主要试剂及试剂盒 |
| 5.2.4 基因克隆及测序 |
| 5.2.5 真核表达载体的构建 |
| 5.2.6 细胞复苏,传代与冻存 |
| 5.2.7 细胞转染(以24 孔板转染为例) |
| 5.2.8 荧光显微镜观察基因定位 |
| 5.2.9 过表达基因对下游干扰素相关免疫因子转录水平的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 真核表达载体的构建 |
| 5.3.2 细胞转染效率 |
| 5.3.3 团头鲂pEGFP-N1-MaTlrs亚细胞定位 |
| 5.3.4 团头鲂Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21 基因过表达对下游干扰素相关免疫基因m RNA转录水平的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 团头鲂MaTlrs的亚细胞定位 |
| 5.4.2 团头鲂Matlrs基因对下游干扰素相关免疫因子m RNA表达的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 团头鲂tlrs基因与irfs基因之间的信号传导 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试验材料 |
| 6.2.2 主要设备与仪器 |
| 6.2.3 主要试剂及试剂盒 |
| 6.2.4 基因克隆及测序 |
| 6.2.5 细胞凋亡的测定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 六个Mairfs启动子区域克隆及特征分析 |
| 6.3.2 Matlrs与 Mairfs之间的信号传导 |
| 6.3.3 细胞凋亡试验测定 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）Survivin在不同年龄牦牛组织器官内表达检测及其多克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 一 IAP研究进展 |
| 1 IAP的结构特征 |
| 2 IAPs与哺乳动物细胞凋亡 |
| 二 Survivin研究进展 |
| 1 survivin的结构与分布 |
| 2 Survivin及其异构体 |
| 3 Survivin的功能 |
| 4 Survivin与 caspase-3 细胞凋亡 |
| 5 Survivin的表达与抗体制备 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究部分 |
| 第一章 牦牛survivin生物信息学分析及其在新生和成年牦牛组织器官内的表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 survivin与 caspase-3 在牦牛免疫器官中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 Survivin原核表达质粒的构建和多克隆抗体制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
四、诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白质的原核表达载体构建研究（论文参考文献）
- [1]大鼠CDON与IZUMO1和JUNO的相互作用及对受精的影响[D]. 霍雨佳. 内蒙古大学, 2021(12)
- [2]猫干扰素ω和干扰素γ的可溶性原核表达、纯化及安全性初步评价[D]. 任丽君. 甘肃农业大学, 2021(09)
- [3]罗非鱼NCC亚群的构成解析及其活性调控因子半乳糖凝集素（Galectins）的功能研究[D]. 牛金中. 广东海洋大学, 2021(02)
- [4]猪GRP多克隆抗体的制备与应用及其对Leydig cells睾酮分泌的影响[D]. 郭军培. 扬州大学, 2021
- [5]BLM-EZH2相互作用影响前列腺癌细胞增殖的分子机制研究[D]. 阮涌. 贵州大学, 2021(01)
- [6]克氏原螯虾Yippee-2和Yippee-5基因的鉴定及其功能的研究[D]. 刘晓晓. 安徽农业大学, 2021(02)
- [7]宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究[D]. 韩聪. 西北农林科技大学, 2020
- [8]日本七鳃鳗L-STAT3基因的克隆及功能初探[D]. 张文颖. 辽宁师范大学, 2020(02)
- [9]团头鲂tlrs及irfs基因的克隆、表达及其功能研究[D]. 詹凡玢. 华中农业大学, 2019(01)
- [10]Survivin在不同年龄牦牛组织器官内表达检测及其多克隆抗体的制备[D]. 刘俊. 甘肃农业大学, 2019(02)